Роль трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в терапии острого лимфобластного лейкоза у детей и подростков группы высокого риска тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, кандидат наук Семенова, Елена Владимировна

• Семенова, Елена Владимировна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Семенова, Елена Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение__3

Глава 1. Обзор литературы__12

Глава 2. Методы исследования и характеристика пациентов__57

Глава 3. Сравнение режимов кондиционирования и их влияние на результаты после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых

клнток__87

Глава 4. Осложнения раннего и позднего периодов пациентов после

аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток__119

Глава 5. Терапия рецидивов острого лимфобластного лейкоза высокого риска у детей и подростков до и после аллогенной трансплантации

гемопоэтических стволовых клеток__147

Заключение__177

Выводы__201

Список сокращений__205

Список литературы__207

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в терапии острого лимфобластного лейкоза у детей и подростков группы высокого риска»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) - самое частое злокачественное заболевание у детей, доля которого в структуре онкологической заболеваемости составляет около 25 %. Ежегодно в РФ ОЛЛ диагностируется более чем у 800 детей в возрасте до 18 лет. Выдающиеся успехи программной химиотерапии ОЛЛ в США, Европе и России привели к возможности достижения полного излечения у большинства детей с ОЛЛ, однако 5-летняя безрецидивная выживаемость (БРВ) варьирует в зависимости от наличия факторов риска течения заболевания от 30 до 92% (Pui СН., 2008; Карачунский А.И., 2011). Эффективность химиотерапии у детей ОЛЛ группы высокого риска остаётся неудовлетворительной - 5-летняя безрецидивная выживаемость не превышает 31—40% (Pui СН., 2009; Moricke А., 2010), что связано с развитием резистентности злокачественного клона клеток к стандартной химиотерапии. Неадекватное лечение пациентов этой группы значимо повышает вероятность рецидивов заболевания (Locatelli F., 2012). Увеличение БРВ у детей с ОЛЛ высокого риска уже не может быть связано с интенсификацией доз цитостатических препаратов, возможные комбинации которых практически исчерпаны. Для улучшения эффективности лечения таких пациентов необходимо использовать принципиально новые подходы, не имеющие перекрестной резистентности с химиотерапией, основанные на применении «таргетных» препаратов и иммуноадоптивной терапии.

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является существенным фактором в повышении эффективности терапии детей с ОЛЛ высокого риска (Афанасьев Б.В., 2002; Зубаровская Л.С., 2003; Румянцев А.Г., Масчан A.A., 2003), сочетая возможность применения цитостатического и иммуноадоптивного эффектов. Однако преимущества данного подхода не могут быть реализованы оптимальным образом ввиду постоянного изменения факторов прогноза группы высокого риска ОЛЛ, что

осложняет принятие решения в пользу проведения одного из вариантов алло-ТГСК на ранних этапах лечения до возникновения первого рецидива с соблюдением баланса между риском смерти от заболевания и развитием осложнений, связанных с трансплантацией (Balduzzi А., 2005; Schrauder А., 2008). В связи со значительными успехами, полученными в ходе применения химиотерапии в лечении OJLJI у детей, показания к алло-ТГСК притерпевают изменения. Отсутствие ремиссии после индукционной терапии, неблагоприятные хромосомные поломки, транслокации (4; 11), гиподиплоидия (<44 хромосом) и другие - основные неблагоприятные факторы прогноза OJIJI. ОВ и БРВ таких пациентов после алло-ТГСК в первой ремиссии составили 85% и 64%, соответственно Развитие рецидива OJLJI - наиболее значимый неблагоприятный фактор, в случае которого выполнение алло-ТГСК показано всем пациентам при условии достижения ремиссии, за исключением больных с поздним экстрамедуллярным рецидивом. ОВ и БРВ детей и подростков с ОЛЛ, алло-ТГСК которым выполнена во 2 ремиссии, равна 60% и 47%, соответственно (Pui СН., 2011; Henze G., 2013).

Особую группу составляют пациенты с ОЛЛ, не достигшие ремиссии (первично-резистентные) или находящиеся в состоянии резистентного рецидива. Химиотерапия, включая высокодозную, не решает проблему излечения рефрактерных форм ОЛЛ (Tallen С., 2010), ОВ у детей данной категории не превышает 5%. Ежегодно в РФ неблагоприятные формы ОЛЛ диагностируются у 180-200 детей.

Степень разработанности

С появлением новых препаратов (флударабин, неларабин, клофарабин, блинатумомаб и др.) выбор терапевтических средств, увеличивающих вероятность достижения ремиссии у пациентов с ОЛЛ (высокий риск, рецидивы), существенно расширился (Kantarjian et al., 2000; Hoelzer D., 2013). Комбинация с алло-ТГСК является возможным методом лечения для пациентов с рефрактерными формами ОЛЛ (Dunsmore КР., 2012; Locatelli F., 2013). Однако

эффективность иммуноадоптивного воздействия при ОЛЛ не достигает уровня чувствительности пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) (СЬашрНп Я., 1999). В тоже время, для ОЛЛ не изучена возможность воздействия эффекта «трансплантат-против-лейкоза» за счет комбинированного влияния иммуноадоптивного эффекта алло-ТГСК, реализуемого посредством инфузий донорских лимфоцитов, в том числе несепарированных, ЫК — клеток, модифицированных САЯ-Т-лимфоцитов, с другими однонаправленными факторами (ростовыми факторами, ингибиторами шТОЯ, ингибиторами тирозин-киназ, моноклональными антителами). При рецидиве и резистентном течении ОЛЛ у детей не разработаны варианты оптимальной подготовки пациентов к алло-ТГСК, не установлена эффективность различных типов алло-ТГСК в зависимости от источника ГСК (родственный, неродственный, гаплоидентичный донор) и режимов кондиционирования.

Миелоаблативные режимы кондиционирования (МАК), преимущественно с тотальным облучением тела (ТОТ), являются классическими вариантами подготовки пациентов с ОЛЛ к алло-ТГСК. Наилучшие результаты при применении МАК установлены после алло-ТГСК, выполненной в 1 ремиссии, так 5-летняя БРВ в 1 ремиссии равна 58-84%, во 2 ремиссии - 36-60%, рецидиве -5% (Ме1йа РА., 2008; Тгасеу I., 2013). Основными причинами неудач при алло-ТГСК остаются высокая вероятность тяжёлых осложнений (инфекции, острая и хроническая реакции «трансплантат-против-хозяина» и др.), а также рецидивы основного заболевания. Кроме того, особое место у детей и подростков занимают поздние осложнения (эндокринные нарушения, потеря фертильности).

Использование режимов кондиционирования со сниженной интенсивностью доз (РИК) у взрослых показало свою эффективность у пациентов со злокачественными гематологическими заболеваниями, в том числе, при различных стадиях ОЛЛ (ремиссия, рецидив) (Савченко В.Г., 2007; МоЫу М., 2010). В последние годы нами получены первые данные об эффективности алло-ТГСК с РИК у детей с ОЛЛ в продвинутых стадиях заболевания (Уешепв М., 2010; Афанасьев Б.В., 2010). Несомненные преимущества РИК - возможность

существенного снижения цитостатической нагрузки при алло-ТГСК у детей с сохранением терапевтической эффективности за счет иммуноадоптивного воздействия. Внедрение алло-ТГСК с РИК у детей с ОЛЛ, группы высокого риска, чрезвычайно актуально, поскольку даёт возможность выполнить трансплантацию у пациентов с высокой степенью предлеченности и низким индексом Ланского/Карновского. Применение алло-ТГСК с РИК у детей невозможно без анализа эффективности различных вариантов РИК, источников получения трансплантата, спектра осложнений раннего и позднего периодов, способов профилактики острой РТПХ. Применение РИК может иметь особенности в зависимости от стадии заболевания, что требует разработки протоколов посттрансплантационной терапии детей с рецидивами ОЛЛ как на момент алло-ТГСК, так и возникшими после её проведения.

Рецидивы после алло-ТГСК развиваются у 24-65% пациентов и являются одной из наиболее частых причин летального исхода. Существует несколько способов лечения посттрансплантационных рецидивов:

- химиотерапия, с помощью которой зачастую невозможно преодоление химиорезистентности;

- повторная алло-ТГСК, проведение которой связано с высокой летальностью;

- иммуноадоптивная терапия представляется наиболее оптимальным вариантом терапии, поскольку не обладает перекрестной резистентностью;

- комбинация вышеперечисленных способов.

Несмотря на имеющиеся возможности, лечение рецидивов сопряжено с рядом трудностей, в связи с этим предупреждение рецидивов является неотъемлемой частью ведения пациентов после алло-ТГСК. Контроль за показетелями, определяющими уровень минимальной остаточной болезни (МОБ) является необходимым исследованием в посттрансплантационном периоде, который поможет в выборе терапии детей и подростков с ОЛЛ после алло-ТГСК (Bader Р., 2009). Анализ совокупности данных, обосновывающих профилактическое и превентивное назначение препаратов, выбор направления

терапии рецидива после алло-ТГСК будет способствовать созданию новых протоколов для лечения наиболее неблагоприятных вариантов ОЛЛ у детей.

Таким образом, несмотря на достигнутые в последние годы успехи в терапии ОЛЛ у детей и подростков, результаты лечения прогностически неблагоприятных форм ОЛЛ остаются неудовлетворительными. Возможности интенсификации химиотерапии исчерпаны, в связи с чем возникает необходимость разработки новых терапевтических подходов в лечении детей и подростков с ОЛЛ группы высокого риска. Современные протоколы программного лечения рецидивов после алло-ТГСК также требуют дальнейшего изучения.

Цель исследования

Повысить эффективность терапии детей и подростков с острым лимфобластным лейкозом группы высокого риска с помощью внедрения различных вариантов аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Задачи исследования

1. Оценить факторы, влияющие на общую и безрецидивную выживаемость у детей и подростков с ОЛЛ в сравнении с дозами препаратов, используемых в режимах кондиционирования при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

2. Оценить эффективность нуклеозид-содержащих схем в терапии ОЛЛ высокого риска в качестве этапа подготовки пациентов к алло-ТГСК.

3. Проанализировать влияние источников ГСК (типа доноров) на эффективность трансплантации у детей и подростков с ОЛЛ, высокого риска, в том числе с резистентными формами течения заболевания.

4. Выявить особенности двух флударабин-содержащих режимов кондиционирования со сниженной интенсивностью доз (флударабин+бусульфан, флударабин+мелфалан) по сравнению с миелоаблативными режимами при

проведении алло-ТГСК. Сравнить частоту и характер осложнений раннего и позднего периодов у пациентов после алло-ТГСК в зависимости от режимов кондиционирования, стадии заболевания и источников трансплантата.

5. Изучить факторы, влияющие на развитие рецидивов ОЛЛ высокого риска после алло-ТГСК в зависимости от вида трансплантации, уровня минимальной остаточной болезни и донорского химеризма.

6. Оценить возможности иммуноадоптивной терапии в упреждении и лечении рецидивов ОЛЛ после алло-ТГСК с примененим различных режимов кондиционирования.

7. Установить значение МОБ и донорского химеризма в различных периодах после алло-ТГСК для прогноза и определения тактики превентивной терапии рецидивов ОЛЛ.

Научная новизна

Характеристики эффективности алло-ТГСК (ОВ, БСВ, риск развития рецидива, причины летальности) при использовании РИК у детей и подростков с ОЛЛ существенно не отличались от МАК. Предложены критерии для выбора доз в режимах кондиционирования у детей и подростков, страдающих ОЛЛ высокого риска.

Установлено, что режимы кондиционирования со сниженной интенсивностью имеют меньшую вероятность развития нейро- гепато- и нефротоксичности, а также частоту геморрагических циститов, мукозитов в раннем периоде после алло-ТГСК по сравнению с миелоаблативными режимами кондицонирования. Показано, что у детей и подростков флударабин- и неларабинсодержащие программы являются эффективным этапом подготовки к выполнению алло-ТГСК. Определены факторы прогноза развития пострансплантационных рецидивов у детей и подростков с ОЛЛ, высокого риска. Установлены оптимальные сроки динамического наблюдения за состоянием донорского химеризма и МОБ после алло-ТГСК у детей и подростков с ОЛЛ с целью профилактики рецидива и коррекции терапии. Показана эффективность

применения иммуноадоптивной терапии в лечении и упреждении рецидивов ОЛЛ высокого риска после алло-ТГСК.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Проведенный анализ результатов алло-ТГСК с применением доз, имеющих различный уровень интенсивности в режимах кондиционирования у детей и подростков, страдающих ОЛЛ высокого риска, позволяет научно обосновать использование режимов кондиционирования со сниженной интенсивностью доз. Показано отсутствие различия в клинической эффективности РИК и МАК, при этом РИК имеют преимущества, касающиеся меньшей вероятности развития осложнений в раннем периоде после алло-ТГСК, что дает возможность применять данные режимы кондиционирования у детей и подростков с ОЛЛ с высокой степенью «предлеченности». При развитии рецидива после алло-ТГСК с РИК в большей степени возможна реализация иммуноадоптивного эффекта по сравнению с МАК алло-ТГСК. Определены возможные пути преодоления резистентности при ОЛЛ: до алло-ТГСК - применение новых комбинаций ХТ, а также проведение гаплоидентичных алло-ТГСК, использование посттрансплантационной терапии (иммуноадоптивной, таргетной, комбинированной).

Методология и методы исследования

В работе использованы эмпирические: наблюдения, сравнения, измерение, счет, моделирования, а также теоретические методы исследования: гипотетические и общелогические (аналогии, абстрагирования, индукции и дедукции). Основываясь на принципах диалектической логики (объективности и всесторонности рассмотрения, конкретности и историзма) использовался комплексный системный исследовательский подход.

Положения, выносимые на защиту 1. Алло-ТГСК является важным этапом лечения ОЛЛ у детей и

подростков группы высокого риска, в том числе у пациентов с высокой степенью «предлеченности» и рецидивом заболевания.

2. Аллогенные трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с применением режимов кондиционирования, имеющих сниженный уровень интенсивности доз сопоставимы по эффективности в достижении ремиссии и показателей общей выживаемости с алло-ТГСК с миелоаблативными режимами кондиционирования.

3. РИК имеют меньшую вероятность развития ранних осложнений после алло-ТГСК, включая нейро-, гепато- и нефротоксичности.

4. Флударабин- и неларабинсодержащие программы химиотерапии эффективны в достижении ремиссии у пациентов с рецидивирующими формами ОЛЛ и являются этапом подготовки для последующего проведения алло-ТГСК.

5. Динамическое наблюдение за МОБ и состоянием донорского химеризма создает условия для своевременного назначение превентивной противорецидивной терапии (иммуноадоптивной, в том числе в комбинации с ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) и/или химиотерапией), что является необходимым при лечении детей и подростков с ОЛЛ группы высокого риска после одного из вариантов алло-ТГСК.

Степень достоверности

Степень достоверности результатов проведенного исследования подтвержается большим объемом наблюдений, адекватным набором оцениваемых показателей, выбором для обработки материалов методов статистичекого анализа, соответствующего цели и задачам исследования и современному уровню науки.

Основные положения диссертации внедрены в практическую работу в отделение химиотерапии острых лейкозов детской городской больницы №1 (СПб), клиники НИИ ДОГиТ им.Р.М.Горбачевой, НИИ онкологии им.проф .Н.Н.Петрова.

Материалы диссертации используются в лекциях и на практических занятиях для постдипломной подготовки педиатров, гематологов и детских

онкологов на кафедре гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ФПО Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова. Опубликовано методическое пособие для врачей.

По теме диссертации опубликовано 95 работ (из них 63 в зарубежных журналах), в том числе 16 статей (и 6 тезисов) в научных журналах и изданиях рекомендуемых ВАК РФ.

Материалы и основные положения работы доложены на 27 научных и научно-практических Российских и международных конференциях.

Апробация результатов

Апробация диссертации проведена 06.09.2013 на совместном заседании проблемной комиссии «Онкология, молекулярная медицина и трансплантология» и кафедры гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ФПО ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им.И.П.Павлова.

12

Глава 1

Обзор литературы

Острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) является самым частым злокачественным заболеванием у детей, и занимает первое место по частоте встречаемости среди всех вариантов лейкозов. Основным методом лечения OJIJI у детей остается применение современных программ химиотерапии, при этом достижение полной клинико-гематологической ремиссии (ПКГР) возможно у 95-99% пациентов (5-летняя бессобытийная выживаемость достигает 80-85%) (Карачунский А.И., 2010; Pui СН., 2008; Seibel NL., 2008; Contor V., 2010; Moricke А., 2010). Тем не менее, несмотря на использование современных комбинаций химиопрепаратов, у 25-30% детей с OJIJI рецидив наступает в первый год после получения 1 111 КР, что является прогностически неблагоприятным фактором. В последующем только у 30-40% больных удается получить вторую полную ремиссию. Двухлетняя общая выживаемость таких пациентов составляет 20-24% (Алейникова О.В., 2004; Thomson В., 2004; Nguyen К., 2008). Прогнозы для лечения второго и третьего рецидива еще более неблагоприятны, ремиссию удается достигнуть у менее 10% пациентов (Dini G., 2003), а долгосрочная выживаемость таких пациентов приближается к 0% (Stackelberg А., 2011; Reismuller В., 2013).

В зависимости от факторов прогноза европейскими исследовательскими центрами дети и подростки с OJIJI разделены на группы стандартного, промежуточного и высокого риска. Шестилетняя безрецидивная выживаемость по данным группы BFM составила 89,5% при стандартном риске, 79,7% -промежуточном, 49% - высоком (Moricke А., 2008). В ходе исследования, в которое включены данные 6000 детей с OJIJI, Американская научная группа COG (Chidren's Oncology Group) выделила 4 прогностические группы: стандартного,

промежуточного, высокого и сверх высокого риска. Четырехлетняя

бессобытийная выживаемость пациентов по группам составила 91%, 86%, 76% и 46%, соответственно.

1. Факторы прогноза высокого риска детей с ОЛЛ и показания к алло-ТГСК.

Анализ многочисленных клинических исследований показал, что ОЛЛ у детей и подростков является биологически гетерогенным заболеванием. Основным достижением в лечении ОЛЛ у детей стала разработка риск-адаптированной терапии, согласно которой интенсивность лечения должна соответствовать группе риска. Стратификация пациентов построена на определении факторов прогноза, определяющих ту или иную группу риска. Основными прогностическими факторами, которые используются во всех программах лечения ОЛЛ у детей, являются возраст, иммунофенотип лейкозных клеток, инициальный лейкоцитоз, наличие экстрамедуллярных поражений, характер хромосомных изменений, ответ на индукционную терапию и уровень минимальной остаточной болезни (МОБ) после курса индукции ремиссии (Масчан М.А., 2006). К неблагоприятным факторам прогноза относятся медленный ответ на гормональную профазу, отсутствие ремиссии после индукционной терапии (неэффективность индукции), младенческий лейкоз (лейкоз у детей до года), РЬ-позитивный ОЛЛ. (В1^\уат Б., 2010).

Прогноз, основанный на оценке раннего ответа на терапию, является достаточно чувствительным, объективным и точным, зачастую более значимым чем другие клинические и цитогенетические предикторы. Несмотря на то, что точные биологические факторы, определяющие ранний ответ на терапию не установлены, тем не менее, скорость ответа на начало терапии - результат динамического взаимодействия между химиочувствительностью лейкозных клеток, эффективностью выбранной терапии и фармакогенетикой организма пациента. Исследовательская группа ВРМ традиционно оценивала уровень бластов в периферической крови на 8 день гормональной профазы. Наличие в

крови менее 1000 бластов в микролитре расценивался как хороший ответ, более 1000 бластов/мкл - плохой. По результатам протокола ALL-BFM-90, 5-летняя БСВ пациентов с плохим ответом составила 34%, с хорошим- 82% (Schrappe M.et al. 2000). Кроме того, для оценки ответа на терапию применяется морфологическое исследование аспирата костного мозга на 7, 15 и после окончания курса индукции. (Sandlund JT., 2002; Moricke А., 2013). При хорошем ответе количество бластов должно быть менее 5%. По результатам ряда исследований для оценки ответа в большей степени имеет значение выявление признаков злокачественностных бластов (Borowitz MJ. et al., 2008, Сатрапа D., 2009; Biondi А., 2009; Yang Y-L., 2012). Таким образом, было введено понятие "минимальная остаточная болезнь" (МОБ).

МОБ - объем остаточных лейкозных клеток, которые не выявляются с помощью световой микроскопии. Для определения МОБ используется проточная цитофлуориметрия, молекулярно-биологическое выявление продукта реарранжировки генов иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора или химерного транскрипта. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки. Проточная цитофлуориметрия выявляет экспрессию антигенов, который не встречается на нормальных клетках, так называемый, аберрантный лейкемический иммунофенотип. С помощью этого метода адекватную мишень для определения МОБ удается выявить у 80% пациентов. К преимуществам цитофлуориметрии также относятся доступность, возможность дистанционного выполнения анализа в референс-лабораториях и высокая чувствительность.

Выявление продуктов реарранжировки генов иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора с помощью полимеразно-цепной реакции (ПНР) обладает еще большей чувствительностью и возможностью применения у большинства пациентов. Недостатками является нестабильность мишени, что может привести к ложноотрицательным результатам. Этот метод достаточно трудоемкий, требует высокой квалификации лабораторного персонала. Проводится детальный анализ первичного образца по выявлению уникальной мишени для каждого пациента. С учетом нестабильности мишени требуется определение нескольких маркеров,

которые будут использоваться для контроля уровня МОБ (Eckert С.,2013). Самым чувствительным методом является молекулярно-биологическое определение химерных генов (BCR/ABL, TEL/AML, MLL/AF4 и др.), но применение его возможно не более чем у 35 % детей с OJIJI. Результаты всех методов определения МОБ совпадают, поэтому использование любого из них является допустимым (Neale GA. et al, 1999).

Исследовательская группа BFM распределила пациентов на 3 группы в зависимости от уровня МОБ, который определяли у детей с OJIJI после индукционной (Т1) и консолидирующей (Т2) терапии с помощью ПЦР (определение мутаций генов Т-клеточного рецепторов и иммуноглобулинов): МОБ-стандартный риск (МОБ <10"4 в Т1 и Т2), МОБ- промежуточный риск (>10" 4, но <10"3), МОБ-высокий риск (>10"3 в Т2). В зависимости от этих уровней 10-летняя бессобытийная выживаемость составила 93%, 74%, и 16%, соответственно (Flohr Т. et al, 2008). В исследовательском госпитале Св. Иуды (США) предложено определение МОБ на 15 день терапии и после индукции с помощью проточной цитофлуориметрии, что позволяет выявить пациентов с минимальной вероятность развития рецидива (<5%) и больных с вероятностью рецидива более 75%. Определение МОБ на столь ранних этапах терапии позволяет выявить группу пациентов, которым необходимо интенсифицировать терапию, вплоть до выполнения алло-ТГСК в первой ремиссии. Мониторинг МОБ имеет значение, как при проведении химиотерапии, так и алло-ТГСК, в том числе до (Bader Р. et al, 2002; Foster JH., 2011; Leung W., 2012) и, в большей степени, после алло-ТГСК, так как позволяет своевременно оценить необходимость применения иммуноадоптивной терапии.

Неэффективность индукции (>5 % бластов по окончанию индукционной терапии) является крайним вариантом позднего ответа, при котором достижение ремиссии возможно только посредством интенсификации химиотерапии. Около 80% пациентов достигают ремиссию после проведения высокодозных блоков, общая выживаемость при этом не превышает 30%. (Oudot с. Et al, 2008). В результате проведенного исследования COG-группы бессобытийная

выживаемость пациентов с неэффективной индукцией без алло-ТГСК составила 46%, после алло-ТГСК - 67%. В исследовательском госпитале Св. Иуды пришли к заключению, что все больные с неэффективной индукцией имеют показания к алло-ТГСК непосредственно после консолидирующей и реиндукционной терапии (Schultz KR. et al, 2008). По результатам совместного рандомизированного исследования групп BFM и AIEOP (Италия) алло-ТГСК также значимо улучшает эффективность лечения детей с OJIJI, группы высокого риска (с неэффективной индукцией) в сравнении с химиотерапией (5-летняя БРВ пациентов после алло-ТГСК в первой ремиссии составила 56%, без алло-ТГСК - 26,5%) (Balduzzi A. Et al, 2005).

К крайне неблагоприятным вариантам OJIJI относится младенческий лейкоз, развившийся у детей на первом году жизни. Данный вариант OJIJI составляет 23% от всех вариантов детских OJIJI. Характерными особенностями младенческого OJIJI являются гиперлейкоцитоз, частое вовлечение ЦНС, незрелый В-клеточный иммунофенотип и высокая частота перестройки MLL гена (у 80%), расположенного в регионе llq23 (Pui CH. et al 2002; Krivtsov AV. et al., 2007; Попов A.M., 2012). Наиболее неблагоприятная перестройка (4; 11) с образованием химерного гена MLL/AF4 встречается у 70% пациентов. По данным Pui СН, (2002) БСВ пациентов с младенческим лейкозом и t(4;ll) составляет 19%. Традиционные протоколы лечения OJIJI показали свою неэффективность в терапии младенческого лейкоза, у пациентов отмечается высокая частота ранних резистентных рецидивов (Marieke H., 2009). Неэффективность терапии объясняется биологией заболевания, связанной с резистентностью к основным препаратам лечения OJIJI, таким как преднизолона, аспарагиназа, а так же особенностью клеточных транспортных систем детей раннего возраста, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов, что может приводить как к недостаточной чувствительности к цитостатическим препаратам, так и к повышенной их токсичности (Ramakersvan Woerden NL., et al, 2004). Однако, несмотря на отсутствие значимого улучшения эффективности лечения младенческого OJIJI в ряде исследований путем интенсифицирование терапии,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Семенова, Елена Владимировна, 2014 год

Источник ГСК

• КМ 73 (50%)

• ПСКК 58 (40%)

• КМ+ПСКК 15 (10%)

Режимы кондиционирования

МАК

• ВиСу±АТО 68 (47%)

• ТгеоСу±АТО 11 (7,5%)

• АгаСВиСуССЫШАТО 20 (14%)

РИК

• БЬВи+АТС 24 (16%)

• Р1иМе1±АТО 22 (15%)

• Р1иСу±АТС 1 (0,5%)

Схемы профилактики РТПХ:

• Циклоспорин-содержащие 103 (70,5%)

• Такролимус-содержащие 43 (29,5%)

Перед началом исследования все пациенты и родители детей до 18 лет, участвующих в исследовании, подписывали информированное согласие, согласно Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2008).

В исследование включены данные о 118 алло-ТГСК от родственного и неродственного доноров. У 33 пациентов с рецидивом OJLJI до алло-ТГСК с целью индукции ремиссии проанализированы варианты резервной химиотерапии, основными компонентами которых являлись флударабин или неларабин. Одним из вариантом в преодолении резистентности предложена гаплоидентичная алло-ТГСК, которая была выполнена у 28 детей и подростков с рецидивирующим течением ОЛЛ. В качестве иммуноадоптивной терапия для лечения и предупреждения рецидива после алло-ТГСК у 39 пациентов проводились инфузии донорских лимфоцитов (в монорежиме, комбинации с химиотерапией и рекомбинантными цитокинами). У 6 детей превентивная терапия заключалась в использовании цитостатических и терагетных препаратов. Для определения показаний к превентивной терапии после алло-ТГСК выполняли исследование МОБ (п=32) и посттрансплантационного химеризма (п=69).

2.1.Реиндукция ремиссии до проведения алло-ТГСК у пациентов с

рецидивом ОЛЛ

С марта 2008 г. по октябрь 2012 г. в клинике НИИ ДОГиТ им.Р.М.Горбачевой реиндукция ремиссии до алло-ТГСК выполнена у 33 пациентов, из них у 6 детей отмечалось первично-резистентное течение ОЛЛ, у 11 больных - первый ранний резистентный рецидив, у 16 пациентов — 2 и 3 резистентные рецидивы (Таблица 2). Возраст пациентов колебался от 1 до 21 года (медиана - 11,5 лет). По полу пациенты распределились: мальчики - 23, девочки -10. B-иммунологический вариант ОЛЛ диагностирован у 18 пациентов: B1 (n=3), В2 (n=2), В2ВЗ (n=4), ВЗ (п=6), без уточнения (п=3). Цитогенетическое исследование проводилось у 10 больных с В-ОЛЛ: нормальный кариотип определялся у 3 пациентов, t(4;ll) - у 3 больных, t(9;22) - у 2 пациентов и комплексные поломки — у 2 детей. Факторы неблагоприятного прогноза, которые

были выявлены у пациентов с В-ОЛЛ на момент постановки диагноза: возраст (>10 лет - п=6; <1 года - п=2), спленомегалия > 4 см из-под края реберной дуги (п=5), гиперлейкоцитоз 40-1180,0 х109/л (п=2), транслокации (9;22) и (4; 11) (п=5), инициальный нейролейкоз (п=1), отказ родителей от первичной химиотерапии

(п=1).

Т-клеточный фенотип ОЛЛ диагностирован у 15 детей и подростков: Т1 (п=4), Т2 (п=6), ТЗ (п=3), Т4 (п=2). При цитогенетическом исследовании, которое было проведено у 11 больных перед курсом флударабин- или неларабинсодержащей ХТ, были выявлены следующие хромосомные аберрации: г(3;4), г(2;9), 1(4; 12), 1;14), 1(6; 14), с!е1 6, ёе1 17. Нормальный кариотип отмечали у 4 больных. У одного ребенка был выявлен химерный ген 81Ь/ТАЬ. Факторами неблагоприятного прогноза на момент постановки диагноза Т-ОЛЛ были гиперлейкоцитоз 40,0-411,0 х109/л (п=10), возраст >10 лет (п=8), экстрамедуллярные поражения ЦНС, селезенки и лимфатических узлов (п=8). Кроме того, у 9 пациентов не было получено ремиссии после курса индукционной терапии.

У большинства пациентов в качестве противорецидивной терапии до схем с нуклеозидными аналогами применялись блоки химиотерапии из протокола ВБМ-АЬЬ-Яег различных редакций. Количество курсов предшествующей терапии составило в среднем 3 (0-8). На противорецидивной ХТ ни у одного из включенных в данное исследование пациентов ремиссия не была достигнута.

Основными препаратами, используемыми в достижении повторной ремиссии, были флударабин- и неларабин-содержащие схемы. У 23 детей и подростков с В- или Т-ОЛЛ использовали схему РЬАСЬьЫа и у 10 детей с Т-ОЛЛ применяли неларабин с сочетании с другими цитостатиками. Флударабин-

____А

содержащие схемы: РЬАО[флударабин(РЬ) ЗОмг/м /день, в/в, 5 дней; цитозар(А)

/у

2г/м /день, в/в, 5дней и Г-КСФ(О) 3-5мкг/кг/день, п/к, ежедневно, начиная за 1 день до ХТ] и РЬАО-Ма [флударабин 30мг/м2/день,в/в, 4дня; цитозар 2г/м2/день, в/в, 4дня; идарубицин(Ма) 12мг/м2/день, в/в, Здня и Г-КСФ 5мкг/кг/день, п/к, ежедневно, начиная за 1 день до ХТ]. Неларабин применялся в комбинации:

(блоки HR 5 [неларабин 650 мг/м в/в , 5дней; циклофосфан 200мг/м х 2 раза в день,в/в, Здня; дексаметазон -20 мг/м /сут, per/os или в/в, 5 дней; PEG-аспарагиназа 1 ООО Ед/м2,в/в,однократно] и HR 6 [неларабин 650 мг/м2, в/в, 5дней;

А М

цитозар ЗООмг/м , в/в х 2 раза в день, 3 дня; этопозид 150 мг/м , в/в, 3 дня; дексаметазон 20 мг/м2 /сут, per/os или в/в, 5 дней; PEG-аспарагиназа 1 000 ЕД/м2, в/в, однократно] протокола Москва-Берлин 2008 для резистентных Т-клеточных ОЛЛ), в качестве монотерапии неларабин использовался у 3 больных (650 мг/м2/д х 5 дней или 1500 мг/м2/д х 3 дня).

Таблица 2 - Иммунологический вариант и стадия ОЛЛ на момент проведения флударабин-, неларабинсодержащей терапии

Иммунологический вариант ОЛЛ Т-ОЛЛ п=15 В-ОЛЛ п=18 Итого

Схема ХТ FLAGilda Неларабин-содержащая FLAG±Ida

Стадии ОЛЛ

Первично- резистентное течение 1 3 2 6

1ранний резистентный рецидив 2 3 6 11

2 рецидив 1 2 9 12

3 рецидив 1 2 1 4

Итого 5 10 18 33

Параллельно назначению курсов химитерапии у всех пациентов проводился поиск неродственного донора. Алло-ТГСК выполнена у 24 больных в сроки от 2 до 8 месяцев от начала противорецидивной терапии. На момент алло-ТГСК ремиссия диагностирована у 11 пациентов, в состоянии рецидива находилось 13 больных. Схема РЬАСЬЬЫа применялась у 18 пациентов (с В-ОЛЛ-у 15 детей и подростков, с Т-ОЛЛ - у 3 больных), неларабинсодержащея терапия -у 6 человек с Т-ОЛЛ. Родственная совместимая алло-ТГСК проведена у 3

больных, неродственная совместимая - у 8 пациентов, гаплоидентичная - у 13 детей и подростков. Миелоаблативные режимы кондиционирования применялись у 14 пациентов, режимы со сниженной интенсивностью доз у 10 человек.

2.2. Проведение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток крови у детей и подростков с острым лимфобластным

лейкозом высокой группы риска

Решение о проведении алло-ТГСК у каждого пациента принимал консилиум, на котором присутствовал больной и его законные представители (родители или опекуны). Показаниями для выполнеия алло -ТГСК у детей и подростков с OJIJI группы высокого риска являются (Pulsipher М., 2011): В 1 ремиссии:

1. Отсутствие ремиссии после индукции;

2. Неблагоприятные хромосомные нарушения: t(4;ll), t(9;22) Ph-позитивный OJIJI, гиподиплоидия (<44 хромосом).

Во 2 ремиссии:

1. Ранний костномозговой рецидив (до 36 мес после постановки OJIJI, или менее 6 мес после окончаний терапии) или комбинированный рецидив с высоким уровнем МОБ после индукции;

2. Любой сверхранний рецидив;

3. Поздний костно-мозговой рецидив. В 3 ремиссии - все виды рецидива.

После определения показаний к проведению алло-ТГСК для каждого пациента выполняли типирование HLA-антигенов реципиента и членов его семьи серологическим методом (до 2007 года), при помощи специальных иммунных сывороток в стандартном двухступенчатом комплемент-зависимом лимфоцитотоксическом тесте. При совпадении пары донор-реципиент подтверждающее молекулярно-биологическое типирование локусов I (А, В и С) и II (DR, DQ, DP) классов проводили с использованием реактивов фирмы "Protrans"

в лаборатории тканевого типирования НИИ ДОГиТ им.Р.М.Горбачевой. Типирование HLA-системы осуществлялось молекулярно-биологическим методом - полимеразной цепной реакцией с сиквенс-специфическими праймерами (PSR-SSP) с использованием наборов-реагентов фирмы «Protrans» низким разрешением и от среднего к высокому. Визуализацию продуктов, полученных в результате полимеразной цепной реакции, проводили посредствам электрофореза в горизонтальном 2% агарозном геле. Интерпретацию результатов осуществляли с помощью таблиц, прилагаемых к набору праймеров.

При выявлении HLA-идентичного донора в семье пациента (брат, сестра, отец, мать) проводили родственную алло-ТГСК.

Заготовку, оценку, криоконсервирование гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (ГСК КМ) или периферической крови (ПСКК) проводили в отделении сепарации и криоконсервации клиники НИИ ДОГиТ им. Р.М.Горбачевой» ПСПбГМУ им акад. И.П.Павлова.

Концентрат ПСКК получали методом лейкафереза (ЛФ) с использованием фракционатора крови - СОВЕ SPECTRA (GAMBRO) . Процедуре ЛФ предшествовали различные протоколы «мобилизации»-применение рекомбинантных ростовых факторов (Г-КСФ), которые увеличивают количество гемопоэтических клеток, циркулирующих в периферическом русле. Стимуляцию кроветворения донора перед аферезом осуществляли с помощью «Граноцита» или «Нейпогена» в дозе и 5 мкг/кг, п/к, 2 раза в день в течение 3-5 дней. Оптимальное время начала ЛФ определяли по содержанию CD34 позитивных клеток в периферической крови- не менее 20 в 1 мкл крови.

Костномозговую взвесь, содержащую ГСК, получали во время операции миелоэксфузии в условиях операционной под общим эндотрахеальным наркозом, путем множественных пункций костномозговых полостей гребней подвздошных костей. Аспирацию миеловзвеси проводили в шприц, содержащий антикоагулянт (гепарин), а затем переводили в пластиковый контейнер, емкостью 450 мл («Гемакон», Therumo»). Общий объем аспирата не превышал 15-20 мл/ кг массы тела (не более 15% ОЦК). С целью уменьшения риска развития анемии

после миелоэксфузии выполняется фракционирование костного мозга с последующей реинфузией аутоэритроцитов.

Оценку полученных трансплантатов ГСК проводили по следующим показателям:

- общее количество лейкоцитов определяли методом световой микроскопии в камере Горяева;

- содержание CD34+ клеток оценивали методом проточной цитофлуориметрии на аппарате FACSCalibur («Becton Dickinson», США) по протоколу ISHAGE с использованием моноклональных антител к CD45, CD34 и ДНК красителя 7-AAD;

- для определения функциональной активности ГСК - использовали метод культивирования клеток в полутвердой среде на основе метилцеллюлозы («MethoCult», «StemCell Technologies», Canada) с подсчетом количества колониеобразующих единиц (КОЕ) через 14 дней экспозиции в условиях СО2 инкубатора при температуре 37°С.

С помощью иммуномагнитных методов выделения (CliniMACS) проводилась клеточная селекция ГСК для гаплоидентичной алло-ТГСК и выделение субпопуляции лимфоцитов и NK-клеток для иммуноадоптивной терапии.

Всех реципиентов и родственных доноров ГСК обследовали, используя техническое оснащение лабораторий ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова.

Для пациентов, не имеющих HLA-совместимых родственников, поиск неродственных доноров осуществляли в международной базе данных доноров ГСК.

Инфузия ГСК проводилась через центральный венозный катетер после премедикации и гидратации пациента с применением системы для переливания гемокомпонентов. У детей младшего возраста инфузия ГСК проводилась через инфузомат со скоростью введения не более 10-15 мл/кг/ч.

Оценка восстановления клеточного звена иммунной системы реципиента после алло-ТГСК проводили методом проточной цитофлуориметрии с помощью

специфических моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, CD45 на аппарате FACSCalibur и FACSAria фирмы «Beckton Dickinson», США. Материалом для исследования служила периферическая кровь пациентов на 14, 30, 45,60 день после трансплантации.

После алло-ТГСК, два раза в неделю, с целью контроля дозы проводили определение уровня циклоспорина А или такролимуса в плазме крови иммунологическим методом с использованием реактивов фирмы «Abbot».

Исследование донорского химеризма проводилось с использованием высокополиморфных маркеров - коротких тандемных повторов (short tandem repeat, STR), некодирующих последовательностей ДНК.

Минимальная остаточная болезнь (МОБ) определялась двумя методами: проточная цитофлуориметрия и молекулярно-биологическое выявление химерных генов.

Осложнения (РТПХ, инфекционные, мукозит, геморрагический цистит, токсическое поражение печени, ЦНС и почек) после алло-ТГСК оценивались у пациентов, у которых состоялось приживление донорских гемопоэтических стволовых клеток.

Признаками приживления трансплантата, согласно критериям ЕВМТ 2012, является сохранение в периферической крови реципиента:

- абсолютного числа гранулоцитов 0,5x10% и более на протяжении трех последующих дней при условии отсутствия стимуляции кроветворения реципиента с помощью ростовых факторов;

- абсолютного числа тромбоцитов 50,0 х109/л и более на протяжении трех последующих дней при условии отсутствия заместительных трансфузий гемокомпонентов.

2.2.1. Сравнение различных режимов кондиционирования при родственной и неродственной алло-ТГСК В группу исследования эффективности алло-ТГСК в зависимости от интенсивности режима кондиционирования включены 118 пациентов с прогностически неблагоприятными формами ОЛЛ, получивших родственную или неродственную алло-ТГСК с 2000 по 2011 год. Режимы кондиционирования сниженной интенсивности доз на основе флударабина фосфата применили у 36 больных: родственные алло-ТГСК провели 8 (22%) больным, неродственные — 28 (78%) пациентам. Миелоаблативные режимы кондиционирования использовали у 82 больных, среди них аллоТГСК от родственных доноров проведены 28 (34%) пациентам, от неродственных доноров - 54 (66%) пациентам (Рисунок 1).

В группу с РИК вошли пациенты, у которых проведение миелоаблативного режима кондиционирования не было возможно ввиду ожидаемой высокой летальности, ассоциированной с трансплантацией. Показания для выполнения алло-ТГСК с РИК:

• Общее состояни при оценке индекса Карновского (Ланского)<80% вследствие высокой «предлеченности» (количество курсов предшествующей химиотерапии более 10);

• Непереносимость и тяжелые осложнения при проведении цитостатической терапии в анамнезе: побочные эффекты, токсичность, инфекционные осложнения;

• Инфекционные осложнения на момент проведения алло-ТГСК (например, инвазивный аспергиллез);

• Ауто-ТГСК в анамнезе.

Все пациенты, алло-ТГСК которым выполнена в 1 ремиссии, имели крайне неблагоприятный прогноз: врожденный лейкоз, t(9;22) в период до внедрения в клиническую практику ингибиторов тирозинкиназ, t(4;ll), отсутствие ремиссии после индукционной терапии и/или высокий уровень МОБ (>10"3) (у пациентов с bcr/abl или MLL/AF4).

100%

Режимы сниженной интенсивности

миелоаблативные режимы

инеродственн

Рисунок 1 - Распределение пациентов в зависимости от типа донора и интенсивности режима кондиционирования

Распределение реципиентов по возрасту. Средний возраст пациентов составил 12,5 лет (от 1 до 21 года). В группу пациентов, у которых провели РИК алло-ТГСК, включено 20 (62,5%) детей (2-13 лет) и 16 (37,5%) подростков (1421 лет). Среди пациентов с миелоаблативным режимом кондиционирования было 46 (56%) детей (1-13 лет) и 36 (44%) подростков (14-21 лет) (Рисунок 2).

100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00%

режимы миелоаблативные

сниженной режимы

интенсивности

■ подростки □дети

Рисунок 2 - Распределение пациентов в зависимости от возраста и интенсивности

режима кондиционирования.

Распределение пациентов по полу. В исследование включено 74 мальчиков и 44 девочек. В группе пациентов, которым провели РИК алло-ТГСК, было 19 (53%) мальчиков и 17 (47%) девочек. Среди пациентов после МАК алло-ТГСК мальчиков - 55 (67%), девочек - 27 (33%) (Рисунок 3).

■ девочки □ мальчики

100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00%

режимы сниженной интенсивности

Рисунок 3 - Распределение пациентов в зависимости от пола и интенсивности

режима кондиционирования

Распределение пациентов в зависимости от стадии заболевания на момент алло-ТГСК. В исследование были включены пациенты с различными стадиями ОЛЛ на момент алло-ТГСК.

В группе пациентов, которым провели алло-ТГСК с РИК, было 5 (13,5%) больных в 1 ремиссии [у 1-го ребенка - врожденный ОЛЛ и отсутствие ремиссии после индукционной терапии, у 4 пациентов - высокий уровень МОБ (> 10" ), у 2 из них РЬ+], 18 (50%) пациентов - во 2 ремиссии, 2 (5,5%) больных - в 3 ремиссии, 1 (3%) ребенок - в 4 ремиссии, 2 (5,5%) больных - в 1 рецидиве, 4 (11%) пациента - во 2 рецидиве, 2 (5,5%) больных - в 3 рецидиве, по 1 (3%) ребенку - в 5 рецидиве и с первично-резистентным течением (Рисунок 4).

n=1

n=2

пер-резист; n=l

I ремиссия; n=5

II рецидив; I рецидив; n=2

VI ремиссия; n=l

III ремиссия; n=2

II ремиссия; n=18

Рисунок 4 - Распределение пациентов с РИК алло-ТГСК в зависимости от стадии

заболевания

Алло-ТГСК с использованием миелоаблативных режимов кондиционирования провели 11 (14%) пациентам в 1 ремиссии [3 больным с РЬ+ОЛЛ и высоким уровнем МОБ, 1 ребенку с РЬ+ОЛЛ и отсутствие ремиссии после индукционной терапии, 2 пациентам с врожденным ОЛЛ с 1(4; 11), 5 больным с отсутствием ремиссии после индукционной терапии], 34 (41%) больным - во 2 ремиссии, 8 (10%) пациентам - в 3 ремиссии, 1 (1%) ребенку - в 4 ремиссии, 5 (6%) больным - в 1 рецидиве, 14 (17%) пациентам - во 2 рецидиве, 5 (6%) больным - в 3 рецидиве, 1 (1%) ребенку - в 4 рецидиве и 3 (4%) пациентам с первично-резистентным течением ОЛЛ (Рисунок 5).

Таким образом, суммируя данные по стадиям, у 23 (64%) пациентов на момент проведения алло-ТГСК с РИК была 1 или 2 ремиссия, у 13 (36%) больных - другие стадии заболевания. В группе с миелоаблативными режимами кондиционирования 45 (55%) пациентов находились в 1или 2 ремиссии и 37 (45%) пациента - в других стадиях заболевания (Рисунок 6)

II рецидив;

пер-резист; п=3

III рецидив; п=5

1 ремиссия; п=11

I рецидив;

IV ремиссия; п=1

III ремиссия; п=8

II ремиссия; п=34

Рисунок 5 - Распределение пациентов с МАК алло-ТГСК в зависимости от стадии

заболевания

режимы сниженной миелоаблативные интенсивности режимы

■ I или II ремиссия □ Вне 1-11 ремиссии

Рисунок 6 - Распределение пациентов в зависимости от стадии ОЛЛ на момент

алло-ТГСК и режима кондиционирования.

Осложнения (РТПХ, инфекционные, мукозит, геморрагический цистит, токсическое поражение печени, ЦНС и почек) после алло-ТГСК оценивались у пациентов, у которых состоялось приживление донорских гемопоэтических стволовых клеток (у 31 больного после алло-ТГСК с РИК и у 76 пациентов после алло-ТГСК с МАК).

Общее состояние пациентов на момент алло-ТГСК. Для оценки состояния пациентов использовали индекс Карновского (для подростков от 18 до 21 года) и индекс Ланского (для детей от 1 до 17 лет).

В группе пациентов, которым выполнена алло-ТГСК с РИК, было 29 (80,5%) больных с индексом Карновского (Ланского) < 80% и 7 (19,5%) детей с индексом > 80%. Большинство пациентов (94%) из группы МАК (п= 77) имели индекс > 80%. У четырех (5%) пациентов индекс составил 80%, и у одного - 70% (Рисунок 7).

100% 80% 60% 40% 20% 0%

режимы сниженной миелоаблативные режимы интенсивности

■ >80% 0^80%

Г ...... , 94% (0=77)

у / ¿6,594 (п=29)

У | 1 ; Л ■

У

к х—ИВ --- -1-----

Рисунок 7 - Индекс Карновского (Ланского) на момент выполнения алло-ТГСК с различными по интенсивности режимами кондиционирования

Источник ГСК и клеточность трансплантата при алло-ТГСК. У 60

(51%) больных источником ГСК был КМ, у 58 (49%) пациентов - ПСКК.

При проведении алло-ТГСК с РИК в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток у 21 (58%) пациентов использовали КМ, у 15 (42%) больных -ПСКК.

После миелоаблативных режимов кондиционирования трансплантация костного мозга выполнена 39 (48%) пациентам, трансплантация периферических стволовых клеток крови - 43 (52%) больным (Таблица 3).

Таблица 3 - Распределение пациентов при алло-ТГСК в зависимости от источника ГСК и режима кондиционирования

Режимы Сниженной Миелоаблативные

кондиционирования интенсивности

Источник ГСК п % п %

-КМ 21 58 39 48

-ПСКК 15 42 43 52

Всего 36 100 40 100

Клеточность трансплантата по СБ34+/кг веса реципиента при использовании костного мозга составила в среднем 4,8 (1,6-11,4) х106/кг веса реципиента. Медиана - 4,45 х106/кг веса реципиента.

Клеточность трансплантата по СБ34+/кг веса реципиента при использовании ПСКК составила в среднем 8,5 (2,4-20,5) х106/кг веса реципиента. Медиана - 7,6 х106/кг веса реципиента. (Таблица 4).

Таблица 4 - Количество СБ34+/кг веса пациента в зависимости от источника ГСК и интенсивности режима кондиционирования

Режимы Сниженной Миелоаблативные Р

кондиционирования интенсивности

Источник ГСК медиана Интервал Медиана интервал

-КМ 4,1 1,6-8,8 4.8 1,7-11,4 0,305

-ПСКК 7,2 2,4-19,8 7,7 2,4-20,5 0,674

В таблице 5 представлены данные о поле и возрасте доноров ГСК при выполнении алло-ТГСК от родственного и неродственного донора.

Таблица 5 - Характеристика доноров

Доноры Количество человек (%)

Режимы сниженной интенсивности Миелоаблативные режимы

Степень родства

Родственные 8 (22%) 28 (34%)

-сиблинг 8 (22%) 25 (30%)

- отец - 2 (3%)

- мать - 1 (1%)

Неродственные 28 (78%) 54 (66%)

Пол

- мужской 26 (72%) 48 (58,5%)

- женский 10 (28%) 34 (41,5%)

Возраст

- до 40 лет 32 (89%) 73 (89%)

- старше 40 лет 4(11%) 9(11%)

Совпадение по группам крови ABO в парах донор-реципиент

Возможные варианты несовместимости по ABO группам крови, которые наблюдаются при алло-ТГСК:

- большая несовместимость - аллоагглютинины анти-А, -В или -АВ к донорским эритроцитам определяются в плазме реципиента (реципиент с 0(1) группой крови, донор со А(И), B(III) или AB(IV) группой крови);

- малая несовместимость - аллоагглютинины анти-А,-В или -АВ к эритроцитам реципиента определяются в плазме донора (реципиент со А(П), В(Ш) или AB(IV) группой крови, донор с 0(1) группой крови);

- комбинированная (двунаправленная) несовместимость - аллоагглютинины выявляются и в плазме реципиента, и плазме донора.

В зависимости от совпадения групп крови ABO в парах донор-реципиент пациенты разделены на четыре группы (Таблица 6):

- совместимые - 50 пар;

- большая несовместимость-17 пар;

- малая несовместимость — 26 пары;

- комбинированная несовместимость - 25 пара.

Таблица 6 - Совпадение по группам крови в парах донор-реципиент

Совместимость по группам Режимы сниженной Миелоаблативные

крови интенсивности режимы

п % п %

Совместимые 16 44,5 34 41

Большая 4 11 13 16

несовместимость

Малая 9 25 17 21

несовместимость

Комбинированная Несовместимость 7 19,5 18 22

Всего 36 100 82 100

Режимы кондиционирования со сниженной интенсивности доз на основе флударабина фосфата проведены у 36 больных:

- флударабин (Flu, 150 мг/м ) в комбинации с бусульфаном (Ви, 8 мг/кг) + АТГ (АТГАМ, Pfizer, 60 мг/кг или Тимоглобулин, Genzime, 7,5 мг/кг или АЛГ, Fresenius, 40мг/кг);

14 А _____ _____

- флударабин (Flu, 150 мг/м ) с мелфаланом (Mel, 140 мг/м )± АТГ (АТГАМ, Pfizer, 60 мг/кг или Тимоглобулин, Genzime, 7,5 мг/кг или АЛГ, Fresenius, 40мг/кг).

Миелоаблативные режимы кондиционирования использовали у 82 больного:

- бусульфан (Ви, 16 мг/кг) и циклофосфан (Су, 120 мг/кг) ± АТГ (АТГАМ, Pfizer, 60 мг/кг или Тимоглобулин, Genzime, 7,5 мг/кг или АЛГ, Fresenius, 40мг/кг);

- треосульфан (Тгео, 36-42 г/м2) и циклофосфан (Су, 120 мг/кг) ± АТГ (АТГАМ, Pfizer, 60 мг/кг или Тимоглобулин, Genzime, 7,5 мг/кг или АЛГ, Fresenius, 40мг/кг).

В таблице 7 представлены данные о распределении пациентов в зависимости от интенсивности режима кондиционирования.

Таблица 7 - Распределение пациентов при алло-ТГСК в зависимости от интенсивности режима кондиционирования.

Режимы Режимы сниженной Миелоаблативные

кондиционирования интенсивности режимы

п % п %

Flu+Bu+ATG 17 47 - -

Flu+Mel±ATG 19 53 - -

Bu+Cy±ATG - - 71 87

Treo+Cy±ATG - - 11 13

Всего 36 100 82 100

Профилактику острой РТПХ проводили с использованием различных комбинаций препаратов - циклоспорина А (ЦсА), такролимуса (Тс), метотрексата (MTX), глюкокортикостероидов (ГКС) и микофенолат мофетила (Селл-септ) (ММФ).

У пациентов, включенных в исследование, использовали следующие режимы профилактики острой РТПХ: на основе ЦсА - у 82 (69,5%) больных, на основе такролимуса - 36 (30,5%) (Таблица 8).

Таблица 8 - Распределение пациентов в зависимости от режимов профилактики РТПХ при алло-ТГСК с различными режимами

Режимы Сниженной Миелоаблативные

кондиционирования интенсивности

Режим профилактики п % п %

- ЦсА+МТХ 17 47 32 39

- ЦсА+МТХ+Пред 0 - 18 22

- ЦсА+ММФ 2 5,5 8 10

-ЦсА 2 5,5 3 4

- Такролимус+ММФ 15 42 17 20

- Такролимус+МТХ 0 - 4 5

Всего 36 100 82 100

Циклоспорин А (ЦсА) вводили парентерально (в/в) в дозе 3 мг/кг, такролимус применялся в дозе 0,03 мг/кг с Д-1 и далее в зависимости от уровня препарата в плазме крови. При появлении признаков приживления и отсутствии осложнений со стороны ЖКТ дальнейший прием препаратов продолжали перорально. Пациенты принимали ингибиторы кальценеврина в среднем до

Д+150-Д+180 после алло-ТГСК вне зависимости от стадии на момент алло-ТГСК и наличия признаков РТПХ. При отсутствии клинических проявлений острой РТПХ проводили постепенное снижение дозы препарата вплоть до полной отмены.Метотрексат (MTX) вводили парентерально (в/в) в Д+1, Д+3 и Д+6 в дозе 5 мг/м . Микофенолат мофетила (Cell-Cept) применяли с Д+1 до Д+30 в дозе

л

500мг/м , р.о.

Таблица 9 - Характеристики пациентов, которым выполнили алло-ТГСК с

различными по интенсивности режимами кондиционирования

Параметры МАК п (%) РИК п(%) Р

Количество пациентов 82 36

Возраст средний (интервал) 12,5 лет (1-21 год) 12,3 лет (2-21 год) 0,987

1-17 лет 60 (73%) 27 (75%)

18-21 год 22 (27%) 9 (25%)

Индекс Карновского (Ланского): 0,000

< 80% 5 (6%) 29 (80,5%)

>80% 77 (94%) 7 (19,5%)

Стадия ОЛЛ на момент алло-ТГСК: 0,421

1ПКГР 11 (3 МОБ*) 14% 5(4 МОБ*) 13,5%

2ПКГР 34 (41%) 18 (50%)

Вне 1 или 2 ремиссии 37 (45%) 13 (36,5%)

Тип донора: 0,278

Родственный 28 (34%) 8 (22%)

Неродственный 54 (66%) 28 (78%)

Источник ГСК: 0,321

КМ 39 (48%) 21 (58%)

ПСКК 43 (52%) 15 (42%)

Профилактика оРТПХ: 0,112

Циклоспорин А+ 61 (75%) 21 (58%)

Такролимус 21 (25%) 15 (42%)

*-высокий уровень минимальной остаточной болезни (молекулярно-

биологический рецидив).

В сводной таблице 9 представлены характеристики групп пациентов, которым выполнена алло-ТГСК с РИК и МАК. Группы являются однородными по всем показателям, кроме индекса Карновского (Ланского), что позволяет провести адекватный сравнительный анализ по оценке эффективности.

2.2.2. ТГСК у детей и подростков с РЬ-позитивным ОЛЛ

В исследовании оценены данные 22 пациентов с ОЛЛ, РЬ(+) в возрасте от 4 до 21 года (в среднем 12 лет), которым выполнены различные виды ТГСК с 1992 по 2011 год: неродственная (п=11), родственная (п=4), гаплоидентичная (п=4), аутологичная (п=3) (Таблица 10).

В исследование были включены пациенты с различными стадиями ОЛЛ на момент алло-ТГСК: 1 ремиссия наблюдалась у 9 (41%) (6 детей и подростков с молекулярно-биологическим рецидивом (МБР) больных; 2 ремиссия

- у 6 (27,5%) (1ребенок с МБР) пациентов; 3 ремиссия - у 2 (9%) детей; 2 рецидив

- у 2 (9%) детей; 4 рецидив - у 1 (4.5%) пациента и первично-резистентное течение - у 2 (9%) больных.

У пациентов, получивших ТГСК до 2008 года, в терапии не применяли ИТК (п=15). Комбинацию иматиниба с химиотерапией использовали для лечения рецидива перед алло-ТГКС у 5 больных. Двое пациентов с первично-резистентным течением до алло-ТГСК получали иматиниб в сочетании с цитостатическими препаратами. В связи с неэффективностью иматиниба, у этих пациентов в качестве второй линии применяли дазатиниб.

Таблица 10 - Основные характеристики пациентов с Ph-позитивным

ОЛЛ

Параметры сравнения Количество человек (%)

Количество больных 22

Возраст, средний (интервал): 12 лет (4-21)

Дети 1-13 лет 13 (59%)

Подростки 14-21 года 9 (41%)

Пол:

девочки 8 (36%)

мальчики 14 (64%)

Стадия заболевания:

1 ремиссия 9 (41%) (6 с МБР)

2 ремиссия 6 (27,5%) (1 с МБР)

3 ремиссия 2(9%)

2 рецидив 2(9%)

4 рецидив 1(4,5%)

Первично-резистентное течение 2(9%)

Терапия НТК до ТГСК:

проводилась 7 (32%)

не проводилась 15 (68%)

Источник ГСК

КМ 11 (50%)

ПСКК 8 (36%)

КМ+ПСКК 3 (14%)

Интенсивность режима

кондиционирования:

РИК 5 (23%)

МАК 17 (77%)

Алло-ТГСК с использованием миелоаблативных режимов кондиционирования провели 17 (77%) пациентам:

- бусульфан 16мг/кг в комбинации с циклофосфаном 120мг/кг± АТГ (АТГАМ, Pfizer, 60 мг/кг или Тимоглобулин, Genzime, 7,5 мг/кг или АЛГ, Fresenius, 40мг/кг) применялся у 12 больных перед алогенными родственными и неродственными ТГСК,

- бусульфан 16мг/кг с циклофосфаном 2000мг/м2, цитозаром 4000мг/м2,

л

ломустин 250мг/м - у 2 детей перед гаплоидентичной ТГСК,

- бусульфан 16 мг/кг с циклофосфаном 120мг/кг и вепезитом - у 3 пациентов пред аутологичной ТГСК.

Режимы кондиционирования сниженной интенсивности доз на основе

<ч

флударабина фосфата (Flu, 150 мг/м ) в комбинации с бусульфаном (Ви, 8 мг/кг) или мелфаланом (Mel, 140 мг/м2)± АТГ (АТГАМ, Pfizer, 60 мг/кг или Тимоглобулин, Genzime, 7,5 мг/кг или АЛГ, Fresenius, 40мг/кг) проводились у 5(27%) больных.

У 11 (50%) больных источником ГСК был КМ, у 8 (36%) пациентов -ПСКК, у 3 (14%) детей - ПСКК+КМ.

Профилактику острой РТПХ после алло-ТГСК осуществляли с использованием различных комбинаций препаратов - циклоспорина А (ЦсА), такролимуса (Тс), метотрексата (MTX), глюкокортикостероидов (ГКС) и микофенолат мофетила (Селл-септ) (ММФ).

У пациентов, включенных в исследование, использовали режимы профилактики острой РТПХ: на основе ЦсА - у 14 (74%) больных, на основе такролимуса - у 5 (26%).

2.2.3. Гаплоидентичная ТГСК при рефрактерном течении ОЛЛ у детей

и подростков

Эффективность гаплоидентичной алло-ТГСК у детей и подростков с рефрактерным течением ОЛЛ проанализирована у 28 пациентов. Длительность наблюдения составила в среднем 10 месяцев (интервал 1-40 месяцев). Определяющими показаниями к проведению гаплоидентичной алло-ТГСК были отсутствие совместимого родственного или неродственного донора или времени, необходимого на поиск неродственного совместимого донора, ввиду прогрессии заболевания. Подробная характеристика пациентов представлена в таблице 11.

Средний возраст пациентов составил 9,8 лет (1-21 год). Детей (до 14 лет) было 19 (68%) человек, подростков (от 14 до 21 года) - 9 (32%) больных.

Среди пациентов, которым выполнили гаплоидентичную алло-ТГСК 8 (28,5%) больных были с Т-клеточным вариантом ОЛЛ и 20 (71,5%) больных с В-клеточным ОЛЛ. У 5 (18%) детей на момент гаплоидентичной алло-ТГСК был 1

резистентный рецидив, у 12 (43%) пациентов - 2 рецидив, у 7 (25%) больных - 3 рецидив, первично-резистентное течение - у 4 (14%) детей.

Таблица 11 - Общая характеристика пациентов при гаплоидентичной алло-

ТГСК

Параметры сравнения Количество человек(%)

Количество больных 28

Возраст, средний (интервал): 9,8 лет (1-21)

Дети 1-13 лет 19 (68%)

Подростки 14-21 года 9 (32%)

Пол:

девочки 12 (43%)

мальчики 16 (57%)

Иммунологический вариант ОЛЛ:

Т-клеточный 8 (28,5%)

В-клеточный 20 (71,5%)

Стадия заболевания:

1 рецидив 5 (18%)

2 рецидив 12 (43%)

3 рецидив 7 (25%)

Первично-резистентное течение 4 (14%)

Предтрансплантационная циторедуктивная

терапия:

проводилась 17 (60,5%)

не проводилась 11 (39,5%)

Донор:

мать 23 (82%)

отец 5 (18%)

Несовместимость по НЬА-системе 3/6 28 (100%)

Интенсивность режима кондиционирования:

РИК 11 (39,5%)

МАК 17 (60,5%)

Профилактика РТПХ:

Циклоспорин-содержащие схемы 21 (75%)

Такролимус-содержащие схемы 7 (25%)

Пострансплантационная превентивная

терапия:

проводилась 13 (46,5%)

не проводилась 15 (53,5%)

Циторедуктивная химиотерапия перед гаплоидентичной алло-ТГСК была выполнена 17 (60,5%) пациентам. Для уменьшения опухолевой массы применялись резервные схемы (чаще FLAG).

У 23 (82%) пациентов в качестве донора была мать, у 5 (18%) - отец.

Комбинированный трансплантат с использованием стимулированных ГСК КМ и стимулированных, манипулированных ПГСК использовался у 15 (53,5%) больных, стимулированный неманипулированный костный мозг трансплантирован 13(46,5%) пациентам. При заготовке костного мосга все гаплоидентичные доноры с целью стимуляции получали подкожно Г-КСФ в дозе 5мг/кг/день в течение 3 дней. На третий день производили миелоэксфузию гаплоидентичного костного мозга в условиях стерильной операционной. При трансплантации комбинированного трансплантата гаплоидентичный донор получал стимуляцию Г-КСФ в той же дозе 4 последующих дня. На пятый (при необходимости шестой) день при помощи СОВЕ Blood Cell Separator (Spectra LRS, СОВЕ BCT Inc., Lakewood, CO, USA) производился аферез ПГСК. После афереза ПГСК подвергались позитивной селекции С034+клеток при помощи аппарата CliniMACS (Miltenyi Biotec).

В качестве предтрансплантационной подготовки миелоаблативный режим кондиционирования (МАК) применяли у 17 (60,5%) пациентов, у 11 (39,5%) больных - режим кондиционирования со сниженной интенсивностью доз (РЖ).

В режиме кондиционирования со сниженной интенсивностью доз у 7

А __

пациентов использовали флударабин (Flu, 150мг/м )+бусульфан (Ви, 8мг/кг); у 3

А А

больных - флударабин (Flu, 150 мг/м )+мелфалан (Mel, 140мг/м ), у одного

>ч

ребенка - флударабин (Flu, 150 мг/м )+циклофосфан (Су, 120мг/кг). В качестве миелоаблативного режима кондиционирования у 17 пациентов применяли бусульфан (Ви, 16мг/кг)+циклофосфан (Су, 2000мг/м2)+цитозар (Ага-С, 4000мг/м2)+ломустин (CCNU, 250мг/кг).

Всем пациентам проводили профилактику реакции «трансплантат против хозяина». У 27 пациента (96%) в режим кондиционирования был включен

антитимоцитарный глобулин (АТГАМ, бОмг/кг), 1 ребенок (4%) получил алемтузумаб (Кэмпас, 1,2мг/кг). Базовую иммуносупрессивную терапию на основе циклоспорина А (ЦсА, Змг/кг/день) получили 21 пациент (75%), такролимус (Тс, 0,03мг/кг/день) использовали у 7 больных (25%).

2.2.4 Превентивная терапия и терапия рецидивов ОЛЛ после алло-

ТГСК

В анализ включено 131 пациентов, которым выполнена алло-ТГСК с ноября 2000 г. по декабрь 2011 г. У всех больных отмечалось приживление донорских ГСК.

Совместимая родственная алло-ТГСК выполнена у 29 больных, неродственная - у 78 пациентов, гаплоидентичная родственная - у 24 детей и подростков с ОЛЛ, высокого риска. Для сравнительного анализа пациенты были разделены на две группы:

- пациенты, получившие превентивную терапию (п= 16),

- больные, получившие терапию рецидива ОЛЛ (п=47).

В качестве превентивной терапии и терапии рецидивов после алло-ТГСК использовалась цитостатическая и иммуноадоптивная терапия в различных комбинациях.

Превентивная терапия для предотвращения рецидива проводилась 16 (12%) пациентам. В клинике применялось три вида терапии: иммуноадоптивная (инфузии донорских лимфоцитов ± цитокины ± таргетные препараты), таргетная терапия у пациентов с РЬ+ ОЛЛ и поддерживающая химиотерапия. Показанием для проведения превентивной терапии были:

- снижение уровня донорского химеризма;

- появление и нарастание уровня МОБ (^Ю"4).

Десять пациентов получили ИДЛ (монотерапией или в комбинации с таргетными препаратами). Три пациента с РЬ-позитивным ОЛЛ получили в качестве монотерапии ИТК (иматиниб или дазатиниб) в связи с возникновение молекулярно-биологического рецидива.

Химиотерапия (6-МП+метотрексат в поддерживающих дозах) с превентивной целью проведена 3 больным в связи с появлением и нарастанием МОБ.

Терапия рецидивов проводилась 47 пациентам, у которых развился рецидив ОЛЛ после алло-ТГСК.

У большинства пациентов (п=29) для лечения рецидива ОЛЛ применялись инфузии донорских лимфоцитов после отмены иммуносупрессивной терапии в сочетании с химиотерапией (п=27) и без XT (п=2).

В качестве иммуноадоптивной терапии у двоих пациентов выполнена ранняя отмена иммуносупрессивной терапии без дополнительных лечебных воздействий.

Химиотерапия без дополнительных иммуноадоптивных воздействий применялась у 11 больных (у 7 пациентов - FLAG, у 4 детей - блоки для ОЛЛ одного из вариантов противорецидивного протокола BFM).

Повторная алло-ТГСК (без предшествующей терапии) выполнена у 5 детей (гаплоидентичная алло-ТГСК - у 3 пациентов, совместимая родственная от другого донора - у 1 подростка, неродственная от того же донора - у 1 ребенка).

Применение ИДЛ у пациентов с ОЛЛ. Инфузия донорских лимфоцитов в качестве превентивной терапии проведена у 10 больных (монотерапия ИДЛ - 8 пациентам, ИДЛ в сочетании с иматинибом - 1 больному, ИДЛ с комбинации с интерлейкином-2 - 1 ребенку). Начальная доза лимфоцитов по CD3+ для превентивной терапии составила от 1,0 х104 до 1,0 х108/кг (медиана 5,0x105) веса

A Q У'

пациента, суммарная доза - от 1,0 х10 до 1,0 х10/кг (медиана 1,5x10 ) веса пациента. Одно введение получили 4 пациента, 2 введения - 3 пациента, 3-6 инфузий - 3 пациента. Показаниями для превентивного назначения инфузии донорских лимфоцитов были:

- снижение уровня донорского химеризма (п=7);

- нарастающий уровень МОБ (п=3).

Для лечения рецидива ИДЛ применяли (п=29):

- в качестве монотерапии у 2 пациентов;

- в сочетании с химиотерапией - у 19 больных (перед ИДЛ в качестве XT применяли схему FLAG у 16 пациентов, другие схемы - у 3 детей);

- в комбинации с химиотерапией и последующей повторной алло-ТГСК — у 8 пациентов.

Начальная доза донорских лимфоцитов (CD3+) составила от 1,0 х104 до 1,0 х108/кг веса пациента (медиана — 8,0x105). Суммарная доза — 1,0 х104 —2,0 х108/на кг веса пациента (медиана - 2,0 хЮ6).

Шестнадцать пациентов получили одно введение донорских лимфоцитов, 11 больных - 2 введения, два пациента - 3 введения.

В случае доступности донора (родственный донор), концентрат донорских лимфоцитов получали из периферической крови донора методом лейкафереза с использованием клеточных фракционаторов с постоянным током крови: СОВЕ Spectra (Cardian ВСТ), либо путем ручного фракционирования с использованием метода седиментации с гидроксиэтилкрахмалом. Предварительная стимуляция донора не проводилась, при необходимости часть концентрата замораживалась и использовалась в дальнейшем в размороженном виде при необходимости повторных ИДЛ.

В случае выполнения алло-ТГСК от неродственного донора, когда источником гемопоэтических стволовых клеток являлась периферическая кровь, в соответствии с протоколом, часть мобилизованного трансплантата замораживалась в качестве концентрата донорских лимфоцитов. Таким образом, реципиенты алло-ТГСК от неродственного донора получали ИДЛ из размороженного образца периферической крови мобилизованного донора.

Если источником гемопоэтических клеток был костный мозг неродственного донора, то при необходимости введения донорских лимфоцитов, проводился повторный запрос в Международный регистр. При согласии донора выполнялся лейкоферез. Полученный нативный концентрат донорских лимфоцитов доставляли в клинику для последующего введения реципиенту.

2.2.5. Определение МОБ и донорского химеризма у детей и подростков с OJIJI высокого риска после алло-ТГСК

В исследование по изучению МОБ включены 32 пациента от 1 до 21 года с ОЛЛ, которым была выполнена алло-ТГСК. МОБ определялась методами:

- проточная цитофлуориметрия;

- молекулярно-биологическое выявление химерных генов (BCR-ABL, TEL-

AML1 (ETV6-RUNX1 ), MLL-AF4 и SIL-TAL 1).

Определение МОБ проводили до алло-ТГСК и после трансплантации на 30, 60, 180 и 365 дни. В качестве материала для исследования использовали костный мозг или периферическую кровь. Методом проточной цитофлуориметрии на аппарате FACSCalibur и FACSAria (фирмы «Beckton Dickinson», США) исследовано 145 проб, с целью выявления аберрантного иммунофенотипа, который представляет собой одновременную экспрессию антигенов различных линий дифференцировки, не встречающихся в норме. Также проводили выявление иммунофенотипического профиля B-лимфоцитов по комбинации маркеров CD45/CD19/CD10/CD20/CD34/CD38/CD22 и сравнение его с иммунофенотипическим профилем гематогонов (нормальных созревающих В-лимфоцитов костного мозга).

У 19 пациентов выявлены различные хромосомные поломки, что позволило определять у них уровень МОБ молекулярно-биологической детекцией продуктов экспрессии химерных генов, таких как В CR-ABL, TEL-AML1(ETV6-RUNX1), MLL-AF4 и SIL-TAL l(Gabert J.,2003). При этом проводилась количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), в качестве базовой применялась система с использованием зондов TaqMan, амплификация и визуализация результатов осуществлялись на амплификаторе IQ5 (BioRad, США). Положительным значением МОБ считалось >10'4.

Исследование донорского химеризма проводилось у 69 пациентов на 15, 30-45, 60, 120, 365 дни после алло-ТГСК с использованием высокополиморфных маркеров - коротких тандемных повторов (short tandem repeat, STR), некодирующих последовательностей ДНК, позволяющих, благодаря уникальному

для каждого человека сочетанию длин повторов, выполнить идентификацию донорских клеток в биоматериале пациента после алло-ТГСК. Визуализация и полуколичественная оценка продуктов ПЦР осуществлялась методом капиллярного гельэлектрофореза на секвенаторе ABI3100 (Life Technologies, США). Последовательности праймеров для детекции STR-локусов и методы оценки результатов были заимствованы из открытых литературных источников (Nollet F.,2001).