Роль PIK- киназ в клеточном ответе на ядрышковый и репликативный стрессы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Лужин Артем Васильевич

• Лужин Артем Васильевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Лужин Артем Васильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность работы

1.2 Цели и задачи

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

1.4 Положения, выносимые на защиту

1.5 Личный вклад автора

1.6 Методология и методы исследования

1.7 Степень достоверности и апробация результатов

1.8 Структура и объем работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 История открытия PIK-киназ

2.1.1 Открытие DNA-PK

2.1.2 Открытие ATM

2.1.3 Открытие ATR

2.2 Общие характеристики PIK-киназ

2.2.1. Структура

2.2.2. Субстратная специфичность

2.2.3. Аутофосфорилирование

2.2.4. Привлечение в сайты повреждений

2.3 Роль PIK-киназ в репарации двуцепочечных разрывов

2.3.1 ATM и гомологичная рекомбинация (HR)

2.3.2 DNA-PKcs - регулирует репарацию с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ)

2.3.3 Роль ATR в репарации ДЦР

2.4 PIK-киназы и репликативный стресс

2.4.1 Регуляция активации ориджинов

2.4.2 Реверсия вилки репликации

2.4.3 FANCD2- и BRCA-зависимые пути стабилизации реверсированной вилки репликации37

2.5 PIK-киназы и ядрышковый стресс

2.5.1 Общая характеристика и структура ядрышка

2.5.2 Ядрышко как сенсор стресса

2.5.3 Репрессия РНК-полимераза I-зависимой транскрипции при ДЦР в рибосомных генах

2

2.5.4 Формирование ядрышковых кэпов

2.5.5 Выбор пути репарации и репарация повреждений ДНК в рДНК

2.5.6 Репрессия рибосомной транскрипции при внеядрышковых ДЦР

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Разработка метода автоматического анализа данных, полученных с помощью электрофореза одиночных клеток

4.1.1 Общая характеристика разработанного подхода

4.1.2 Анализа распределения фаз клеточного цикла с помощью ДНК-комет

4.1.3 Анализ повреждений ДНК, индуцированных этопозидом, на различных стадиях клеточного цикла

4.2 Роль ATM и ATR в клеточном ответе на гипоосмотический стресс

4.2.1 Гипоосмотический стресс индуцирует зависимое от ATM и ATR фосфорилирование

гистона H2AX

4.2.2 Индуцированные гипоосмотическим стрессом сигналы о повреждении ДНК

локализуется в ядрышках

4.2.3 Гипоосмотический стресс индуцирует формирование R-петель в рибосомных генах ... 76 4.2.5 ATR - апикальная киназа при гипоосмотическом стрессе

4.3 Роль DNA-PKcs в клеточном ответе на репликативный стресс

4.3.2 Камптотецин (CPT) индуцирует активацию DNA-PKcs в S-фазных клетках

4.3.4 CPT индуцирует независимое привлечение DNA-PKcs и BRCA1 в сайты репликации ДНК

4.3.5 Активности DNA-PKcs и BRCA1 необходимы для обеспечения выживаемости клеток при репликативном стрессе

4.3.6 DNA-PKcs необходима для стабилизации вилок репликации при гипертермии

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРИМЕЧАНИЯ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ APH афидиколин - ингибитор эукариотических ДНК-полимераз

BrdU 5-бромо-2'-дезоксиуридин

CPT камптотецин - ингибитор ДНК-топоизомеразы I

DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол

DDR клеточный ответ на повреждения ДНК (от англ. DNA damage

response)

DMEM модифицированная Дульбекко среда Игла (от англ. Dulbecco modified

Eagle medium) DNA-PK ДНК-зависимая протеинкиназа EdU 5 -этинил-2' - дезоксиуридин

HR гомологичная рекомбинация (от англ. homologous recombination)

HU гидроксимочевина - ингибитор рибонуклеотидредуктазы

NHEJ негомологичное соединение концов ДНК (от англ. non-homologous

end joining) PBS фосфатно-солевой буфер

PIKK фосфатидилинозитол-3-киназа-подобные киназы

PMSF фенилметилсульфонилфторид

RPA белок репликации А (Replication protein A)

SIM микроскопия структурированного освещения

5 -FU 5 '-фторуридин

БСА бычий сывороточный альбумин

ДМСО диметилсульфоксид

ДЦР двухцепочечный разрыв ДНК

миРНК малые интерферирующие РНК

мРНК матричная РНК

ОЦР одноцепочечный разрыв ДНК

ПЦР полимеразная цепная реакция

рДНК рибосомная ДНК

т.п.н. тысяч пар нуклеотидов

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

оцДНК одноцепочечная ДНК

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль PIK- киназ в клеточном ответе на ядрышковый и репликативный стрессы»

1.1 Актуальность работы

Клетки живого организма постоянно подвергаются действию экзогенных (УФ-излучение, ионизирующая радиация) и эндогенных (активные формы кислорода, репликативный стресс) факторов, повреждающих макромолекулы. Действие этих факторов на клетку приводит, в частности, к появлению различных типов повреждений ДНК: одно- (ОЦР) и двуцепочечных разрывов (ДЦР), модификации азотистых оснований, ошибочно спаренных оснований и т.д. В последние годы было разработано большое количество методов регистрации таких повреждений, применяющихся в исследовательских и клинических целях.

Метод ДНК-комет (от англ. comet assay; также известен как гель-электрофорез одиночных клеток), впервые описанный Остлинг и Йоханссон в 1984 г., является одним из наиболее быстрых и чувствительных методов детекции повреждений ДНК на уровне одиночных клеток. Метод ДНК-комет используется в системах in vitro и in vivo, применяется в оценке генотоксичности фармацевтических и промышленных химических препаратов, изучении репарации ДНК, оценке эффективности противораковой терапии и т.д. Несмотря на название, электрофорез одиночных клеток оценивает средний уровень повреждений ДНК в клеточной популяции. Растущее число исследований, сконцентрированных на анализе одиночных клеток показали, что генетически одинаковые клетки, находящиеся в одних и тех же условиях, могут отличаться не только фенотипически, но и по уровню ответа на повреждение ДНК (Loewer and Lahav, 2011; Niepel et al., 2009). Такая вариабельность между клетками может быть результатом флуктуаций уровня мРНК, количества белка, популяционного контекста и др. Одним из основных факторов, влияющих на гетерогенность клеток в популяции, является

клеточный цикл. Поэтому разработка методов анализа повреждений ДНК в зависимости от фазы клеточного цикла, с одной стороны может быть полезным инструментом в исследовании механизмов ответа раковых клеток при химиотерапии, а с другой стороны может помочь более эффективно подбирать химиотерапевтические препараты в зависимости от типа клеток и соотношения фаз клеточного цикла в их популяции. Первая часть настоящей работы будет посвящена разработке такого подхода на основе метода ДНК-комет, и оптимизации программного обеспечения для анализа полученных с его помощью данных.

В ходе эволюции у клеток сформировались разнообразные механизмы репарации повреждений ДНК. Одними из ключевых участников таких механизмов являются фосфотидилинозитол-3-киназа-подобные киназы (PIK-киназы), в частности, ATR, ATM и каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs) (Chapman et al., 2012). PIK-киназы не только участвуют в распознавании повреждений ДНК и активации репарационных процессов, но и являются частью сигнальных каскадов, приводящих к остановке клеточного цикла (Walworth, 2000; Zannini et al., 2014). Самые разнообразные типы клеточного стресса индуцируют активацию PIK-киназ. Среди них генотоксические агенты, гипертермия, окислительный стресс, гипоксия и многие другие. Отнюдь не все из этих типов стрессов сопровождаются физическими повреждениями ДНК. Одним из примеров такого типа стресса является гипоосмотический шок. Было показано, что в условиях гипотонии происходит активация киназы ATM, однако до сих пор не было выяснено, какова же функциональная роль этого феномена (Bakkenist and Kastan, 2003; Baure et al., 2009). Поэтому во второй части работы мы сосредоточили своё внимание на исследовании механизмов и функционального значения активации PIK-киназ в условии гипоосмотического стресса. Эта работа позволит расширить наше

представление о фундаментальных механизмах, лежащих в основе реакции клеток на стресс и способах стрессовой адаптации.

PIK-киназы также участвуют в регуляции репликации ДНК. Аккуратное удвоение ДНК в S-фазе клеточного цикла позволяет передавать наследственную информацию без изменений от клетки к клетке. Однако, несмотря на то что репликация ДНК является высокоточным процессом, существуют ситуации, при которых репликация может быть нарушена. Такими ситуациями могут быть истощение пула нуклеотидов, повреждения ДНК, ингибирование компонентов реплисомы; все это может привести к замедлению или даже полной остановке репликативных вилок. Остановку или замедление репликативной машины определяют как «репликативный стресс» (Mijic et al., 2017; Moiseeva et al., 2019; Neelsen and Lopes, 2015; Olcina et al., 2013). Для предотвращения опасных последствий репликативного стресса в клетке предусмотрены различные механизмы. Классическим регулятором ответа на репликативный стресс является PIK-киназа ATR, которая инициирует каскад реакций, приводящих к остановке клеточного цикла и запрету активации спящих ориджинов репликации (Ge et al., 2007; Mcintosh and Blow, 2012; Woodward et al., 2006). По сравнению с ATR, роль киназы ATM в ответе на стресс репликации является не столь драматической. В основном она сводится к активации чекпоинт-киназ и регуляции клеточного цикла (Kanu et al., 2016). Однако роль DNA-PKcs из всех PIK-киназ в ответе на репликативный стресс является самой малоизученной (Lin et al., 2018; Liu et al., 2012b; Ying et al., 2016). В предыдущих работах нашей лаборатории было показано, что DNA-PKcs активируется в S-фазных клетках в условии гипертермии и обеспечивает фосфорилирование гистона H2AX (Velichko et al., 2012; Velichko et al., 2015). Однако необходимость этих событий при ответе клеток на репликативный стресс оставалась неопределённой. Мы решили продолжить эти исследования, и третья часть

работы будет посвящена изучению роли киназы DNA-PK.cs в ответе на различные типы репликативного стресса. Исследования в этом направлении являются актуальными, поскольку с одной стороны расширяют наше понимание фундаментальных механизмов поддержания стабильности генома клетки в ответе на стресс, а с другой стороны имеют потенциальное клинически-значимое применение. Дело в том, что многие индукторы репликативного стресса применяются в противораковой терапии. В связи с чем более детальное понимание механизмов ответа клетки на действия подобных стимулов является базой для разработки новых и адаптации существующих терапевтических стратегий.

1.2 Цели и задачи

Целью настоящей работы является исследование роли Р1К-киназ в ответе на ядрышковый и репликативный стрессы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать количественный метод анализа повреждений ДНК с учетом фазы клеточного цикла индивидуальных клеток млекопитающих.

2. Изучить роль Р1К-киназ в ответе на ядрышковый стресс, индуцируемый гипотонией.

3. Изучить роль DNA-PKcs в ответе на репликативный стресс, индуцируемый гипертермией и низкомолекулярными химическими соединениями.

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе представлено исследование роли Р1К-киназ в ответе на ядрышковый и репликативный стрессы. Р1К-киназы были открыты в ходе масштабного сравнительного анализа последовательности различных фосфатидилинозитол киназ. В

отличии от остальных фосфатидилинозитол киназ, мишенями PIK-киназ являются белки, а не липиды. На сегодня наибольший интерес вызывают PIK-киназы, участвующие в ответе на повреждение ДНК, такие как ATM, ATR и DNA-PKcs. Многочисленными работами была показана роль и механизмы действия этих киназ при повреждениях ДНК. Основной и канонической функцией ATM, ATR и DNA-PKcs является запуск специфических систем репарации повреждений ДНК и остановка клеточного цикла. Однако, в последнее время стало появляться все больше работ, демонстрирующих участие этих киназ в регуляции других клеточных процессов при различных стрессах.

В настоящей работе продемонстрирован механизм ингибирования транскрипции рибосомных генов при гипоосмотическом стрессе. Показано, что в условиях гипоосмотического стресса ингибирование РНК полимераза I-зависимой транскрипции рибосомных генов осуществляется с помощью киназы ATR, в то время как активность киназы ATM необходима для амплификации сигналов о повреждении ДНК. Также продемонстрировано, что в условиях репликативного стресса активируется киназа DNA-PKcs, что необходимо для стабилизации остановленных вилок репликации. На модели гипертермии продемонстрирован возможный механизм синтетической летальности высоких температур и ингибиторов DNA-PKcs.

Полученные нами результаты способствуют лучшему пониманию механизмов активации PIK-киназ, что в дальнейшем позволит осуществлять разработку подходов для терапии рака с использованием комбинации ДНК-повреждающих агентов и ингибиторов PIK-киназ.

1.4 Положения, выносимые на защиту

1. Разработан подход для анализа повреждений ДНК в единичных клетках, зависящих от фазы клеточного цикла.

2. Показано, что гипоосмотический стресс индуцирует ответ на повреждение ДНК в ядрышке.

3. Гипоосмотический стресс приводит к стабилизации РНК-ДНК гибридов (Я-петель) в сайтах активно транскрибирующихся рибосомных генов.

4. Продемонстрировано, что в условиях гипоосмотического стресса, ингибирование транскрипции рибосомных генов зависит от активности АТЯ.

5. В условиях репликативного стресса активация DNA-PK.cs необходима для стабилизации остановленных вилок репликации и является альтернативой ВЯСА1-зависимому механизму их защиты.

6. На модели гипертермии продемонстрирован возможный механизм синтетической летальности высоких температур и ингибиторов DNA-PKcs.

1.5 Личный вклад автора

Работа основана на результатах, полученных автором в ходе экспериментов в период с 2015 по 2019 гг. В ходе работы автором проведены эксперименты, демонстрирующие роль Р1К-киназ в ответе на гипоосмотический и репликативный стрессы. Автором был также разработан протокол анализа повреждений ДНК в одиночных клетках методом ДНК-комет. Автор участвовал в получении клеточных линий с нокаутом/нокдауном индивидуальных генов, получении клеточной линии, стабильно экспрессирующей эндонуклеазу 1-Рро1, анализировал уровень транскрипции в клетках с помощью ПЦР и иммунофлуоресценции, выполнял эксперименты с

использованием микроскопии структурированного освещения (SIM, structured illumination microscopy), а также выполнял иммунофлуоресцентное окрашивание клеток и их анализ.

1.6 Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и широкого спектра методов молекулярной и клеточной биологии. В работе были применены такие методы как молекулярное клонирование, непрямое иммунофлуоресецентное окрашивание, иммуноокрашивание РНК-ДНК гибридов, анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блот-анализа, метод ДНК-комет, иммунопреципитация хроматина, методы микроскопического исследования, в том числе микроскопия структурированного освещения (SIM, structured illumination microscopy) и др.

1.7 Степень достоверности и апробация результатов

По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах. Основные результаты были представлены автором на 3 научных конференциях.

Публикации:

1. AV Luzhin, AK Velichko, SV Razin, OL Kantidze (2016) Automated Analysis of Cell Cycle Phase-Specific DNA Damage Reveals Phase-Specific Differences in Cell Sensitivity to Etoposide. Journal of Cellular Biochemistry 117 (10), 2209-14

2. О.Л. Кантидзе, А.К. Величко, А.В. Лужин, С.В. Разин (2016) Повреждения ДНК при тепловом стрессе. Acta Naturae 8 (2), 84-88

3. OL Kantidze, AK Velichko, AV Luzhin, NV Petrova, SV Razin (2018) Synthetically lethal interactions of ATM, ATR, and DNA-PKcs. Trends in Cancer 4 (11), 755-768

4. AK Velichko, NadV Petrova, AV Luzhin, OS Strelkova, N Ovsyannikova , II Kireev, Nat V Petrova, SV Razin, OL Kantidze (2019) Hypoosmotic stress induces R loop formation in nucleoli and ATR/ATM-dependent silencing of nucleolar transcription. Nucleic Acids Research 47 (13), 6811-6825

Материалы конференций:

1. AV Luzhin, AK Velichko, SV Razin, OL Kantidze (2016) Automated analysis of cell cycle phase-specific DNA damage. Gliwice Scientific Meetings 2016, November 18-19, Gliwice, Poland, p.62

2. Лужин А.В., Величко А.К., Кантидзе О.Л. (2016) Разработка подходов для анализа повреждений ДНК, зависящих от стадии клеточного цикла. Международный молодежный научный форум «Ломоносов» XXIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, стр. 286

3. AV Luzhin, AK Velichko, NV Petrova, OL Kantidze (2019) Synthetic lethality of hyperthermia and inhibitors of DNA-PKcs and ATM. The FEBS Congress 2019. 6-11 July 2019, Krakow, Poland, p. 154

1.8 Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение»), заключения и выводов. Работа

изложена на 119 страницах, содержит 29 рисунков, 3 таблицы и одно примечание. Список литературы включает 218 источников.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Клетки постоянно подвергается действию различных экзогенных и эндогенных факторов (ионизирующая радиация, УФ-излучение, повышенная температура, активные формы кислорода, репликативный стресс и т.д.), многие из которых могут вызывать те или иные повреждения ДНК: одно- (ОЦР) и двуцепочечные разрывы (ДЦР), модификации нуклеотидов (алкилирование, дезаминирование, метилирование), ошибки репликации и др. В процессе эволюции в клетке сформировались системы, которые распознают различные типы повреждений ДНК и репарируют их. Работа таких систем обеспечивает надежное хранение и передачу наследственной информации. Наиболее опасным типом повреждения ДНК для клетки являются ДЦР. Независимо от природы их происхождения такие разрывы способны вызывать перестройки в геноме, индуцировать старение и клеточную смерть. Кроме того, дефекты в системах репарации ДЦР могут обеспечивать предпосылки для развития заболеваний иммунной, нервной систем, и конечно же развития рака (Huang, 2010; Jackson and Bartek, 2009). За регуляцию клеточного ответа на повреждение ДНК и запуск систем репарации ДЦР в клетках млекопитающих отвечают фосфатидилинозитол-3-киназа-подобные киназы (PIK-киназы), в частности ATM, ATR и DNA-PK. Данный обзор литературы будет посвящен истории открытия этих киназ, их структуре, механизмам активации, а также их функциям в клеточном ответе на повреждение ДНК.

2.1 История открытия PIK-киназ

Довольно давно было открыто семейство ферментов, способных перемещать фосфат на один или несколько гидроксилов головной группы фосфатидилинозитола -фосфолипида, входящего в состав мембран клеток эукариот. Впоследствии на основании

гомологии аминокислотной последовательности этот класс был разделен на три основные группы: фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), фосфатидилинозитол-4-киназы (PI4K) и фосфатидилинозитол-фосфат-киназы (PIP) (Domin and Waterfield, 1997; Loijens et al., 1996; Zvelebil et al., 1996). Позднее к этому семейству была добавлена группа фосфатидилинозитол-3-киназа-подобных киназ (PIK-киназы), которые по своей структуре и последовательности сильно отличаются от представителей трех основных групп (Keith and Schreiber, 1995). PI3K, PI4K и PIP представляют собой фосфатидилинозитол киназы, различающиеся субстратной специфичностью и структурой, хотя и имеют гомологичные каталитический и PIK-домены (фосфатидилинозитол киназные домены) (Burke, 2018). В клетке эти киназы участвуют в передаче внутриклеточных и внеклеточных сигналов, релокализации белков, образовании везикул и клеточном делении (Herman and Emr, 1990; Pike, 1992; Rodriguez-Viciana et al., 1997). Однако, в отличии от PI3K, PI4K и PIP, субстратом PIK-киназ являются белки, а не липиды. К этому семейству были отнесены киназы, во-первых, участвующие в росте клетки (TOR, от англ. Target Of Rapamycin), во-вторых киназы участвующие в ответе на повреждение ДНК (ATM, от англ. Ataxia Telangiectasia Mutated; DNA-PKcs, от англ. DNA-dependent Protein Kinase catalytic subunit; ATR, от англ. ATM-and Rad3-related).

2.1.1 Открытие DNA-PK

В 1985 году (Walker et al., 1985) и его коллегами было обнаружено, что добавление двуцепочечной ДНК (дцДНК) к клеточному экстракту приводит к увеличению количества ряда фосфорилированных белков. Данное открытие было случайным, поскольку авторы изучали синтез белков, а препарат РНК, который использовали в ходе

эксперимента был контаминирован дцДНК. Однако эти эксперименты доказывали существование белка, который может быть активирован двуцепочечной ДНК. Позднее тремя независимыми группами этот белок был выделен, и получил название киназа DNA-PK (от англ. DNA dependent protein kinase) (Carter et al., 1990; Jackson et al., 1990; LeesMiller et al., 1990). Киназная активность DNA-PK была ассоциирована с 300 кДа полипептидом, который в последствии получил название каталитической субъединицы -DNA-PKcs (DNA-PK catalytic subunit) (Blunt et al., 1995). Дальнейшие исследования показали, что для активации DNA-PKcs и ее привлечения к ДНК необходим гетеродимер Ku, состоящий из двух субъединиц с массами 70 и 80 кДа. Их стали называть соответственно Ku70 и Ku80 (Gottlieb and Jackson, 1993). Оба этих белка были способны связывать преимущественно концы двуцепоченой ДНК, а вместе с тем, что киназа DNA-PK способна активироваться исключительно линейной, но не суперскрученной ДНК, навело исследователей на мысль, что DNA-PK может быть также активирована в ответ на двунитевые повреждения ДНК in vivo (Walker et al., 1985). Позднее на моделях клеточных линий грызунов с дефектной системой репарации ДЦР и радиочувствительной клеточной линии глиомы человека было продемонстрировано, что эти клетки характеризуются отсутствием активностей DNA-PKcs и Ku. Эти вместе взятые наблюдения позволили установить, что DNA-PK необходима для репарации ДЦР с помощью системы, которая сейчас известна как репарация с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ, non-homologous end joining) (Blunt et al., 1995; Finnie et al., 1995; Kirchgessner et al., 1995; Lees-Miller et al., 1995; Taccioli et al., 1994).

2.1.2 Открытие ATM

Атаксия телеангиоэктазия (АТ), известная также как синдром Луи-Бар (англ. Louis-Bar syndrome) - редкое генетическим нейродегенеративное заболевание человека, при котором происходит расширение сосудов (телеангиоэктазия) и нарушение согласованности движений различных мышц (атаксия). АТ пациенты также демонстрирую иммунодефицит и имеют повышенную предрасположенность к раку, в особенности к лимфомам и лейкозам. Было обнаружено, что клетки пациентов с АТ обладают повышенной радиочувствительностью и не способны правильно репарировать ДНК (Taylor et al., 1975). Когда в клетках АТ пациентов был обнаружен мутантный ген, названный ATM (от англ. ataxia telangiectasia mutated), было установлено, что C-терминальный конец кодируемого этим геном белка содержит в себе PI3K-подобный киназный домен (Savitsky et al., 1995). Сравнив ATM с известными на тот момент белками, оказалось, что эта киназа наиболее гомологична дрожжевому белку Tel1, который участвует в регуляции длины теломер (Lustig and Petes, 1986). Также была выявлена гомология между киназой ATM и другими дрожжевыми белками, а именно Mec1/Esr1/Sad3 и Rad3, которые являются важнейшими участниками систем репарации ДНК и регуляции клеточного цикла у дрожжей (Savitsky et al., 1995).

2.1.3 Открытие ATR

Открытие ATR было связано с изучением последовательностей дрожжевых белков Mec1 и Rad3, которые участвуют в регуляции клеточного цикла. Было показано, что два этих белка обладают гомологией друг с другом и с киназой ATM человека, а также характеризуются наличием С-концевого PBK-подобного киназного домена (Bentley et al., 1996). Позднее (Cimprich et al., 1996) клонировали последовательности генов

человеческих аналогов Mec 1 и RAD3. Один из них был назван FRP1 (FRAP-related protein 1) из-за схожести к FRAP белку и известного сейчас как mTOR (Cimprich et al., 1996), в то время как другой был назван ATR (ATM- and Rad3-related). Так был идентифицирован последний представитель группы PIK-киназ, принимающих участие в репарации повреждений ДНК у позвоночных.

2.2 Общие характеристики PIK-киназ 2.2.1. Структура

Долгое время структуру PIK-киназ не могли разрешить из-за их большого размера (от 2000 до 5000 аминокислот). Последние успехи в области криоэлектронной микроскопии позволили разрешить структуру полноразмерных PIK-киназ и выявить их структурные особенности (Rao et al., 2018; Wang et al., 2016; Yang et al., 2016a; Yin et al., 2017). PIK-киназы характеризуются общей доменной организацией (Рис. 1) (Bosotti et al., 2000). Во всех белках этой группы на С-конце локализованы киназные домены, которые фланкированы FAT-доменом (FRAP-ATM-TRRAP) с N-конца, и FATC регуляторным мотивом (PIKK (PRD) и C-терминала FAT) с C-конца (Bosotti et al., 2000). FAT, FATC и киназный домены вместе образуют так называемый FATKIN-домен. На N-конце FAT-домена все PIK-киназы состоят из спиральных соленоидных HEAT-повторов переменной

FATKIN

Рисунок 1. Доменная организация PIK-киназ. Адаптировано из (Chaudhary andAl-Baradie, 2014).

длины, с помощью которых реализуются их белок-белковые взаимодействия (Sibanda et al., 2017; Yang et al., 2013).

Структура киназы ATM была разрешена сравнительно недавно (Baretic et al., 2017; Wang et al., 2016). ATM - большой белок, размером 3056 аминокислотных остатков. В неактивной форме ATM представляет собой закрытый бабочкообразный димер, поверхность которого образована FATKIN-доменом, а HEAT-повторы организованы в свободные супер-спирали. Анализ пространственной структуры этой киназы выявил наличие уникального элемента FLAP, находящегося недалеко от сайта активации и отсутствующего у других PIK-киназ. FLAP представляет собой объединение FATC-домена, LstS-связывающего элемента (LBE), активационной петли и PIK-подобного регуляторного домена. В неактивной форме ATM характеризуется закрытым димером, в котором FLAP сближен с сайтом активации и инактивирует его. В случае активации ATM происходит конформационный переход, при котором элементы FATKIN-домена разворачиваются друг относительно друга (Baretic et al., 2017). В такой открытой форме взаимодействия поверхностей димера уменьшены и FLAP отдален от сайта активации, позволяя связывать субстраты.

Структура ATR была разрешена в 2017 году. Было показано, что ATR представляет собой димер, формирующий в пространстве седцеобразную структуру. Каждый из мономеров ATR характеризуется своей уникальной конформацией. Взаимодействие между мономерами ATR осуществляется за счет сближения и ассиметричного взаимодействия FATKIN-домена с HEAT-повторами. Свободные N-терминальные концы мономеров представляют собой супер-спиральные a-соленоиды, которые связывают белок ATRIP - активатор ATR (Zou and Elledge, 2003). В отличии от ATM, элементы FATKIN-домена не сближены с активным центром ATR и не участвуют в регуляции его

активности. Также, как и ATM, ATR характеризуется открытой - активной и закрытой -неактивной формами, однако пока что для ATR не показан механизм перехода из одной формы в другую.

Каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs) - это третья и самая большая (4128 аминокислотных остатков) из PIK-киназ. По своей структуре она сильно отличается от ATM и ATR, поскольку DNA-PKcs существует в виде мономера, уложенного в виде трех структурных элементов - С-концевой головы, N-концевого элемента и кругового кармана. Последние два элемента представляют собой a-спиральные повторы, уложенные в виде кольцеобразной структуры. C-концевая голова состоит из FRB- (FKBP12-rapamycin-binding) и FATC-регионов (Sibanda et al., 2017). В отличие от ATM, DNA-PKcs имеет также уникальную a-шпильку - которая скрывает 3950 тирозин, фосфорилирование которого инактивирует киназную активность (Meek et al., 2012). DNA-PKcs формирует активный комплекс с гетеродимером Ku70-Ku80. При наличии свободного конца дцДНК, с ним взаимодействует гетеродимер Ku70-Ku80, который привлекает к разрыву DNA-PKcs (Jette and Lees-Miller, 2015). Образовавшийся комплекс инициирует сильные конформационные изменения DNA-PKcs, сопровождающиеся её аутофосфорилированием в нескольких позициях (Meek et al., 2007) (Hammel et al., 2010).

2.2.2. Субстратная специфичность

Ранние биохимические исследования (Kim et al., 1999) показали, что ATM может фосфорилировать серин/треониновый остаток находящийся перед глутаминовым остатком (S/T-Q мотив), также, как ATR и DNA-PK (Bannister et al., 1993; Kim et al., 1999). Кроме того, эти исследования показали, что гидрофобные или кислотные остатки в

положениях, фланкирующих фосфорилированный серин/треонин, могут служить положительными детерминантами для привлечения PIK-киназ к субстрату, в то время как основные остатки являются детерминантами отрицательными. Таким образом DNA-PK, ATM и ATR используют похожие субстраты, содержащие S/TQ-мотивы, а также имеют некоторые перекрывающиеся функции.

2.2.3. Аутофосфорилирование

S/TQ-мотивы характерны не только для субстратов PIK-киназ, но и для них самих. И ATR, и ATM, и DNA-PKcs способны аутофосфорилировать собственные S/TQ-мотивы.

У DNA-PKcs есть несколько сайтов аутофосфорилирования, которые расположены в области HEAT-повторов (Jette and Lees-Miller, 2015). Аутофосфорилирование S2056 и T2609 указывает на активацию DNA-PKcs в клетках человека (Chan et al., 2002; Chen et al., 2005). Однако ни S2056, ни T2609 не требуются непосредственно для активности киназы. Аутофосфорилирование по этим сайтам вызывает конформационные изменения белка, которые обеспечивают диссоциацию DNA-PKcs из сайтов DSB, что в свою очередь облегчает процессирование и лигирование концов ДНК в сайте разрыва (Jiang et al., 2015).

Для ATM и ATR роль автофосфорилирования является более спорной (Bakkenist and Kastan, 2003). Действительно, ATM способна аутофосфорилироваться по серину-1981, что сопровождается переходом киназы из неактивного в активное состояние, однако на сегодня нет четкого понимания является ли это аутофосфорилирование необходимым для активации ATM. С использованием культур клеток из пациентов с синдромом АТ и клеток c мутацией, приводящей к инактивации сайта аутофосфорилирования ATM (замена серина-1981 на аланин), была подтверждена необходимость аутофосфорилирования этого серина для изменения конформации белка

(Kozlov et al., 2006). В то же время другими группами было показано обратное (Daniel et al., 2008; Dupre et al., 2006; Lee and Paull, 2005; Pellegrini et al., 2006).

Как и другие PIK-киназы, ATR также способна аутофосфорилироваться в частности по треонину-1989 и лизину-2589 (Liu et al., 2011). Было показано in vitro (Rao et al., 2018) и in vivo (Liu et al., 2011), что данные модификации необходимы для привлечения и взаимодействия с TOPBP1, который сам по себе стимулирует киназную активность ATR.

2.2.4. Привлечение в сайты повреждений

Действие ATM, ATR и DNA-PKcs в клетках является строго регулируемым. По этой причине для каждой их этих киназ существуют специфические белковые коактиваторы, необходимые для рекрутирования киназ в сайты повреждения ДНК. Для ATM - это белок NBS1 (Falck et al., 2005), для ATR - ATRIP (Zou and Elledge, 2003) и Ku80 для DNA-PKcs (Gell and Jackson, 1999). Хотя каждая киназа требует свой собственный фактор активации, в основе их привлечения лежит общий принцип: NBS1, ATRIP и Ku80 имеют общий С-концевой домен, необходимый для связывания с PIK-киназами, вероятно, через взаимодействия с их HEAT-повторами (Ball et al., 2005; Spagnolo et al., 2006).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лужин Артем Васильевич, 2020 год

— —

— — —. — — ---

YH2AX Н2АХ

Ж К 1ч Зч

YH2AX

pChk1-S345

pChk2-T68

Н2АХ

Рисунок 13. Фосфорилирование H2AX при гипоосмотическом стрессе зависит от фазы клеточного цикла и индуцируется ATR и ATM киназами. А - Клетки Hela инкубировали в среде c 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU) (10 мкМ, 20 минут), а затем подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 1 часа, после чего фиксировали и окрашивали антителами против gH2AX. EdU выявляли с использованием клик-реакции. ДНК окрашивали с помощью DAPI. На рисунке также представлено совмещенное изображение (merge). Масштабная полоса - 20 мкм. Б - клетки, синхронизированные по 01-/02-/Б-фазам клеточного цикла, подвергали действию гипоосмотического стресса («ОС»), а затем проводили вестерн-блот анализ с помощью антител против gH2AX. Антител против cyclin E использовали в качестве маркера S-фазы, антител против cyclin B1 использовали в качестве маркера 02-фазы. Немодифицированный гистон H2AX был использован как внутренний контроль. В - клетки HeLa инкубировали в среде, содержащей EdU (10 мкМ, 20 минут), подвергали действию гипоосмотического стресса, фиксировали и окрашивали антителами против gH2AX. EdU выявляли с использованием клик-реакции. Затем с помощью программного обеспечения CellProfiler отдельно анализировали интенсивность флуоресценции gH2AX в S-фазных клетках (EdU-положительные) и в 01/02-фазных (EdU-отрицательные). На рисунке представлены результаты анализа в виде бокс плотов. По оси «Y» указана интенсивность флуоресценции gH2AX в условных единицах, по оси «X» сила гипоосмотического стресса в мОсмоль. Г, Д - клетки с нокдауном (kd) индивидуальных киназ (ATM kd, ATR kd, PRKDC kd - нокдаун гена PRKDC, кодирующего белок DNA-PKcs) или клетки, обработанные ингибиторами индивидуальных киназ (KU55933 - ингибитор ATM, VE821 -ингибитор ATR, NU7026 - ингибитор DNA-PKcs), подвергали действию гипоосмотического стресса (ОС). Уровень gH2AX анализировали с помощью вестерн-блот анализа клеточных экстрактов с соответствующими антителами. Немодифицированный гистон H2AX был использован как внутренний контроль. Е, Ж - клетки HeLa подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 1 или 3 ч и анализировали клеточные экстракты с помощью вестерн-блот анализа с использованием антител против фосфорилированных форм киназ ATM и ATR, а также против фосфорилированных форм их мишеней CHK1 и CHK2.

4.2.2 Индуцированные гипоосмотическим стрессом сигналы о повреждении ДНК локализуется в ядрышках

Проанализировав пространственное распределение факторов репарации ДНК в G1-клетках, мы обнаружили, что факторы ATR-зависимого (фосфо-КРЛ32, TopBPl, фосфо-ATR) и ATM-зависимого (фосфо-Nbsl, фосфо-ATM) сигнальных путей локализуются в ядрышках при гипоосмотическом стрессе (Рис. 14). Кроме того, мы обнаружили, что при гипоосмотическом стрессе эти факторы сначала локализуются внутри ядрышка (при 30 минутах стресса), а через 3 часа перемещаются на его периферию и формируют так называемые «ядрышковые кэпы» (от англ. nucleolar caps) (Рис. 14, Рис. 15А). Более того,

ОС 30 мин ОС 3 ч

уН2АХ • Nucleolin DAPI Merge » YH2AX *- « DAPI Merge X 9

рАТМ ё н» Nucleolin DAPI Merge « * pATM Nucleolin « • DAPI Merge

pNbsl .с f % DAPI Merge я i pNbsl • DAPI Merge *

pATR fi • f DAPI Merge * pATR * У DAPI Merge

pRPA % Mf. B23 % DAPI pRPA • DAPI Merge

TopBPl •f ♦ DAPI TopBPl • DAPI Merge »

Рисунок 14. Иммуноцитохимический анализ компонентов ATR- и ATM-зависимых путей ответа на повреждение ДНК при гипоосмотическом стрессе.

Клетки HeLa подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 30 минут или 3 часов. Затем клетки фиксировали и окрашивали с использованием антител против различных белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК: фосфо-КРА32 (pRPA), TopBPl, фосфо-ATR (pATR), фосфо-Nbsl (pNbsl), фосфо-ATM (pATM). Для визуализации ядрышка использовали антитела против нуклеолина (nucleolin) или нуклеофозмина (B23). ДНК визуализировали с помощью DAPI. На рисунке также представлено совмещенное изображение (merge). Масштабная полоса - 5 мкм.

мы обнаружили, что белки ATM- и ATR-зависимых путей ответа на повреждение ДНК полностью колокализуются внутри ядрышка на начальных этапах стресса и позднее в ядрышковых кэпах (Рис. 15 А).

Ядрышко - это компартмент, формирующийся в результате транскрипции рибосомной ДНК (рДНК). Для того чтобы понять, является ли индуцированный гипоосмотическим стрессом сигналинг специфичным для рДНК, мы иммунопреципитировали хроматин с помощью антител против некоторых факторов ATM- и ATR-зависимых путей репарации включая gH2AX, TopBPl, RPA32, Nbsl и Mrell. Преципитированную ДНК анализировали с помощью количественной ПЦР, используя праймеры к нескольким участкам рибосомных генов (Рис. 15Б). С помощью этого подхода мы доказали, что все искомые компоненты ATR- и ATM-сигнальных путей начинают локализоваться в рибосомных генах под действием гипоосмотического стресса (Рис. 15Б). Стоит отметить, что наибольшее обогащение наблюдалось для белков RPA32 и TopBPl на промоторе рибосомных генов. Известно, что в ядрышке присутствуют два типа рибосомных повторов: активно транскрибирующиеся и транскрипционно неактивные. Чтобы определить, в каких именно из этих повторов локализуются сигналы о повреждении ДНК, мы проанализировали пространственное положение gH2AX и белка UBF - транскрипционного фактора РНК-полимеразы I, являющегося маркером транскрипционно активных рибосомных генов (Рис. 15В). Полученные нами результаты демонстрируют, что индуцированный гипоосмотическим стрессом ответ на повреждение ДНК связан именно с активно транскрибирующейся рДНК, т.к. во всех случаях наблюдалась колокализация между gH2AX и UBF (Рис. 15В).

рА рАТМ Merge DAPI

IpNbsl Merge

Промотер 18S

5.8S

28S

pATR рАТМ it Merge ' 4 DAPI

J pNbsl Merge У DAPI

• 1 * >

25

23

21

о 19

<D 17 s

X

0

? 2

CO 2

Й 1.5 ° 1

0.5 0

A1 GAPDH

A2

A3

□ A1

□ A2 ll

■ A3 I

I I7i il L, 'г..

К ОС К ОС к ОС к ОС к ОС к ОС

IgG Nbs1 Mre11 TopBPI yH2AX RPA32

yH2AX/U BF/DAPI

1 % J

! LA

Рисунок 15. Сигналы ответа на повреждение ДНК при гипоосмотическом стрессе специфичны для ядрышка и активно транскрибирующихся рибосомных генов.

А - клетки подвергали действию гипоосмотического стресса («ОС») (30 минут или 3 часа), фиксировали и окрашивали с помощь антител против TopBPI, фосфо-Nbsl (pNbsl), фосфо-ATM (pATM) или фосфо-ATR (pATR). Полученные препараты анализировали с помощью микроскопии высокого разрешения (3D-SIM). На рисунке представлено совмещенное изображение (merge), демонстрирующие колокализацию факторов ответа на повреждение ДНК. Масштабная полоса - 5 мкм. Б - клетки подвергали действию гипоосмотического стресса, после чего выполняли иммунопреципитацию хроматина с помощью антител против факторов ответа на повреждение ДНК. Для контроля преципитации использовали иммуноглобулины мыши (IgG). Результаты иммунопреципитации анализировали с помощь количественной ПЦР, используя праймеры к нескольким участкам рДНК. В качестве отрицательного контроля использовали праймеры к гену GAPDH. Результаты эксперимента представлены в виде процента обогащения относительно начального количества хроматина. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Сверху представлена схема рибосомного повтора и отмечено расположение праймеров, использовавшихся в ПЦР-анализе. В - В анализ взяты контрольные клетки и подвергнутые действию гипоосмотического стресса в течение 30 минут. Клетки фиксировали и окрашивали с помощью антител против gH2AX и транскрипционного фактора UBF. ДНК визуализировали с помощью DAPI. Полученные препараты анализировали с помощью микроскопии высокого разрешения (3D-SIM). Верхний малый квадрат - участок, выбранный для колокализационного анализа. Стрелкой отмечен вектор направления колокализационного анализа. Результаты анализа представлены в виде графиков распределения интенсивностей флуоресцентных сигналов вдоль выбранного вектора (нижний малый квадрат). Масштабная полоса - 5 мкм.

4.2.3 Гипоосмотический стресс индуцирует формирование R-петель в рибосомных генах

Активация АТЯ-зависимого сигнального пути в нереплицирующихся клетках и, вместе с тем, присутствие ко-активаторов ЛТЯ - ТорВР1 и ЯРЛ32 (маркеров однонитевой ДНК) навело нас на мысль, что возможно Я-петли являются причиной запуска ответа на повреждение ДНК в рибосомных генах при гипоосмотическом стрессе. Я-петли представляют собой дуплексы РНК и ДНК, образующиеся при гибридизации РНК с комплементарной цепью ДНК в ходе транскрипции. В результате этого в области гибридизации вытесняется одна из исходных цепей ДНК, которая становиться доступной для распознавания системами репарации. Я-петли могут стабилизироваться при различных нарушениях процесса транскрипции, таких как нехватка факторов сплайсинга, недостаточная активность топоизомераз, или наоборот при избыточной локальной транскрипции (Ве1о18егкоУ8ки й а1., 2018). Поскольку формирование Я-петель всегда происходит в условиях активной транскрипции, мы предположили, что предварительное ингибирование РНК-полимеразы I, обеспечивающей транскрипцию рибосомных генов, предотвратит индукцию сигналов о повреждении ДНК в условиях гипоосмотического стресса. Чтобы проверить эту гипотезу, мы обрабатывали клетки актиномицином Д (ЛСБ), который в низких концентрация ингибирует только РНК-полимеразу I, после чего подвергали клетки действию гипоосмотического стресса и анализировали уровень гистона уИ2ЛХ. В качестве дополнительного контроля мы обрабатывали клетки 1-0-0-рибофуранозидом (БЯВ), который преимущественно ингибирует РНК-полимеразу II. Результаты эксперимента продемонстрировали, что ингибирование РНК-полимеразы I актиномицином Д полностью блокирует активацию ответа на повреждение ДНК в

Рисунок 16. Индуцированный гипоосмотическим стрессом ответ на повреждение ДНК связан с транскрипционной активностью РНК-полимеразы I.

А - клетки инкубировали с ингибитором РНК-полимеразы I актиномицином Д (+АСП) или РНК-полимеразы II (+ВЯБ). Затем подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 30 мин (ОС), получали клеточные экстракты и анализировали их методом вестерн-блот гибридизации с помощью антител против гистона уИ2АХ. Немодифицированный гистон И2АХ был использован как внутренний контроль. Б - клетки обрабатывали, как описано в А, фиксировали и окрашивали антителами против гистона уИ2АХ. Полученные препараты анализировали с помощью программного обеспечения СеПРгв/Нег. Результаты представлены в виде боксплотов. На оси «У» отмечена интенсивность флуоресценции уИ2АХ. Статистически значимые различия отмечены ***.

условии гипоосмотического стресса, в то время как ингибирование РНК полимеразы II с помощью DRB такого эффекта не имеет (Рис. 16 А, Б).

Проведенные нами эксперименты лишь косвенно доказывали участие Я-петель в ответе на повреждение ДНК. Чтобы напрямую показать, что при гипоосмотическом стрессе Я-петли формируются именно в рДНК мы осуществили иммуноцитохимическое окрашивание клеток и иммунопреципитацию хроматина с помощью антител 89.6, специфично распознающих РНК-ДНК-гибриды. Результаты иммуноцитохимического окрашивания клеток демонстрируют явное увеличение сигнала от антител 89.6 в ядрышке при гипоосмотическом стрессе (Рис. 17А). Иммунопреципитация хроматина с помощью антител 89.6 также продемонстрировала достоверное увеличение РНК-ДНК гибридов в промоторе рибосомных генов (Рис. 17Б). Более того, в экспериментах с оверэкспрессией в клетках рибонуклеазы Н1 (РНКаза Н1), которая предотвращает стабилизацию Я-петель, специфично деградируя в них РНК (№катига й а1., 1991),

индуцированный гипоосмотическим стрессом ответ на повреждение ДНК также был полностью отменен (Рис. 17В).

5 X

О Z

го о;

О +

S9.6 Nucleolin * * • t% • • • • 4 DAPI Merge ' "к • . • *

Щ * • • • Г Щг , ... # Ф м » " « • Г - . *

• ■ * % • • *

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

ЯGAPDH а А1

DAPI/yH2AX RNHI-mCherry

1

iL

-RNH1

+RNH1

Контроль ос ОС + RNH1

Рисунок 17. Гипоосмотический стресс индуцирует стабилизацию Я-петель в рибосомных генах.

А - Клетки подвергали действию гипоосмотического стресса (ОС) в течение 30 мин. Затем клетки фиксировали и окрашивали с помощью антител 89.6 против РНК-ДНК гибридов и маркера ядрышка (Ыис1ео1т). В качестве отрицательного контроля фиксированные клетки дополнительно обрабатывали рибонуклеазой Н1 (+К№Н1). Масштабная полоса - 20 мкм. ДНК визуализировали с помощью БАР!. Б - Иммунопреципитация хроматина с использованием антител 89.6 против РНК-ДНК гибридов. Результаты иммунопреципитации анализировали с помощь количественной ПЦР, используя праймеры к промотору рДНК и к гену ОАРБН. В качестве контроля хроматин дополнительно обрабатывали рибонуклеазой Н1 (+К№Н1). Результаты эксперимента представлены в виде процента обогащения относительно начального количества хроматина. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Статистически значимые различия отмечены ***. В - В клетках НеЬа оверэкспрессировали РНКазу Н1 слитую с флуоресцентным белком тСкетту (+ЕКН1-тСИеггу) и подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 30 мин. Затем клетки фиксировали и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. ДНК визуализировали с помощь БАР!.

Известно, что стабилизированные R-петли могут конвертироваться в ДЦР благодаря работе систем эксцизионной репарации нуклеотидов (SoШer and Cimprich, 2015). Чтобы понять, реализуется ли подобный сценарий при гипоосмотическом стрессе, мы применили разработанный нами подход детекции повреждений ДНК на основе метода ДНК-комет. В качестве положительного контроля мы использовали клетки, экспрессирующие эндонуклеазу рестрикции I-PpoI из Physarum, которая индуцирует ДЦР преимущественно в сайтах рибосомных повторов (Berkovich et а1., 2007). В наших экспериментах мы использовали клетки ИеЬа, в которых мы оверэкспрессировали плазмиду с эндонуклеазой рестрикции 1-Рро1, слитой с доменом эстрогенового рецептора (ER). Наличие ER в составе химерного белка делает систему активируемой. Для активации 1-Рро1 системы и индукции ДЦР в рДНК мы инкубировали клетки в среде с 4-гидрокситамоксифеном (4-ОИТ). 4-ОИТ связывается с ER в составе 1-Рро1, что приводит к релокализации 1-Рро1 из цитоплазмы в ядро, где 1-Рро1 вносит ДЦР по своим сайтам рестрикции. Проанализировав ДНК-кометы из клеток, обработанных гипоосмотическим стрессом, и клеток с активированной 1-Рро1, как и ожидалось, мы обнаружили достоверное увеличение количества ДЦР в клетках с активированной 1-Рро1 (Рис. 18). В то же время, мы не обнаружили достоверного увеличения величины ТМ при 30 минутах гипоосмотического стресса (Рис. 18). Однако при трех часах гипоосмотического стресса наблюдалось смещение медианы ТМ ближе к таковому для положительного контроля, хотя статистическая значимость этого сдвига была незначительной (Рис. 18). Эти результаты демонстрируют, что с большей долей вероятности гипоосмотический стресс

индуцирует ATM- и ATR-зависимый путь ответа на повреждение ДНК без индукции

ДЦР.

500 -1

р=0.07

n.s.

н 200 -

о

X

(D 5

i 100 -

о ш

о m

20 Н

i-1-1-1-1

К l-ppol ОС ОС VP16 30 мин 3 ч

Рисунок 18. Гипоосмотический стресс не приводит к индукции ДЦР в клетках ИеЬа

Анализ ДЦР осуществлялся с помощью нейтральной версии метода ДНК-комет. В эксперименте использовались клетки, подвергнутые действию гипоосмотического стресса («ОС») в течение 30 мин и 3 часов. В качестве контролей использовались клетки, обработанные этопозидом (УР16) и клетки с оверэкспрессированной эндонуклеазой 1-Рро1. На оси «X» отмечен хвостовой момент. Статистически значимые различия отмечены ***. Статистически недостоверные различия отмечены п.$.

4.2.4 Гипоосмотический стресс приводит к ATM/ATR-зависимому ингибированию транскрипции рибосомных генов

PIK-киназы не только обеспечивают распознавание повреждений ДНК и активацию репаративных систем, но и участвуют во многих других клеточных процессах. Так, например, известно, что ATM обеспечивает репрессию РНК-полимераза II-зависимой транскрипции при повреждении ДНК. Кроме того, недавние исследования продемонстрировали роль ATM в ингибировании транскрипции рибосомных генов в ядрышке при цис- и транс-повреждениях ДНК (Harding et al., 2015; Larsen et al., 2014; Shanbhag et al., 2010). Поэтому далее мы решили проверить, не происходит ли репрессии

Рисунок 19. Гипоосмотический стресс индуцирует ЛТМ/ЛТЯ-зависимое ингибирование транскрипции рибосомных генов.

А - клетки подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 30 мин в среде, содержащей 5-фторуридин (5-БО), затем фиксировали и выявляли 5-Би с помощью иммуноцитохимического окрашивания. ДНК окрашивали с помощью БАР!. Масштабная полоса - 10 мкм. Б - клетки подвергали действию гипоосмотического стресса в течение 30 мин в среде, содержащей 5-фторуридин (5-БО), затем фиксировали и выявляли 5-Би с помощью иммуноцитохимического окрашивания и анализировали препараты с помощью программного обеспечения СеПРго/Иег. На рисунке представлены результаты анализа в виде боксплотов. На оси У отмечена интенсивность флуоресценции 5-Би, выраженная в условных единицах (у.е.), на оси X - длительность гипоосмотического стресса. Статистически значимые различия отмечены ***. В - клетки НеЬа инкубировали с ингибиторами Р!К-киназ (Ки55933, УЕ821, N07026), а затем обрабатывали как в (Б). Г -клетки с нокаутом (ко) или нокдауном (кй) факторов ответа на повреждение ДНК подвергали действию гипоосмотического стресса также как в (Б), фиксировали, выявляли 5-Би с помощью иммуноцитохимического окрашивания и анализировали препараты с помощью программного обеспечения СеПРго/Иег. На рисунке представлены результаты анализа в виде боксплотов. На оси У отмечена интенсивность флуоресценции 5-Би, выраженная в условных единицах (у.е.), на оси X - длительность гипоосмотического стресса. Статистически значимые различия отмечены ***. Статистически недостоверные различия отмечены п.$. Д - на рисунке представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа уровня транскрипции 458 РНК при гипоосмотическом стрессе на фоне нокдауна (кй) или нокаута (ко) факторов ответа на повреждение ДНК. В качестве контроля транскрипционной репрессии 458 РНК использовались клетки, обработанные актиномицином Д (АСБ). На оси У отмечен относительный уровень транскриптов 458 РНК. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Статистически значимые различия относительно контрольных клеток отмечены ***. Статистически недостоверные различия отмечены п.&.

транскрипции рибосомных генов в условиях гипоосмотического стресса, и если да, то регулируется ли этот процесс PIK-киназами. Для начала мы осуществили мечение клеток аналогом нуклеотида 5-фторуридином (5-FU), который может встраиваться РНК-полимеразами в новосинтезированную РНК. Мы проанализировали уровень включения 5-FU на фоне гипоосмотического стресса и обнаружили значительное падение ядрышковой транскрипции (Рис. 19А, Б). Чтобы определить роль ATM/ATR-зависимых путей в наблюдаемом эффекте, мы подвергали клетки действию гипоосмотического стресса при ингибировании PIK-киназ, после чего измеряли уровень транскрипции рДНК с помощью включения 5-FU или ОТ-ПЦР c праймерами, специфичными последовательности из гена 45S РНК. Результаты эксперимента показали, что инактивация ATR и, в меньшей степени, ATM эффективно предотвращали репрессию транскрипции при гипоосмотическом стрессе (Рис. 19В, Прим. 1Б). В дальнейшем, проанализировав уровень транскрипционной репрессии при гипоосмотическом стрессе в клетках с нокдауном генов ATR, ATM, PRKDC (ген, кодирующий DNA-PKcs), Nbsl и нокаутом гена H2AX, мы продемонстрировали, что максимальный вклад в репрессию вносит киназа ATR. Киназа DNA-PKcs вообще не оказывала какого-либо влияния, а остальные белки-участники сигналинга по степени их участия в репрессии транскрипции располагались в следующем порядке: ATM> Nbs1> H2AX (Рис. 19Г, Д).

Известно, что при классическом ДЦР активация ATM необходима для ингибирования ядрышковой транскрипции (Harding et al., 2015). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в условиях гипоосмотического стресса в репрессии транскрипции рДНК участвует как ATM, так и ATR. Чтобы выяснить реализуется ли подобный механизм при классическом ДЦР в рибосомных генах, мы использовали in vivo ДЦР-индуцируемую систему I-PpoI. Мы использовали клетки HeLa,

в которых оверэкспрессировали плазмиду с эндонуклеазой рестрикции I-PpoI, слитой с доменом эстрагенового рецептора (ER). Для активации I-PpoI системы и индукции ДЦР в рДНК мы инкубировали клетки в среде с 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT), после чего окрашивали клетки антителами против фосфо-ATM и нуклеолина (маркер ядрышка). Из рисунка (Рис. 20А) видно, что в случае активации I-PpoI фосфорилированная форма ATM начинает локализоваться в ядрышковых «кэпах». Проанализировав уровень транскрипции с помощью включения 5-FU на фоне ингибирования PIK-киназ, мы обнаружили, что отключение транскрипции при индуцируемых I-PpoI ДЦР зависит исключительно от ATM, но не от ATR (Рис. 20Б). Таким образом, в случае ДЦР в рДНК остановка транскрипции зависит от активности ATM, а в случае стабилизации R-петель

i

0

1

X

о

4 +

pATM Nucleolin • I V Р • % • * Л f Merge + DAPI ' J»"' о о W «• • V <•

* к ■ ^ * » > 4 ' 1. • . • *• • .* <x * • » • .

® 35 -30 LL 25 "20

0 15 £ Ю

§ 5

1

■» т

У

х *

+ 4-ОНТ

Рисунок 20. Репрессия транскрипции рибосомных генов при 1-Рро1-индуцированных ДЦР зависит только от ATM.

А - в клетках HeLa оверэкспрессировали эндонуклеазу рестрикции I-PpoI и активировали ее с помощью гидрокситамоксифена («+ 4-OHT»), затем клетки фиксировали и окрашивали антителами против фосфо-ATM (pATM) и нуклеолина (nucleolin). ДНК визуализировали с помощью DAPI. На совмещенном изображении («merge+DAPI») продемонстрирована совместная локализация фосфо-ATM и нуклеолина. Масштабная полоса - 20 мкм. Б - клетки, экспрессирующие эндонуклеазу I-PpoI, инкубировали с ингибиторами PIK-киназ, а затем индуцировали ДЦР с помощью гидрокситамоксифена («+ 4-OHT») в среде, содержащей 5-FU. Далее клетки фиксировали и выявляли 5-FU с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Полученные препараты анализировали с помощью программного обеспечения CellProfiler. На оси «X» отмечена интенсивность флуоресценции 5-FU, выраженная в условных единицах (у.е.). В качестве контроля использовались клетки с не активированной гидрокистамоксифеном I-PpoI («- 4-OHT»). Статистически значимые различия отмечены ***. Статистически недостоверные различия отмечены n.s.

при гипоосмотическом стрессе, судя по всему, ATR является ключевым фактором в обеспечении транскрипционной репрессии.

4.2.5 ATR - апикальная киназа при гипоосмотическом стрессе

Для дальнейшего изучения вовлеченности различных факторов репарации в ответ на повреждение ДНК при гипоосмотическом стрессе, мы проанализировали активацию киназ ATM, ATR, а также их мишеней (фосфо-Nbsl, gH2AX) в клетках HeLa с нокаутом H2AX или нокдауном ATM, ATR и Nbs1. Мы обнаружили, что клетки с нокдауном киназы ATR, характеризуются самым слабым уровнем активации факторов репарации (Рис. 21А). Это свидетельствовало о том, что в случае гипоосмотического стресса именно ATR является апикальным фактором индукции стресс-сигналинга. В то же время, анализ клеток с нокдауном Nbsl позволил нам заключить, что Nbsl - мишень ATR, но при этом необходимая для активации ATM (Рис. 21А). Количество gH2AX существенно снижается в клетках с нокдауном ATM и Nbsl, но полностью отсутствует в клетках с нокдауном ATR (Рис. 21А). В клетках с нокаутом H2AX мы не обнаружили изменений в уровне активации Nbsl и ATR, но наблюдали существенное снижение уровня активации ATM (Рис. 21А).

Чтобы подтвердить и расширить полученные результаты мы использовали иммунопреципитацию хроматина антителами против ATM, Nbsl, Mrell и TopBPl на фоне нокдауна ATR, ATM и нокаута H2AX (Рис. 21 Б). Только отсутствие ATR приводило к значительному снижению привлечения факторов Nbsl, Mrell, TopBPl и ATM к рибосомным генам в ответ на гипоосмотический стресс (Рис. 21Б).

Рисунок 21. Анализ факторов репарации, участвующих в клеточном ответе при гипоосмотическом стрессе.

Клетки с нокаутом (ko) или нокдауном (kd) факторов ответа на повреждение ДНК подвергали действию гипоосмотического стресса (ОС) в течение 30 минут и анализировали с помощью вестерн-блот гибридизации (А) или иммунопреципитации хроматина (Б). А -вестерн-блот анализ проводили с помощью антител против факторов ответа на повреждение ДНК. Гистон H3 использовали в качестве внутреннего контроля. Б -Результаты иммунопреципитации хроматина с помощью антител против факторов ответа на повреждение ДНК (Mre11, TopBPl, Nbsl, ATM). Результаты иммунопреципитации анализировали с помощь количественной ПЦР, используя праймеры к нескольким участкам рибосомной ДНК (см. рис.13Б). В качестве отрицательного контроля использовали праймеры к гену GAPDH. Результаты эксперимента представлены на рисунке в виде процента обогащения относительно начального количества хроматина. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение для трех независимых экспериментов.

Полученные нами результаты показывают, что активация ATR - одно из первых событий в ответе на формирование R-петель при гипоосмотическом стрессе. ATR необходим для привлечения Nbsl и активации ATM. Дальнейшее увеличение количества активной ATM, которая наблюдается к 3 часам стресса, вероятно опосредовано gH2AX-зависимой петлей амплификации сигнала о повреждении ДНК. Апикальное положение ATR также объясняет ее роль при ингибировании ядрышковой транскрипции. Тем не менее тот факт, что при гипоосмотическом стрессе ATM не способствует привлечению/активации других факторов (Рис. 21 А, Б), но необходима для ингибирования ядрышковой транскрипции, свидетельствует о том, что ATM может быть

всего лишь эффекторным для ATR белком в стресс-индуцированной репрессии рибосомных генов (Kakarougkas et al., 2014; Ui and Yasui, 2016).

Для поддержания стабильности генома в клетке существуют механизмы ответственные за инициацию ответа на повреждение ДНК. У высших эукариот эти механизмы связаны с активацией PIK-киназ (ATM, ATR, DNA-PKcs). ATM и DNA-PKcs, как правило, активируются в присутствии ДЦР, а активация ATR связана с наличием участков оцДНК, покрытых RPA. Хотя ATM и ATR имеют много общих мишеней, пути ответа на повреждение ДНК, которые они опосредуют, самодостаточны и редко пересекаются. Однако существуют ситуации, при которых ATM может активировать ATR, что, например, происходит при чрезмерной резекции концов ДНК при репарации ДЦР (Cuadrado et al., 2006; Shiotani and Zou, 2009). Стоит отметить, что существуют также экспериментальные данные подтверждающие и обратную ситуацию, при которой ATR может активировать ATM (Stiff et al., 2006).

Ядрышко - это самый большой ядерный компартмент, который формируется вокруг кластеров рДНК. Транскрипция рДНК осуществляется с помощью РНК-полимеразы I, в результате чего синтезируются пре-рибосомные РНК (Grummt, 2013). Главная функция ядрышка — это биосинтез рибосом, который является самым энергозатратным и одним из важнейших процессов в клетке. Поэтому своевременная регуляция транскрипции в ядрышке необходима, во-первых, для поддержания стабильности рДНК при ее повреждении (Harding et al., 2015; Kruhlak et al., 2007b), а во-вторых, для перераспределения энергетических ресурсов, обеспечивающих клеточный гомеостаз в условиях стресса (Larsen et al., 2014).

В нашей работе мы охарактеризовали новый механизм стресс-индуцированной остановки транскрипции в ядрышке. Мы показали, что при гипоосмотическом стрессе стабилизируются R-петли в транскрибирующихся рДНК, что приводит к образованию участков оцДНК покрытые RPA. Это событие индуцирует привлечение в ядрышко киназы ATR и её активацию. Наши данные подтверждают идею, что ATR может активироваться участками оцДНК, которые обычно формируются в сайтах стабилизированных R-петель. Последующая активация ATM опосредована ATR и не связана с ДЦР. ATR может напрямую (Larsen et al., 20l4) фосфорилировать ATM или через привлечение MRN комплекса. Это привлечение может быть осуществлено за счет способности Nbsl связываться с комплексом RPA/оцДНК (Shiotani et al., 20l3). Роль gH2AX в этом процессе заключается в амплификации сигнала о повреждении ДНК через привлечение MDCl и MRN комплекса. В результате активированная ATM выключает ядрышковую транскрипцию вероятно с помощью одного из известных механизмов ATM-зависимого отключения транскрипции для РНК-полимеразы II (Kakarougkas et al., 20l4; Shanbhag et al., 20l0).

Полученные нами и другими исследовательскими группами результаты подтверждают, что ядрышко и РНК-полимераза I - многофункциональный сенсор клеточного стресса. Уровень транскрипции РНК-полимеразы I намного выше уровня транскрипции РНК-полимеразы II, что делает ядрышко более чувствительным к разным типам стрессовых факторов (гипоосмотический, тепловой, окислительный стрессы и др.). Поэтому стабилизация R-петель и активация ответа на повреждение ДНК в ядрышке, может обеспечивать эффективную остановку транскрипции рибосомных генов и опосредовать другие молекулярные события без ДЦР. Ядрышко-специфичный ответ на повреждение ДНК может запускать различные пути клеточного ответа на стресс.

Активация ATR и ATM может привести к активации киназ регулирующие клеточный цикл (CHK1, CHK2) и p53. В результате этих событий происходит остановка клеточного цикла или запуск программы клеточной смерти. Интересно, что остановка транскрипции в рДНК сама по себе может активировать p53. Так остановка транскрипции в ядрышке приводит к высвобождению рибосомных белков, которые подавляют MDM2, что приводит к накоплению/активации p53 (Deisenroth et al., 2016). Кроме того, структурные изменения ядрышка вместе с ингибированием РНК-полимеразы I могут индуцировать перераспределение белков ядрышка (B23, фибрилларин, нуклеолин), которые участвуют в клеточном ответе на стресс (Boulon et al., 2010; Scott and Oeffinger, 2016; Yang et al., 2016b). Результаты наших исследований не только предоставляют новую информацию о регуляции транскрипции РНК-полимеразы I при стрессе, но и демонстрирует неканоническую роль PIK-киназ в этом процессе.

4.3 Роль DNA-PKcs в клеточном ответе на репликативный стресс

4.3.1 Индуцированный гипертермией репликативный стресс сопровождается

активацией DNA-PKcs

Ранее в нашей лаборатории на примере клеточной линии mcf-7 было продемонстрировано что в условиях теплового шока (гипертермии) происходит зависимое от DNA-PKcs фосфорилирование гистона H2AX. Это фосфорилирование происходило преимущественно в S-фазных клетках и было связано с ингибированием репликации ДНК (Velichko et al., 20l2). Тем не менее, функциональной роли активации DNA-PKcs при ингибировании репликации установлено не было. Мы решили более детально исследовать это явление, и для начала проверили, индуцирует ли гипертермия репликативный стресс и активацию DNA-PKcs в других клеточных линиях. Для этого мы протестировали культуру клеток HeLa. В качестве маркера репликативного стресса мы использовали фосфорилированную по серину-33 форму репликативного белка RPA (pS33-RPA) (Liu et al., 20l2b). Мы подвергали клетки действию гипертермии (45°C, 30 минут) и окрашивали антителами против фосфорилированной формы RPA (Рис. 22А) и против активной формы DNA-PKcs (фосфорилированной по 2056 серину - pS2056-DNA-PKcs) (Рис. 22Б). В этом эксперименте использовалась несинхронизированная культура клеток, поэтому чтобы идентифицировать S-фазу, мы предварительно инкубировали клетки с аналогом нуклеотида 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), который включается в новосинтезированную ДНК и может быть в дальнейшем выявлен с помощью клик-химии (см. раздел «Методы»). Результаты иммуноцитохимического окрашивания, представленные на рисунке 22А демонстрируют, что при гипертермии в S-фазных клетках происходит накопление фосфорилированной формы RPA. Это свидетельствует

об индуцированном в клетках репликативном стрессе. Кроме того, этот эксперимент показал, что активация DNA-PK.cs происходит в условии гипертермии преимущественно в 8-фазных клетках (Рис. 22Б).

DAPI EdU PRPA п

□

Увеличение

DAPI EdU • pDNA-PK □

□

Увеличение

6 VP16

Рисунок 22. Гипертермия индуцирует фосфорилирование RPA и активацию DNA-PKcs в отсутствии ДЦР в клетках НеЬа

A, Б - Клетки HeLa инкубировали в среде с EdU (10 мкМ, 20 минут), а затем подвергали действию гипертермии (45 °C, 30 минут), фиксировали и окрашивали антителами против pS33-RPA (pRPA) (А) или pS2056-DNA-PKcs (pDNA-PK) (Б). EdU выявляли с использованием клик-реакции. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 10 мкм. В - клетки HeLa подвергали действию гипертермии различной силы (от 41 °C до 45 °C, 30 минут), после чего иммобилизовали в 1%-ной агарозе и проводили электрофорез в пульсирующем поле (Zellweger et al., 2015). Цифрами на электрофореграмме обозначены: 1 - контрольные клетки, 2 - гипертермия при 41 °C, 3 - 42 °C, 4 - 43 °C, 5 - 44 °C, 6 - 45 °C, VP16 - клетки, обработанные этопозидом (20 мкг/мл, 1 час), M - маркерная ДНК H.Wingei.

Поскольку активация DNA-PKcs может быть связана с образованием ДЦР (Burke, 2018), мы оценили количество повреждений ДНК в клетках, подвергнутых действию гипертермии. Для этого мы использовали метод электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) позволяющий детектировать двуцепочечные разрывы ДНК (Рис. 22В). Результаты электрофореза демонстрируют, что в отличие от этопозида, который использовался в эксперименте в качестве положительного контроля, гипертермия не индуцирует ДЦР. Таким образом, можно заключить, что в культуре клеток HeLa гипертермия индуцирует репликативный стресс и активацию DNA-PKcs, несвязанную с возникновением в клетках ДЦР.

4.3.2 Камптотецин (CPT) индуцирует активацию DNA-PKcs в S-фазных клетках.

Следующим этапом работы стала проверка универсальности феномена активации

DNA-PKcs при репликативном стрессе. Известно, что некоторые химические агенты, в частности афидиколин (APH), гидроксимочевина (HU) и камптотецин (CPT) способны ингибировать репликацию ДНК (Vesela et al., 2017). Мы решили проверить, будет ли обработка клеток этими агентами в низких концентрациях приводить к схожей с гипертермией активации DNA-PK в S-фазных клетках. Подвергнув клетки линии HeLa действию этих агентов, мы обнаружили, что только обработка HU и CPT, подобно гипертермии, индуцируют и активацию DNA-PKcs, и фосфорилирование RPA в S-фазных клетках (Рис. 23 А, Б). Кроме того, мы продемонстрировали, что индуцируемая HU и CPT активация DNA-PKcs, также как в случае гипертермии не связана с формированием ДЦР (Рис. 23В). В дальнейшей работе, в качестве модели репликативного стресса мы решили остановиться на использовании CPT.

Рисунок 23. CPT и HU индуцируют фосфорилирование RPA и активацию DNA-PKcs в S-фазных клетках при отсутствии ДЦР.

A, Б - Клетки HeLa инкубировали в среде с EdU (10 мкМ, 20 минут), затем обрабатывали афидиколином (APH, 0.5 мкМ), гидроксимочевиной (HU, 0.5 мМ) или камптотецином (CPT, 25 нМ) в течение 1 часа, после чего фиксировали и окрашивали антителами против pS33-RPA (pRPA) (А) или pS2056-DNA-PKcs (pDNA-PK) (Б). ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 10 мкм. В - клетки HeLa подвергали действию различных типов стресса, после чего иммобилизовали в 1% агарозе и проводили электрофорез в пульсирующем поле в соответствии с (Zellweger et al., 2015). Цифрами на электрофореграмме обозначены: 1 - контрольные клетки; клетки, обработанные 2 - HU (гидроксимочевина) 0.5 мМ, 3 - HU10 мМ, 4 - APH (афидиколин) 0.5 мкМ, 5 - APH 10 мкМ, 6 - CPT 25 нМ, 7 - CPT 10 мкМ, 8 -гипертермия при 45 °C, 9 - H2O2 100 мкМ, VP16 - этопозид 20 мкг/мл.

4.3.3 БКА-РКс8, БКСЛ1 и РЛКСБ2 при репликативном стрессе колокализуются в сайтах репликации ДНК

Чтобы убедиться, что активная форма DNA-PK.cs на фоне репликативного стресса

локализуется именно в вилках репликации, мы проанализировали пространственную

локализацию новосинтезированной ДНК и активной формы DNA-PKcs (pS2056-DNA-

PKcs) с помощью микроскопии высокого разрешения 3D-SIM. Для этого, клетки

предварительно инкубировали с EdU (30 мин), подвергали действию CPT и иммуноокрашивали соответствующими антителами. Для оценки колокализации определяли коэффициенты Мандерса M1 и M2 используя плагин Coloc2 для программы ImageJ. Коэффициент M1 отражает процент перекрывающихся пикселей первого канала, с пикселями второго канала. Полученные результаты демонстрируют, что pS2056-DNA-PKcs частично колокализуется с меченными EdU сайтами репликации ДНК (M1=0.68, M2=0.56) (Рис. 24А). Интересно, что между pS2056-DNA-PKcs и gH2AX также не

наблюдалось полной колокализации. Это может свидетельствовать о том, что в ответе на А

сЛ/

{■• >v V-SC . -V vt »> • ■ Гч

г - *Х'

pDNA-PK

pDNA^K

¿¿if

••f4 vtv

Ml=0.68

уН2АХ.

pDNA-PK

уН2АХ pDNA-PK

М1=0.6Э .

М2=049- '

W ' ' Л • ' • ''■г

; >

f ■1'

Рисунок 24. Анализ относительной локализации вилок репликации ДНК, pDNA-PKcs, и yH2AX с помощью 3D-SIM.

А, Б - Клетки HeLa инкубировали в среде с EdU (10 мкМ, 20 минут), затем обрабатывали камптотецином (CPT, 25 нМ) в течение 1 часа, после чего фиксировали и окрашивали соответствующими антителами (gH2AX или pS2056-DNA-PKcs). EdU выявляли с использованием клик-реакции. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Полученные препараты анализировали с помощью микроскопии высокого разрешения (3D-SIM). Масштабная полоса - 3 мкм. Цифрами на изображениях обозначены коэффициенты корреляции сигналов Мандерса.

индуцируемый CPT репликативный стресс принимает участие не только DNA-PKcs, но и в определенной части остановленных вилок репликации ДНК другая PIK-киназа, например, ATR (Рис. 24Б).

Остановленная или замедленная вилка репликации - нестабильная структура, которая является субстратом для специфичных нуклеаз, а также может коллапсировать с образованием ДЦР (Cobb et al., 2003; De Piccoli et al., 2012; Kanada et al., 2007; Malkova and Ira, 2013; Tercero and Diffley, 2001). Однако, как было сказано выше, мы не детектировали ДЦР в используемых моделях стресса, а, следовательно, в этих условиях

Рисунок 25. Анализ относительной локализации pDNA-PKcs, FANCD2 и BRCA1 с помощью 3D-SIM.

А, Б - Клетки обрабатывали камптотецином (CPT, 25 нМ) в течение 1 часа, после чего фиксировали и окрашивали соответствующими антителами. EdU выявляли с использованием клик-реакции. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Полученные препараты анализировали с помощью микроскопии высокого разрешения (3D-SIM). Масштабная полоса - 3 мкм. Цифрами на изображениях обозначены коэффициенты корреляции сигналов Мандерса.

вилки репликации ДНК оставались неповрежденными. Известно два основных механизма защиты вилок репликации в условиях стресса - BRCA- и Fancomi anemia (FA)-опосредованные пути, основными участниками которых являются белки BRCA1 и FANCD2, соответственно (Michl et al., 2016; Mijic et al., 2017; Przetocka et al., 2018; Schlacher et al., 2011; Schlacher et al., 2012; Ying et al., 2012). Мы решили проверить, привлекаются ли белки BRCA1 и FANCD2 к вилкам репликации ДНК в условиях действия CPT. Для этого с помощью микроскопии 3D-SIM мы проанализировали пространственную локализацию pS2056-DNA-PKcs и BRCA1, а также FANCD2 и BRCA1 в условиях репликативного стресса. Мы обнаружили, что при обработке CPT в клетках наблюдается образование фокусов pS2056-DNA-PKcs, часть из которых либо полностью колокализуются с BRCA1, либо находятся вблизи фокусов BRCA1 (M1=0.72, M2=0.64) (Рис. 25А). Мы также наблюдали аналогичную ситуацию при анализе FANCD2 и BRCA1 (M1=0.81, M2=0.34) (Рис. 25Б).

4.3.4 CPT индуцирует независимое привлечение DNA-PKcs и BRCA1 в сайты репликации ДНК

DNA-PKcs и BRCA1 - конкурирующие белки. Известно, что BRCA1 привлекается в сайт ДЦР совместно с DNA-PKcs, где блокирует её активацию (Davis et al., 2014), что в свою очередь облегчает привлечение других ферментов HR. В тоже время показано, что белок BAAT1, взаимодействующий с BRCA1, наоборот приводит к активации DNA-PKcs (Ouchi and Ouchi, 2010). Принимая во внимания эти факты, мы решили проверить, привлекаются ли DNA-PKcs и BRCA1 в вилки репликации в условиях стресса взаимозависимо. Для этого мы подвергали клетки действию CPT и иммуноокрашивали их антителами против BRCA1 на фоне ингибирования DNA-PKcs (Рис. 26A), а также

Рисунок 26. DNA-PKcs и BRCA1 привлекаются в сайты репликации ДНК независимо друг от друга.

A - Контрольные клетки и клетки обработанные ингибитором БЫА-РКея (20 мкМЫП7441, 2 часа) инкубировали в среде с Еёи (10 мкМ, 20 минут), затем подвергали действию камптотецина (СРТ, 25 нМ), после чего фиксировали и окрашивали антителами против ВЯСА1. Б - Контрольные клетки и клетки с нокдауном ВЯСА1 (кё) инкубировали в среде с Еёи (10 мкМ, 20 минут), затем подвергали действию камптотецина, после чего фиксировали и окрашивали антителами противр82056-БЫА-РКея. А и Б - Еёивыявляли с использованием клик-реакции. ДНК окрашивали с помощью БАР1. Масштабная полоса - 10 мкм.

антителами против р82056-БКА-РКс8 на фоне нокдауна БЯСА1 (Рис. 24Б). Во-первых,

мы обнаружили, что фокусы БЯСА1 присутствуют в 8-фазе клеточного цикла даже при

нормальных условиях и их количество незначительно изменяется в условиях

репликативного стресса (Рис. 26А). Во-вторых, мы не обнаружили значимых изменений

в количестве БЯСА1 при репликативном стрессе на фоне ингибирования БКА-РКс8 (Рис.

26А). Эти наблюдения также были подтверждены с помощью нокдауна БКА-РКс8

(данные не приводятся). В то же время, проанализировав активацию БКА-РКс8 на фоне

нокдауна БЯСА1 (Рис. 26Б), мы наблюдали увеличение количества р82056-БКА-РКс8 в

условиях репликативного стресса. Таким образом, БКА-РКс8 никак не влияет на

способность БЯСА1 привлекаться в вилки репликации ДНК, но отсутствие БЯСА1

драматическим образом увеличивает количество активной формы БКА-РКс8. Это, по

всей видимости, свидетельствует о том, что DNA-PKcs и BRCA1 независимо привлекаются в сайты арестованных репликативных вилок, но активация DNA-PKcs является дополнительным механизмом защиты вилок репликации при условии отсутствия BRCA1 и невозможности HR-репарации. Если это предположение верно, то в случае одновременного снижения уровней DNA-PKcs и BRCA1 репликативный стресс вероятно спровоцирует дестабилизацию вилок репликации ДНК, их коллапс и формирование ДЦР. Чтобы проверить эту гипотезу мы подвергали клетки репликативному стрессу при одновременном ингибировании активности DNA-PKcs и нокдауне BRCA1. Затем мы иммуноокрашивали клетки антителами против белка 53BP1 - маркера ДЦР (Gupta et al., 2014). Как видно из рисунка 27 сам по себе нокдаун BRCA1

Контроль__BRCA1 KD

Рисунок 27. Репликативный стресс индуцирует повреждение ДНК в отсутствие BRCA1 и DNA-PKcs.

Контрольные клетки ИвЬа и клетки ИвЬа с нокдауном ВЯСА1 (ВЯСА1 кё) инкубировали в среде, содержащей I) индуктор репликативного стресса СРТ (25 нМ, 60 минут) либо II) ингибитор БЫА-РКея ЫП7441 (20 мкМ, 120 минут) либо 111) сначала ЫП7441, а затем СРТ. Для маркирования клеток, находящихся, в 8-фазе клеточного цикла, все клетки инкубировали в среде с Еёи (10 мкМ, 20 минут), который выявляли с помощью клик-реакции. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против 53ВР1. ДНК окрашивали с помощью БАР1. Масштабная полоса - 10 мкм.

приводит к незначительному увеличению количества 53БР1. Скорее всего это связано с тем, что БЯСА1 является необходимым компонентом ИЯ и его отсутствие приводит к накоплению ДЦР. Поэтому при обработке СРТ эти клетки демонстрировали повышенный уровень 53БР1 по сравнению с интактными клетками. Однако проанализировав количество 53БР1 в клетках, подвергнутых репликативному стрессу с одновременным нокдауном БЯСА1 и инактивированной БКА-РК, мы обнаружили его драматическое увеличение (Рис. 27). Таким образом, БЯСА1 и БКА-РКс8 по всей видимости взаимно дополняют друг друга в условиях репликативного стресса и обеспечивают стабилизацию ингибированных вилок репликации, предотвращая их коллапс.

4.3.5 Активности DNA-PKcs и BRCA1 необходимы для обеспечения выживаемости клеток при репликативном стрессе

Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу того, что БКА-РКс8 и БЯСА1 являются альтернативными и взаимодополняющими путями стабилизации вилок репликации ДНК в условиях репликативного стресса. Это в свою очередь предполагает, что отсутствие обоих этих факторов должно повышать вероятность гибели клеток в результате более токсического действия репликативного стресса. Для проверки этого предположения мы проанализировали колониеобразующую активность клеток ИеЬа в условиях репликативного стресса на фоне одновременного ингибирования БКА-РКс8 и нокдауна БЯСА1. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 28. Видно, что в интактных клетках ни СРТ, ни ингибирование БКА-РКс8, ни их совместное действие не приводит к значимым изменениям колониеобразующей способности клеток. В то же время, клетки со сниженным уровнем экспрессии БЯСА1 демонстрируют повышенную чувствительность как к СРТ, так и к ингибитору БКА-РКс8, а совместная

обработка обладает аддитивным токсическим эффектом. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что активность DNA-PKcs важна не только при репликативном стрессе, но также необходима для стабильности репликации при нормальных физиологических условиях.

Рисунок 28. Анализ

колониеобразующей способности клеток при нокдауне БЯСА1 в условии репликативного стресса.

Контрольные клетки HeLa и клетки HeLa с нокдауном BRCA1 (BRCA1 М) инкубировали в среде, содержащей Ш) индуктор репликативного стресса CPT (25 нМ, 60 минут) либо ШШ) ингибитор DNA-PKcs N^441 (20 мкМ, 120 минут) либо Ш) сначала N^441, а затем СРТ. Выживаемость клеток определяли с помощью клоногенного анализа. А - По оси у указано среднее количество колоний. Б - По оси у указано среднее количество колоний по отношению к соответствующему контролю. На рисунке

представлены результаты анализа количества колоний, выполненного в трех биологических

повторностях.

# с/

N1)7441 N1)7441 + СРТ

N1)7441 N1)7441 + СРТ

4.3.6 БКА-РКс8 необходима для стабилизации вилок репликации при гипертермии

В завершении мы решили «вернуться» к модели репликативного стресса, индуцированного гипертермией. Рядом групп было недавно продемонстрировано, что одной из мишеней гипертермии является BRCA1 (Stecklein et а1., 2012; Xian Ma et а1., 2003). Этот белок может деградировать при гипертермии, что в свою очередь приводит к

К1155933 N117441 VE821 KU55933NU7441 УЕ821

Рисунок 29. При ингибировании DNA-PKcs гипертермия приводит к клеточной гибели.

А, Б - Клетки ИеЬа, синхронизированные в Б-фазе клеточного цикла, инкубировали в среде с ингибиторами Р1К-киназ: Ки55933 (15 мкМ, 120 минут), ЫШ441 (20 мкМ, 120 минут) или УЕ821 (10 ткМ, 120 минут), после чего подвергали действию гипертермии (+ИБ; 45 °С, 30 минут). Выживаемость клеток определяли с помощью клоногенного анализа. По оси У указано среднее количество колоний (А) или количество колоний по отношению к

соответствующему контролю (Б).

К1155933 N1)7441 УЕ821 К1155933 N117441 УЕ821

снижению активности ИЯ. Принимая во внимание этот факт, мы предположили, что гипертермия может является таким типом стресса, при котором происходит одновременно и ингибирование репликации, и инактивация ВЯСА1. Если это так, то репликативный стресс, индуцируемый гипертермией в сочетании с ингибированием DNA-PK.cs, будет обладать таким же токсическим действием, как репликативный стресс, индуцируемый СРТ в комбинации с ингибированием DNA-PKcs и нокаутом ВЯСА1. Для проверки этого предположения мы оценивали колониеобразующую активность клеток, подвергнутых гипертермии на фоне действия ингибиторов разных Р1К-киназ. Как видно из результатов эксперимента (Рис. 29А, Б), наиболее сильный эффект на колониеобразующую активность клеток при гипертермии оказывает именно обработка

ингибитором DNA-PKcs. Таким образом, мы можем предположить, что в условиях

гипертермии, активность DNA-PK необходима для стабилизации ингибированных вилок репликации на фоне температурной инактивации BRCA1.

Полученные нами результаты демонстрируют активацию DNA-PKcs как при репликативном стрессе, вызванном гипертермией, так и при классической модели репликативного стресса (обработка клеток CPT или HU). Однако механизм активации DNA-PKcs при репликативном стрессе вызывает некоторые вопросы. Известно, что для активации DNA-PKcs необходим свободный конец ДНК, который зачастую образуется при повреждениях. (Yin et al., 2017) (см. Обзор литературы). Тем не менее, проведенные нами эксперименты демонстрируют, что наблюдаемый феномен активации DNA-PKcs при репликативном стрессе не связан с образованием ДЦР. Одной из возможных причин образования свободного конца ДНК при репликативном стрессе является процессинг ингибированных вилок репликации. Одним из этапов процессинга является так называемая «реверсия» вилок, процесс при котором две дочерние цепи ДНК в вилке репликации отжигаются друг на друга, в результате чего формируется структура, получившая из-за своей специфической формы название «chicken foot» (от англ. chicken foot - «куриная лапка») (Cortez, 2015). По сути «куриные лапки» представляют из себя структуру Холлидея, в которой присутствует свободный конец двуцепочечной ДНК (дцДНК). Он и может быть распознан системами репарации клетки, в частности DNA-PKcs.

Реверсия вилки репликации является одним из механизмов её защиты при стрессе (Cobb et al., 2003; De Piccoli et al., 2012; Hanada et al., 2007; Malkova and Ira, 2013; Tercero and Diffley, 2001). В то же время, реверсированная вилка репликации представляет собой уязвимую структуру, поскольку она подвержена атаке структур-специфических нуклеаз

(например, Mus81 или SLX4) и, как следствие, нуклеолитической деградации. Поэтому в клетках предусмотрены механизмы защиты и перезапуска реверсированных вилок репликации. Один из таких механизмов сопряжен с работой системы HR и требует активности белка BRCA1 (Michl et а1., 2016; Mijic et а1., 2017; Przetocka et а1., 2018; Schlacher et а1., 2011; Schlacher et а1., 2012; Ying et а1., 2012). Наша работа демонстрирует, что DNA-PKcs и BRCA1 привлекаются к вилкам репликации независимо друг от друга в условиях стресса, но, скорее всего, работают одновременно в одних и тех же сайтах репликации ДНК. Кроме того, мы показали, что в отсутствие BRCA1 уровень активации DNA-PKcs резко возрастает. Последнее предполагает существование альтернативного пути защиты остановленной вилки репликации с помощью DNA-PKcs. Эта защита может реализовываться либо за счет ингибирования структур-специфичных нуклеаз, либо за счет активации механизмов перезапуска репликации.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работы нашей лаборатории, связанные с изучением клеточного ответа на различные типы стресса, демонстрируют, что клетки, находящиеся в разных фазах клеточного цикла - характеризуются разным уровнем ответа на стресс. Разработанный нами подход фазо-специфичного анализа повреждений ДНК показал, что клетки, находящиеся на разных фазах клеточного цикла, характеризуются разным количеством повреждений ДНК при обработке ДНК-повреждающими агентами. Наш подход может быть использован как инструмент в исследованиях механизмов ответа раковых клеток при химиотерапии, а также при оптимизации протоколов химиотерапии в зависимости от типа клеток и соотношения фаз клеточного цикла в их популяции. Кроме того, в работе был впервые продемонстрирован ответ на повреждение ДНК при гипоосмотическом стрессе. Мы показали, что этот ответ в не S-фазных клетках связан с репрессией транскрипции в ядрышке. Мы установили, что в условиях гипоосмотического стресса происходит стабилизация R-петель в активно транскрибирующихся рибосомных генах. Было также установлено, что PIK-киназы ATM и ATR при этом выполняют разные функции. Так активность ATR при гипоосмотическом стрессе необходима для ингибирования транскрипции рибосомных генов, в то время как ATM необходима для амплификации сигналов о повреждении ДНК. Далее с помощью модели гипертермии нами был предложен возможный механизм синтетической летальности высоких температур и ингибиторов DNA-PKcs. Мы показали, что в условиях репликативного стресса (как при гипертермии, так и при обработке CPT), происходит активация DNA-PKcs. Активность DNA-PKcs, судя по всему, необходима для реализации дополнительных механизмов стабилизации и защиты остановленных вилок репликации. В частности, мы показали, что в условиях инактивации BRCA1, активность DNA-PKcs

является критичной для поддержания стабильности генома при репликативном стрессе. Последнее, вероятно, и объясняет возможный механизм синтетической летальности высоких температур и ингибиторов DNA-PKcs, поскольку известно, что при гипертермии происходит деградация BRCA1 и, как следствие, инактивация BRCA1-опосредованного пути защиты вилок репликации.

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан и протестирован метод автоматического анализа изображений ДНК-комет, позволяющий одновременно определять фазу клеточного цикла и уровень повреждений ДНК в единичных клетках.

2. Впервые продемонстрировано, что гипоосмотический стресс индуцирует формирование ДНК-РНК-дуплексов (R-петель) в рибосомных генах клеток млекопитающих, что приводит к активации ATM/ATR-зависимого ответа на повреждение ДНК.

3. Показано, что киназа ATR участвует в репрессии РНК-полимераза I-зависимой транскрипции и является ключевым фактором в ответе на повреждение ДНК при гипоосмотическом стрессе. Функция ATM, при этом, сводится к амплификации сигнала о повреждении ДНК.

4. Продемонстрировано, что репликативный стресс в клетках млекопитающих приводит к активации DNA-PKcs.

5. Установлено, что активность DNA-PKcs необходима для реализации одного из альтернативных механизмов стабилизации остановленной вилки репликации ДНК, а также продемонстрирован возможный механизм синтетической летальности гипертермии и ингибиторов DNA-PKcs.

7. ПРИМЕЧАНИЯ

Примечание 1. Эффективность нокдауна Р1К-киназ и нокаута Н2АХ. А - Контрольные клетки (К) и клетки с нокдауном индивидуальных Р1К-киназ (КО) анализировали с помощью метода вестерн-блот гибридизации. ОЛРОИ использовали в качестве внутреннего контроля. Б - Три клона контрольных клеток ИеЬа (обозначены цифрами) и три клона клеток ИеЬа с нокаутом И2ЛХ анализировали с помощью метода вестерн-блот гибридизации. Гистон ИЗ использовали в качестве внутреннего контроля.

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Aymard, F., Aguirrebengoa, M., Guillou, E., Javierre, B.M., Bugler, B., Arnould, C., Rocher, V., Iacovoni, J.S., Biernacka, A., Skrzypczak, M., et al. (2017). Genome-wide mapping of longrange contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nat Struct Mol Biol 24, 353-361.

2. Bakkenist, C.J., and Kastan, M.B. (2003). DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature 421, 499-506.

3. Ball, H.L., Myers, J.S., and Cortez, D. (2005). ATRIP binding to replication protein A-single-stranded DNA promotes ATR-ATRIP localization but is dispensable for Chkl phosphorylation. Mol Biol Cell 16, 2372-2381.

4. Bannister, A.J., Gottlieb, T.M., Kouzarides, T., and Jackson, S.P. (1993). c-Jun is phosphorylated by the DNA-dependent protein kinase in vitro; definition of the minimal kinase recognition motif. Nucleic Acids Res 21, 1289-1295.

5. Baretic, D., Pollard, H.K., Fisher, D.I., Johnson, C.M., Santhanam, B., Truman, C.M., Kouba, T., Fersht, A.R., Phillips, C., and Williams, R.L. (2017). Structures of closed and open conformations of dimeric human ATM. Sci Adv 3, e1700933.

6. Bartek, J., Lukas, C., and Lukas, J. (2004). Checking on DNA damage in S phase. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 792-804.

7. Bass, T.E., Luzwick, J.W., Kavanaugh, G., Carroll, C., Dungrawala, H., Glick, G.G., Feldkamp, M.D., Putney, R., Chazin, W.J., and Cortez, D. (2016). ETAA1 acts at stalled replication forks to maintain genome integrity. Nat Cell Biol 18, 1185-1195.

8. Baure, J., Izadi, A., Suarez, V., Giedzinski, E., Cleaver, J.E., Fike, J.R., and Limoli, C.L. (2009). Histone H2AX phosphorylation in response to changes in chromatin structure induced by altered osmolarity. Mutagenesis 24, 161-167.

9. Belin, B.J., Lee, T., and Mullins, R.D. (2015). DNA damage induces nuclear actin filament assembly by Formin -2 and Spire-(1/2) that promotes efficient DNA repair. [corrected]. Elife 4, e07735.

10. Belotserkovskii, B.P., Tornaletti, S., D'Souza, A.D., and Hanawalt, P.C. (2018). R-loop generation during transcription: Formation, processing and cellular outcomes. DNA Repair (Amst) 71, 69-81.

11. Bentley, N.J., Holtzman, D.A., Flaggs, G., Keegan, K.S., DeMaggio, A., Ford, J.C., Hoekstra, M., and Carr, A.M. (1996). The Schizosaccharomyces pombe rad3 checkpoint gene. EMBO J 15, 6641-6651.

12. Berkovich, E., Monnat, R.J., Jr., and Kastan, M.B. (2007). Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat Cell Biol 9, 683-690.

13. Betous, R., Mason, A.C., Rambo, R.P., Bansbach, C.E., Badu-Nkansah, A., Sirbu, B.M., Eichman, B.F., and Cortez, D. (2012). SMARCAL1 catalyzes fork regression and Holliday junction migration to maintain genome stability during DNA replication. Genes Dev 26, 151162.

14. Blackford, A.N., and Jackson, S.P. (2017). ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Mol Cell 66, 801-817.

15. Blunt, T., Finnie, N.J., Taccioli, G.E., Smith, G.C., Demengeot, J., Gottlieb, T.M., Mizuta, R., Varghese, A.J., Alt, F.W., Jeggo, P.A., et al. (1995). Defective DNA-dependent protein kinase activity is linked to V(D)J recombination and DNA repair defects associated with the murine scid mutation. Cell 80, 813-823.

16. Bolderson, E., Scorah, J., Helleday, T., Smythe, C., and Meuth, M. (2004). ATM is required for the cellular response to thymidine induced replication fork stress. Hum Mol Genet 13, 29372945.

17. Bosotti, R., Isacchi, A., and Sonnhammer, E.L. (2000). FAT: a novel domain in PIK-related kinases. Trends Biochem Sci 25, 225-227.

18. Boulon, S., Westman, B.J., Hutten, S., Boisvert, F.M., and Lamond, A.I. (2010). The nucleolus under stress. Mol Cell 40, 216-227.

19. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-254.

20. Bray, M.A., Vokes, M.S., and Carpenter, A.E. (2015). Using CellProfiler for Automatic Identification and Measurement of Biological Objects in Images. Curr Protoc Mol Biol 109, 14 17 11-13.

21. Burke, J.E. (2018). Structural Basis for Regulation of Phosphoinositide Kinases and Their Involvement in Human Disease. Mol Cell 71, 653-673.

22. Caridi, C.P., D'Agostino, C., Ryu, T., Zapotoczny, G., Delabaere, L., Li, X., Khodaverdian, V.Y., Amaral, N., Lin, E., Rau, A.R., et al. (2018). Nuclear F-actin and myosins drive relocalization of heterochromatic breaks. Nature 559, 54-60.

23. Carroll, C., Bansbach, C.E., Zhao, R., Jung, S.Y., Qin, J., and Cortez, D. (2014). Phosphorylation of a C-terminal auto-inhibitory domain increases SMARCAL1 activity. Nucleic Acids Res 42, 918-925.

24. Carter, T., Vancurova, I., Sun, I., Lou, W., and DeLeon, S. (1990). A DNA-activated protein kinase from HeLa cell nuclei. Mol Cell Biol 10, 6460-6471.

25. Chan, D.W., Chen, B.P., Prithivirajsingh, S., Kurimasa, A., Story, M.D., Qin, J., and Chen, D.J. (2002). Autophosphorylation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit is required for rejoining of DNA double-strand breaks. Genes Dev 16, 2333-2338.

26. Chapman, J.R., and Jackson, S.P. (2008). Phospho-dependent interactions between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Rep 9, 795-801.

27. Chapman, J.R., Taylor, M.R., and Boulton, S.J. (2012). Playing the end game: DNA doublestrand break repair pathway choice. Mol Cell 47, 497-510.

28. Chaudhary, M.W., and Al-Baradie, R.S. (2014). Ataxia-telangiectasia: future prospects. Appl Clin Genet 7, 159-167.

29. Chen, B.P., Chan, D.W., Kobayashi, J., Burma, S., Asaithamby, A., Morotomi-Yano, K., Botvinick, E., Qin, J., and Chen, D.J. (2005). Cell cycle dependence of DNA-dependent protein kinase phosphorylation in response to DNA double strand breaks. J Biol Chem 280, 1470914715.

30. Chou, D.M., Adamson, B., Dephoure, N.E., Tan, X., Nottke, A.C., Hurov, K.E., Gygi, S.P., Colaiacovo, M.P., and Elledge, S.J. (2010). A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18475-18480.

31. Cimprich, K.A., Shin, T.B., Keith, C.T., and Schreiber, S.L. (1996). cDNA cloning and gene mapping of a candidate human cell cycle checkpoint protein. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2850-2855.

32. Cobb, J.A., Bjergbaek, L., Shimada, K., Frei, C., and Gasser, S.M. (2003). DNA polymerase stabilization at stalled replication forks requires Mec1 and the RecQ helicase Sgs1. EMBO J 22, 4325-4336.

33. Collins, A.R. (2004). The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol 26, 249-261.

34. Cortez, D. (2015). Preventing replication fork collapse to maintain genome integrity. DNA Repair (Amst) 32, 149-157.

35. Cortez, D., Wang, Y., Qin, J., and Elledge, S.J. (1999). Requirement of ATM-dependent phosphorylation of brca1 in the DNA damage response to double-strand breaks. Science 286, 1162-1166.

36. Couch, F.B., Bansbach, C.E., Driscoll, R., Luzwick, J.W., Glick, G.G., Betous, R., Carroll, C.M., Jung, S.Y., Qin, J., Cimprich, K.A., et al. (2013). ATR phosphorylates SMARCAL1 to prevent replication fork collapse. Genes Dev 27, 1610-1623.

37. Cuadrado, M., Martinez-Pastor, B., Murga, M., Toledo, L.I., Gutierrez-Martinez, P., Lopez, E., and Fernandez-Capetillo, O. (2006). ATM regulates ATR chromatin loading in response to DNA double-strand breaks. J Exp Med 203, 297-303.

38. Dai, M.S., Zeng, S.X., Jin, Y., Sun, X.X., David, L., and Lu, H. (2004). Ribosomal protein L23 activates p53 by inhibiting MDM2 function in response to ribosomal perturbation but not to translation inhibition. Mol Cell Biol 24, 7654-7668.

39. Daniel, J.A., Pellegrini, M., Lee, J.H., Paull, T.T., Feigenbaum, L., and Nussenzweig, A. (2008). Multiple autophosphorylation sites are dispensable for murine ATM activation in vivo. J Cell Biol 183, 777-783.

40. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H.D., Zhao, H., and Podhorecka, M. (2011). Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods Mol Biol 761, 85-96.

41. Davis, A.J., Chi, L., So, S., Lee, K.J., Mori, E., Fattah, K., Yang, J., and Chen, D.J. (2014). BRCA1 modulates the autophosphorylation status of DNA-PKcs in S phase of the cell cycle. Nucleic Acids Res 42, 11487-11501.

42. De Piccoli, G., Katou, Y., Itoh, T., Nakato, R., Shirahige, K., and Labib, K. (2012). Replisome stability at defective DNA replication forks is independent of S phase checkpoint kinases. Mol Cell 45, 696-704.

43. Deisenroth, C., Franklin, D.A., and Zhang, Y. (2016). The Evolution of the Ribosomal Protein-MDM2-p53 Pathway. Cold Spring Harb Perspect Med 6.

44. Delacroix, S., Wagner, J.M., Kobayashi, M., Yamamoto, K., and Karnitz, L.M. (2007). The Rad9-Hus1-Rad1 (9-1-1) clamp activates checkpoint signaling via TopBP1. Genes Dev 21, 1472-1477.

45. Domin, J., and Waterfield, M.D. (1997). Using structure to define the function of phosphoinositide 3-kinase family members. FEBS Lett 410, 91-95.

46. Dupre, A., Boyer-Chatenet, L., and Gautier, J. (2006). Two-step activation of ATM by DNA and the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Nat Struct Mol Biol 13, 451-457.

47. Ellison, V., and Stillman, B. (2003). Biochemical characterization of DNA damage checkpoint complexes: clamp loader and clamp complexes with specificity for 5' recessed DNA. PLoS Biol 1, E33.

48. Falck, J., Coates, J., and Jackson, S.P. (2005). Conserved modes of recruitment of ATM, ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage. Nature 434, 605-611.

49. Feng, S., Zhao, Y., Xu, Y., Ning, S., Huo, W., Hou, M., Gao, G., Ji, J., Guo, R., and Xu, D. (2016). Ewing Tumor-associated Antigen 1 Interacts with Replication Protein A to Promote Restart of Stalled Replication Forks. J Biol Chem 291, 21956-21962.

50. Feric, M., Vaidya, N., Harmon, T.S., Mitrea, D.M., Zhu, L., Richardson, T.M., Kriwacki, R.W., Pappu, R.V., and Brangwynne, C.P. (2016). Coexisting Liquid Phases Underlie Nucleolar Subcompartments. Cell 165, 1686-1697.

51. Finnie, N.J., Gottlieb, T.M., Blunt, T., Jeggo, P.A., and Jackson, S.P. (1995). DNA-dependent protein kinase activity is absent in xrs-6 cells: implications for site-specific recombination and DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 320-324.

52. Floutsakou, I., Agrawal, S., Nguyen, T.T., Seoighe, C., Ganley, A.R., and McStay, B. (2013). The shared genomic architecture of human nucleolar organizer regions. Genome Res 23, 20032012.

53. Fouche, N., Ozgur, S., Roy, D., and Griffith, J.D. (2006). Replication fork regression in repetitive DNAs. Nucleic Acids Res 34, 6044-6050.

54. Fumagalli, S., Ivanenkov, V.V., Teng, T., and Thomas, G. (2012). Suprainduction of p53 by disruption of 40S and 60S ribosome biogenesis leads to the activation of a novel G2/M checkpoint. Genes Dev 26, 1028-1040.

55. Gatei, M., Scott, S.P., Filippovitch, I., Soronika, N., Lavin, M.F., Weber, B., and Khanna, K.K. (2000). Role for ATM in DNA damage-induced phosphorylation of BRCA1. Cancer Res 60, 3299-3304.

56. Ge, X.Q., Jackson, D.A., and Blow, J.J. (2007). Dormant origins licensed by excess Mcm2-7 are required for human cells to survive replicative stress. Genes Dev 21, 3331-3341.

57. Gell, D., and Jackson, S.P. (1999). Mapping of protein-protein interactions within the DNA-dependent protein kinase complex. Nucleic Acids Res 27, 3494-3502.

58. Getts, R.C., and Stamato, T.D. (1994). Absence of a Ku-like DNA end binding activity in the xrs double-strand DNA repair-deficient mutant. J Biol Chem 269, 15981-15984.

59. Gibbons, J.G., Branco, A.T., Godinho, S.A., Yu, S., and Lemos, B. (2015). Concerted copy number variation balances ribosomal DNA dosage in human and mouse genomes. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 2485-2490.

60. Goodarzi, A.A., Yu, Y., Riballo, E., Douglas, P., Walker, S.A., Ye, R., Harer, C., Marchetti, C., Morrice, N., Jeggo, P.A., et al. (2006). DNA-PK autophosphorylation facilitates Artemis endonuclease activity. EMBO J 25, 3880-3889.

61. Gottlieb, T.M., and Jackson, S.P. (1993). The DNA-dependent protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen. Cell 72, 131-142.

62. Grummt, I. (2013). The nucleolus-guardian of cellular homeostasis and genome integrity. Chromosoma 122, 487-497.

63. Gu, J., Lu, H., Tippin, B., Shimazaki, N., Goodman, M.F., and Lieber, M.R. (2007a). XRCC4:DNA ligase IV can ligate incompatible DNA ends and can ligate across gaps. EMBO J 26, 1010-1023.

64. Gu, J., Lu, H., Tsai, A.G., Schwarz, K., and Lieber, M.R. (2007b). Single-stranded DNA ligation and XLF-stimulated incompatible DNA end ligation by the XRCC4-DNA ligase IV complex: influence of terminal DNA sequence. Nucleic Acids Res 35, 5755-5762.

65. Guo, Z., Kozlov, S., Lavin, M.F., Person, M.D., and Paull, T.T. (2010). ATM activation by oxidative stress. Science 330, 517-521.

66. Gupta, A., Hunt, C.R., Chakraborty, S., Pandita, R.K., Yordy, J., Ramnarain, D.B., Horikoshi, N., and Pandita, T.K. (2014). Role of 53BP1 in the regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Radiat Res 181, 1-8.

67. Haahr, P., Hoffmann, S., Tollenaere, M.A., Ho, T., Toledo, L.I., Mann, M., Bekker-Jensen, S., and Raschle, M. (2016). Activation of the ATR kinase by the RPA-binding protein ETAA1. 18, 1196-1207.

68. Hammel, M., Yu, Y., Mahaney, B.L., Cai, B., Ye, R., Phipps, B.M., Rambo, R.P., Hura, G.L., Pelikan, M., So, S., et al. (2010). Ku and DNA-dependent protein kinase dynamic conformations and assembly regulate DNA binding and the initial non-homologous end joining complex. J Biol Chem 285, 1414-1423.

69. Hanada, K., Budzowska, M., Davies, S.L., van Drunen, E., Onizawa, H., Beverloo, H.B., Maas, A., Essers, J., Hickson, I.D., and Kanaar, R. (2007). The structure-specific endonuclease Mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol 14, 1096-1104.

70. Harding, S.M., Boiarsky, J.A., and Greenberg, R.A. (2015). ATM Dependent Silencing Links Nucleolar Chromatin Reorganization to DNA Damage Recognition. Cell Rep 13, 251259.

71. Herman, P.K., and Emr, S.D. (1990). Characterization of VPS34, a gene required for vacuolar protein sorting and vacuole segregation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 10, 6742-6754.

72. Heyer, W.D., Ehmsen, K.T., and Liu, J. (2010). Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu Rev Genet 44, 113-139.

73. Higgs, M.R., Reynolds, J.J., Winczura, A., Blackford, A.N., Borel, V., Miller, E.S., Zlatanou, A., Nieminuszczy, J., Ryan, E.L., Davies, N.J., et al. (2015). BOD1L Is Required to Suppress Deleterious Resection of Stressed Replication Forks. Mol Cell 59, 462-477.

74. Huang, K. (2010). DNA repair deficiency in a newly identified neurological disease. Clin Genet 78, 418-419.

75. Huen, M.S., Grant, R., Manke, I., Minn, K., Yu, X., Yaffe, M.B., and Chen, J. (2007). RNF8 transduces the DNA-damage signal via histone ubiquitylation and checkpoint protein assembly. Cell 131, 901-914.

76. Imseng, S., Aylett, C.H., and Maier, T. (2018). Architecture and activation of phosphatidylinositol 3-kinase related kinases. Curr Opin Struct Biol 49, 177-189.

77. Jackson, S.P., and Bartek, J. (2009). The DNA-damage response in human biology and disease. Nature 461, 1071-1078.

78. Jackson, S.P., MacDonald, J.J., Lees-Miller, S., and Tjian, R. (1990). GC box binding induces phosphorylation of Sp1 by a DNA-dependent protein kinase. Cell 63, 155-165.

79. Jeggo, P.A., Jackson, S.P., and Taccioli, G.E. (1996). Identification of the catalytic subunit of DNA dependent protein kinase as the product of the mouse scid gene. Curr Top Microbiol Immunol 217, 79-89.

80. Jette, N., and Lees-Miller, S.P. (2015). The DNA-dependent protein kinase: A multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Prog Biophys Mol Biol 117, 194-205.

81. Jiang, W., Crowe, J.L., Liu, X., Nakajima, S., Wang, Y., Li, C., Lee, B.J., Dubois, R.L., Liu, C., Yu, X., et al. (2015). Differential phosphorylation of DNA-PKcs regulates the interplay between end-processing and end-ligation during nonhomologous end-joining. Mol Cell 58, 172185.

82. Jiang, Y., and Chu, W.K. (2018). Potential Roles of the Retinoblastoma Protein in Regulating Genome Editing. Front Cell Dev Biol 6, 81.

83. Jowsey, P.A., Doherty, A.J., and Rouse, J. (2004). Human PTIP facilitates ATM-mediated activation of p53 and promotes cellular resistance to ionizing radiation. J Biol Chem 279, 5556255569.

84. Jungmichel, S., Clapperton, J.A., Lloyd, J., Hari, F.J., Spycher, C., Pavic, L., Li, J., Haire, L.F., Bonalli, M., Larsen, D.H., et al. (2012). The molecular basis of ATM-dependent dimerization of the Mdc1 DNA damage checkpoint mediator. Nucleic Acids Res 40, 3913-3928.

85. Kakarougkas, A., Ismail, A., Chambers, A.L., Riballo, E., Herbert, A.D., Kunzel, J., Lobrich, M., Jeggo, P.A., and Downs, J.A. (2014). Requirement for PBAF in transcriptional repression and repair at DNA breaks in actively transcribed regions of chromatin. Mol Cell 55, 723-732.

86. Kanu, N., Zhang, T., Burrell, R.A., Chakraborty, A., Cronshaw, J., DaCosta, C., Gronroos, E., Pemberton, H.N., Anderton, E., Gonzalez, L., et al. (2016). RAD18, WRNIP1 and ATMIN promote ATM signalling in response to replication stress. Oncogene 35, 4020.

87. Keith, C.T., and Schreiber, S.L. (1995). PIK-related kinases: DNA repair, recombination, and cell cycle checkpoints. Science 270, 50-51.

88. Kienker, L.J., Shin, E.K., and Meek, K. (2000). Both V(D)J recombination and radioresistance require DNA-PK kinase activity, though minimal levels suffice for V(D)J recombination. Nucleic Acids Res 28, 2752-2761.

89. Kim, S.T., Lim, D.S., Canman, C.E., and Kastan, M.B. (1999). Substrate specificities and identification of putative substrates of ATM kinase family members. J Biol Chem 274, 3753837543.

90. Kirchgessner, C.U., Patil, C.K., Evans, J.W., Cuomo, C.A., Fried, L.M., Carter, T., Oettinger, M.A., and Brown, J.M. (1995). DNA-dependent kinase (p350) as a candidate gene for the murine SCID defect. Science 267, 1178-1183.

91. Kolas, N.K., Chapman, J.R., Nakada, S., Ylanko, J., Chahwan, R., Sweeney, F.D., Panier, S., Mendez, M., Wildenhain, J., Thomson, T.M., et al. (2007). Orchestration of the DNA-damage response by the RNF8 ubiquitin ligase. Science 318, 1637-1640.

92. Kolinjivadi, A.M., Sannino, V., De Antoni, A., Zadorozhny, K., Kilkenny, M., Techer, H., Baldi, G., Shen, R., Ciccia, A., Pellegrini, L., et al. (2017). Smarcal1-Mediated Fork Reversal Triggers Mre11-Dependent Degradation of Nascent DNA in the Absence of Brca2 and Stable Rad51 Nucleofilaments. Mol Cell 67, 867-881 e867.

93. Kozlov, S.V., Graham, M.E., Peng, C., Chen, P., Robinson, P.J., and Lavin, M.F. (2006). Involvement of novel autophosphorylation sites in ATM activation. EMBO J 25, 3504-3514.

94. Kruhlak, M., Crouch, E.E., Orlov, M., Montano, C., Gorski, S.A., Nussenzweig, A., and Misteli, T. (2007a). The ATM repair pathway inhibits RNA polymerase I transcription in response to chromosome breaks. 447, 730-734.

95. Kruhlak, M., Crouch, E.E., Orlov, M., Montano, C., Gorski, S.A., Nussenzweig, A., Misteli, T., Phair, R.D., and Casellas, R. (2007b). The ATM repair pathway inhibits RNA polymerase I transcription in response to chromosome breaks. Nature 447, 730-734.

96. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

97. Larsen, D.H., Hari, F., Clapperton, J.A., Gwerder, M., Gutsche, K., Altmeyer, M., Jungmichel, S., Toledo, L.I., Fink, D., Rask, M.B., et al. (2014). The NBS1-Treacle complex controls ribosomal RNA transcription in response to DNA damage. Nat Cell Biol 16, 792-803.

98. Lee, J.H., and Paull, T.T. (2004). Direct activation of the ATM protein kinase by the Mre 11/Rad50/Nbs 1 complex. Science 304, 93-96.

99. Lee, J.H., and Paull, T.T. (2005). ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre 11-Rad50-Nbs 1 complex. Science 308, 551-554.

100. Lees-Miller, S.P., Chen, Y.R., and Anderson, C.W. (1990). Human cells contain a DNA-activated protein kinase that phosphorylates simian virus 40 T antigen, mouse p53, and the human Ku autoantigen. Mol Cell Biol 10, 6472-6481.

101. Lees-Miller, S.P., Godbout, R., Chan, D.W., Weinfeld, M., Day, R.S., 3rd, Barron, G.M., and Allalunis-Turner, J. (1995). Absence of p350 subunit of DNA-activated protein kinase from a radiosensitive human cell line. Science 267, 1183-1185.

102. Li, J., and Stern, D.F. (2005). Regulation of CHK2 by DNA-dependent protein kinase. J Biol Chem 280, 12041-12050.

103. Lieber, M.R. (2008). The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. J Biol Chem 283, 1-5.

104. Lin, Y.F., Shih, H.Y., Shang, Z.F., Kuo, C.T., Guo, J., Du, C., Lee, H., and Chen, B.P.C. (2018). PIDD mediates the association of DNA-PKcs and ATR at stalled replication forks to facilitate the ATR signaling pathway. Nucleic Acids Res 46, 1847-1859.

105. Liu, J., Luo, S., Zhao, H., Liao, J., Li, J., Yang, C., Xu, B., Stern, D.F., Xu, X., and Ye, K. (2012a). Structural mechanism of the phosphorylation-dependent dimerization of the MDC1 forkhead-associated domain. Nucleic Acids Res 40, 3898-3912.

106. Liu, S., Opiyo, S.O., Manthey, K., Glanzer, J.G., Ashley, A.K., Amerin, C., Troksa, K., Shrivastav, M., Nickoloff, J.A., and Oakley, G.G. (2012b). Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res 40, 10780-10794.

107. Liu, S., Shiotani, B., Lahiri, M., Marechal, A., Tse, A., Leung, C.C., Glover, J.N., Yang, X.H., and Zou, L. (2011). ATR autophosphorylation as a molecular switch for checkpoint activation. Mol Cell 43, 192-202.

108. Loewer, A., and Lahav, G. (2011). We are all individuals: causes and consequences of non-genetic heterogeneity in mammalian cells. Curr Opin Genet Dev 21, 753-758.

109. Loijens, J.C., Boronenkov, I.V., Parker, G.J., and Anderson, R.A. (1996). The phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase family. Adv Enzyme Regul 36, 115-140.

110. Lustig, A.J., and Petes, T.D. (1986). Identification of yeast mutants with altered telomere structure. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 1398-1402.

111. Machwe, A., Xiao, L., Groden, J., and Orren, D.K. (2006). The Werner and Bloom syndrome proteins catalyze regression of a model replication fork. Biochemistry 45, 1393913946.

112. Malkova, A., and Ira, G. (2013). Break-induced replication: functions and molecular mechanism. Curr Opin Genet Dev 23, 271-279.

113. Marechal, A., and Zou, L. (2013). DNA damage sensing by the ATM and ATR kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol 5.

114. Masai, H., Matsumoto, S., You, Z., Yoshizawa-Sugata, N., and Oda, M. (2010). Eukaryotic chromosome DNA replication: where, when, and how? Annu Rev Biochem 79, 89-130.

115. Matsuoka, S., Ballif, B.A., Smogorzewska, A., McDonald, E.R., 3rd, Hurov, K.E., Luo, J., Bakalarski, C.E., Zhao, Z., Solimini, N., Lerenthal, Y., et al. (2007). ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science 316, 11601166.

116. Matsuoka, S., Huang, M., and Elledge, S.J. (1998). Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science 282, 1893-1897.

117. McArt, D.G., McKerr, G., Saetzler, K., Howard, C.V., Downes, C.S., and Wasson, G.R. (2010). Comet sensitivity in assessing DNA damage and repair in different cell cycle stages. Mutagenesis 25, 299-303.

118. McIntosh, D., and Blow, J.J. (2012). Dormant origins, the licensing checkpoint, and the response to replicative stresses. Cold Spring Harb Perspect Biol 4.

119. McStay, B. (2016). Nucleolar organizer regions: genomic 'dark matter' requiring illumination. Genes Dev 30, 1598-1610.

120. Meek, K., Douglas, P., Cui, X., Ding, Q., and Lees-Miller, S.P. (2007). trans Autophosphorylation at DNA-dependent protein kinase's two major autophosphorylation site clusters facilitates end processing but not end joining. Mol Cell Biol 27, 3881-3890.

121. Meek, K., Lees-Miller, S.P., and Modesti, M. (2012). N-terminal constraint activates the catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase in the absence of DNA or Ku. Nucleic Acids Res 40, 2964-2973.

122. Melander, F., Bekker-Jensen, S., Falck, J., Bartek, J., Mailand, N., and Lukas, J. (2008). Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. J Cell Biol 181, 213-226.

123. Michl, J., Zimmer, J., Buffa, F.M., McDermott, U., and Tarsounas, M. (2016). FANCD2 limits replication stress and genome instability in cells lacking BRCA2. Nat Struct Mol Biol 23, 755-757.

124. Mijic, S., Zellweger, R., Chappidi, N., Berti, M., Jacobs, K., Mutreja, K., Ursich, S., Ray Chaudhuri, A., Nussenzweig, A., Janscak, P., et al. (2017). Replication fork reversal triggers fork degradation in BRCA2-defective cells. Nat Commun 8, 859.

125. Mimitou, E.P., and Symington, L.S. (2009). Nucleases and helicases take center stage in homologous recombination. Trends Biochem Sci 34, 264-272.

126. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., and Iliakis, G. (2016). DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Semin Cancer Biol 37-38, 51-64.

127. Moiseeva, T., Hood, B., Schamus, S., O'Connor, M.J., Conrads, T.P., and Bakkenist, C.J. (2017). ATR kinase inhibition induces unscheduled origin firing through a Cdc7-dependent association between GINS and And-1. Nat Commun 8, 1392.

128. Moiseeva, T.N., Yin, Y., Calderon, M.J., Qian, C., Schamus-Haynes, S., Sugitani, N., Osmanbeyoglu, H.U., Rothenberg, E., Watkins, S.C., and Bakkenist, C.J. (2019). An ATR and CHK1 kinase signaling mechanism that limits origin firing during unperturbed DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 13374-13383.

129. Moore, H.M., Bai, B., Boisvert, F.M., Latonen, L., Rantanen, V., Simpson, J.C., Pepperkok, R., Lamond, A.I., and Laiho, M. (2011). Quantitative proteomics and dynamic imaging of the nucleolus reveal distinct responses to UV and ionizing radiation. Mol Cell Proteomics 10, M111 009241.

130. Motegi, A., Liaw, H.J., Lee, K.Y., Roest, H.P., Maas, A., Wu, X., Moinova, H., Markowitz, S.D., Ding, H., Hoeijmakers, J.H., et al. (2008). Polyubiquitination of proliferating cell nuclear antigen by HLTF and SHPRH prevents genomic instability from stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 12411-12416.

131. Murphy, A.K., Fitzgerald, M., Ro, T., Kim, J.H., Rabinowitsch, A.I., Chowdhury, D., Schildkraut, C.L., and Borowiec, J.A. (2014). Phosphorylated RPA recruits PALB2 to stalled DNA replication forks to facilitate fork recovery. J Cell Biol 206, 493-507.

132. Nakamura, H., Oda, Y., Iwai, S., Inoue, H., Ohtsuka, E., Kanaya, S., Kimura, S., Katsuda, C., Katayanagi, K., Morikawa, K., et al. (1991). How does RNase H recognize a DNA.RNA hybrid? Proc Natl Acad Sci U S A 88, 11535-11539.

133. Neelsen, K.J., and Lopes, M. (2015). Replication fork reversal in eukaryotes: from dead end to dynamic response. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 207-220.

134. Nergadze, S.G., Rocchi, M., Azzalin, C.M., Mondello, C., and Giulotto, E. (2004). Insertion of telomeric repeats at intrachromosomal break sites during primate evolution. Genome Res 14, 1704-1710.

135. Niepel, M., Spencer, S.L., and Sorger, P.K. (2009). Non-genetic cell-to-cell variability and the consequences for pharmacology. Curr Opin Chem Biol 13, 556-561.

136. Nitiss, J.L. (2009). DNA topoisomerase II and its growing repertoire of biological functions. Nat Rev Cancer 9, 327-337.

137. Olcina, M.M., Foskolou, I.P., Anbalagan, S., Senra, J.M., Pires, I.M., Jiang, Y., Ryan, A.J., and Hammond, E.M. (2013). Replication stress and chromatin context link ATM activation to a role in DNA replication. Mol Cell 52, 758-766.

138. Ouchi, M., and Ouchi, T. (2010). Regulation of ATM/DNA-PKcs Phosphorylation by BRCA1-Associated BAAT1. Genes Cancer 1, 1211-1214.

139. Paques, F., and Haber, J.E. (1999). Multiple pathways of recombination induced by doublestrand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63, 349-404.

140. Pellegrini, M., Celeste, A., Difilippantonio, S., Guo, R., Wang, W., Feigenbaum, L., and Nussenzweig, A. (2006). Autophosphorylation at serine 1987 is dispensable for murine Atm activation in vivo. Nature 443, 222-225.

141. Petermann, E., and Helleday, T. (2010). Pathways of mammalian replication fork restart. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 683-687.

142. Petrova, N.V., Velichko, A.K., Razin, S.V., and Kantidze, O.L. (2016). Early S-phase cell hypersensitivity to heat stress. Cell Cycle 15, 337-344.

143. Pike, L.J. (1992). Phosphatidylinositol 4-kinases and the role of polyphosphoinositides in cellular regulation. Endocr Rev 13, 692-706.

144. Polo, S.E., Blackford, A.N., Chapman, J.R., Baskcomb, L., Gravel, S., Rusch, A., Thomas, A., Blundred, R., Smith, P., Kzhyshkowska, J., et al. (2012). Regulation of DNA-end resection by hnRNPU-like proteins promotes DNA double-strand break signaling and repair. Mol Cell 45, 505-516.

145. Prioleau, M.N., and MacAlpine, D.M. (2016). DNA replication origins-where do we begin? Genes Dev 30, 1683-1697.

146. Przetocka, S., Porro, A., Bolck, H.A., Walker, C., Lezaja, A., Trenner, A., von Aesch, C., Himmels, S.F., D'Andrea, A.D., Ceccaldi, R., et al. (2018). CtIP-Mediated Fork Protection Synergizes with BRCA1 to Suppress Genomic Instability upon DNA Replication Stress. Mol Cell 72, 568-582 e566.

147. Ralf, C., Hickson, I.D., and Wu, L. (2006). The Bloom's syndrome helicase can promote the regression of a model replication fork. J Biol Chem 281, 22839-22846.

148. Rao, Q., Liu, M., Tian, Y., Wu, Z., Hao, Y., Song, L., Qin, Z., Ding, C., Wang, H.W., Wang, J., et al. (2018). Cryo-EM structure of human ATR-ATRIP complex. Cell Res 28, 143156.

149. Raska, I., Shaw, P.J., and Cmarko, D. (2006). Structure and function of the nucleolus in the spotlight. Curr Opin Cell Biol 18, 325-334.

150. Reinhardt, H.C., Aslanian, A.S., Lees, J.A., and Yaffe, M.B. (2007). p53-deficient cells rely on ATM- and ATR-mediated checkpoint signaling through the p38MAPK/MK2 pathway for survival after DNA damage. Cancer Cell 11, 175-189.

151. Roche, B., Arcangioli, B., and Martienssen, R. (2017). New roles for Dicer in the nucleolus and its relevance to cancer. Cell Cycle 16, 1643-1653.