Роль конформационных изменений в функционировании неорганической пирофосфатазы Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Моисеев, Виктор Михайлович

• Моисеев, Виктор Михайлович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Моисеев, Виктор Михайлович

1. Введение.

2. Роль петель в функционировании белков (обзор литературы).

2.1. Конформационные изменения в белковых структурах.

2.2. Строение петель.

2.3. Конформационные изменения петель и их участие в функционировании белков.

2.4; Роль остатков глицина в формировании структуры и обеспечении г конформационной подвижности активного центра.

3. Конформационные изменения в структуре неорганической пирофосфатазы обзор литературы).

3.1. Связывание ионов металла.

3.2. Связывание субстрата.

3.3: Гидролиз субстрата.

3.4. Уход продуктов.

4. Роль конформационных изменений в функционировании неорганической пирофосфатазы Escherichia coli (обсуждение результатов);.

4.1; Исследование мутантных вариантов Е-РРазы GlylOOAla и Glyl47Val.

4.2. Количественная оценка стабильности структуры РРазы.

4.3. Роль остатка Asp67 в функционировании РРазы Е. coli.

5. Экспериментальная часть.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль конформационных изменений в функционировании неорганической пирофосфатазы Escherichia coli»

Пространственная структура белков стабилизирована сетью нековаленгных взаимодействий. В отличие or комплементарных взаимодействий, стабилизирующих структуру нуклеиновых кислот, контакты между аминокислотными остатками в белках неспецифичны, что создает основу для. многочисленных возможностей перебора партнеров практически для любой функциональной группы. Это свойство, а также лабильность нековалентных взаимодействий приводят к уникальной особенности глобулярной структуры белков: их молекулы существуют в виде равновесного набора близких конформаций, и это равновесие легко сдвигается при взаимодействии с различными лигаидами. В результате в процессе функционирования белки неизбежно претерпевают конформационные изменения, которые могут включать как основную полипептидную цепь, так и боковые группы аминокислотных остатков и значительно варьировать по амплитуде и скорости. Часть структурных перестроек лежит в основе таких жизненно важных свойств белков, как рецепция, аллостерическая регуляция или ферментативный катализ. Однако некоторые конформационные изменения являются г «конкомитантными», т.е. просто неизбежно сопровождают функционирование белка, не влияя на его биологическую активность; другие же изменения могут, наоборот, приводить к снижению биологической активности, являясь затратной статьей энергетического баланса.

На сегодняшний день наиболее широко распространенным способом выявления конформационных изменений является сравнительный анализ пространственных структур белков. В частности, для ферментов используют наложение кристаллических структур, полученных в различных условиях, имитирующих отдельные: стадии каталитического процесса. Выяснение возможной роли наблюдаемых перестроек в катализе является отдельной задачей. Для этой цели анализ пространственных структур комбинируют с сайт-направленным мутагенезом. Интерпретация; результатов исследования мутантных вариантов часто затруднена как раз из-за лабильности белковой структуры. Даже щадящие единичные замены аминокислотных остатков могут приводить не только к локальным изменениям структуры в месте мутации, но и к перебору партнеров в сети нековалентных взаимодействий в других частях глобулы. Тем не менее, совместный анализ данных, полученных разными методами, иногда позволяет соотнести изменение изучаемого свойства с конкретной введенной мутацией.

Целью данной работы было изучение функциональной роли конформационных изменений неорганической иирофосфатазы Escherichia coli (Е-РРазы) на различных стадиях катализа. Объект данного исследования является хорошо охарактеризованным ферментом. Для нативной Е-РРазы получено около десяти кристаллических структур в комплексе с различными лигандами. Сравнительный анализ лих структур позволяет предположить, какими конформационными изменениями сопровождается катализ. Помимо боковых групп остатков активного центра, наблюдается смещение боковых групп многих других аминокислотных остатков по всей глобуле.- Кроме того, наблюдаются перестройки; (смещение или скручивание) подвижных элементов полипептидной цепи - различных петель и обоих концевых участков. Сравнение этих результатов с аналогичным наложением для другого представителя; растворимых РРаз, фермента из пекарских дрожжей S. ccrevisiue, показывает удивительное сходство конформационных перестроек, которые происходят с отдельными неупорядоченными участками структуры на одних и тех же стадиях катализа в двух РРазах. К ним относятся, в частности, р-шпилька.95-102 (далее:петля II) и участок 141-149 (далее петля III). Эти участки цепи имеют низкую гомологию первичных структур, но сходны по пространственному строению и содержат в своем составе: остатки глицина. Предварительный анализ первичных структур 80 растворимых РРаз из различных прокариотических и эукариотических: организмов показал, что положение остатков глицина в данных структурных элементах может варьировать, но их наличие является обязательным условием. Этот факт позволил предположить, что либо само строение данных участков, либо их: конформационная подвижность (обусловленная» обязательным ; наличием глицинов) может оказаться важным фактором в проявлении s каталитической активности РРаз. Для проверки высказанного предположения ¡в работе были ; охарактеризованы мутантные варианты Е- РРазы с заменами t ключевых остатков > глицина. 01у100А1аи Glvl47Val. с искусственно сниженной гибкостью петель II и III.

Чтобы охарактеризовать вклад различных факторов в стабильность глобулярной! структуры : фермента, в работе была определена энергия термической ¡ и химической ; денатурации Е-РРазы и ее мутантных вариантов.

При анализе полученных недавно рентгеноструктурных данных обнаружилось неизвестное ранее смещение : боковой группы остатка активного центра Asp67. Чтобы выяснить возможную роль, наблюдаемой; перестройки; в катализе,, в г данной? работе изучена рН-зависимость ингибирования фторид-ионом гидролиза субстрата нативной Е-РРазой и мутантным вариантом Asp67Asn.

Обзор литературы состоит из двух глав. Первая глава посвящена неструктурированным; элементам белковой молекулы - петлям; В ней описаны, закономерности строения петельных регионов, роль петель при функционировании белков. Во второй главе рассмотрены известные на сегодняшний день конформационные изменения в структуре неорганической пирофосфатазы по ходу катализа.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Моисеев, Виктор Михайлович

выводы

1. Замены остатков глицина GlylOOAla и Glyl47Val РРазы Е. coli приводят к следующим изменениям свойств фермента:

- резкое уменьшение скоростей конформационных перестроек после заполнения активаторных центров связывания Mg2\ необходимых для последующего связывания субстрата;

- существенное уменьшение каталитической константы гидролиза субстрата за счет более медленного ухода продуктов реакции;

- снижение стабильности РРазы в условиях термической; и химической; денатурации;

- увеличение равновесного количества связанного с РРазой пирофосфата при; насыщении активного центра фосфатом магния.

2. Определены значения энтальпии денатурации нативной РРазы E.coli, мутантных вариантовt GlylOOAla, Glyl47Val и ряда вариантов с единичными заменами в различных областях молекулы РРазы. Показано, что в присутствии 10 мМ Mg2+ энтальпия денатурации нативной РРазы возрастает на 1140 кДж/моль.

3. Рассмотрены две модели протекания химической денатурации нативной РРазы E.coli и мутантных РРаз GlylOOAla и Glyl47Val. Рассчитаны соответствующие изменения свободной энергии денатурации, количественно охарактеризовано влияние лигандов на стабильность структуры нативной РРазы.

4. Предложена модель, согласно которой роль Asp67 в катализе Е-РРазой, наряду с поляризацией связи О-Н в нуклеофильной молекуле воды Wa, заключается в освобождении кислородного атома Onu в процессе ухода электрофильного фосфата Р2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Моисеев, Виктор Михайлович, 2005 год

1. Carlson; H.A., McCammon, . J.A. (2000) Accommodating Protein Flexibility in Computational Drug Design: MoL Pharm:, 57, 213-218.

2. Carrell, RIW., Gooptu;. B. (1998) Conformational! changes and< disease — serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin: Struc. Biol., 8, 799-809.

3. Kumara, S., Nussinov, R. (2001) How do thermophilic proteins deal with heat? Cell. Mol.LifeSci., 58; 1216-1233.

4. Dubey, A., Sharma, G., Mavroidis, C., Tomassone, M.S., Nikitczuk, K., Yarmush, M.L. (2004) Computational: Studies of Viral Protein Nano-Actuator. J. Comput: Theor; Nanosci., 1, 1-11.

5. Petsko, G;A., Ringe, D. (2004) in Protein structure:and function. New Science Press Ltd, London; p. 195.

6. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E: (2000) The protein data bank. Nucleic Acids Res., 28, 235-242.

7. Gutteridge, A., Thornton, J., (2004) Conformational change in substrate binding, catalysis and product release: an open and shut case? FEBS Letters, 567, 67-73.

8. Gerstein; M., Krebs, W. (1998) A database of macromolecular motions. Nucleic Acids Res:. 26, 4280-4290.

9. Kuntz, I.D. (1972) Protein folding. J. Am. Chem. Soc, 94, 4009-4012.

10. Rose, G.D.; Gierasch. L.M., Smith. J .A. (1985) Turns in peptides and proteins. Adv. Prot. Chem:. 37,1-109;

11. Venkatachalam, C.M. (1968) Stereochemical criteria for polypeptides and proteins. V. Conformation of a system of three linked peptide units. Biopolymers, 6, 1425-1436.

12. Fuchs, P.F.J., Alix, A.J.P. (2005) High accuracy prediction of p-turns and their types using propensities and multiple alignments. Prot., 59,3 828-839.

13. Oliva, В., Bates, P.A., Querol, E., Aviles, F.X., Sternberg, M.J.E. (1997) An automated classification of the structure of protein loops .J. Mol. Biol., 266, 814-830.

14. Kawasaki, H., Kretsinger, R.H. (1995) Calcium binding proteins 1 :EF-hands. Prot: Profiles, 2, 305-490.

15. Wierenga, R.K., Terpstra, P., Hoi, W.G.J. (1986) Prediction of the occurrence of the-ADP-binding: alpha beta alpha fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint: J. Mol. Biol., 187; 101-107.

16. Saraste, M., Sibbald, PR., Wittinghofer, A. (1990) The P-loop: a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci., 15, 430-434.

17. Mathews, B.W. (1972) The у -turn. Evidence for a new folded conformation in Ш proteins. Mucromolecules, 5, 818-819.

18. Wilmot, C.M., Thornton, J.M. (1990) P-turns and their distortions: a proposed new nomenclature. Prot. Eng. . 3, 479-494.

19. Hutchinson, E.G., Thornton, J.M. (1994) A revised set of potentials for beta-turn formation in proteins. Prot. Sci., 3, 2207-2216.

20. Schellman, C. (1980) The aL conformation at the ends of helices. In: Protein folding. Ed. Jaenicke, R., Amsterdam, Elsevier, p. 53-61.

21. Milner-White, E.J. (1988) Recurring loop motif in proteins that occurs in right handed and left handed forms. J. Mol. BioL, 199, 503-511.

22. Milner-White, E;J„ Nissink, J.W., Allen, F.H., Duddv, W.J. (2004) Recurring main-chain anion-binding motifs in short polypeptides: nests. Acta Cryst:, D60, 1935-1942.

23. Gunasekaran, К., Ma, В., Nussinov, R. (2003) Triggering loops and enzyme Function: identification of loop that trigger and modulate movements. J. Mol. Biol:, 332, 143159.

24. Joseph, D., Petsko, G.A., Karplus, M. (1990) Anatomy of a conformation change: hinged "Lid" motion of the triosephosphate isomerase loop. Science, 249, 1425-1428.

25. Nicholson, L.K., Yamazaki, Т. Torchia, D.A., Grzesiek, S„ Bax, A. Stahl, S.J. (1995) Flexibility and function in HIV-Г protease. Nature Struct. Biol., 2, 274-280.•

26. Derewenda, Z.S. (1994) Structure and function of lipases. Adv. Prot. Chem., 45, 1 -52.

27. Lebioda, L., Stec, B. (1991) Mechanism of enolaser the crystal structure of enolase-Mg'^-2-phosphoglycerate/phosphoenolpyruvate complex at 2,2 A resolution. Biochemistry, 30, 2817-2822.

28. Beaman, T.W., Vogel, K.W., Drueckhammer, D.G., Blanchard, J.S., Roderick, S.L. (2002) Acyl group specificity at the active site of tetrahydridipicolinate N-succinyltransferase. Prot. Sci., 11, 974-979.

29. Koshland, D. (1998) Conformational changes: how small is big enough? -/Va/. Med., 4, 1112-1114.

30. Shi, D., Morizono, H., Yu, X., Tonga, L., Allewell, N.M., Tuchman, M. (2001) Human ornithine transcarbamylase: crystallographic insights into substrate recognition and conformational changes. Biochem. J., 354, 501-509.

31. Huntley, J.J., Scrofani, S.D.B., Osborne, M.J., Wright, P.E., Dyson, H.J. (2000) Dynamics of the metallo-P-Iactamase from bacteroides fragilis in the presence and absence of a tight-binding inhibitor. Biochemistry. 39, 13356-13364.

32. Huntley, J.J., Fast, W., Benkovic, S.J., Wright, P.E., Dyson, H.J. (2003) Role of a solvent-exposed tryptophan in the recognition and binding of antibiotic substrates for a metallo-beta-lactamase. Prot. Sci., 12, 1368-1375.

33. Chin, D., Means, A.R. (2000) Calmodulin: a prototypical calcium sensor. Trends Cell Biol., 10,322 328.

34. Ye, Y., Lee, H.-W.,Yang, W., Shealy, S.J., Wilkins, A.L., Liu, Z., Torshin, I., Harrison, R:, Wohlhueter, R., Yang, J.J. (2001) Metal binding affinity and structural : properties of an isolated EF-Ioop in a scaffold protein. Prot. Eng., 14, 1001-1013.

35. Cook, B.C., Rudolph, A.E., Kurumbail, R.G., Porche-Sorbet, R:, Miletich, J.P. (2000) Directed glycosylation of human coagulation factor X at residue 333. J. Biol. Chem., 275,38774-38779.

36. Soejima; K., Yuguchi, M., Mizuguchi, J., Tomokiyo, K., Nakashima, T., Nakagaki, T., Iwanaga, S. (2002) The 99 and 170 loop-modified factor Vila mutants show enhanced catalytic activity without tissue factor. J. Biol. Chem. , 277, 49027-49035;

37. Huang, Z., Prusiner, S.B;, Cohen. F.E. (1996) Structures of prion proteins: and; conformational models for prion diseases. Scrapie prions: a three-dimensional model; of an infectious fragment. Fold Des:, l, 13-19.

38. Kuwabara. Y. Nishino. T. Okamoto. K. Matsumura. T., Eger, B.T. Pai. E.F., Nishino, T. (2003) Unique amino acids cluster for switching from the dehydrogenase to oxidase form of xanthine oxidoreductase. Proc. Natl. Acad. Sci., 100, 8170-8175 .

39. Okano, Y., Mizohata, E., Xie, Y., Matsumura, H., Sugawara, H., Inoue, T., Yokota, A., Kai, Y. (2002) X-ray structure of Galdieria Rubisco complexed with one sulfate ion per active site. FEBS Letters, 527, 33-36.

40. Duff, A.P., Andrews, T.J., Curmi, P.M.G. (2000) The transition between the open and closed states of rubisco is triggered by the inter-phosphate distance of the bound bisphosphate. J. Mol. Biol., 298, 903-916.

41. Hoff, R.H, Hengge, A.C., Wu, L., Keng, Y.-F., Zhang, Z.-Y. (2000) Effects on general acid catalysis from mutations of the invariant tryptophan and arginine residues in the protein tyrosine phosphatase from Yersinia. Biochemistry, 39. 46-54.

42. Scapin; G., Patel, S., Patel, V., Kennedy, В., Asante-Appiah, E. (2001) The structure of. apo protein-tyrosine phosphatase IB C215S mutant: more than just an S ~>0 change. Prot. Sci., 10; 1596-1605.

43. Hellal-Levy, C., Fagart, J!, Souque, A., Wurtz, J.-M., Moras, D;, Rafestin-Oblin, M.-E. (2000) Crucial role of the HI 1-H12 loop in stabilizing the active conformation of the human mineralocorticoid receptor.Mol. Endocrinol., 14; 1210-1221.

44. Hughes, SJ., Tanner, J.A., Hindley, A.D., Miller, A.D., Gould; LR. (2003) Functional asymmetry in the lysyl-tRNA synthetase explored by molecular dynamics, free energy calculations andexperiment; BMC Struct. Biol., 3, 5-25;

45. Варфоломеев, С.Д., Упоров,. И.В;, Федоров, E.Bl (2002) Биоинформатика и молекулярное моделирование в химической энзимологии. Активные центры гидролаз. Биохимия, 67, 1328-1340.

46. Seibert, A.L., Liu, J., Hanck, D.A., Blumenthal; К.М; (2003) Arg-14 loop of site 3 anemone toxins: effects of glycine replacement on toxin affinity. Biochemistry, 42, 14515-14521.

47. Bavkov, A. A., Fabrichniy, I. P., Pohjanjoki, P., Zyryanov, А. В., Lahti, R: (2000) Fluoride effects along the reaction pathway of pyrophosphatase: evidence for a second enzyme-pyrophosphate intermediate. Biochemistry, 39, 11939-11947.

48. Gonzalez. M.A., Webb, M.R., Welsh. K.M. Cooperman; B.S. (1984) Evidence that catalysis by yeast inorganic pyrophosphatase proceeds by direct phosphoryl transfer to water and not via a phosphoryl enzyme intermediate. Biochemistry, 23, 797.

49. Zyryanov, A.B., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R„ Baykov, A.A. (2001) The electrophilic and leaving group phosphates in the catalytic mechanism of yeast pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 276; 17629-17634

50. Арутюнян, Э.Г., Оганесян; В.Ю. Оганесян. H.H., Терзян, С.С., Попов. А.Н. Рубинский, С.В., Вайнштейн, Б.К., Назарова, Т.И., Курилова, С.А., Воробьева,

51. H.H., Аваева, C.M. (1996) Структура неорганической пирофосфатазы Е. coli и ее комплекса с ионом Мп:" при разрешении 2.2 А. Кристаллография. 41; 84-96

52. Kankare, J., Salminen, Т., Lahti, R., Cooperman, В. S., Baykov, А. A., Goldman, A. (1996) Crystallographic identification of metal-binding sites in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 35, 4670-4677

53. Avaeva. S.M. Rodina. E.V. Kurilova. S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996) Effect of D42N substitution in; Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2r binding. FEBS Letters, 392, 91-94.

54. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N., Harutyunyan, E.H., Oganessyan, V.Yu. (1995) Mg2+ activation of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. FEBS Letters,377, 44-46.

55. Baykov, A. A., Hyytia, Т., Volk, S. E., Kasho, V. N„ Vener, A. V., Goldman, A., Lahti. R., Cooperman, B. S. (1996) Catalysis by Escherichia coli i inorganic pyrophosphatase: pH and Mg:* dependence. Biochemistry, 35, 4655-4661.

56. Вайнонен, Ю.П. (2002) Получение н изучение свойств олигомерных форм неорганической ; пирофосфатазы Escherichia coli; : активация пирофосфатом. Дис. канд. хим. наук, МГУ, Москва:

57. Shestakov, A.S., Baykov, A.A., Avaeva, S.M. (1989) Tightly bound pyrophosphate in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. FEBS Letters, 262, 194-196

58. Baykov, A.A., Shestakov, A.S., Kasho, V.N.,, Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., 194, 879-887.

59. Зырянов. А.Б. (2002) Сравнение каталитических механизмов растворимых пирофосфатаз двух семейств. Дис. канд. хим. наук, МГУ. Москва.

60. Hochachka, P.W. (1999) The metabolic implications of intracellular circulation. Proc. Nat. Acad. Sci., 96, 12233-12239.

61. Goguadze, N.G., Hammerstad-Pedersen, J.M., Khoshtariya, D.E., Ulstrup, J: (1991) Conformational; dynamics and. solvent, viscosity effects in carboxvpeptidase A catalyzed benzoylglycvlphenvllactate hydrolysis. Eur. J. Biochem., 200,! 423-429:

62. Gonnelli, M., Strambini; G.B. (1993) Glycerol effects on protein flexibility: a tryptophan phosphorescence study. Biophys. X. 65. 131-137.

63. Kukita, F. (1997) Solvent-dependent rate-limiting steps in the conformational change of sodium channel gating in squid giant axon. J. Physiol., 498, 109-133.

64. Jacob, M., Schmid, F.X. (1999) Protein folding as a diffusional process. Biochemistry, 38, 13773-13779.

65. Ситник, Т.С., Лваева, С.М. (2005) Катионный кластер аминокислотных остатков? неорганической; пирофосфатазы Escherichia coli как возможный; центр связывания эффектора. Биоорган. химия, 31, 251-258.

66. Вайнонен, Ю.П., Воробьева, H.H., Родина, E.B., Назарова, Т.И:, Курилова, С.А., Скоблов, Ю.С., Аваева, С.М. (2005) Свободный PPi активирует гидролиз MgPPi неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70, 85-96.

67. Pedroso, I., Irun, M.P., Machicado, C., Sancho, J. (2002) Four-state equilibrium unfolding of an scFv antibody fragment. Biochemistry, 41, 9873-9884.

68. Ml. Уверский, B.H., Птицын, О.Б. (1996) Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков; сильными денатурантами. I Карбоангидраза В. Мол. Биол., 30, 1124-1134.

69. Del Vecchio, P., Graziano, G., Granata, V., Barone, G., Mandrich, L., Manco, G., Rossi, M. (2002) Temperature- and; denaturent-induced unfolding: of two thermophilic esterases. Biochemistry, 41Д 1364-1371.

70. Tanford; C. (1970) Protein denaturation. C. Theoretical models for the mechanism of denaturation. Adv. Prot. Chem., 24, 1-95.

71. Morgan, C.J., Wilkins, D.K., Smith, L.J., Kawata, Y., Dobson, C.M. (2000) Л compact monomeric intermediate identified by NMR in the denaturation of dimeric triose phosphate isomerase. J. Xiol. Rial., 300, 11-16.

72. Baykov, A.A., Fabrichniy, LP., Pohjanjoki, P., Zyryanov,. Л.В., Lahti, R. (2000). Fluoride effect along the reaction pathway of pyrophosphatase: evidence for a second enzyme pyrophosphate intermediate. Biochemistry, 39. 11939-11947.

73. Baykov, A.A., Avaeva, S.M. (1981) A simple and sensitive apparatus for continuous monitoring of orthophosphate in; the presence of acid-labile compounds. Anal. Biochem:, 116, 1-4.

74. Thompson, J.D., Higgins, D.G. Gibbson. T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res., 22, 46734680.

75. Kraulis, P. (1991) MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl. Cryst:, 24, 946-950.

76. Шафранский, Ю.А. Байков. A.A. Андрукович. П.Ф., Аваева. C.M. (1977) Сравнительное изучение кинетики Mg:* активируемого гидролизапирофосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия 42, 1244-1254.

77. Kapyla, J., Hyytia, Т., Lahti, R., Goldman, A., Baykov, A.A., Cooperman, B.S. (1995) Effect of D97E substitution on the kinetic and thermodynamic properties of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry 34, 792-800.