Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Бутылин, Павел Андреевич

• Бутылин, Павел Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бутылин, Павел Андреевич

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цели и задачи.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,.

2.1 Белки SMC семейства.

2.2 Конденсин.

2.2.1 Конденсин: структура.

2.2.2 Конденсин: локализация в клетке, связывание с ДНК.

2.2.3 Конденсин: функции - компактизация.

2.2.4 Конденсин: функции - сегрегация хроматид.

2.2.5 Конденсин: функции - регуляция клеточного цикла.

2.2.6 Конденсин: функции - регуляция транскрипции.

2.3 рДНК, ядрышко, ядрышковый организатор.

2.4 Регуляция биосинтеза рибосом: TOR, рапамицин.

2.5 Штаммы с изменённой рибосомной ДНК.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Штаммы.

3.2 Плазмиды.

3.3 Среды и условия культивирования.

3.4 Молекулярно-биологические и биохимические методы.

3.5 Тест на стабильность хромосомы III.

3.6 Минихромосомы.

3.7 Тест на потерю минихромосом.

3.8 Микроскопия.

3.9 Микроскопия живых клеток в реальном времени.

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1 Значение ядрышкового организатора в контроле продолжительности и динамики анафазы дрожжей.

5.1.1 Штаммы с эписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности.

5.1.2 Отсутствие хромосомного локуса рДНЕС повышает уровень успешной сегрегации ядрышка в мутантах smc2-8.

5.1.3 Возможный механизм нестабильности генома в штамме с ЭрДНК: повышенная чувствительность к функциональности митотического веретена и кинетохора.

1.4.1 Анализ динамики митоза (телофаза+анафаза) в штаммах с различной структурой рДНК.

5.2 Функциональное и физическое взаимодействие конденсина с ДНК ядрышкового организатора.

5.2.1 Активность Pol I необходима для выхода конденсина из ядрышка по окончании митоза.

5.2.2 Транскрипционный статус рДНК связан с повышением частоты ошибок сегрегации ядрышка при активации мутации конденсина.

5.2.3 Стабильность минихромосомы, содержащей мономер рДНК, зависит от функционального состояния рДНК (активности Pol I) и мутации конденсина.

5.2.4 Транскрипция РНК-полимеразой II не оказывает дестабилизирующего действия на минихромосому, содержащую рДНК.

2.5 Исследование митотической стабильности минихромосом, содержащих двойной повтор рДНК.

5.3 Определение стабильности минихромосом, содержащих последовательности связывания конденсина in situ.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Транскирипция Pol I и связывание конденсина на рДНК.

6.2 Роль рДНК в процессе регуляции точности расхождения хромосом в митозе.

6.3 Скрининг индивидуальных сайтов связывания конденсина в геноме S. cerevisiae с использованием модели митотической сегрегации минихромосом.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

1.1 Актуальность проблемы

Стабильность генома и передача генетического материала из поколения в поколение гарантируется точностью расхождения хромосом в митозе. Сегрегация хромосом в процессе клеточного деления требует от эукариотической клетки слаженной работы комплекса ассоциированных с хроматином структурных белков и энзимов. Один из этих белковых факторов - это конденсин, молекулярная «машина» конденсации хромосом (Losada, Hirano, 2005). У позвоночных обнаружены два конденсиновых комплекса (конденсин I и конденсин II), различающиеся динамикой экспрессии и картиной хромосомной локализации (Hirano, 2006). У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae выявлен только один конденсин, состоящий из пяти жизненно важных субъединиц, две из которых Smc2 и Smc4 относятся к SMC белкам (Structural Maintenance of Chromosomes), и содержат участок связывания АТФ, а три - это вспомогательные субъединицы Brn1, Ycs4 и Ycs5. Все компоненты комплекса - высококонсервативные белки. Мутации хотя бы одной из субъединиц приводят к нарушению разделения хроматина при делении клетки (Freeman et al., 2000). Сходные фенотипы нерасхождения хроматид в митозе при инактивации конденсина описаны и у высших эукариот (Saka et al., 1994; Gerlich et al., 2006). Основной функцией конденсина in vivo является не столько компактизация хроматина, сколько разделение хроматид в ходе митотической сегрегации. Кроме того, конденсин принимает участие в регуляции экспрессии генов, которые сохраняют активность в митозе (Xing et al., 2008).

У позвоночных конденсины, диффузно распределённые в цитоплазме (конденсин I) или в ядре (конденсин II) в интерфазе, в митозе перераспределяются во внутренние домены конденсированных хромосом (Swedlow, Hirano, 2003; Maeshima et al., 2005). У S. cerevisiae в интерфазе конденсин диффузно распределён в цитоплазме, а в митозе основным сайтом связывания конденсина является рибосомная ДНК (Freeman et al., 2000).

Рибосомная ДНК (рДНК) S. cerevisiae состоит из примерно 150 повторов, которые располагаются на правом плече XII хромосомы. Каждый повтор рибосомной ДНК содержит ген - предшественник 35S рРНК, i транскрибируемый РНК полимеразой первого типа (Pol I), а также ген, транскрибируемый РНК полимеразой третьего типа (Pol III), кодирующий 5S рРНК (Shaw et al., 2005). Эти гены разделены двумя нетраскрибируемыми (спейсерными) участками (рис. 6А). Ранее было показано, что конденсин имеет 4 главных сайта связывания на рибосомной ДНК, два из которых приходятся на участок, транскрибируемый Pol I. Около половины повторов рДНК являются транскрипционно активными, при этом число генов рДНК остается стабильным из поколения в поколение (Damman et al., 1993), при этом регуляция уровня рРНК у клеток, находящихся в разных фазах роста (French et. al., 2003), осуществляется путём модуляции транскрипции «активных» повторов. Роль «молчащих» повторов рДНК остаётся неизвестной.

Инактивация конденсина в клетках Э. сегеу/з/ае приводит к тому, что большая часть клеток останавливается в метафазе митоза, но сохраняет высокую жизнеспособность. Часть клеток, которые входят в анафазу, обладают признаками неправильной сегрегации хромосом. Дефекты сегрегации наиболее ярко выражены для хромосомы XII, несущей гены ядрышкового организатора. Частота нерасхождений этой хромосомы в 2-3 раза выше, чем других хромосом (Уопд-Оопга^г а1., 2007). Какие особенности организации и функционирования ядрышка обуславливают тот факт, что сегрегация именно этого локуса является особенно зависимой от конденсина? Этот вопрос, а также вопрос о молекулярной природе взаимодействия конденсина и района ядрышкового организатора, являются предметом настоящей работы.

Высокая пластичность дрожжевого генома предоставляет возможность исследовать анатомию взаимодействия конденсина и субдоменов рДНК. Для исследования функционального взаимодействия хроматина ядрышка с конденсином в митозе мы использовали штамм с эписомной локализацией рДНК, в котором хромосомный локус рДНК (тандемные повторы) был заменён многокопийной плазмидой, несущей одиночные повторы рДНК (\Л/а1 а1., 2000). Использование данной модели позволило впервые показать роль ядрышка в регуляции процесса сегрегации всего генома в митозе.

1.2 Цели и задачи j

Целью настоящего исследования является изучение роли конденсина в обеспечении митотической стабильности хроматина на примере хромосомного локуса ядрышкового организатора. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Определить, как влияет перераспределение рибосомной ДНК, основного сайта связывания конденсина в митозе, из хромосомы в эписому на сегрегацию хромосом и поддержание стабильности генома.

2. Исследовать влияние транскрипционной активности Pol I на взаимодействие конденсина с рДНК и выяснить роль функционального взаимодействия конденсина и транскрипции при сегрегации ядрышка в митозе.

3. Оценить функциональную роль хромосомных сайтов связывания конденсина (вне рДНК) в поддержании высокой митотической стабильности хромосом и минихромосом.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Бутылин, Павел Андреевич

выводы

1. Тандемная повторяющаяся организация рДНК необходима для оптимального контроля динамики анафазы, что обеспечивает точность разделения хромосом в митозе.

2. Конденсин необходим для успешной сегрегации хромосом, содержащих локусы, которые транскрибируются Pol I в митозе. I

3. В нативной хромосоме конденсин взаимодействует с «молчащими» повторами рДНК, не транскрибируемыми Pol I, что объясняет транскрипционную гетерогенность локуса рДНК.

4. Функция сайтов связывания конденсина в геноме необязательно напрямую связана с сегрегацией этих участков, а может иметь вспомогательную или интерфазную функцию.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бутылин, Павел Андреевич, 2009 год

1. Anderson DE, Losada A, Erickson HP, Hirano Т. Condensin and cohesin display different arm conformations with characteristic hinge angles. 2002. J. Cell Biol. 156: 419^24.

2. Aono N, Sutani T, Tomonaga T, Mochida S, Yanagida M. Cnd2 has dual roles in mitotic condensation and interphase. Nature. 2002 May 9;417(6885):197-202.

3. Ball AR Jr, Schmiesing JA, Zhou C, Gregson HC, Okada Y, Doi T, Yokomori K. Identification of a chromosome-targeting domain in the human condensin subunit CNAPl/hCAP-D2/Eg7. Mol Cell Biol. 2002 Aug;22(16):5769-81.

4. Bazett-Jones DP, Kimura K, Hirano T. Efficient supercoiling of DNA by a single condensin complex as revealed by electron spectroscopic imaging. Mol Cell. 2002 Jun;9(6): 1183-90.

5. Berger C, Horlebein A, Gogel E, Grummt F. Temporal order of replication of mouse ribosomal RNA genes during the cell cycle. Chromosoma. 1997 Dec;106(8):479-84.

6. Bhalla N, Biggins S, Murray AW. Mutation of YCS4, a budding yeast condensin subunit, affects mitotic and nonmitotic chromosome behavior. Mol Biol Cell. 2002 Feb;13(2):632-45.

7. Bhat MA, Philp AV, Glover DM, Bellen HJ. Chromatid segregation at anaphase requires the barren product, a novel chromosome-associated protein that interacts with Topoisomerase II. Cell. 1996 Dec 13;87(6):1103-14.

8. Burds AA, Lutum AS, Sorger PK. Generating chromosome instability through the simultaneous deletion of Mad2 and p53. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9;102(32):11296-301. Epub 2005 Jul 29.

9. Burke D, Dawson D, Stearns T. Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. 2000. CSHL Press, New-York. 205 pp.

10. Camargo RS, Maeda MY, di Loreto C, Shirata NK, Anselmo Garcia E, Filho AL. Is agNOR and DNA ploidy analysis useful for evaluating thyroid neoplasms? Anal Quant Cytol Histol. 2005 Jun;27(3): 157-61.

11. Chernoff YO, Newnam GP, Liebman SW. The translational function of nucleotide

12. CI054 in the small subunit rRNA is conserved throughout evolution: genetic evidence in yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Mar 19;93(6):2517-22.

13. Chernoff YO, Vincent A, Liebman SW. Mutations in eukaryotic 18S ribosomal RNA affect translational fidelity and resistance to aminoglycoside antibiotics. EMBO J. 1994 Feb 15;13(4):906-13.

14. Ciosk R, Shirayama M, Shevchenko A, Tanaka T, Toth A, Shevchenko A, Nasmyth K. Cohesin's binding to chromosomes depends on a separate complex consisting of Scc2 and Scc4 proteins. Mol Cell. 2000 Feb;5(2):243-54.

15. Clemente-Blanco A, Mayan-Santos M, Schneider DA, Machin F, Jarmuz A, Tschochner H, Aragon L. Cdcl4 inhibits transcription by RNA polymerase I during anaphase. Nature. 2009 Jan 21. Epub ahead of print.16.