Роль киназы р38α и фосфатазы Wip1 в опухолеобразовании тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Тимофеев, Олег Владимирович

• Тимофеев, Олег Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимофеев, Олег Владимирович

1. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна работы.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы.

1.7. Объем и структура диссертации.

2. Обзор литературы.

2.1. Поиск новых мишеней для терапии рака.

2.2. Митоген-активируемые протеин-киназы.

2.2.1. Основные группы МАП киназ у млекопитающих.

2.2.2. МАПК р38 — структура и функции.

2.2.3. Регуляция активности МАПК р38.

2.3. Мишени МАП киназы р38.

2.4. Антипролиферативная роль МАПК р38.

2.4.1. Участие киназы р38 в регуляции прохождения 22 контрольной точки G1/S.

2.4.2. Киназа р38 и контрольная точка G2/M.

2.4.3. МАПК р38 и митотическая контрольная точка.

2.5. р38 и апоптоз.

2.6. р38 и клеточное старение.

2.7. Фосфатаза Wipl как регулятор активности МАПК р38.

3. Материалы и методы исследований.

3.1. Мыши.

3.2. Генотипирование.

3.3. Подсчет полипов и взятие проб тканей.

3.4. Оценка туморогенности.

3.5. Клеточные линии и их культивирование.

3.6. Ретровирусная инфекция.

3.7. Получение клеточной линии HeLa с индуцибельной 43 экспрессией киназы МКК6. MTS-тест.

3.8. Приготовление ядерных экстрактов.

3.9. Иммуноблоттинг, иммунопреципитация, in vitro киназная 45 проба и электрофорез.

3.10. Иммуногистохимия.

3.11. Иммунофлуоресценция.

4. Результаты.

4.1. Трансформированные эмбриональные фибробласты с 48 инактивацией фосфатазы Wipl (Ppmld'') имеют пониженную туморогенность при введении бестимусным мышам.

4.2. В эмбриональных фибробластах с инактивацией фосфатазы 50 Wipl СPpmld^ повышено содержание pl6INK4A, pl9ARF, р53 и ряда других белков, участвующих в регуляции клеточного цикла.

4.3. Снижение способности трансформантов Ppmldобразовывать 52 опухоли in vivo зависит от р16 NK4A и pl9ARF.

4.4. Активация МКК6 снижает способность клеток HeLa к 55 образованию опухолей у бестимусных мышей.

4.5. Мыши с нокаутом по гену фосфатазы Wipl устойчивы к 59 полипозу кишечника, вызванного мутацией АРС^1'".

5. Обсуждение.

6. Выводы.

7. Список опубликованных работ по теме диссертации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль киназы р38α и фосфатазы Wip1 в опухолеобразовании»

1.1. Актуальность проблемы.

Одним из важнейших направлений молекулярной и клеточной биологии является изучение механизмов канцерогенеза и поиск новых путей терапии опухолей. Идентификация перспективных молекулярных мишеней имеет большое значение для разработки новых, более эффективных методов терапии рака. Исследования последних лет показали, что киназа р38 (представитель семейства митоген-активируемых протеин-киназ - МАПК), принимает участие в важнейших клеточных процессах - пролиферации, апоптозе, старении и дифференцировке, нарушение которых является причиной опухолевой трансформации. Имеются многочисленные данные, полученные в экспериментах in vitro, указывающие на антипролиферативную и проапоптотическую роль киназы р38 (Lavoie et al. 1996; Molnar et al. 1997; Bulavin et al. 1999; Casanovas et al. 2000; Awad et al. 2000), а также некоторые свидетельства ее опухолесупрессорной активности in vivo (Bulavin et al. 2002b).

Недавно описанная фосфатаза Wipl, специфичная в отношении МАПК р38, дефосфорилирует и инактивирует эту киназу (Takekawa et al. 2000). Роль этой фосфатазы в инактивации киназы р38 in vivo и в туморогенезе недостаточно изучена. Идентификация у мыши гена PPM1D, кодирующего фосфатазу Wipl (Choi et al. 2000), и получение мышей с нокаутом по этому гену (Choi et al. 2002) сделало возможным изучение роли Wipl в туморогенезе in vivo. Инактивация гена PPM1D приводит к конститутивной активации киназы р38, что позволяет исследовать ее роль в опухолеобразовании in vivo как на клетках, так и на модельных животных - мышах.

1.2. Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в изучении роли фосфатазы Wipl и киназы р38 в регуляции клеточной пролиферации и канцерогенезе. В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Разработать и охарактеризовать клеточную модель для изучения роли киназы р38 в супрессии канцерогенеза.

2. Получить мышей с инактивацией киназы р38 и провести анализ их чувствительности к развитию некоторых опухолей, в частности, полипозу кишечника.

3. Получить мышей с предрасположенностью к полипозу кишечника и одновременной инактивацией Wipl для изучения влияния активации р38 каскада на развитие этой формы опухолей.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Конститутивная активность р38 каскада, вызванная инактивацией фосфатазы Wipl или активацией киназы МККб, приводит к значительному снижению способности трансформированных клеток образовывать опухоли.

2. Способность фибробластов Wipl"7", трансформированных различными онкогенами, к образованию опухолей снижается за счет повышения уровня pl6INK4A -ингибитора активности циклин-киназных комплексов, и белка р 19ARF.

3. Подавление туморогенеза при инактивации фосфатазы Wipl не зависит от опухолевого супрессорар53.

4. Мыши с нокаутом гена PPM1D устойчивы к аденоматозному полипозу кишечника, вызванного мутацией в гене АРС (АРС"т).

1.4. Научная новизна.

Впервые установлено, что инактивация фосфатазы Wipl в трансформированных эмбриональных фибробластах мыши снижает способность клеток образовывать опухоли при пересадке бестимусным мышам.

Показано, что наблюдаемое подавление туморогенеза обусловлено повышением уровня ингибитора активности циклин-киназных комплексов pl6INK4A и белка pl9ARF, причем действие последнего не опосредовано через р53, что говорит о существовании дополнительных опухоль-супрессорных функций у pl9ARF.

Обнаружено, что активация р38 каскада в клетках HeLa с индуцибельной экспрессией киназы МКК6 незначительно влияет на пролиферацию клеток in vitro, но достаточна для опухолевой супрессии in vivo.

Впервые показано, что инактивация фосфатазы Wipl вызывает устойчивость к полипозу кишечника у мышей с мутацией АРСт.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли киназы р38 в супрессии туморогенеза in vivo. Один из механизмов этого эффекта - повышение уровня белков pl6INK4A и pl9ARF за счет усиления их транскрипции. Эти факты расширяют существующие представления о функциях р38 и говорят о необходимости поиска новых мишеней р38 и регуляторных путей, в которые может быть вовлечена эта киназа. Зависимость супрессорной способности р38 от pl9ARF в отсутствие р53 подразумевает существование у белка pl9ARF дополнительных функций, не зависимых от р53. Важное практическое значение имеет выявленный в работе противоопухолевый эффект инактивации фосфатазы Wipl, которая может оказаться перспективной мишенью при терапии рака.

Отсутствие выраженного влияния активации р38 на пролиферацию и апоптоз in vitro при сильном опухоль-супрессорном действии in vivo показывает, что для скринирования противораковых средств требуется использование методов in vivo или разработка новых тестов для клеточных культур. Широко используемые сейчас методы оценивают, в основном, уровень пролиферации и апоптоза, отсеивая, таким образом, потенциально перспективные соединения, не влияющие на эти параметры.

1.6. Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано три статьи. Основные положения доложены и обсуждены на научных семинарах лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клетки Института цитологии РАН, лаборатории Базовых исследований Национального института рака при Национальных институтах здоровья (США, Бетезда) и лаборатории Контроля клеточного цикла и туморогенеза Института молекулярной и клеточной биологии (Сингапур).

1.7. Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов и списка цитируемой литературы, содержащего 266 публикаций. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста и иллюстрирована 22 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Тимофеев, Олег Владимирович

6. ВЫВОДЫ

1. Инактивация гена фосфатазы Wipl (Ppmld1') подавляет способность клеток МЭФ, трансформированных комплементирующими парами онкогенов ElA+Hrasl, Hrasl+cMyc и Hrasl+Erbb2, образовывать опухоли.

2. Подавление опухолеобразования обусловлено накоплением ингибитора pl6INK4A, вызывающим снижение активности комплексов циклин Dl/Cdk4, а также белка P19ARF.

3. Активация киназы МКК6 в раковых клетках человека HeLa, приводящая к активации р38 киназы, снижает способность клеток к опухолеобразованию.

4. Опухоль-супрессорный эффект при инактивации Wipl или активации киназы р38 не зависит отр53.

5. Инактивация гена фосфатазы Wipl (Ppmld1') у мышей приводит к устойчивости к полипозу кишечника, вызванного мутацией АРС"'".

7. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимофеев О.В., Поспелова Т.В., Поспелов В.А. Функции p21Waf в норме и при стрессе. Молекулярная биология 2004, 38(3): 371-385.

2. Bulavin, D. V., Phillips, С., Nannenga, В., Timofeev, О., Donehower, L. A., Anderson, С. W., Appella, E., and Fornace, A. J., Jr. Inactivation of the Wipl phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38 MAPK-mediated activation of the pl6(Ink4a)-pl9(Arf) pathway. Nat.Genet. 2004; 36(4):343-350.

3. Timofeev, O.V., Ting Yi Lee, Bulavin D.V. A subtle change in p38 МАРК activity is sufficient to suppress in vivo tumorigenesis. Cell Cycle 2005, 4(1), 49-51. 1 2 3 4 5

6.

7,

8,

9.

10.

11.

12.

13.

14.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тимофеев, Олег Владимирович, 2005 год

1. Aberle,H., Bauer,A., Stappert,J., Kispert,A. & Kemler,R. 1997. beta-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway. EMBOJ. 16, 3797-3804.

2. Adams,R.H., Porras,A., Alonso,G., Jones,M., Vintersten,K., Panelli,S., Valladares,A., Perez,L., Klein,R. & Nebreda,A.R. 2000. Essential role of p38alpha MAP kinase in placental but not embryonic cardiovascular development. Mol. Cell 6, 109-116.

3. Ag garwal,B.B. 2004. Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell 6,203-208.

4. Alt,J. R., Cleveland,J.L., Hannink,M. & Diehl,J.A. 2000. Phosphorylation-dependent regulation of cyclin D1 nuclear export and cyclin D1-dependent cellular transformation. Genes Dev. 14,3102-3114.

5. Amanullah,A., Liebermann,D.A. & Hoffman,B. 2000. p53-independent apoptosis associated with c-Myc-mediated block in myeloid cell differentiation. Oncogene 19, 2967-2977.

6. Appella,E. & Anderson,C.W. 2001. Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses. Eur. J. Biochem. 268, 2764-2772.

7. Awad,M.M., Enslen,H., Boylan,J.M., Davis,R.J. & Gruppuso,P.A. 2000. Growth regulation via p38 mitogen-activated protein kinase in developing liver. J. Biol. Chem. 275,38716-38721.

8. Awad,M.M. & Gruppuso,P.A. 2000a. Cell cycle control during liver development in the rat: evidence indicating a role for cyclin D1 posttranscriptional regulation. Cell Growth Differ. 11, 325-334.

9. Awad,M.M. & Gruppuso,P.A. 2000b. Cell cycle control during liver development in the rat: evidence indicating a role for cyclin D1 posttranscriptional regulation. Cell Growth Differ. 11, 325-334.

10. Behr ens,J., von Kries,J.P., Kuhl,M., Bruhn,L., Wedlich,D., Grosschedl,R. & Birchmeier,W. 1996. Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1. Nature 382, 638-642.

11. Borisch, В., Semac,I., SoItermann,A., PaIomba,C. & Hoessli,D.C. 2001. Anti-CD20 treatments and the lymphocyte membrane: pathology for therapy. Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 85, 161-166.

12. Bowe, D.B., Kenney,N.J., Adereth,Y. & MarouIakou,I.G. 2002. Suppression of Neu-induced mammary tumor growth in cyclin D1 deficient mice is compensated for by cyclin E. Oncogene 21,291-298.

13. Bran cho,D., Tanaka,N., Jaeschke,A., Ventura,J.J., Kelkar,N., Tanaka,Y., Kyuuma,M., Takeshita,T., Flavell,R.A. & Davis,R.J. 2003. Mechanism of p38 MAP kinase activation in vivo. Genes Dev. 17, 1969-1978.

14. Bri ght-Thomas,R.M. & Hargest,R. 2003. APC, beta-Catenin and hTCF-4; an unholy trinity in the genesis of colorectal cancer. Eur. J. Surg. Oncol. 29, 107-117.

15. Brown,N.R., Nobl e,M.E., Lawrie,A.M., Morris,M.C., Tunnah,P., Divita,G., Johnson,L.N. & Endicott,J.A. 1999. Effects of phosphorylation of threonine 160 on cyclin-dependent kinase 2 structure and activity. J. Biol. Chem. 274, 8746-8756.

16. Bulavin,D.V., Amundso n,S.A. & Fornace,A.J. 2002a. p38 and Chkl kinases: different conductors for the G(2)/M checkpoint symphony. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 92-97.

17. Bulavin,D.V., Hi gashimoto,Y., Popoff,I.J., Gaarde,W.A., Basrur,V., Potapova,0., Appella,E. & Fornace,A.J., Jr. 2001. Initiation of a G2/M checkpoint after ultraviolet radiation requires p38 kinase. Nature 411, 102-107.

18. Bulavin,D.V., Saito,S., H oIIander,M.C., Sakaguchi,K., Anderson,C.W., Appella,E. & Fornace,A.J., Jr. 1999. Phosphorylation of human p53 by p38 kinase coordinates N-terminal phosphorylation and apoptosis in response to UV radiation. EMBOJ. 18, 68456854.

19. Campisi, J. 2001. Cellular senescence as a tumor-suppressor mechanism. Trends Cell Biol. 11, S27-S31.

20. Camps,M., Nichols,A. & ArkinstaIl,S. 2000. Dual specificity phosphatases: a gene family for control of MAP kinase function. FASEBJ. 14, 6-16.

21. Cangi,M.G., Cukor, В., Soung,P., Signoretti,S., Moreira,G., Jr., Ranashinge,M., Cady,B., Pagano,M. & Loda,M. 2000. Role of the Cdc25A phosphatase in human breast cancer. J. Clin. Invest 106,753-761.

22. Casanovas,0., Ja umot,M., Paules,A.B., Agell,N. & Bachs,0. 2004. P38SAPK2 phosphorylates cyclin D3 at Thr-283 and targets it for proteasomal degradation. Oncogene 23, 7537-7544.

23. Casanovas,0., Miro, F., Estanyol,J.M., Itarte,E., Agell,N. & Bachs,0. 2000. Osmotic stress regulates the stability of cyclin D1 in a p38SAPK2-dependent manner. J. Biol. Chem. 275, 35091-35097.

24. Chang, L. & Karin,M. 2001. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature 410, 37-40.

25. Cheng,M., Olivier,P., Di ehl,J.A., Fero,M., Roussel,M.F., Roberts,J.M. & Sherr,C.J. 1999. The p21(Cipl) and p27(Kipl) CDK 'inhibitors' are essential activators of cyclin D-dependent kinases in murine fibroblasts. EMBO J. 18, 1571-1583.

26. Choi, J., Appella,E. & Donehower,L.A. 2000. The structure and expression of the murine wildtype p53-induced phosphatase 1 (Wipl) gene. Genomics 64, 298-306.

27. Chun,K.S., Kim,S.H., So ng,Y.S. & Surh,Y.J. 2004. Celecoxib inhibits phorbol ester-induced expression of COX-2 and activation of AP-1 and p38 MAP kinase in mouse skin. Carcinogenesis 25, 713-722.

28. Collins,L.R., Minden,A., Karin,M. & Brown,J.H. 1996. Galphal2 stimulates c-JunNH2-terminal kinase through the small G proteins Ras and Rac. J. Biol. Chem. 271, 1734917353.

29. Cui,Y„ Kim,D.S., Park,S .H., Yoon,J.A., Kim,S.K., Kwon,S.B. & Park,K.C. 2004. Involvement of ERK AND p38 MAP kinase in AAPH-induced COX-2 expression in HaCaT cells. Chem. Phys. Lipids 129,43-52.

30. Danne nberg,A.J. & Subbaramaiah,K. 2003. Targeting cyclooxygenase-2 in human neoplasia: rationale and promise. Cancer Cell 4,431-436.

31. Datta,A., Na g,A., Pan,W., Hay,N., Gartel,A.L., Colamonici,0., Mori,Y. 8c Raychaudhuri,P. 2004. Myc-ARF (alternate reading frame) interaction inhibits the functions of Мус. J. Biol. Chem. 279, 36698-36707.

32. Datta,A., Na g,A. & Raychaudhuri,P. 2002. Differential regulation of E2F1, DPI, and the E2F1/DP1 complex by ARF. Mol. Cell Biol. 22, 8398-8408.

33. Deacon, K., Mistry,P., Chemoff,J., Blank,J.L. & Patel,R. 2003. p38 Mitogen-activated protein kinase mediates cell death and p21-activated kinase mediates cell survival during chemotherapeutic drug-induced mitotic arrest. Mol. Biol. Cell 14, 2071-2087.

34. Deak,M., Clifton ,A.D., Lucocq,L.M. & Alessi,D.R. 1998. Mitogen- and stress-activated protein kinase-1 (MSK1) is directly activated by МАРК and SAPK2/p38, and may mediate activation of CREB. EMBO J. 17,4426-4441.

35. Derijard, В., Raingeaud,J., Barrett,Т., Wu,I.H., Han,J., Ulevitch,R.J. 8c Davis,R.J. 1995b. Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms. Science 267, 682-685.

36. Derijard, В., Raingeaud,J., Barrett,Т., Wu,I.H., Han,J., Ulevitch,R.J. & Davis,R.J. 1995a. Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and MKK isoforms. Science 267, 682-685.

37. Diehl,J.A., Cheng,M., Roussel,M.F. & She rr,C.J. 1998. Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin D1 proteolysis and subcellular localization. Genes Dev. 12, 3499-3511.

38. Diehl,J.A., Zind y,F. & Sherr,C.J. 1997. Inhibition of cyclin D1 phosphorylation on threonine-286 prevents its rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev. 11,957-972.

39. Dietrich,W.F., Lander,E.S., Smith,J.S., Moser,A.R., Gould,K.A., Luongo,C., Borenstein,N. & Dove,W. 1993. Genetic identification of Mom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse. Cell 75, 631-639.

40. Dimri,G.P., Itahana,K., Acosta,M. & Campisi,J. 2000. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and pl4(ARF) tumor suppressor. Mol. Cell Biol. 20,273-285.

41. Donzelli,M. & Draetta, G.F. 2003. Regulating mammalian checkpoints through Cdc25 inactivation. EMBO Rep. 4,671-677.

42. Egan,S.E. & Weinberg,R.A. 1993. The pathway to signal achievement. Nature 365, 781783.

43. Enslen,H. & D avis,R.J. 2001. Regulation of MAP kinases by docking domains. Biol. Cell 93, 5-14.

44. Enslen,H., Raing eaud,J. & Davis,R.J. 1998. Selective activation of p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase isoforms by the MAP kinase kinases MKK3 and MKK6. J. Biol. Chem. 273, 1741-1748.54