Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, доктор биологических наук Томилин, Алексей Николаевич

• Томилин, Алексей Николаевич
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Томилин, Алексей Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Oct4 и его роль в онтогенезе мыши.

2.2. Предполагаемая роль Oct4 в соматических клетках.

2.3. POU-доменные димеры.

2.4. Взаимодействие POU домена с гетерогенными белками.

2.5. PIAS белки.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Плазмидные вектора.

3.2. Работа с ЭС клетками.

3.3. Генотипирование.

3.4. Работа с мышами.

3.5. СЭПГ.

3.6. Двугибридный скрининг.

3.7. Коиммунопреципитация.

3.8. Временная трансфекция.

3.9. Иммунологическая окраска.

3.10. Работа с лентивирусами.

3.11. Другие методы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Изучение роли Oct4 в первичных половых клетках.

4.1.1. Создание Oct4flox аллеля.

4.1.2. Подготовительные скрещивания.

4.1.3. Oct4 фенотип у взрослых самок.

4.1.4. Oct4 фенотип у взрослых самцов.

4.1.5. Oct4 фенотип у зародышей.

4.1.6. Судьба ППК без Oct4.

4.1.7. Обсужден ие.

4.2. (Изучение роли Oct4 в соматических стволовых клетках.

4.2.1. Нокаут Oct4 в эпителии кишечника.

4.2.2. Нокаут Oct4 в костном мозге.

4.2.3. Нокаут Oct4 в печени.

4.2.4. Нокаут Oct4 в ЦНС.

4.2.5. Нокаут Oct4 в волосяных фолликулах.

4.2.6. Обсуждение.

4.3. Регуляция транскрипции димерами POU-доменными белками.

4.3.1. Новая димерная конформация на мотиве MORE.

4.3.2. Селективное рекрутирование OBF1 PORE-димером.

4.3.3. Vn-OBFl парадокс.

4.3.4. OBF1 как мощный стабилизатор PORE-димеров.

4.3.5. Фосфорилирование селективно регулирует димеризацию.

4.3.6. Обсужден ие.

4.4. Модуляция активности Oct4 белками семейства PIAS.

4.4.1. Oct4 и PIASy взаимодействуют in vivo.

4.4.2. PIASy не является SUMO-лигазой для Oct4.

4.4.3. PIASy суппресирут активность Oct4.

4.4.4. PIAS белки релокализуют Oct4.

4.4.5. PIASy и Oct4 в предимплантационномразвитии.

4.4.6. Обсуждение.

4.5. Леитиврусы для ткаие-специфических генных манипуляций.

4.5.1. Лентивирусы не проходят через барьер ТЭ.

4.5.2. Обсуждение.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих»

Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, впервые полученные в 80-е годы из ранних эмбрионов мыши, уже на протяжении более чем двух десятилетий остаются важным инструментом для изучения функции генов методом нокаута. Признание важности этого открытия нашло свое отражение в Нобелевской премии за 2007 г., присуждённой Эвансу, Капекки и Смитису. Изолированные из внутренней клеточной массы бластоцисты, ЭС клетки способны неограниченно долго делиться в культуре, а также подвергаться генетическому манипулированию (мутагенезу через гомологичную рекомбинацию или введение трансгенов), сохраняя свои свойства. Путём изменения условий культивирования можно добиваться дифференцировки ЭС клеток in vitro практически во все клеточные типы тканей взрослой мыши (за исключением двух внезародышевых клеточных типов — трофэктодермы и первичной эндодермы). После подсадки в доимплантационные эмбрионы, ЭС клетки способны встраиваться в ткани, происходящие из всех трех зародышевых листков и, что существенно для успешного проведения генного нокаута, в линию половых клеток, обеспечивая, таким образом, передачу введенных генных мутаций следующему поколению. Описанные свойства обозначаются словом "плюрипотентность". Неотъемлемым компонентом регулярного аппарата ядра, обеспечивающим поддержание плюрипотентности, является POU домен-содержащий транскрипционный фактор Oct4.

В 1998 г. Томсоном были впервые получены ЭС клетки человека (Thomson et al., 1998), что открыло путь для использования этих клеток в заместительной терапии и дало следующий мощный стимул исследованиям в области биологии стволовых клеток. Вопрос о том, являются эти клетки действительно ЭС клетками в полном смысле этого слова, остается до сих пор отрытым, а получение доказательства их плюрипотентности через способность дифференцироваться во все зародышевые листки in vivo после подсадки в ранние эмбрионы по известным причинам на человеке невозможно. Однако некоторые признаки, такие как независимость от LIF и зависимость от bFGF при культивировании позволяет скорее отнести их к эпибластным стволовым клеткам (ЭпиС, от англ. EpiSC), недавно описанным для мыши и крысы (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007). Ha сегодняшний день получены уже несколько десятков линий ЭС клеток человека, стали известны некоторые молекулярные и генетические аспекты механизма регуляции самообновления и плюрипотентности ЭС клеток мыши и человека, идут широкомасштабные работы по оптимизации методов их дифференцировки в различные клеточные типы. Однако очевидны и серьёзные ограничения, заметно отдаляющие перспективу применения ЭС клеток в клинической практике, какими являются (а) туморогенность и (б) отсутствие этих клеток во взрослом организме с возникающей вследствие этого проблемой иммунной несовместимости при аллогенной трансплантации дифференцированных производных от уже полученных человеческих ЭС линий.

Первая трудность пока еще ждет своего решения, тогда как для решения второй уже предложены несколько подходов. Во-первых, создание банков человеческих ЭС клеток, охватывающих все HLA типы, поможет решить эту проблему, но это, по-видимому, будет (если будет) реализовано только в отдаленной перспективе. Во-вторых, терапевтическое клонирование было предложено как альтернативный метод получения аутологичных (пациент-совместимых) ЭС клеток. При гаком подходе ядра соматических клеток пациента подсаживают в безъядерные ооциты. ЭС клетки затем получают в культуре из развившихся клонированных бластоцист. Это весьма дорогостоящий и малоэффективный метод, который к тому же предполагает уничтожение доимплантационных человеческих эмбрионов, что запрещено в некоторых странах по этическим соображениям. Поэтому получение аутологичных ЭС или подобных клеток непосредственно из соматических клеток пациента, не прибегающее к терапевтическому клонированию, представлялось крайне актуальным. Подобная идея доказала свою состоятельность, когда одна группа из Киотского университета путём простого перебора различных комбинаций из 24 генов, экспрессия которых ассоциирована с ЭС фенотипом, показала возможность индукции плюрипотентного состояния соматических клеток (МЭФ) при помощи форсированной генной экспрессии (Takahashi and Yamanaka, 2006). Как оказалось, экспрессии 4 транскрипционных факторов Oct4, Sox2, сМус и Klf4, доставленных в фибробласты при помощи ретровирусных векторов, на протяжении нескольких дней было достаточно для получения иПС клеток. Полученные иПС клетки обладали всеми свойствами, присущими ЭС клеткам мыши, т.е. способностью самообновляться и дифференцироваться in vivo и in vitro во все эмбриональные типы клеток, включая половые клетки. За последующие 3 года вышло большое количество работ по данной тематике, описавших альтернативные комбинации транскрипционных факторов, улучшающие эффективность получения иПС клеток у разных видов (включая человека), предложивших различные способы доставки (вирусный, плазмидный, транспозонпый, белковый), использовавших различные исходные соматические клеточные типы для получения иПС клеток и т. д. (Ellis et al., 2009; Maherali and Hochedlinger, 2008). Стало совершенно понятно, что клеточная терапия, основанная в первую очередь на иПС клетках, уже в ближайшие годы сулит здоровью человечества огромные выгоды.

Примечательно, что во всех используемых комбинациях транскрипционных факторов и при всех условиях культивирования для успешной индукции плюрипотентности в соматических клетках было абсолютно необходимо введение POU-доменного транскрипционного фактора Oct4, тогда как введение остальных факторов не было обязательным. Диссертация посвящена изучению молекулярных механизмов действия этого ключевого для плюрипотентности белка и его партнеров, его роли в онтогенезе мыши.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Томилин, Алексей Николаевич

5. ВЫВОДЫ

1. В отличие от трофоблаетной дифференцировки плюрипотетных клеток ранних зародышей мышей, их непосредственные потомки - ППК - при генетическом нокаутировании гена Oct4 подвергаются апоптотической гибели, что указывает на плейотропные функции в развитии клеток «полового пути».

2. Ген Oct4 не экспрессируется и не нужен для самообновления и дифференцировки взрослых соматических стволовых клеток, таких как нейрональиые стволовые клетки, КСК и МСК костного мозга, а также стволовые клетки крипты эпителия кишечника, печени, и волосяного фолликула.

3. Существует новый класс с «--элементов в ДНК (MORE), опосредующих связывание гомо- и гетеродимеров Oct-факторов в ранее не описанной конфигурации, что было подтверждено после определения молекулярной структуры MORE и ранее описанного PORE типа POU димеров. Фосфорилирование серинов и треонинов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях внутри PORE и MORE типов POU димеров, играет важную биологическую роль в селективной регуляции димеризации по двум описанным типам.

4. Димерный комплекс Octl, образованный на PORE, способен рекрутировать изветный лимфоидный коактиватор ОсаВ и, тем самым, стимулировать транскрипцию, в то время как конфигурация POU димера, образованного на MORE ДНК, является непермиссивной для взаимодействия с ОсаВ.

5. Описанные ранее как «гептамерные/октамерные» сайты из семейства промоторов генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH) представляют собой природные MORE элементы, которые также непермисивны для ОсаВ.

6. ОсаВ может выступать в роли мощного стабилизатора димера Octl на PORE ДНК, а также в роли коактиватора, существенно ослабляющего требования к специфичности в последовательности PORE. Полученные нами данные предполагают альтернативное соединение POUs и POUH суб-доменов в димерном Octl/PORE комплексе в присутствии ОсаВ.

7. PIASy, один из известных членов семейства SUMO лигаз, является впервые описанным негативным транскрипционным ко-регулятором Oct4, способным взаимодействовать с POU доменом Oct4 через свой SAP домен и репрессировать (независимо от его SUMO-лигазной активности) Oct4-опосредованную транскрипционную активацию посредством релокализации Oct4 на периферию ядра.

8. Лентивирусы способны заражать ТЭ бластоцисты, однако, ввиду эпителиальной природы последней, не способны проникать через нее и заражать клетки ВКМ. Данное свойство лентивирусов может быть использовано в функциональной генетике мыши для тканеспецифических генных манипуляций.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Томилин, Алексей Николаевич, 2009 год

1. Anderson, R., Copeland, Т.К., Scholer, H., Heasman, J., and Wylie, C. (2000). The onset of germ cell migration in the mouse embryo. Mech Dev 91, 61-68.

2. Boiani, M., Eckardt, S., Scholer, H.R., and McLaughlin, K.J. (2002). Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev 16, 12091219.

3. Botquin, V., Hess, H., Fuhrmann, G., Anastassiadis, C., Gross, M.K., Vriend, G., and Scholer, H.R. (1998). New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev 12, 2073-2090.

4. Boyer, L.A., Lee, T.I., Cole, M.F., Johnstone, S.E., Levine, S.S., Zucker, J.P., Guenther, M.G., Kumar, R.M., Murray, H.L., Jenncr, R.G., et al. (2005). Coretranscriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 122, 947-956.

5. Brehm, A., Ohbo, K., Zwerschke, W., Botquin, V., Jansen-Durr, P., and Scholer, H.R. (1999a). Synergism with germ line transcription factor Oct-4: viral oncoproteins share the ability to mimic a stem cell-specific activity. Mol Cell Biol 19, 2635-2643.

6. Brehm, A., Ohbo, K., Zwerschke, W., Botquin, V., Jansen-Durr, P., and Scholer, H.R. (1999b). Synergism with germ line transcription factor Oct-4: viral oncoproteins share the ability to mimic a stem cell-specific activity. Mol Cell Biol 19, 2635-2643.

7. Butteroni, C., De Felici, M., Scholer, H.R., and Pesce, M. (2000). Phage displayscreening reveals an association between germline-specific transcription factor Oct-4 and multiple ccllular proteins. J Mol Biol 304, 529-540.

8. Casellas, R., Jankovic, M., Meyer, G., Gazumyan, A., Luo, Y., Roeder, R., and

9. Nussenzweig, M. (2002). OcaB is required for normal transcription and V(D)J recombination of a subset of immunoglobulin kappa genes. Cell 110, 575-585.

10. Chasman, D., Cepek, K., Sharp, P.A., and Pabo, C.O. (1999). Crystal structure of an OCA-B peptide bound to an Oct-1 POU domain/octamer DNA complex: specific recognition of a protein-DNA interface. Genes Dev 13, 2650-2657.

11. Chen, X., Fang, F., Liou, Y.C., and Ng, H.H. (2008). Zfpl43 regulates Nanog through modulation of Oct4 binding. Stem Cells 26, 2759-2767.

12. Cook, A.L., and Sturm, R.A. (2008). POU domain transcription factors: BRN2 as aregulator of melanocytic growth and tumourigenesis. Pigment Cell Melanoma Res 27,611-626.

13. De Miguel, M.P., Cheng, L., Holland, E.C., Federspiel, M.J., and Donovan, P.J. (2002). Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retro viral-mediated gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 10458-10463.

14. Donohoe, M.E., Silva, S.S., Pinter, S.F., Xu, N., and Lee, J.T. (2009). The pluripotency factor Oct4 interacts with Ctcf and also controls X-chromosome pairing and counting. Nature 460, 128-132.

15. Donovan, P.J., and de Miguel, M.P. (2003). Turning germ cells into stem cells. Сип-Орт Genet Dev 13, 463-471.el Marjou, F., Janssen, K.P., Chang, B.H., Li, M., Hindie, V., Chan, L., Louvard, D.,

16. Chambon, P., Metzger, D., and Robine, S. (2004). Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis 39, 186-193.

17. Feldman, N., Gerson, A., Fang, J., Li, E., Zhang, Y., Shinkai, Y., Cedar, H., and

18. Bergman, Y. (2006). G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. Nat Cell Biol 8, 188-194.

19. Ginsburg, M., Snow, M.H., and McLaren, A. (1990). Primordial germ cells in the mouse embiyo during gastrulation. Development 110, 521-528.

20. Gu, H., Marth, J.D., Orban, P.C., Mossmann, H., and Rajewsky, K. (1994). Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science 265, 103-106.

21. Herr, W., and Cleaiy, M.A. (1995). The POU domain: versatility in transcriptionalregulation by a flexible two-in-one DNA-binding domain. Genes Dev 9, 16791693.

22. Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., and Jaenisch, R. (2005). Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell 121, 465-477.

23. Hogan, B. (1994). Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, 2nd edn (Plainview, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

24. Jacobson, E.M., Li, P., Leon-del-Rio, A., Rosenfeld, M.G., and Aggarwal, A.K. (1997). Structure of Pit-1 POU domain bound to DNA as a dimer: unexpected arrangement and flexibility. Genes Dev 11, 198-212.

25. Kang, J., Gemberling, M., Nakamura, M., Whitby, F.G., Handa, H., Fairbrother, W.G., and Tantin, D. (2009a). A general mechanism for transcription regulation by Octl and Oct4 in response to genotoxic and oxidative stress. Genes Dev 23, 208-222.

26. Kang, J., Shaky a, A., and Tantin, D. (2009b). Stem cells, stress, metabolism and cancer: a drama in two Octs. Trends Biochem Sci 34, 491-499.

27. Kemler, I., Schreiber, E., Muller, M.M., Matthias, P., and Schaffner, W. (1989).

28. Octamer transcription factors bind to two different sequence motifs of the immunoglobulin heavy chain promoter. EMBO J 8, 2001-2008.

29. Kim, U., Qin, X.F., Gong, S., Stevens, S., Luo, Y., Nussenzweig, M., and Roeder, R.G. (1996). The B-cell-specific transcription coactivator OCA-B/OBF-l/Bob-1 is essential for normal production of immunoglobulin isotypes. Nature 383, 542547.

30. Klemm, J.D., Rould, M.A., Aurora, R., Herr, W., and Pabo, C.O. (1994). Crystalstructure of the Oct-1 POU domain bound to an octamer site: DNA recognition with tethered DNA-binding modules. Cell 77, 21-32.

31. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., andRajewsky, K. (1995). Inducible gene targeting in mice. Science 269, 1427-1429.

32. Maherali, N., and Hochedlinger, K. (2008). Guidelines and techniques for thegeneration of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 3, 595-605.

33. Mangelsdorf, D.J., and Evans, R.M. (1995). The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell 83, 841-850.

34. McLaren, A. (2000). Germ and somatic cell lineages in the developing gonad. Mol Cell Endocrinol 163, 3-9.

35. Morris, R.J., Liu, Y., Maries, L., Yang, Z., Trempus, C., Li, S., Lin, J.S., Sawicki, J.A., and Cotsarelis, G. (2004). Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 22, 411-417.

36. Nagy, A. (2003). Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, 3rd edn (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

37. Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E.M., Prideaux, V.R., Ivanyi, E., Markkula, M., and Rossant, J. (1990). Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development 110, 815-821.

38. Nichols, J., Zevnik, В., Anastassiadis, K., Niwa, H., Klewe-Nebenius, D., Chambers, I., Scholer, H., and Smith, A. (1998). Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 95, 379-391.

39. Niwa, FI., Miyazaki, J., and Smith, A.G. (2000). Quantitative expression of Oct-3/4defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet 24, 372-376.

40. Niwa, H., Toyooka, Y., Shimosato, D., Strumpf, D., Takahashi, K., Yagi, R., and Rossant, J. (2005). Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell 123, 917-929.

41. Okumura-Nakanishi, S., Saito, M., Niwa, H., and Ishikawa, F. (2005). Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J Biol Chem 280, 5307-5317.

42. Palmieri, S.L., Peter, W., Hess, FI., and Scholer, H.R. (1994). Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the firsttwo extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol 166, 259267.

43. Pesce, M., Gross, M.K., and Scholer, H.R. (1998a). In line with our ancestors: Oct-4 and the mammalian germ. Bioessays 20, 722-732.

44. Pesce, M., Wang, X., Wolgemuth, D.J., and Scholer, H. (1998b). Differential expression of the Oct-4 transcription factor during mouse germ cell differentiation. Mech Dev 71, 89-98.

45. Poellinger, L., Yoza, B.K., and Roeder, R.G. (1989). Functional cooperativity between protein molecules bound at two distinct sequence elements of the immunoglobulin heavy-chain promoter. Nature 337, 573-576.

46. Remenyi, A., Lins, K., Nissen, L.J., Reinbold, R., Scholer, H.R., and Wilmanns, M. (2003). Crystal structure of a POU/HMG/DNA ternary complex suggests differential assembly of Oct4 and Sox2 on two enhancers. Genes Dev 17, 20482059.

47. Remenyi, A., Pohl, E., Scholer, H.R., and Wilmanns, M. (2001a). Crystallization of redox-insensitive Octl POU domain with different DNA-response elements. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57, 1634-1638.

48. Remenyi, A., Tomilin, A., Pohl, E., Lins, K., Philippsen, A., Reinbold, R., Scholer, H.R., and Wilmanns, M. (2001b). Differential dimer activities of the transcription factor Oct-1 by DNA-induced interface swapping. Mol Cell 8, 569-580.

49. Rodda, D.J., Chew, J.L., Lim, L.H., Loh, Y.H., Wang, В., Ng, H.H., and Robson, P.2005). Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J Biol Chem 280, 24731-24737.

50. Rodriguez, M.S., Dargemont, C., and Hay, R.T. (2001). SUMO-1 conjugation in vivo requires both a consensus modification motif and nuclear targeting. J Biol Chem 276, 12654-12659.

51. Rosner, M.H., Vigano, M.A., Ozato, K., Timmons, P.M., Poirier, F., Rigby, P.W., and Staudt, L.M. (1990). A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature 345, 686-692.

52. Roth, W., Sustmann, C., Kieslinger, M., Gilmozzi, A., Irmer, D., Kremmer, E., Turck, C., and Grosschedl, R. (2004). PIASy-deficient mice display modest dcfects in IFN and Wnt signaling. J Immunol 173, 6189-6199.

53. Ryan, A.K., and Rosenfcld, M.G. (1997). POU domain family values: flexibility, partnerships, and developmental codes. Genes Dev 11, 1207-1225.

54. Sachdev, S., Bruhn, L., Sieber, H., Pichler, A., Melchior, F., and Grosschedl, R. (2001). PIASy, a nuclear matrix-associated SUMO E3 ligase, represses LEF1 activity by sequestration into nuclear bodies. Genes Dev 15, 3088-3103.

55. Scholer, H.R. (1991). Octamania: the POU factors in murine development. Trends Genet 7, 323-329.

56. Scholer, H.R., Ciesiolka, Т., and Gruss, P. (1991a). A nexus between Oct-4 and El A: implications for gene regulation in embryonic stem cells. Cell 66, 291-304.

57. Scholer, H.R., Ciesiolka, Т., and Gruss, P. (1991b). A nexus between Oct-4 and El A: implications for gene regulation in embryonic stem cells. Cell 66, 291-304.

58. Scholer, H.R., Dressier, G.R., Balling, R., Rohdewohld, H., and Gruss, P. (1990a). Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. EMBO J 9, 2185-2195.

59. Scholer, H.R., Hatzopoulos, A.K., Balling, R., Suzuki, N., and Gruss, P. (1989). A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J 8, 25432550.

60. Scholer, H.R., Ruppert, S., Suzuki, N., Chowdhury, K., and Gruss, P. (1990b). Newtype of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature 344, 435-439.

61. Schubart, D.B., Rolink, A., Kosco-Vilbois, M.H., Botteri, F., and Matthias, P. (1996).

62. B-cell-specific coactivator OBF-1/OCA-B/Bobl required for immune response and germinal centre formation. Nature 383, 538-542.

63. Stallock, J., Molyneaux, K., Schaible, K., Knudson, C.M., and Wylie, C. (2003). The pro-apoptotic gene Bax is required for the death of ectopic primordial germ cells during their migration in the mouse embryo. Development 130, 65896597.

64. Staudt, L.M., Singh, H., Sen, R., Wirth, Т., Sharp, P.A., and Baltimore, D. (1986). A lymphoid-speeific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes. Nature 323, 640-643.

65. Surani, M.A. (2001). Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. Nature 414, 122-128.

66. Surani, M.A., and McLaren, A. (2006). Stem cells: a new route to rejuvenation. Nature 443, 284-285.

67. Tadokoro, Y., Yomogida, K., Ohta, H., Tohda, A., and Nishimune, Y. (2002).

68. Homeostatic regulation of germinal stem cell proliferation by the GDNF/FSH pathway. Mech Dev 113, 29-39.

69. Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676.

70. Tanaka, M., Hadjantonakis, A.K., and Nagy, A. (2001). Aggregation chimeras.

71. Combining ES cells, diploid and tetraploid embryos. Methods Mol Biol 158, 135-154.

72. Tesar, P.J., Chenoweth, J.G., Brook, F.A., Davies, T.J., Evans, E.P., Mack, D.L.,

73. Gardner, R.L., and McKay, R.D. (2007). New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature 448, 196-199.

74. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J.,

75. Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147.

76. Tokuda, M., Kadokawa, Y., Kurahashi, H., and Marunouchi, T. (2007). CDH1 is a specific marker for undifferentiated spermatogonia in mouse testes. Biol Reprod 76, 130-141.

77. Tolkunova, E., Cavaleri, F., Eckardt, S., Reinbold, R., Christenson, L.K., Scholer, H.R., and Tomilin, A. (2006). The caudal-related protein cdx2 promotes trophoblast differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells 24, 139-144.

78. Tolkunova, E., Malashicheva, A., Parfenov, V.N., Sustmann, C., Grosschedl, R., and Tomilin, A. (2007). PIAS proteins as repressors of Oct4 function. J Mol Biol 374, 1200-1212.

79. Tomilin, A., Remenyi, A., Lins, К., Bak, H., Leidel, S., Vriend, G., Wilmanns, M., and Scholer, H.R. (2000). Synergism with the coactivator OBF-1 (OCA-B, BOB-1) is mediated by a specific POU dimer configuration. Cell 103, 853-864.

80. Tomioka, M., Nishimoto, M., Miyagi, S., Katayanagi, Т., Fukui, N., Niwa, H.,

81. Muramatsu, M., and Okuda, A. (2002). Identification of Sox-2 regulatory region which is under the control of Oct-3/4-Sox-2 complex. Nucleic Acids Res 30, 3202-3213.

82. Torres, R.M., and Kiihn, R. (1997). Laboratory protocols for conditional gene targeting (Oxford ; New York, Oxford Uninversity Press).

83. Trono, D. (2002). Lentiviral vectors (Berlin ; New York, Springer).

84. Venter, J.C., Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., Sutton, G.G., Smith, H.O., Yandell, M., Evans, C.A., Holt, R.A., et al. (2001). The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351.

85. Verrijzer, C.P., and Van der Vliet, P.C. (1993). POU domain transcription factors. Biochim Biophys Acta 1173, 1-21.

86. Voss, J.W., Wilson, L., and Rosenfeld, M.G. (1991). POU-domain proteins Pit-1 and Oct-1 interact to form a heteromeric complex and can cooperate to induce expression of the prolactin promoter. Genes Dev 5, 1309-1320.

87. Wang, J., Rao, S., Chu, J., Shen, X., Levasseur, D.N., Theunissen, T.W., and Orkin,

88. S.H. (2006). A protein interaction network for pluripotency of embryonic stem cells. Nature 444, 364-368.

89. Wassarman, P.M., and DePamphilis, M.L. (1993). Guide to techniques in mouse development (San Diego, Academic Press).

90. Wei, F., Scholer, H.R., and Atchison, M.L. (2007). Sumoylation of Oct4 enhances its stability, DNA binding, and transactivation. J Biol Chem 282, 21551-21560.

91. Wiznerowicz, M., and Trono, D. (2003). Conditional suppression of cellular genes:lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol 77, 89578961.

92. Yamaguchi, S., Yamazaki, Y., Ishikawa, Y., Kawaguchi, N., Mukai, H., andNakamura, T. (2005). EWSR1 is fused to POU5F1 in a bone tumor with translocation t(6;22)(p21;ql2). Genes Chromosomes Cancer 43, 217-222.

93. Yeom, Y.I., Fuhrmann, G., Ovitt, C.E., Brehm, A., Ohbo, K., Gross, M., Hubner, K.,and Scholer, H.R. (1996). Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells. Development 122, 881-894.

94. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C., and Dailey, L. (1995). Developmental-specificactivity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3. Genes Dev 9, 2635-2645.

95. Zhao, G.Q., and Garbers, D.L. (2002). Male germ cell specification and differentiation. Dev Cell 2, 537-547.