Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Горин, Андрей Олегович

• Горин, Андрей Олегович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Горин, Андрей Олегович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Злокачественные опухоли и механизм их образования

1.2 Рецептор эпидермального фактора роста и его роль в клетках опухолей

1.2.1 Строение рецептора эпидермального фактора роста

1.2.2 Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста

1.2.3 Путь эндоцитоза и деградации рецептора эпидермального фактора роста

1.2.4 Блокаторы рецептора эпидермального фактора роста

1.3 Исследование взаимодействия сигнальных путей при помощи синтетической летальности

1.4 Биосинтез стеролов их роль и в клетках

1.4.1 Путь биосинтеза стеролов

1.4.2 С4-деметилирующий комплекс

1.5 Метаболизм стеролов и опухоли

1.6 Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Реактивы и оборудование

2.2 Объекты исследования

2.2.1 Объекты исследования in vitro

2.2.2 Объекты исследования in vivo

2.3 Трансфекция клеток с помощью малой интерферирующей РНК

2.4 Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга

2.5 Анализ выживаемости клеток

2.6 Анализ апоптоза

2.7 Иммунопреципитация и анализ убиквитинилирования рецептора ЭФР

2.8 Иммунофлуоресценция и анализ колоколизации сигналов

2.9 Проточная цитометрия

2.10 Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Увеличение чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста

3.2 Изменение стерольного профиля клеток при блокаде биосинтеза стеролов на различных участках

3.3 Влияние добавления метаболитов на жизнеспособность клеток

3.4 Карта взаимодействий ортолога гена 8С4МОЬ в дрожжах ЗассИагошусев сегеуівіае

3.5 Влияние блокады биосинтеза стеролов на эндоцитоз и деградацию рецептора эпидермального фактора роста

3.6 Влияние блокады биосинтеза стеролов на сигнальную активность рецептора ЭФР

3.7 Влияние блокады биосинтеза стеролов на рост ксенографтных

опухолей у мышей

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

^ЭНЕ - ЫАО(Р)-81его1с1-ёеЬус1го§епа8е-Нке - декарбоксилаза из С4-

деметилирующего комплекса

РАКР - поли(АДФ-рибоза)-полимераза

8С4МОЬ - 81его1-С4-шеЛу1-охуёа8е-Нке - С4-метилоксидаза из С4-деметилирующего комплекса ГМГ - З-гидрокси-З-метилглутарил ЭФР - эпидермальный фактор роста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в XXI веке. Так как опухоль представляет собой совокупность бесконтрольно делящихся клеток, то для терапии опухолей самой предпочтительной мишенью является блокада сигнальных путей, ответственных за запуск митотических процессов. Одним из ключевых механизмов проведения таких сигнальных путей является рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР), стимулирующий деление клеток после активации факторами роста. Это привело к созданию многочисленных блокаторов этого рецептора, которые показали хорошие результаты при исследованиях in vitro (Jimeno and Hidalgo, 2005; Laskin and Sandler, 2004). Однако в клинической практике блокада рецептора ЭФР оказалась значительно ниже предполагаемой вследствие развития опухолями первичной или приобретенной резистентности к используемым препаратам (Hopper-Borge et al., 2009).

Таким образом, поиск способов усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР является крайне актуальной проблемой современной онкологии, над котороый работают многочисленные лаборатории в России и за рубежом. Большинство опубликованных по данной теме работ направлены на изменение структуры самого лекарственного средства для усиления его эффективности и уменьшения вероятности развития резистентности клетками опухолей (Elloumi et al., 2012).

В данной работе был использован новый подход к увеличению эффективности блокаторов рецептора ЭФР. Во многих случаях причиной развития приобретенной резистентности является запуск альтернативных сигнальных путей, поэтому в качестве основы для работы было взято устранение этого обхода. Сигнальная система клеток представляет собой огромную сеть пересекающихся путей, которые до сих пор остаются не до конца изученными. Так как спрогнозировать путь обхода клеткой опухоли блокады рецептора на современном этапе не представляется возможным, то в качестве средства поиска альтернативных путей использовались

опубликованные скрининговые исследования, указывающие точечно на гены, которые при их блокаде могут усилить эффект ингибирования рецептора ЭФР (Astsaturov et al., 2010).

Для сужения огромных баз данных были выбраны гены, относящиеся только к пути метаболизма стеролов. Блокада биосинтеза холестерола сама по себе была описана в качестве способа замедления роста опухоли (Israel and Schwartz, 2011), и вместе с сенситизирующим эффектом к ингибиторам рецептора ЭФР может оказаться эффективным средством в терапии опухолей.

В соответствии с вышеизложенным в данной работе была поставлена цель - описать механизм влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР.

2. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы.

3. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов.

4. Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

Научная новизна

В данной работе было впервые исследовано взаимодействие пути биосинтеза стеролов с сигнальным путем рецептора ЭФР. Показано, что эффект на жизнеспособность опухолевых клеток оказывает не сам факт блокады пути, а точечное ингибирование активности определенных генов, кодирующих этап С4-деметилирования предшественника холестерола. При этом было впервые описано, что эти гены контролируют такой общий клеточный процесс, как везикулярный транспорт, что не относится к их

непосредственной функции. Это изменение движения везикул и является основной причиной развития опухолями сенситизации к лечению блокаторами рецептора ЭФР. Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты представляют интерес для разработки новых лекарственных препаратов, которые будут усиливать эффект лечения пациентов антагонистами рецептора ЭФР, а также будут препятствовать развитию приобретенной резистентности опухолевыми клетками к данной терапии.

Кроме этого описанные взаимодействия являются крайне интересными для понимания процессов внутриклеточного везикулярного транспорта, так как описан абсолютно новый механизм модификации данного процесса посредством блокирования генов из пути биосинтеза стеролов. Таким образом, полученные данные представляют интерес как с практической точки зрения в качестве лекарственного препарата, так и с точки зрения таких теоретических дисциплин, как молекулярная биология и биохимия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование двух ферментов С4-деметилирующего комплекса из пути биосинтеза стеролов увеличивают чувствительность опухолевых клеток к блокаде рецептора ЭФР.

2. Блокада С4-деметилирования приводит к изменению внутриклеточного движения везикул, что в результате ускоряет лизосомальную деградацию рецептора ЭФР.

3. Рост ксенографтных опухолей с выключенным ферментом из пути С4-деметилирования подавляется практически полностью лечением блокаторами рецептора ЭФР.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на ежегодных конференциях «Актуальные проблемы биохимии и нанотехнологии» (Казань, 2012 и 2013),

на III Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2012; приз за лучший устный доклад), на 50-й ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (Филадельфия, США, 2010), на 13-й конференции онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2011; второе место в постерной сессии), на конференции «Метаболизм и опухоль» Американской ассоциации исследования опухоли (Балтимор, США, 2011), на конференции «Молекулярные мишени и терапия опухоли» Американской ассоциации исследования опухоли (Сан-Франциско, США, 2011), на I конференции университета Тэмпл (Филадельфия, США, 2012). Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в список ВАК и 2 публикации в журналах базы SCOPUS. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок. Библиография включает 141 наименование.

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Злокачественные опухоли и механизм их образования

Злокачественные опухоли составляют около 15% всех причин смертности и стоят на втором месте по этому показателю после сердечнососудистых заболеваний. В 2010 году в России было зарегистрировано более 500 тысяч новых случаев злокачественных новообразований и 290 тысяч связанных с ними смертей. При этом за последние десять лет число случаев появления опухолей выросло более, чем на 15% [Чиссов и др., 2011]. Таким образом, проблема онкологических заболеваний является крайне актуальной для России в настоящее время.

Опухоль - это патологический процесс, представленный новообразованной тканью, в которой изменения генетического аппарата приводит к нарушению регуляции роста и дифференцировки клеток. Злокачественные опухоли являются наихудшим течением заболевания, которое характеризуется клеточным и тканевым атипизмом, наличием малодифференцированных клеток, быстрым инфильтрирующим ростом, склонностью к метастазированию и рецидивированию, что в совокупности негативно влияет на общее состояние организма. Опухоль является генетическим заболеванием, те есть для ее образования необходимым событием является мутация. При этом нарушается функционирование генетического аппарата, регулирующего деление и дифференцировку клетки. К формированию опухолевой клетки могут привести мутации, активирующие онкогены или подавляющие гены-супрессоры опухолей. Онкогенами называются гены, повышение активности которых приводит к злокачественной трансформации клетки. В обычном, неактивном, состоянии такие гены называются протоонкогенами. В результате генетических изменений, приводящих в активирующей мутации или гиперпродукции этих генов, происходит стимуляция клеточного деления. К онкогенам относятся гены факторов роста и их рецепторов, белков МАР-киназного каскада и ряд

других генов. Гены-супрессоры опухолей, также называемые антионкогенами, являются отрицательными регуляторами клеточного деления. Они сдерживают чрезмерную стимуляцию деления, поэтому их функционирование необходимо для нормальной жизнедеятельности клетки. Потеря их функции ведет к злокачественному перерождению клеток, то есть их малигнизации. Основными генами-супрессорами опухолей являются ТР53 и RB, регулирующие клеточный цикл, и PTEN, ингибирующий митогенные пути рецепторов факторов роста.

Канцерогенез, процесс образования опухоли, начинается с исходной мутации в одной клетке. Причиной этой мутации может быть химическое, физическое или вирусное воздействия. В результате такая клетка получает преимущество в делении перед соседними, что приводит к образованию все большего числа клонов, несущих мутацию. Важным отличием опухолевых клеток от нормальных является геномная нестабильность, развивающаяся в результате дефектов в системах репарации ДНК (Lengauer et al., 1998; Martin et al., 2010). В результате этого увеличивается вероятность появления новых, вторичных, мутаций, которые могут также оказаться онкогенными и придать данной клетке дополнительное преимущество в делении. Таким образом, каждая опухоль приобретает специфический набор мутаций.

Классическим средством для терапии опухолей с 1940-х гг. являются цитотоксические препараты, которые представляют собой ДНК-повреждающие агенты (Чу и др., 2008). Так как в клетках опухолей нарушены процессы репарации, то они становятся более чувствительными к повреждению ДНК, чем нормальные клетки. Тем не менее, этого небольшого воздействия на нормальные клетки достаточно для развития сильных побочных эффектов. Для более специфического эффекта в последние годы все шире применяется таргетная терапия, воздействующая на определенную молекулярную мишень данной опухоли (Имянитов, 2010; Hortobagyi, 2004). Таргетная терапия подбирается индивидуально для каждого случая опухоли, исходя из обнаруженных генетических изменений. При этом существенно

снижается количество побочных эффектов, так как таргетные лекарства не воздействуют на нормальные клетки, не несущие мутаций. К таргетным препаратам относятся блокаторы рецепторов факторов роста, мутантных белков, онкогенных сигнальных молекул и ряд других. Особенно эффективными таргетные препараты оказываются в случае опухолей, несущих только одну мутацию, так как блокада одной мишени останавливает патологическое стимулирование деления.

Но, несмотря на большие достижения за 60 лет исследований, современный уровень лечения онкологических заболеваний остается далеким от идеального. Смертность от опухолей остается на крайне высоком уровне, причем заболеваемость с каждым годом растет. Для большинства опухолей 5-летняя выживаемость пациентов не превышает 30% даже при использовании комбинаций препаратов разных классов (Smyth and Cunningham, 2012). Таким образом, разработка новых видов лекарств и улучшение эффективности существующей терапии онкологических заболеваний является одной из первостепенных задач современной медицины.

1.2 Рецептор эпидермального фактора роста и его роль в клетках

опухолей

Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) является ключевым механизмом передачи сигналов, регулирующих рост, пролиферацию, дифференцировку, адгезию, миграцию и деление клеток. Этот рецептор экспрессируется на плазматической мембране большинства клеток человека и представляет собой трансмембранный рецепторный гликопротеин с молекулярной массой 170 кДа, обладающий активностью тирозиновой киназы. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста у всех позвоночных включает в себя четыре представителя: собственно рецептор ЭФР (EGFR, HERI, ErbBl), ErbB2 (HER2), ЕгЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER4) (Ferguson et al., 2003; Yarden, 2001).

Так как сигнальная активность рецептора ЭФР регулирует ключевые морфогенетические процессы в клетке (Miettinen et al., 1995; Sibilia and Wagner, 1995; Threadgill et al., 1995), нарушения его функционирования являются главным механизмом развития многих опухолей. Первые шаги к пониманию роли этого рецептора в канцерогенезе были сделаны около двадцати лет назад, когда две группы ученых разработали теорию аутокринной секреции (de Larco and Todaro, 1978; Sporn and Roberts, 1985). Главной идеей этой теории была сниженная зависимость линий опухолевых клеток от добавления экзогенных факторов роста. С того времени многочисленные исследования рецепторов факторов роста и их роли в опухолях показали, что повышение функциональной активности рецептора ЭФР является ключевым механизмом патогенеза и прогрессии многих карцином (Salomon et al., 1995). Было описано, что опухолевые клетки приобретают амплификацию (Brandt et al., 2006) или различные мутации рецептора ЭФР (Gazdar, 2009; Gschwind et al., 2004), приводящие к увеличенной митотической активности и малигнизации клеток.

1.2.1 Строение рецептора эпидермального фактора роста

Многочисленные исследования кристаллической структуры рецептора ЭФР (Cho and Leahy, 2002; Cho et al., 2003; Garrett et al., 2003; Garrett et al., 2002; Ogiso et al., 2002) показали, что он состоит из трех доменов: внеклеточного лиганд-связывающего, гидрофобного трансмембранного и внутриклеточного, обладающего ферментативной активностью (рис. 1). В отсутствие стимуляции рецептор находится на поверхности клетки в мономерном состоянии. В роли активирующих лигандов могут выступать сам ЭФР, а также другие факторы роста: трансформирующий фактор роста (TGF), амфирегулин, эпирегулин и др. (Harris et al., 2003), синтезируемые самой клеткой (аутокринная секреция) или соседними клетками (паракринная секреция) (Yarden, 2001; Yarden and Sliwkowski, 2001). Гликозилированный внеклеточный домен рецептора ЭФР

содержит два богатых цистеином участка, которые образуют сайт связывания лиганда. Активация рецептора приводит к его димеризации, образуя комплекс из двух молекул рецептора и двух лигандов (Garrett et al., 2002; Laskin and Sandler, 2004). При этом могут образовываться как гомодимеры, так и гетеродимеры с другими рецепторами семейства, в частности с HER2 и HER3 (Olayioye et al., 2000). Среди гетеродимеров главным партнером рецептора ЭФР является HER2 (Tzahar et al., 1996), так как их взаимодействие является наиболее стабильными (Lenferink et al., 1998). Это делает комплекс HER1/HER2 наиболее важным с точки зрения сигнальной функции, что используется некоторыми опухолями молочной железы, приобретающих амплификацию гена HER2 для увеличения митотической активности (Dean-Colomb and Esteva, 2008). Однако HER2 не может димеризоваться друг с другом, а только с HERI, что делает рецептор ЭФР основным действующим звеном. Так, было показано, что одного увеличения экспрессии рецептора ЭФР достаточно для индукции клеточной трансформации (Di Fiore et al., 1987).

При сближении внутриклеточных доменов образовавшихся димеров меняется конформация рецептора, что снимает состояние аутоингибирования остатков тирозина, и происходит их фосфорилировование. Для аутофосфорилирования и сигнальных активности наиболее значимыми остатками являются Y845, Y992, Y1045, Y1068, Y1148 и Y1173 (Jones et al., 2006; Yaffe, 2002), которые при фосфорилировании образуют участки для связывания адаптерных белков, непосредственно запускающих сигнальные каскады.

Существуют мутации гена рецептора ЭФР, которые приводят к постоянной его активации вне зависимости от присутствия лигандов. Наиболее часто встречается делеция 2-7 экзонов этого гена, что приводит к синтезу рецептора с потерей части внеклеточного домена (6-273 аминокислот). Такой рецептор находится в состоянии постоянной, лиганд-независимой активации (Frederick et al., 2000). Такой вариант рецептора ЭФР

не встречается в нормальной ткани. Однако в связи с тем, что такой вариант рецептора увеличивает митогенную сигнальную активность и дает клетке преимущество в делении, такая мутация приобретается некоторыми опухолевыми клетками. Так, описанная делеция обнаруживается в 40% глиобластом (Humphrey et al., 1991) и во многих случаях рака головы и шеи (Sok et al., 2006). Кроме преимущества роста клетки опухолей, несущие такую мутацию, приобретают резистентность к препаратам, блокирующим рецептор ЭФР (Hopper-Borge et al., 2009), что подробно описано в главе, посвященной блокаторам рецептора ЭФР.

NH,

1 _£

цистеин-богатые участки

убрана

134

313

446

632

690

тирозин-киназныи участок

954

1210

связывание лиганда

связывание лиганда

— Y845

Y992

■ Y1068 1 аутофосфо-рилирование

■УГ" _

■ Y1

СООН

Рис. 1. Строение рецептора эпидермального фактора роста. Внеклеточный домен содержит богатые цистеином участки, с которыми связывается ЭФР. Внутриклеточный домен содержит большое количество остатков тирозина, которые при активации фосфорилируются и запускают сигнальные каскады и эндоцитоз рецептора.

Помимо участков, запускающих сигнальные каскады, внутриклеточный домен рецептора ЭФР содержит сайт, ответственный за запуск интернализации рецептора (Wang et al., 2007), что регулирует длительность сигнальной активности (Burke et al., 2001). Таким образом, связывание лиганда с рецептором ЭФР приводит к двум событиям: активации сигнальных каскадов и эндоцитозу рецептора.

1.2.2 Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста

При активации рецептора ЭФР запускается ряд хорошо изученных сигнальных каскадов (рис. 2):

1. Ras-MAP-киназный путь (Sundaram, 2006). К активированному рецептору сначала присоединяется белок She (v-src sarcoma viral oncogene homology 2 domaincontaining protein) (Prigent and Gullick, 1994), являющийся адаптером для белка Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2) (Jiang et al., 2003). Grb2 в свою очередь активирует белок SOS (son of sevenless), который представляет собой фактор обмена ГТФ для белка Ras, что запускает основной МАР-киназный каскад: Raf (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog), MEK (MAP kinase-ERK kinase) и ERK (extracellular signal regulated kinase). Результатом активации этого пути является стимуляция пролиферации и ускорение клеточного цикла.

2. Путь фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), АКТ и mTOR (Freudlsperger et al., 2011; Soltoff and Cantley, 1996). Активированный рецептор ЭФР взаимодействует с PI3K двумя способами: непосредственно взаимодействуя с доменом р85 и опосредованно через ERK, который также активирует PI3K. PI3K фосфорилирует белок АКТ (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog), являющийся важнейшим стимулятором клеточного деления и роста. Помимо этого АКТ индуцирует фосфорилирование mTOR (mammalian target of rapamycin), ответственного за контроль клеточного метаболизма, роста и выживания.

3. JAK-STAT-киназный путь (Olayioye et al., 1999; Quesnelle et al., 2007). Активированный рецептор ЭФР также фосфорилирует киназу JAK (janus kinase), которая взаимодействует с белками Stat (signal transducer and activator of transcription) 3 и 5. В результате этого Stat фосфорилируется, транспортируется в ядро и активирует транскрипцию генов клеточной пролиферации.

Рис. 2. Основные сигнальные каскады рецептора ЭФР (ЕОРЯ): Яаз-МАР-киназный путь, путь фосфатидилинозитол-3-киназы (РІЗК), АКТ и гпТОЯ и 5АК-8ТАТ-киназный путь.

1.2.3 Путь эндоцитоза и деградации рецептора эпидермального фактора

роста

После стимуляции и активации часть рецепторов ЭФР подвергается деградации. Таким образом, даже при длительном воздействии лигандом активный пул рецептора ЭФР значительно сокращается, что регулирует его сигнальную активность, предотвращая чрезмерную стимуляцию клеточного

деления. Деградация осуществляется преимущественно лизосомальным путем, для чего рецептор изначально должен подвергнуться интернализации. Внутриклеточный домен рецептора ЭФР содержит участок, который при присоединении лиганда и димеризации взаимодействует с клеточными белками, ответственными за запуск процесса эндоцитоза (Tong et al., 2009). При этом участок мембраны, содержащий рецептор, инвагинируется внутрь клетки и образует ранние эндосомы. Эндоцитоз рецептора ЭФР может происходить двумя способами в зависимости от локализации рецептора (Myromslien et al., 2006). Неактивированный рецептор может находиться в обычном билипидном участке мембраны или в липидных плотах, которые представляют собой небольшие участки на мембране (10-200 нм), богатые сфинголоипидами и холестеролом. Такой состав липидных плотов локально меняет физические свойства данного участка мембраны, делая его менее подвижным и более жестким (Lingwood and Simons, 2010). В случае локализации рецептора ЭФР в обычном билипидном участке его эндоцитоз опосредуется молекулами белка клатрина (Goh et al., 2010), образующего на поверхности инвагинированного участка мембраны полимерный слой, который позволяет преодолеть силу поверхностного натяжения мембраны. Этот путь называется клатрин-зависимым. В случае локализации рецептора в липидных рафтах для эндоцитоза не требуется дополнительных белков и весь липидный плот интернализуется внутрь клетки. Так происходит клатрин-независимый путь эндоцитоза рецептора (Sigismund et al., 2005). Для индукции эндоцитоза необходим белок с-Cbl, который взаимодействует с фосфорилированными остатками тирозина на внутриклеточном домене рецептора (de Melker et al., 2004). c-Cbl представляет собой фермент убиквитин-лигазу типа ЕЗ, которая убиквитинилирует рецептор ЭФР. Помимо основной роли в протеосомной деградации белков, убиквитин служит меткой для интернализации поверхностных белков (Hicke, 2001). Сам процесс интернализации запускается при помощи белка Hrs (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), который присоединяется к

убиквитинилированному рецептору (Kobayashi et al., 2005). Hrs в комплексе с белком STAM (signal-transducing adaptor molecule) в свою очередь взаимодействует с клатрином (Raiborg and Stenmark, 2002). Регулирующим этапом в этом сложном процессе служит убиквитин-лигаза, поэтому скорость эндоцитоза напрямую зависит от экспрессии белка c-Cbl (Levkowitz et al., 1999).

Рис. 3. Внутриклеточный транспорт рецептора ЭФР (EGFR). После активации рецептор подвергается интернализации и попадает в ранние эндосомы (ЕЕА1), откуда затем может перейти обратно на поверхность клетки или попасть в поздние эндосомы (Rab7) для последующей деградации в лизосомах (LAMP1).

После эндоцитоза рецептор попадает в ранние эндосомы. Они содержат на своей поверхности ряд специфических белковых маркеров (например, ЕЕА1 - early endosome antigen 1), участвующих в последующей сортировке везикул. На этапе ранних эндосом решается дальнейшая судьба их содержимого, в частности, рецептора ЭФР. Они могут перейти в

рециклирующие эндосомы для возврата содержимого обратно на поверхность клетки или перейти в поздние эндосомы, с которыми сливаются лизосомы, ферментативно расщепляя их белки. Каждый тип эндосом содержит набор специфических маркеров, выполняющих роль регуляторов последующей сортировки везикул (Ceresa, 2006). Примером маркера рециклирующих эндосом служит белок Rabil, поздних эндосом - Rab7, лизосом — LAMP1 (lysosomal-associated membrane protein 1) (рис. 3). Процесс сортировки везикул и их содержимого также находится под контролем белка c-Cbl и уровня убиквитинилирования рецептора ЭФР (Raiborg and Stenmark, 2002). Таким образом, убиквитин, помимо метки для интернализации, является также меткой для перехода белка в поздние эндосомы (Eden et al., 2012), где он активирует белковый комплекс ESCRT (endosomal sorting complex required for transport), который направляет везикулы в сторону лизосомальной деградации (Malerod et al., 2011).

Таким образом, деградация рецептора ЭФР является физиологическим процессом регуляции его сигнальной активности. В нормальных клетках примерно 80% активированного рецептора подвергается деградации, и только 20% рециклируется (Scita and Di Fiore, 2010). Рециклирование рецептора является динамическим процессом и может изменяться в зависимости от внешних воздействий, например, окисляющих агентов сигаретного дыма (Khan et al., 2008). Клетки опухолей во многих случаях изменяют движение рецептора ЭФР в сторону рециклирования, что позволяет им обходить естественный механизм сигнальной регуляции, усиливая таким образом активность митогенных сигналов и приобретая преимущество в делении и росте (Bonaccorsi et al., 2007). Увеличение рециклирования рецептора является важным механизмом развития опухолевыми клетками приобретенной резистентности к препаратам, блокирующим рецептор ЭФР (Wei, 2011; Wheeler et al., 2008).

1.2.4 Блокаторы рецептора эпидермального фактора роста

Вследствие описанной выше ключевой роли рецептора ЭФР в регуляции деления клеток, этот рецептор является широко используемой мишенью при терапии онкологических заболеваний (Jimeno and Hidalgo, 2005; Laskin and Sandler, 2004). В настоящее время существует две группы таких препаратов: антитела против внеклеточного домена рецептора и ингибиторы киназной активности внутриклеточного домена.

Впервые антитела к рецептору были синтезированы в 1980-е годы (Kawamoto et al., 1983). Механизм их действия основывается на высокой афинности антител к внеклеточным доменом рецептора ЭФР, которая в десятки раз превышает афинность к нему лигандов (Sato et al., 1983). Это предотвращает связывание лиганда и последующие активацию и стимуляцию рецептора (Ciardiello and Tortora, 2001). Кроме этого антитела стимулируют интернализацию рецептора, в результате чего он проходит описанный выше эндоцитарный путь. При каждом прохождении эндоцитарного цикла часть рецептора подвергается деградации, уменьшая общее количество свободного рецептора на поверхности. Это привело к созданию ряда антител против рецептора ЭФР, которые используются в настоящее время в клинической практике (Elloumi et al., 2012).

Вторую группу антагонистов рецептора ЭФР составляют ингибиторы тирозинкиназ, которые представляют собой низкомолекулярные вещества, свободно проникающие внутрь клетки и имеющие высокую афинность к киназному участку внутриклеточного домена рецептора. В результате предотвращается АТФ-зависимое фосфорилирование остатков тирозина и блокируется последующая активация сигнальных путей рецептора (Chinnaiyan and Harari, 2006). Как и моноклональные антитела, ингибиторы рецептора ЭФР в настоящее время широко применяются при терапии онкологических заболеваний (Nedergaard et al., 2012).

Терапия, направленная на блокаду рецептора ЭФР, применяется при опухолях, в которых сигнальная активность рецептора является критической для поддержания жизнедеятельности и деления (Weinstein and Joe, 2008). Такие опухоли приобретают различные изменения рецептора, дающие им преимущество роста. Основными изменениями рецептора ЭФР в опухолях являются его гиперэксперессия, амплификация гена рецептора и активирующие мутации рецептора. Эти изменения наиболее характерны для раков головы и шеи, немелкоклеточного рака легкого, колоректального рака и глиобластом (Fontanini et al., 1998; Rieske et al., 1998; Rubin Grandis et al., 1996; Salomon et al., 1995). Клетки с гиперэкспрессией рецептора ЭФР являются чувствительными к блокаде рецептора на любом уровне, поэтому при таких опухолях применяются и антитела, и ингибиторы тирозиновых киназ (Hirsch et al., 2008; Hirsch et al., 2005; Moroni et al., 2005). Мутации рецептора ЭФР приводят к его постоянной лиганд-независимой активации, поэтому при таких мутациях используют ингибиторы тирозиновых киназ: при мутациях киназного домена рецептора применяется гефитиниб (Lynch et al., 2004), а при других активирующих мутациях, таких как делеции экзонов 19 или 21, используются эрлотиниб и гефитиниб (Eberhard et al., 2005; Pao et al., 2004; Taron et al., 2005). Также ингибиторы тирозинкиназ применяются при делеции экзонов 2-7, так как такой рецептор теряет сайт связывания антител на внеклеточном домене и их применение, например, цетуксимаба, оказывается неэффективным (Sok et al., 2006; Yang et al., 2008).

Тем не менее, эффективность лечения антагонистами рецептора ЭФР остается на достаточно низком уровне. При мутациях киназного домена рецептора ЭФР положительный ответ на лечение гефитинибом наблюдается у 55% пациентов с немелкоклеточным раком легкого (Sequist et al., 2008). При других активирующих мутациях лечение ингибиторами тирозинкиназ дало результат у 27% пациентов с таким же диагнозом (Shepherd et al., 2005; Zhu et al., 2008). При этом среди всех пациентов с немелкоклеточным раком легкого ингибиторы тирозинкиназ уменьшают рост опухоли всего в 7-10%

случаев (Metro et al., 2006; Zhu et al., 2008). Так же около 10% составляет положительный ответ на лечение ингибиторами тирозинкиназ при карциномах головы и шеи (Karamouzis et al., 2007) и на лечение антителами при колоректальном раке (Meriggi et al., 2009; Willett et al., 2007). Таким образом, указанные данные говорят о невысокой в целом эффективности лечения онкологических заболеваний блокаторами рецептора ЭФР. В связи с этим разработка способов усиления является важным направлением современной онкологии.

1.3 Исследование взаимодействия сигнальных путей при помощи

синтетической летальности

Клеточные сигнальные пути функционируют не линейно. Взаимодействуя друг с другом на различных этапах, они формируют большие сигнальные сети. В результате такого перекрывания недостаточность или отсутствие функционирования одного пути может компенсироваться за счет увеличения активности других. Формирующаяся таким образом буферная емкость сигнальных путей является одной из причин развития клетками резистентности к таргетной терапии. Это явление особенно сильно выражено в опухолевых клетках, когда ингибирование основного пути престает быть эффективным за счет компенсаторной активации параллельных путей (Janne et al., 2009). Для предотвращения развития такой резистентности необходимо заблокировать два пути одновременно. Явление усиления эффекта при блокаде двух сигнальных путей по сравнению с блокадой каждого пути в отдельности носит название синтетической летальности (рис. 4) (Brough et al., 2011; Chan and Giaccia, 2011).

--

путь 1 путь 2

I I

О О

О о \ /

выживаемость

к 1

путь 1 путь 2

Ж I

о о

* / \ *

о о \ /

выживаемость

^ J

путь 1 путь 2

I Ж

о о

+ \ ♦

о о \ /

выживаемость

путь 1 путь 2

Ж Ж

о о

+ ' 4 + т к ч т

О О

\ /

\ /

\ '

\ ' « *

гибель

Рис. 4. Принцип синтетической летальности на примере взаимодействия двух сигнальных путей, ведущих к одному жизненно важному эффекту. Сплошными линиями показаны активные пути, пунктирными - неактивные. В случае блокады только одного из путей, другой путь компенсаторно его активирует ниже за счет перекреста путей. Блокады обоих путей одновременно приводит к полному прекращению эффекта, что ведет к клеточной гибели.

Термин «синтетическая летальность» был предложен в начале XX века при исследовании генетики мух (]Чутап, 2011). Так назвали явление, при котором две нелетальные мутации в комбинации друг с другом становились летальными. Долгое время такой подход использовался только в генетических исследованиях. В последнее время этот термин приобрел более широкое понятие и используется для описания не только взаимодействий между генами, но и между сигнальными путями и генами или сигнальными путями друг с другом. Принцип синтетической летальности получил широкое применение в онкологических исследованиях, так как митогенная сигнальная активность опухолевых клеток может опосредоваться разными путями. В клетке присутствует огромное количество сигнальных путей, многие из которых пересекаются и регулируют друг друга на разных уровнях. Поэтому теоретически предсказать, ингибирование каких двух приведет к желаемому эффекту, на данный момент не представляется

возможным. Для поиска таких взаимодействий проводят масштабные скрининговые исследования, в которых выявляют синтетически летальные пути или гены для исследуемого пути.

К настоящему времени было опубликовано несколько таких скрининговых исследований по поиску синтетически летальных взаимодействий рецептора ЭФР. В качестве одного из партнеров был описан рецептор из семейства EGFR HER2. В некоторых случаях рака груди (Milanezi et al., 2008) и немелкоклеточного рака легкого (Spicer and Rudman, 2010) HER2 гиперактивирован и берет на себя функции рецептора ЭФР. При таких НЕК2-положительных опухолях успешно применяются препараты, ингибирующие одновременно рецепторы ЭФР и HER2: ингибиторы тирозинкиназы лапатиниб (Johnston and Leary, 2006) и нератиниб (Bose and Ozer, 2009). Другим важным механизмом поддержания митотической активности клеток при блокаде рецептора ЭФР является сигнальный путь Notch, ингибирование которого в сочетании с блокадой рецептора ЭФР показало эффективность при некоторых видах рака легкого (Konishi et al., 2010), кожи (Kolev et al., 2008), груди (Dong et al., 2010) и глиом (Purow et al., 2008). В настоящее время ингибиторы пути Notch не применяются в клинике, однако проводятся клинические испытания нескольких ингибиторов у-секретазы, являющейся активатором данного пути (Purow, 2012). Кроме этого используется сочетание блокады рецептора ЭФР с несколькими другими сигнальными путями клетки (Kaelin, 2009). Однако описанные ингибиторы используется только в случаях гиперактивации одного из путей и являются специфичными только для определенного типа опухолей.

Недавно было опубликовано скрининговое исследование, описывающее гены, находящиеся в синтетически летальных взаимодействиях с рецептором ЭФР в опухолевых клеточных линиях (Astsaturov et al., 2010). Выбирая из всех описанных взаимодействий только те, которые подтвердились на всех используемых линиях клеток, можно составить список универсальных сенситизирующих генов. В полученном

списке оказалось несколько генов из пути биосинтеза холестерола (Аз18а1шоу е1 а1., 2010). Эти гены показали высокий индекс сенситизации на всех линиях исследуемых опухолей, что указывает на универсальный характер эффекта. Исходя из описанных данных, исследование влияние биосинтеза стеролов на сигнальную активность рецептора ЭФР стало основным направлением данной работы.

1.4 Биосинтез стеролов и их роль в клетках

Присутствие стеролов в мембранах является характерной особенностью клеток эукариот. Холестерол является основным стеролом мембран, играя важную роль в структуре и динамических параметрах липидного бислоя (Ивков и Берестовский, 1982). В последние десятилетия было проведено большое количество исследований, посвященных функциям стеролов. Было описано, что стеролы выполняют не просто механическую функцию для мембран, а они способствуют формированию и поддержанию латеральной гетерогенности липидного бислоя. Холестерол является основным компонентом липидных рафтов, участков мембран с более плотной упаковкой по сравнению с окружающим слоем липидов. Помимо холестерола липидные рафты содержат большие количества сфинголипидов и насыщенных жирнокислотных остатков. Основная роль липидных рафтов заключается в кластеризации различных рецепторов, передающих внеклеточные сигналы внутрь клетки. Уменьшение содержания холестерола в мембранах снижает сигнальную активность рецепторов, влияя на ключевые морфогенетические процессы клетки. Помимо этого была описана роль стеролов и липидных плотов в реорганизации и динамике актинового цитоскелета, в результате чего нарушение функционирования липидных рафтов сопровождается повышением деформируемости клеток (Ефремова и др, 2012). Полное удаление холестерола при помощи хелаторов стеролов приводит гибели клеток, что говорит о ключевой их роли в жизни клеток.

1.4.1 Путь биосинтеза стеролов

Биосинтез стеролов в клетках происходит в несколько этапов (рис. 5). На первом этапе происходит реакция конденсации ацетил-КоА и ацетоацетил-КоА с образованием 3-гидрокси-3-метилглутарил(ГМГ)-КоА и последующим окислением до мевалоновой кислоты. На втором этапе мевалонат фосфорилируется, образуя активированную форму изопреновой единицы изопентенилпирофосфат. Затем шесть изопентенильных групп объединяются с образованием полиненасыщенного углеводорода сквалена, содержащего 30 атомов углерода. На третьем этапе сквален под действием фермента ланостерол синтазы превращается в первый циклический предшественник всех стеролов ланостерол, содержащий четыре характерных стерольных кольца. Последующая серия реакций деметилирования и дегидрирования, составляющих четвертый этап биосинтеза холестерола, приводят к образованию самого холестерола, содержащего 27 атомов углерода и имеющего в своем составе одну ненасыщенную связь.

Так как основным объектом исследования стали ферменты, работающие на дистальном участке пути стерольного биосинтеза, то рассмотрим подробнее реакции превращения ланостерола в зимостерол (рис. 6). Ланостерол синтезируется ферментом ланостерол-синтазой из сквалена и представляет собой предшественник холестерола, отличающийся количеством ненасыщенных связей и наличием метальных групп в 4, 14 и 24 атомах углерода. Сначала фермент из семейства цитохромов Р450 ланостерол-14а-деметилаза (CYP51A1) декарбоксилирует ланостерол по 14 атому углерода, превращая его в 4,4-диметил-5а-холеста-8,14,24-триен-ЗР-ол. Это вещество также носит название FF-MAS (от англ. - follicular fluid meiosis-activating sterol, фолликулярный мейоз-активирующий стерол), так как оно является фактором, присутствующим в фолликулярной жидкости и активирующим созревание фолликулов (Byskov et al., 2002; Grondahl et al., 1998).

ацепш-КоА

I

ГМГ-КоА

I

мевачовдт 1

изопентешт пирофосфат

I

сквачен

ланостерол

НзС ¿н

шмостерол

холестерол

но

Рис. 5. Основные этапы пути биосинтеза холестерола.

На следующем этапе фермент А14-редуктаза насыщает двойную связь у 14 атома углерода в молекуле РР-МА8, превращая его в 4,4-диметил-5а-

холеста-8(9),24-диен-3(3-ол, представляющий собой другой мейоз-активирующий фактор T-MAS (от англ. - testicular meiosis-activating sterol, тестикулярный мейоз-активирующий стерол), стимулирующий процесс сперматогенеза в семенниках (Bogh et al., 2001; Byskov et al., 1995). Активностью А14-редуктазы обладают два белка: TM7SF2 (transmembrane 7 superfamily member 2) и LBR (lamin В receptor), выполняющий одновременно функции фермента и рецептора л амина В.

На следующем этапе одна метальная группа 4 атома углерода T-MAS окисляется до карбоксильной группы при помощи метилмонооксигеназы SC4MOL (sterol C4-methyl oxidase-like), в результате чего образуется 4а-карбокси-4|3-метил-5а-холеста-8(9),24-диен-3(3-ол. Затем фермент стерол-4а-карбоксилат-3-дегидрогеназа NSDHL (NADP-dependent sterol dehydrogenase-like), обладающий одновременно декарбоксилазной и дегидрогеназной активностями, катализирует отщепление СОг карбоксильной группы при 4 атоме углерода с одновременным окислением гидроксильной группы 3 атома углерода до кетоновой. В результате образуется З-кето-4-метилзимостерол, который восстанавливает карбонильную группу обратно до гидроксильной при помощи 3-кето-стероид-редуктазы HSD17B7 (hydroxysteroid-17(3-dehydrogenase 7) с образованием 4а-метилзимостерола.

В результате последних трех реакций происходит отщепление метальной группы от 4 атома углерода, вследствие чего данные реакции объединяют в одну комплексную реакцию, называемую С4-деметилированием. Эта реакции повторяются еще раз, отщепляя вторую метальную группу от 4 атома углерода и превращая 4а-метилзимостерол в зимостерол.

ланостерол

тностерол-Î 4а-деметилаза

4>4-диметнл-5 а-холеста-8Д4,24-триен-Зр-ол (FF-MAS)

Al 4-редуктаза

4,4-диметил-5а-ходеста-8(9),24-диен-Зр-ол (T-MAS)

штипг монооксигеназа (SC4MOL)

4 а-карб окси-4 ß - мегил-5 а-холеста-8(9),24-днен-Зр-ол

но' нэс сн3

стерол-4а-карбоксилат-З-дегидрогеназа (¡VSDHL)

З-кето-4 - метнлзнмостер ал

З-кето-стероид-редуктаза (HSD17B7)

4 а- метилзимо стерол

I I

знмо стерол

но

н,с

сн,

но'

Рис. 6. Путь превращения ланостерола в зимостерол.

1.4.2 С4-деметилирующий комплекс

С4-деметилирующий комплекс включает в себя 4 белка: ферменты SC4MOL, NSDHL, HSD17B7 и белок C140RF1 (chromosome 14 open reading frame 1), выполняющий каркасную функцию. В клетках млекопитающих эти взаимодействия не изучались, однако были исследованы на клетках дрожжей. И так как путь биосинтеза стеролов является консервативным во всех эукариотических клетках (Gachotte et al., 1997; Lees et al., 1999), то можно предположить и схожие взаимодействия между ферментами этого пути в клетках человека. Эволюционно консервативными гомологами (ортологами) белков С4-деметилирующего комплекса являются: Erg25 (SC4MOL), Erg26 (NSDHL), Erg27 (HSD17B7) и Erg28 (C140RF1), а образуемый ими комплекс называется эргосомой. Белки в эргосомах находятся в непосредственном контакте друг с другом, что было показано методом ко-иммунопреципитации. В результате такого близкого расположения белков, промежуточные продукты каждой реакции могут непосредственно переходить с фермента на фермент. Биологический смысл кластеризации именно данных ферментов пока остается невыясненным. Однако промежуточные продукты этих реакций определяются в клеточных мембранах лишь в следовых количествах. Это позволяет предположить, что данные метаболиты могут быть токсичными для клеток, и для предотвращения их рассеивания в мембранах они локализованно перерабатываются в последующие менее токсичные продукты.

1.5 Метаболизм стеролов и опухоли

Как было описано выше, холестерол играет жизненно важную роль для клеток организма. Для поддержания холестерола на постоянном уровне в клетках существует механизм регуляции его метаболизма. Основным регуляторным звеном является белок SREBP (sterol response element-binding protein), представляющий собой транскрипционный фактор, стимулирующий синтез ферментов стерольного пути. При недостаточном уровне холестерола

SREBP протеолитически расщепляется на две части, одни из которых, С-терминальный конец, переносится в ядро для стимуляции транскрипции генов липогенных ферментов. Кроме этого активность SREBP увеличивает продукцию рецептора LDL (low-density lipoprotein receptor), который стимулирует импорт холестерола из внеклеточной среды. Увеличение концентрации холестерола через белок SCAP (SREBP cleavage-activating protein) инактивирует SREBP, уменьшая синтез ферментов стерольного пути. При этом также активируется рецептор LXR (liver X receptor), выполняющий две основные функции: запускает экспорт холестерола и стимулирует протеосомальную деградацию LDL рецептора. Благодаря сложенной работе описанных механизмов клетки поддерживают строго определенный уровень холестерола в мембранах.

Опухолевые клетки находятся в состоянии ускоренного деления, что налагает особые требования для их метаболизма. Для обеспечения достаточного количества строительных материалов клетки усиливают синтез всех компонентов, в том числе и холестерола. Помимо структурной роли, холестерол играет важную роль в регуляции клеточной дифференцировки и пролиферации (Xu et al., 2005). Более пятнадцати лет назад было обнаружено, что риск развития и агрессивность некоторых типов опухолей имеет обратную зависимость с общим уровнем холестерола в плазме крови (Kritchevsky and Kritchevsky, 1992). После этого была описана связь между скоростью липогенеза и агрессивностью опухоли (Israel and Schwartz, 2011). Недавние исследования показали, что мутации гена ТР53, которые встречаются более чем в половине всех опухолей, усиливают активность SREBP (Freed-Pastor et al., 2012). Ингибирование биосинтеза холестерола показало уменьшение риска развития онкологических заболеваний, а также определенный терапевтический эффект при раке груди (Danilo and Frank, 2012) и колоректальном раке (Jacobs et al., 2012). Описанные данные говорят о важной роли биосинтеза стеролов в клетках опухолей. Не смотря на то, что ингибитроы липогенеза широко не применяются при онкологических

заболеваниях, это направление может оказаться перспективным. В последние несколько лет было предложено использование нестатиновых препаратов в клинических целях (Rozman and Monostory, 2010; Trapani et al., 2011), однако в настоящее время для снижения уровня холестерола в крови применяются только статины, блокирующие стерольный путь на его начальном этапе.

1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанные данные свидетельствуют о большой значимости поиска средств усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР для лечения онкологических заболеваний. В качестве способа усиления эффективности в данной работе использовалась блокада пути биосинтеза стеролов на его дистальном участке, так как анализ опубликованной литературы показал, что этот путь, никогда ранее не исследуемый с этой точки зрения, может влиять на активность рецептора ЭФР. В качестве опухолевой модели были выбраны клеточные линии опухолей, зависимых от сигнальной активности рецептора ЭФР.

В соответствии с выше изложенным в данной работе была поставлена цель - описать механизм влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

5. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР.

6. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы.

7. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов.

8. Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Горин, Андрей Олегович

ВЫВОДЫ

1. Удаление ферментов БС4МОЬ и катализирующих реакцию С4-деметилирования на дистальном участке пути биосинтеза стеролов, значительно сенситизирует опухолевые лини А431, 8СС61, 8СС68 и РС9 к воздействию антагонистов рецептора ЭФР эрлотинибу и цетуксимабу. Это данные подтвердились как при проведении миРНК трансфекции клеток, так и при использовании мшРНК против соответствующих генов.

2. Биоинформативный анализ генетических и физических взаимодействий ортолога гена 8С4МОЬ в 8ассЬагошусез сегеу1з1ае показал, что 28% всех взаимодействий приходится на гены, регулирующие внутриклеточный везикулярный транспорт.

3. Удаление ферментов 8С4МОЬ и ^БНЬ в клеточной линии 8СС61 приводит к изменению внутриклеточного транспорта рецептора ЭФР, направляя его преимущественно в сторону деградации. Это уменьшает общий активный пул рецептора, приводя к снижению активности основных онкогенных сигнальных путей.

4. Ксенографтные опухоли с удаленным ферментом 8С4МОЬ растут значительно медленней без лечения по сравнению с контрольными клетками и полностью останавливают рост при лечении цетуксимабом.

1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанные данные свидетельствуют о большой значимости поиска средств усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР для лечения онкологических заболеваний. В качестве способа усиления эффективности в данной работе использовалась блокада пути биосинтеза стеролов на его дистальном участке, так как анализ опубликованной литературы показал, что этот путь, никогда ранее не исследуемый с этой точки зрения, может влиять на активность рецептора ЭФР. В качестве опухолевой модели были выбраны клеточные линии опухолей, зависимых от сигнальной активности рецептора ЭФР.

В соответствии с выше изложенным в данной работе была поставлена цель - описать механизм влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

5. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР.

6. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы.

7. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов.

8. Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Реактивы и оборудование

Реактивы

CellTiter Blue FF-MAS NaCl NaOH SDS T-MAS Аннексии V

Бычий сывороточный альбумин Вторичные антитела с флуоресцентными метками AlexaFluor488 и AlexaFluor555 Вторичные антитела с флуоресцентными метками IRDye680 и IRDye 800 Диметилсульфоксид Ингибиторы протеаз Ингибиторы фосфатаз Краситель трипановый синий Ланостерол

Лизирующий буффер RIPA миРНК

Параформальдегид

Promega (США)

Avanti (США)

Fisher (США) Fisher (США) Sigma-Aldrich (США) Avanti (США)

Guava Technologies (США) Sigma-Aldrich (США) Invitrogen (США)

Licor (США)

Sigma-Aldrich (США) Thermo Scientific (США) Thermo Scientific (США) Sigma-Aldrich (США) Sigma-Aldrich (США)

Sigma-Aldrich (США)

Qiagen (США)

Electron Microscopy Sciences

США)

• Первичные антитела Cell Signaling (США)

• Питательная среда DMEM, содержащая L- Invitrogen (США) глутамин, 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина

• Протеин-О-конъюгированные агарозные Thermo Scientific (США) бусы

• Раствор Трипсина-ЭДТА Invitrogen (США)

• Твин-20 Sigma-Aldrich (США)

• Трансфекционный реагент HiPerfect Qiagen (США)

• Тритон Х-100 Sigma-Aldrich (США)

• Холестерол Sigma-Aldrich (США)

• ЭФР Sigma-Aldrich (США)

• ЭФР, меченный зеленым красителем Invitrogen (США) AlexaFlour488

Santa Cruz Biotechnology

• Эрлотиниб

США)

Fox Chase Cancer Center

• Цетуксимаб

Pharmacy (США)

Оборудование

• Камера Горяева для подсчёта клеток Fisher (США)

• Пробирки 1,5 мл Fisher (США)

• Пробирки 15 мл и 50 мл Fisher (США)

• Автоматические пипетки Gilson (Франция)

Fisher (США)

• рН-метр AB 15 Fisher (США)

Вортекс Genie-2

Весы аналитические PL601-S

Центрифуга 5804

Центрифуга Sorval Legend Micro 21 Микроцентрифуга 110 VAC С02-инкубатор Forma Scientific Ламинарный шкаф SteriGuard Hood Установка для содержания лабораторных животных Cage Mouse Vent Rack Спетрофотометр NanoDrop 2000 Планшетный спектрофотометр Envision Оптический микроскоп Флуоресцентный микроскоп Конфокальный микроскоп Nikon С-1 Проточный цитофлуориметр BD FACSCalibur

Сканер мембран Licor Odyssey Проточный цитометр FACS-VantageSE Термостат

VWR Scientific (США) Mettler Toledo (США) Eppendorf (Германия) Fisher (США) Fisher (США) Fisher (США) The Baker Company (США) LABEX (США)

Fisher (США) Perkin Elmer (США) Fisher (США) Fisher (США) Nikon (США) BD Biosciences (США)

Licor (США) BD Biosciences (США) VWR Scientific (США)

2.2 Объекты исследования

2.2.1 Объекты исследования in vitro

В работе использовались следующие клеточные линии: А431 (эпидермоидная карцинома), SCC61 и SCC25 (сквамозная карцинома), РС9 (немелкоклеточный рак легкого), HeLa (карцинома эндометрия), MCF12F (нормальный эпителий молочной железы). Все клеточные линии были получены из American Tissue Culture Collection (АТСС, США). Клеточные линии культивировались в ростовой среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка, Ь-глютамин и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-ного С02 при 37°С.

Для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизировался 0.25%-ным раствором трипсина с последующей его инактивацией добавлением среды БМЕМ с 10%-ной сывороткой. Далее клетки осаждались центрифугированием при 900 Осадок ресуспендировался в ростовой среде. Оценка жизнеспособности и подсчет плотности клеток производились после окраски клеток 0,4%-ным раствором трипанового синего в камере Горяева под оптическим микроскопом. Расчет количества клеток проводился по формуле:

Са-Ь)Х 100% где а - общее количество клеток, b - количество синих клеток.

2.2.2 Объекты исследования in vivo

Опыты in vivo проводились на самцах мышей весом 25г линии С-B17.SCID (Jackson Laboratory, США). Образование опухолей вызывались однократной подкожной инъекцией 3 млн клеток SCC61 со стабильным нокаутом гена SC4MOL. С момента появления пальпируемых образований (через неделю после инъекции) начинались измерения объёма опухоли и лечение. Экспериментальной группе мышей вводился цетуксимаб, растворённый в 0.9% NaCl, внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг, 2 раза в неделю в течение 3 недель. Контрольным животным вводился 0.9%-ный раствор NaCl. Объём опухоли вычислялся по формуле ab2/2, где а - длина и b -ширина опухоли. Измерения проводились 2 раза в неделю в течение четырёх недель.

2.3 Траисфекция клеток с помощью малой интерферирующей РНК

Для проведения трансфекции использовались клетки в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6луночного планшета в среде DMEM, содержащей 1% сыворотки теленка и L-глютамин. Для одной лунки 6-луночного планшета 1,8 мкл малй интерферирующей РНК (миРНК) (20 мкМ) смешивались с 6 мкл трансфекционного реагента HiPerfect в 96 мкл безсывороточной среды DMEM. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре раствор с образовавшимися комплексами MHPHK-HiPerfect добавлялся в 1 мл 1%-ной среды DMEM с клетками до конечной концентрации миРНК 10 нМ. Через 72 часа после трансфекции происходил полный нокдаун гена и клетки были готовы для проведения экспериментов. В экспериментах с использованием блокаторов через 48 часов начала после трансфекции к клеткам добавлялись лекарственные вещества. Также через двое суток среда клеток сменялась на бессывороточную DMEM для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток.

2.4 Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга

В случае экспериментов с трансфекцией клетки сажались описанным выше способом. В случае экспериментов без трансфекции клетки сажались в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6-луночного планшета в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка и L-глютамин. Через 24 часа инкубации клеток без трансфекции или через 72 часа после трансфекции клетки стимулировались 100 нг/мл ЭФР в бессывороточной среде. По окончании стимуляции клетки помещались на лед для остановки всех внутриклеточных процессов, отмывались два раза в натрий-фосфатном буфере и лизировались в 50 мкл буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз на лунку 6-луночного планшета. Клетки соскабливались клеточным скребком и полученные лизаты помещались в пробирки. Далее лизаты центрифугировались на скорости 13,000 g в течение 30 минут для осаждения нерастворенных частиц. В полученных супернатантах измерялся уровень белка по методу Лоури, после чего концентрации белка уравнивались путем добавления лизирующего буфера в более концентрированные образцы до концентрации наиболее разбавленного. После этого лизаты кипятились в растворе 2%-ного додецилсульфата натрия в течение пяти минут для полной денатурации белков. Полученные образцы разгонялись методом электрофореза при 120В на градиентном (4-12%) полиакриламидном геле. Белки с геля переносились на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану с помощью электроблоттинга при напряжении 30 В в течение 4-10 часов. Мембрана блокировалась в течение часа в блокирующем буфере Odyssey, после чего инкубировалась с первичными антителами в конечной концентрации 100 нг/мл в течение 12-24 часов при +4°С. Затем мембрана отмывалась три раза по пять минут в трис-боратном буфере, содержащим 0.05% Твин-20, и в течение часа при комнатной температуре инкубировалась с вторичными антителами, меченными флуоресцентной меткой, в конечной концентрации 1 мкг/мл. После трех отмывок мембрана сканировалась на сканнере Licor Odyssey Scanner.

2.5 Анализ выживаемости клеток

Для анализа выживаемости клетки сажались в 96-луночные планшеты в концентрации 3 тысячи клеток на лунку (80 мкл в концентрации 37.5 тысяч клеток в 1 мл). миРНК трансфекция проводилась описанным выше способом. Через 24 часа после трансфекции к клеткам добавлялось 10 мкл среды, содержащей 10-кратное количество лекарственных веществ. После этого клетки инкубировались в течение трех дней. Через 96 часов после трансфекции к клеткам добавлось 10 мкл на лунку реагента CellTiter Blue. Живые клетки метаболизируют входящий в состав реагента ресазурин, восстанавливая его до флуоресцентного ресоруфина. Через два часа после добавления реагента флуоресценция клеток считывалась при помощи спектрофотометра на длине волны 573 нм. Интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в лунке.

2.6 Анализ апоптоза

Анализ клеточной гибели проводился по методу мечения апоптотических клеток красителем аннексином V. При апоптозе или гибели клеток нарушается ассиметричность распределения фосфолипидов в клеточной мембране. В результате фосфатидилсерин, который в живых клетках присутствует только на внутреннем слое мембраны, частично переходит на внешний слой. Краситель аннексии V, обладающий сродством к фосфатидилсерину, присоединяется к апоптотическим и мертвым клеткам. Для отделения мертвых клеток апоптотических клеток используется маркер мертвых клеток 7-амино-актимомицин. Таким образом апоптотические клетки оказываются положительными по окраске аннексином V и отрицательными по окраске 7-амино-актиномицином.

Через 48 часов после трансфекции описанным выше способом к клеткам SCC61 в 6-луночном планшете добавлялся эрлотиниб в рабочей концентрации. Через 72 часа клетки трипсинизировались, ресуспендировались и окрашивались аннексином V, меченным зеленой меткой, и 7-амино-актиномицмном, меченным красной меткой. Результаты считывались при помощи проточного цитометра.

2.7 Иммунопреципитация и анализ убиквитинилирования рецептора

ЭФР

Через 72 часа после трансфекции клетки лизировались в буфере RIPA описанным выше способом. Очищенные центрифугированием и нормализованные на уровень белка лизаты растворялись в 0.5 мл натрий-фосфатного буфера и инкубировались с 10 мкл антител к рецептору ЭФР в течение 12 часов при +4°С при постоянном вращении. Затем к лизатам добавлялось 20 мкл протеин-С-конъюгированных агарозных бус и инкубировалиьс в течение 2 часов при +4°С при постоянном вращении. Бусы осаждались центрифугированием при 3,000 g и отмывались в натрий-фосфатном буфере три раза, после чего кипятились в растворе додецилсульфата натрия в течение пяти минут для отщепления белков от бус и их денатурации. Суспензия бус центрифугировалась при 10,000 % и полученный супернатант подвергался анализу иммуноблоттингом по описанному выше протоколу. После переноса белков мембрана окрашивалась антителами к убиквитину и рецептору ЭФР в качестве контроля преципитации.

2.8 Иммунофлуоресценция и анализ колоколизации сигналов

Клетки выращивались и трансфецировались описанным выше способом в 6-луночных планшетах на стеклянных покровных стеклах. Через 48 часов после трансфекции среда клеток сменялась на бессывороточную для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток. Через 72 часа после трансфекции клетки помещались на лед и инкубировались с меченным зеленой меткой ЕОБ в концентрации 200 нг/мл в течение 10 минут, после чего отмывались от несвязавшегося лиганда в холодном натрий-фосфатном буфере, помещались в полную ростовую среду и инкубировались при +37°С для стимуляции рецептора. По окончании стимуляции клетки немедленно помещались на лед для остановки транспорта рецептора и отмывались холодным натрий-фосфатным буфером. Клетки фиксировались в натрий-фосфатном буфере, содержащим 4% формальдегида, в течение 10 минут при комнатной температуре. Все последующие процедуры выполнялись при комнатной температура. Перфорация клеточных мембран проводилась раствором 0.05%-ного тритона Х-100 в натрий-фосфатном буфере в течение 5 минут, после чего клетки блокировались в растворе 3%-ного бычьего сывороточного альбумина в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут. Затем клетки окрашивались по 1 часу первичными и вторичными антителами с тремя пятиминутными отмывками натрий-фосфатным буфером после каждой инкубации. Концентрация первичных антител составляла 1-2 мг/мл, вторичных антител - 2 мкг/мл. Покровные стекла приклеивались на предметные при помощи глицерола, содержащего краситель ДНК DAPI. Фотографии с полученных слайдов снимались на спектральном конфокальном микроскопе Nikon С-1 объективом с 60-кратным увеличением. Полученные снимки анализировались в программном обеспечении MetaMorph (Universal Imaging/Molecular Devices). Анализ колоколизации красного и зеленого сигналов проводился при помощи встроенного в программу приложения.

2.9 Проточная цитометрия

Клетки трипсинизировались и после подсчета разводились до конечной концентрации 106 клеток/мл в холодном натрий-фосфатным буфере, содержащим 10% сыворотки и 1% азида натрия. Все процедуры проводилиь на льду для замедления внутриклеточного транспорта рецептора ЭФР. В пробирки помещалось по 100 мкл суспензии клеток и добавлялись первичные антитела до конечной концентрации 1 мкл/мл, после чего клетки инкубировались в течение часа. Клетки отмывались от неприсоединенных антител 3 раза в натрий-фосфатным буфере с центрифугированиями со скоростью 900 g для осаждения клеток. Затем клетки инкубировались со вторичными антителами в конечной концентрации 2 мкг/мл в течение часа, после чего отмывались 3 раза в натрий-фосфатным буфере. Готовые образцы хранились при +4°С без доступа света до считывания результатов при помощи проточного цитометра.

2.10 Статистический анализ

Для статистического анализа полученных данных использовался двусторонний ^критерий Стьюдента. Статистически достоверным принималось различие при значении р<0.05. Проверка полученных выборок на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова; критерием нормальности выборки было значение р>0.10.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Горин, Андрей Олегович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ефремова, Т. Н. Сборка актиновых филаментов в трансформированных клетках при действии мембранных модификаторов, связывающих холестерин / Т. Н. Ефремова, В.И. Чубинский-Надеждин, С.Ю. Хайтлина, Е.А. Морачевская // Цитология - 2012. - Т. 54(6) - С. 508514.

2. Ивков, В. Г. Липидный бислой биологических мембран / В. Г. Ивков, Г. Н. Берестовский - М.: Изд-во Наука - 1982. - 224 с.

3. Имянитов, Е. Н. Общие представления о таргетной терапии / Е. Н. Имянитов // Практическая онкология - 2010. - Т. 11(3). - С. 123-130.

4. Чиссов, В. И. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность) - М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздавсоцразвития России. - 2012. - 260 с.

5. Чу, Э. Химиотерапия злокачественных новообразований / Э. Чу, В. Де Вита-младший - М.: Изд-во Практика - 2006. - 447 с.

6. Astsaturov, I. Synthetic lethal screen of an EGFR-centered network to improve targeted therapies / I. Astsaturov, V. Ratushny, A. Sukhanova, M. B. Einarson, T. Bagnyukova, Y. Zhou, K. Devarajan, J. S. Silverman, N. Tikhmyanova, N. Skobeleva, A. Pecherskaya, R. E. Nasto, C. Sharma, S. A. Jablonski, I. G. Serebriiskii, L. M. Weiner, E. A. Golemis // Science signaling. - 2010. - Vol. 3. - P. 130-141.

7. Argiris A. Early tumor progression associated with enhanced EGFR signaling with bortezomib, cetuximab, and radiotherapy for head and neck cancer / A. Argiris, A. G. Duffy, S. Kummar, N. L. Simone, Y. Arai, S. W. Kim, et al. // Clinical Cancer Research. - 2011. - Vol. 17. - P. 5755-5764.

8. Bionda, C. Differential regulation of cell death in head and neck cell carcinoma through alteration of cholesterol levels in lipid rafts microdomains / C. Bionda, A. Athias, D. Poncet, G. Alphonse, A.

Guezguez, P. Gambert, C. Rodriguez-Lafrasse, D. Ardail // Biochemical pharmacology. - 2008. - Vol. 75. - P.761-772.

9. Bogh, I. B. Testicular concentration of meiosis-activating sterol is associated with normal testicular descent / I. B. Bogh, M. Baltsen, A. G. Byskov, T. Greve // Theriogenology. - 2001. - Vol. 55. - P. 983-992.

10. Bonaccorsi, L. Altered endocytosis of epidermal growth factor receptor in androgen receptor positive prostate cancer cell lines / L. Bonaccorsi, D. Nosi, M. Muratori, L. Formigli, G. Forti, E. Baldi // Journal of molecular endocrinology. - 2007. - Vol. 38. - P.51-66.

11. Bose, P. Neratinib: an oral, irreversible dual EGFR/HER2 inhibitor for breast and non-small cell lung cancer / P. Bose, H. Azer // Expert opinion on investigational drugs - 2009. - Vol. 18. - P. 1735-1751.

12. Brandt, B. Mechanisms of egfr gene transcription modulation: relationship to cancer risk and therapy response / B. Brandt, S. Meyer-Staeckling, H. Schmidt, K. Agelopoulos, H. Buerger // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research - 2006. - Vol. 12. -P. 7252-7260.

13. Brough, R. Searching for synthetic lethality in cancer / R. Brough, J. R. Frankum, S. Costa-Cabral, C. J. Lord, A. Ashworth // Current opinion in genetics & development - 2011. - Vol. 21. - P. 34-41.

14. Burke, P. Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking / P. Burke, K. Schooler, H. S. Wiley //Molecular biology of the cell-2001.-Vol. 12.-P. 1897-1910.

15. Byskov, A. G. Role of meiosis activating sterols, MAS, in induced oocyte maturation / A. G. Byskov, C. Y. Andersen, L. Leonardsen // Molecular and cellular endocrinology - 2002. - Vol. 187. - P. 189-196

16. Byskov, A. G. Chemical structure of sterols that activate oocyte meiosis / A. G. Byskov, C. Y. Andersen, L. Nordholm, H. Thogersen, G. Xia, O. Wassmann, J. V. Andersen, E. Guddal, T. Roed // Nature - 1995. - Vol. 374.-P. 559-562.

17. Byskov, A. G. Cumulus cells of oocyte-cumulus complexes secrete a meiosis-activating substance when stimulated with FSH / G. Byskov, C. Y. Andersen, A. Hossaini, X. Guoliang // Molecular reproduction and development - 1997. - Vol. 46. - P. 296-305.

18. Ceresa, B. P. Regulation of EGFR endocytic trafficking by rab proteins. / B. P. Ceresa // Histology and histopathology - 2006. - Vol. 21. - P. 987-993.

19. Chan, D. A. Harnessing synthetic lethal interactions in anticancer drug discovery / D. A. Chan, A.J. Giaccia // Nature reviews: Drug discovery -2011.-Vol. 10.-P. 351-364.

20. Chinnaiyan, P. Clinical advancement of EGFR inhibitors in cancer therapy / P. Chinnaiyan, P. M. Harari // Methods in molecular biology - 2006. - Vol. 327.-P. 189-202.

21. Cho, H. S. Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether / H. S. Cho, D. J. Leahy // Science - 2002. - Vol. 297. -P. 1330-1333.

22. Cho, H. S. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab / H. S. Cho, K. Mason, K. X. Ramyar, A. M. Stanley, S. B. Gabelli, D. W. Denney, D. J. Leahy // Nature - 2003. -Vol. 421.-P. 756-760.

23. Ciardiello, F. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor / F. Ciardiello, G. Tortora // Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research - 2001. - Vol. 7. - P. 2958-2970.

24. Costanzo, M. The genetic landscape of a cell / M. Costanzo, A. Baryshnikova. J. Bellay, Y. Kim, E. D. Spear, C. S. Sevier, H. Ding, J. L. Koh, K. Toufighi, S. Mostafavi et al. // Science - 2010. - Vol. 327. - P. 425431.

25. Coticchio, G. Mouse oocyte meiotic resumption and polar body extrusion in vitro are differentially influenced by FSH, epidermal growth factor and meiosis-activating sterol / G. Coticchio, G. Rossi, A. Borini, C. Grondahl, G.

Macchiarelli, C. Flamigni, S. Fleming, S. Cecconi // Human reproduction -2004. - Vol. 19. - P. 2913-2918.

26. Danilo, C. Cholesterol and breast cancer development / C. Danilo, P. G. Frank // Curr Opin Pharmacol - 2012. - Vol. 12. - P. 677-682.

27. de Larco, J. E. Growth factors from murine sarcoma virus-transformed cells / J. E. de Larco, G. J. Todaro // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1987. - Vol.75. - P. 4001-4005.

28. de Melker, A. A. c-Cbl directs EGF receptors into an endocytic pathway that involves the ubiquitin-interacting motif of Epsl5 / A. A. de Melker, G. van der Horst, J. Borst // Journal of cell science - 2004. - Vol. 117. - P. 50015012.

29. Dean-Colomb, W. Her2-positive breast cancer: herceptin and beyond / W. Dean-Colomb, F. J. Esteva // European journal of cancer - 2008. - Vol. 44. -P. 2806-2812.

30. Di Fiore, P. P. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells / P. P. Di Fiore, J. H. Pierce, T. P. Fleming, R. Hazan, A. Ullrich, C. R. King, J. Schlessinger, S. A. Aaronson // Cell - 1987. - Vol. 51. - P. 1063-1070.

31. Dong, Y. Synthetic lethality through combined Notch-epidermal growth factor receptor pathway inhibition in basal-like breast cancer / Y. Dong, A. Li, J. Wang, J. D. Webber, L. S. Mitchel // Cancer Res - 2010. - Vol. 70. -P. 5465-5474.

32. Eberhard, D. A. Mutations in the epidermal growth factor receptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients with non-small-cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib / D. A. Eberhard, B. E. Johnson, L. C. Amler, A. D. Goddard, S. L. Heldens, R. S. Herbst, W. L. Ince, P. A. Janne, T. Januario, D. H. Johnson, et al. // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology - 2005. - Vol. 23. - P. 5900-5909.

33. Eden, E. R. The role of EGF receptor ubiquitination in regulating its intracellular traffic / E. R. Eden, F. Huang, A. Sorkin, C. E. Futter // Traffic -2012.-Vol. 13.-P. 329-337.

34. Elloumi, J. Monoclonal antibodies as cancer therapeutics / J. Elloumi, K. Jellali, I. Jemel, S. Aifa // Recent patents on biotechnology - 2012. - Vol. 6. -P. 45.56.

35. Faerge, I. Resumption of meiosis induced by meiosis-activating sterol has a different signal transduction pathway than spontaneous resumption of meiosis in denuded mouse oocytes cultured in vitro / I. Faerge, B. Terry, J. Kalous, P. Wahl, M. Lessl, J. L. Ottesen, P. Hyttel, C. Grondahl // Biology of reproduction - 2001. - Vol. 65. - P. 1751-1758.

36. Ferguson, K. M. EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization / K. M. Ferguson, M. B. Berger, J. M. Mendrola, H. S. Cho, D. J. Leahy, M. A. Lemmon // Molecular cell - 2003. Vol. 11.-P. 507-517.

37. Fontanini, G. Evaluation of epidermal growth factor-related growth factors and receptors and of neoangiogenesis in completely resected stage I-IIIA non-small-cell lung cancer: amphiregulin and microvessel count are independent prognostic indicators of survival / G. Fontanini, M. De Laurentiis, S. Vignati, S. Chine, M. Lucchi, V. Silvestri, A. Mussi, S. De Placido, G. Tortora, A. R. Bianco // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research - 1998. - Vol. 4. -P. 241-249.

38. Frederick, L. Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human glioblastomas / L. Frederick, X. Y. Wang, G. Eley, C. D. James // Cancer Res - 2000. - Vol. 60. - P. 1383-1387.

39. Freed-Pastor, W. A. Mutant p53 disrupts mammary tissue architecture via the mevalonate pathway / W. A. Freed-Pastor, H. Mizuno, X. Zhao, A. Langerod, S. H. Moon, R. Rodriguez-Barrueco, A. Barsotti, A. Chicas, W. Li, A. Polotskaia // Cell - 2012. - Vol. 148. - P. 244-258.

40. Freudlsperger, C. EGFR-PI3K-AKT-mTOR signaling in head and neck squamous cell carcinomas: attractive targets for molecular-oriented therapy / C. Freudlsperger, J. R. Burnett, J. A. Friedman, V. R. Kannabiran, Z. Chen, C. Van Waes // Expert opinion on therapeutic targets - 2011. - Vol. 15. - P. 63-74.

41. Gachotte, D. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae ERG26 gene encoding the C-3 sterol dehydrogenase (C-4 decarboxylase) involved in sterol biosynthesis / D. Gachotte, R. Barbuch, J. Gaylor, E. Nickel, M. Bard // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1998. - Vol. 95. - P. 13794-13799.

42. Gachotte, D. A yeast sterol auxotroph (erg25) is rescued by addition of azole antifungals and reduced levels of heme / D. Gachotte, C. A. Pierson, N. D. Less, R. Barbuch, C. Koegel, M. Bard // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1997. - Vol. 94. -P. 11173-11178.

43. Garrett, T. P. The crystal structure of a truncated ErbB2 ectodomain reveals an active conformation, poised to interact with other ErbB receptors / T. P. Garrett, N. M. McKern, M. Lou, T. C. Elleman, T. E. Adams, G. O. Lovrecz, M. Kofler, R. N. Jorissen, E. C. Nice, A. W. Burgess, C. W. Ward // Molecular cell - 2003. - Vol. 11. - P. 495-505.

44. Garrett, T. P. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha / T. P. Garrett, N. M. McKern, M. Lou, T. C. Elleman, T. E. Adams, G. O. Lovrecz, H. J. Zhu, F. Walker, M. J. Frenkel, P. A. Hoyne, et al. // Cell -2002. - Vol. 110. - P. 763-773.

45. Gazdar, A. F. Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors / A. F. Gazdar // Oncogene - 2009. - Vol. 28(1). - P. 24-31.

46. Goh, L. K. Multiple mechanisms collectively regulate clathrin-mediated endocytosis of the epidermal growth factor receptor / L. K. Gah, F. Huang,

W. Kim, S. Gygi, A. Sorkin // The Journal of cell biology - 2010. - Vol. 189.-P. 871-883.

47. Grondahl, C. Meiosis-activating sterol promotes resumption of meiosis in mouse oocytes cultured in vitro in contrast to related oxysterols / C. Grondahl, J. L. Ottesen, M. Lessl, P. Faarup, A. Murray, F. C. Gronvald, C. Hegele-Hartung, I. Ahnfelt-Ronne // Biology of reproduction - 1998. - Vol. 58.-P. 1297-1302.

48. Gschwind, A. The discovery of receptor tyrosine kinases: targets for cancer therapy / A. Gschwind, O. M. Fischer, A. Ullrich // Nature reviews Cancer -2004.-Vol. 4.-P. 361-370.

49. Guo, D. The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis / D. Guo, I. J. Hildebrandt, R. M. Prins, H. Soto, M. M. Mazzotta, J. Dang, J. Czernin, J. Y. Shyy, A. D. Watson, M. Phelps, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2009. - Vol. 106. -P. 12932-12937.

50. Happle, R. The CHILD syndrome. Congenital hemidysplasia with ichthyosiform erythroderma and limb defects / R. Happle, H. Koch, W. Lenz // European journal of pediatrics - 1980. - Vol. 134. - P. 27-33.

51. Harris, R. C. EGF receptor ligands / R. C. Harris, E. Chung, R. J. Coffey // Experimental cell research - 2003. - Vol. 284. - P. 2-13.

52. He, M. Mutations in the human SC4MOL gene encoding a methyl sterol oxidase cause psoriasiform dermatitis, microcephaly, and developmental delay / M. He, L. E. Kratz, J. J. Mitchel, A. N. Valejo, L. Ferris, R. I. Kelley, J. J. Hoover, D. Jukic, K. M. Gibson, L. A. Wolfe, et al. // The Journal of clinical investigation - 2011. - Vol. 121. - P. 976-984.

53. Hicke, L. A new ticket for entry into budding vesicles-ubiquitin / L. A. Hicke // Cell - 2001. - Vol. 106. - P. 527-530.

54. Hirsch, F. R. Increased EGFR gene copy number detected by fluorescent in situ hybridization predicts outcome in non-small-cell lung cancer patients

treated with cetuximab and chemotherapy / F. R. Hirsch, R. S. Herbst, C. Olsen, K. Chansky, J. Crowley, K. Kelly, W. A. Franklin, P. A. Bunn Jr., M. Varella-Garcia, D. R. Gandara // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology - 2008. - Vol. 26. - P. 3351-3357.

55. Hirsch, F. R. Increased epidermal growth factor receptor gene copy number detected by fluorescence in situ hybridization associates with increased sensitivity to gefitinib in patients with bronchioloalveolar carcinoma subtypes: a Southwest Oncology Group Study / F. R. Hirsch, M. Varella-Garcia, J. McCoy, H. West, A. C. Xavier, P. Gumerlock, P. A. Bunn Jr., W. A. Franklin, J. Crowley, D. R. Gandara // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology - 2005. - Vol. 23.-P. 6838-6845.

56. Hopper-Borge, E. A. Mechanisms of tumor resistance to EGFR-targeted therapies / E. A. Hopper-Borge, R. E. Nasto, V. Ratushny, L. M. Weiner, E. A. Golemis, I. Astsaturov // Expert opinion on therapeutic targets - 2009. -Vol. 13.-P. 339-362.

57. Hortobagyi, G. N. Opportunities and challenges in the development of targeted therapies / G. N. Hortobagyi // Semin Oncol - 2004. - Vol. 31 - P. 21-27.

58. Hummel, M. Left-sided CHILD syndrome caused by a nonsense mutation in the NSDHL gene / M. Hummel, D. Cunningham, C. J. Mullet, P. I. Kelley, G. E. Herman // American journal of medical genetics - 2003. - Vol. 122A. -P. 246-251.

59. Humphrey, P. A. Deletion-mutant epidermal growth factor receptor in human gliomas: effects of type II mutation on receptor function / P. A. Humphrey, L. M. Gangarosa, A. J. Wong, G. E. Archer, M. Lund-Johansen, R. Bjerkvig, O. D. Laerum, H. S. Friedman, D. D. Bigner // Biochemical and biophysical research communications - 1991. - Vol. 178. - P. 1413-1420.

60. Israel, M. The metabolic advantage of tumor cells / M. Israel, L. Schwartz // Mol Cancer - 2011. - Vol. 10. - P. 70-79.

61. Jacobs, R. J. Cholesterol metabolism and colorectal cancers / R. J. Jacobs, P. W. Voorneveld, L. L. Kodach, J. C. Hardwick // Curr Opin Pharmacol -2012-Vol. 12.-P. 690-695.

62. Janne, P. A. Factors underlying sensitivity of cancers to small-molecule kinase inhibitors. P. A. Janne, N. Gray, J. Settleman // Nature reviews Drug discovery - 2009. - Vol. 8. - P. 709-723.

63. Jiang, X., Grb2 regulates internalization of EGF receptors through clathrin-coated pits / X. Jiang, F. Huang, A. Marusyk, A. Sorkin // Molecular biology of the cell - 2003. - Vol. 14. P. 858-870.

64. Jimeno, A. Blockade of epidermal growth factor receptor (EGFR) activity / A. Jimeno, M. Hidalgo // Critical reviews in oncology/hematology - 2005. -Vol. 53. P. 179-192.

65. Johnston, S. R. Lapatinib: a novel EGFR/HER2 tyrosine kinase inhibitor for cancer / S. R. Johnston, A. Leary // Drugs of today - 2006. - Vol. 42. - P. 441-453.

66. Jones, R. B. A quantitative protein interaction network for the ErbB receptors using protein microarrays / R. B. Jones, A. Gordus, J. A. Krall, G. MacBeath // Nature - 2006. - Vol. 439. - P. 168-174.

67. Kaelin, W. G., Jr. Synthetic lethality: a framework for the development of wiser cancer therapeutics / W. G. Kaelin Jr. // Genome medicine - 2009. -Vol. l.-P. 99-104.

68. Karamouzis, M. V. Therapies directed against epidermal growth factor receptor in aerodigestive carcinomas / M. V. Karamouzis, J. R. Grandis, A. Argiris // JAMA : the journal of the American Medical Association - 2007. -Vol. 298.-P. 70-82.

69. Kato-Stankiewicz, J. Inhibitors of Ras/Raf-1 interaction identified by two-hybrid screening revert Ras-dependent transformation phenotypes in human cancer cells / J. Kato-Stankiewicz, I. Hakimi, G. Zhi, J. Zhang, I.

Serebriiskii, L. Guo, H. Edamatsu, H. Koide, S. Menon, R. Eckl, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2002. - Vol. 99. - P. 14398-14403.

70. Kawamoto, T. Growth stimulation of A431 cells by epidermal growth factor: identification of high-affinity receptors for epidermal growth factor by an ariti-receptor monoclonal antibody / T. Kawamoto, J. D. Sato, A. Le, J. Polikoff, G. H. Sato, J. Mendelsohn // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1983. - Vol. 80. -P. 1337-1341.

71. Khan, E. M. Epidermal growth factor receptor exposed to cigarette smoke is aberrantly activated and undergoes perinuclear trafficking / E. M. Khan, R. Lanir, A. R. Danielson, T. Goldkorn // FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology - 2008. -Vol. 22.-P. 910-917.

72. Khodarev, N. N. MUC1-induced transcriptional programs associated with tumorigenesis predict outcome in breast and lung cancer / N. N. Khodarev, S. P. Pitroda, M. A. Becket, D. M. MacDermed, L. Huang, D. W. Kufe, R. R. Weichselbaum // Cancer Res - 2009. - Vol. 69. - P. 2833-2837.

73. Kobayashi, H. Hrs, a mammalian master molecule in vesicular transport and protein sorting, suppresses the degradation of ESCRT proteins signal transducing adaptor molecule 1 and 2 / H. Kobayashi, N. Tanaka, H. Asao, S. Miura, M. Kyuuma, K. Semura, N. Ishii, K. Sugamura // The Journal of biological chemistry - 2005. - Vol. 280. - P. 10468-10477.

74. Kolev, V. EGFR signalling as a negative regulator of Notch 1 gene transcription and function in proliferating keratinocytes and cancer / V. Kolev, A. Mandinova, J. Guinea-Viniegra, B. Hu, K. Lefort, C. Lambertini, V. Neel, R. Dummer, E. F. Wagner, G. P. Dotto // Nature cell biology -2008.-Vol. 10.-P. 902-911.

75. Konishi, J. Notch3 cooperates with the EGFR pathway to modulate apoptosis through the induction of bim / J. Konishi, F. Yi, X. Chen, H. Vo, D. P. Carbone, T. P. Dang // Oncogene - 1992. - Vol. 29. - P. 589-596.

76. Kritchevsky, S. B. Serum cholesterol and cancer risk: an epidemiologic perspective / S. B. Kritchevsky, D. Kritchevsky // Annual review of nutrition - 1992. - Vol. 12. - P. 391-416.

77. Laskin, J. J. Epidermal growth factor receptor: a promising target in solid tumours / J. J. Laskin, A. B. Sandler // Cancer treatment reviews - 2004. -Vol. 30-P. 1-17.

78. Lees, N. D. Biochemistry and molecular biology of sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae / N. D. Lees, M. Bard, D. R. Kirsch // Critical reviews in biochemistry and molecular biology - 1999. - Vol. 34. - P. 3347.

79. Lenferink, A. E. Differential endocytic routing of homo- and hetero-dimeric ErbB tyrosine kinases confers signaling superiority to receptor heterodimers / A. E. Lenferink, R. Pinkas-Kramarski, M. L. van de Poll, M. J. van Vugt, L. N. Klapper, E. Tzahar, H. Waterman, M. Sela, E. J. van Zoelen, Y. Yarden // The EMBO journal - 1998. - Vol. 17. - P. 3385-3397.

80. Lengauer, C. Genetic instabilities in human cancers / C. Lengauer, K. W. Kinzler, B. Vogelstein // Nature - 1988. - Vol. 396. - P. 643-649.

81. Levkowitz, G. Ubiquitin ligase activity and tyrosine phosphorylation underlie suppression of growth factor signaling by c-Cbl/Sli-1 / G. Levkowitz, H. Waterman, S. A. Ettenberg, M. Katz, A. Y. Tsygankov, I. Alroy, S. Lavi, K. Iwai, Y. Reiss, A. Ciechanover, et al. // Molecular cell -1999. - Vol. 4. - P. 1029-1040.

82. Li, J. A chemical and phosphoproteomic characterization of dasatinib action in lung cancer / J. Li, U. Rix, B. Fang, Y. Bai, A. Edwards, J. Colinge, K. L. Bennett, J. Gao, L. Song, S. Eschrich, et al. // Nature chemical biology -2010.-Vol. 6.-P. 291-299.

83. Lingwood, D. Lipid rafts as a membrane-organizing principle / D. Lingwood, K. Simons // Science - 2010. - Vol. 327. - P. 46-50.

84. Lynch, T. J. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib / T. J. Lynch, D. W. Bell, R. Sordells, S. Gurubhagavatula, R. Okimoto, B. W. Brannigan, P. L. Harris, S. Haserlat, J. G. Supko, F. G. Haluska et al. // The New England journal of medicine - 2004. - Vol. 350. - P. 2129-2139.

85. Malerod, L. Cargo-dependent degradation of ESCRT-I as a feedback mechanism to modulate endosomal sorting / L. Malerod, N. M. Pedersen, C. E. Sem Wegner, V. H. Lobert, E. Leithe, A. Brech, E. Rivedal, K. Liestol, H. Stenmark // Traffic - 2011. - Vol. 12. - P. 1211-1226.

86. Martin, S. A. Genomic instability and the selection of treatments for cancer / S. A. Martin, M. Hewish, C. J. Lord, A. Ashworth // The Journal of pathology - 2010. - Vol. 220. - P. 281-289.

87. Meriggi, F. Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: how to choose the right patient / F Meriggi, B. Di Biasi, A. Zaniboni // Current drug targets - 2009. -Vol. 10.-P. 1033-1040.

88. Metro, G. Epidermal growth factor receptor (EGFR) targeted therapies in non-small cell lung cancer (NSCLC) / G. Metro, G. Finocchiaro, L. Toschi, S. Bartolini, E. Magrini, A. Cancellieri, R. Trisolini, L. Castaldini, G. Tallini, L. Crino, F. Cappuzzo // Reviews on recent clinical trials - 2006. -Vol. l.-P. 1-13.

89. Miettinen, P. J. Epithelial immaturity and multiorgan failure in mice lacking epidermal growth factor receptor / P. J. Miettinen, J. E. Berger, J. Meneses, Y. Phung, R. A. Pedersen, Z. Werb, R. Derynck // Nature - 1995. - Vol. 376.-P. 337-341.

90. Milanezi, F. EGFR/HER2 in breast cancer: a biological approach for molecular diagnosis and therapy / F. Milanezi, S. Carvalho, F. C. Schmitt // Expert review of molecular diagnostics - 2008. - Vol. 8. - P. 417-434.

91. Moroni, M. Gene copy number for epidermal growth factor receptor (EGFR) and clinical response to antiEGFR treatment in colorectal cancer: a cohort study / M. Moroni, S. Veronese, S. Benvenuti, G. Marrapese, A. Sartore-Bianchi, F. Di Nicolantonio, M. Gambacorta, S. Siena, A. Bardelli // The lancet oncology - 2005. - Vol. 6. - P. 279-286.

92. Myromslien, F. D. Both clathrin-positive and -negative coats are involved in endosomal sorting of the EGF receptor / F. D. Myromslien, L. M. Grovdal, C. Raiborg, H. Stenmark, I. H. Madshus, E. Stang // Experimental cell research - 2006. - Vol. 312. - P. 3036-3048.

93. Nedergaard, M. K. Targeting the epidermal growth factor receptor in solid tumor malignancies / M. K. Nedergaard, C. J. Hedegaard, H. S. Poulsen // BioDrugs : clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy - 2012. - Vol. 26. - P. 83-99.

94. Nijman, S. M. Synthetic lethality: general principles, utility and detection using genetic screens in human cells / S. M. Nijman - 2011. - Vol. 585. - P. 1-6.

95. Ogiso, H. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains / H. Ogiso, R. Ishitani, O. Nureki, S. Fukai, M. Yamanaka, J. H. Kim, K. Saito, A. Sakamoto, M. Inoue, M. Shirouzu, S. Yokoyama // Cell - 2002. - Vol. 110. - P. 775-787.

96. Olayioye, M. A. ErbB receptor-induced activation of stat transcription factors is mediated by Src tyrosine kinases / M. A. Olayioye, I. Beuvink. K. Horsch, J. M. Daly, N. E. Hynes // The Journal of biological chemistry -1999.-Vol. 274.-P. 17209-17218.

97. Olayioye, M. A. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer / M. A. Olayioye, R. M. Neve, H. A. Lane, N. E. Hynes // The EMBO journal - 2000. - Vol. 19. - P. 3159-3167.

98. Pao, W. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib / W. Pao, V. Miller, M. Zakowski, J. Doherty, K. Politi, I.

Sarkaria, B. Singh, R. Heelan, V. Rusch, L. Fulton, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2004. -Vol. 101.-P. 13306-13311.

99. Park, J. Y. EGF-like growth factors as mediators of LH action in the ovulatory follicle / J. Y. Park, Y. Q. Su, M. Ariga, E. Jaw, S. L. Jin, M. Conti // Science - 2004. - Vol. 303. - P. 682-684.

100. , S. P. MUC1-induced alterations in a lipid metabolic gene network predict response of human breast cancers to tamoxifen treatment / S. P. Pitroda, N. N. Khodarev, M. A. Beckett, D. W. Kufe, R. R. Weichselbaum // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2009. - Vol. 106. - P. 5837-5841.

101. Prigent, S. A. Identification of c-erbB-3 binding sites for phosphatidylinositol 3'-kinase and SHC using an EGF receptor/c-erbB-3 chimera / S. A. Prigent, W. J. Gullick // The EMBO journal - 1994. - Vol. 13.-P. 2831-2841.

102. Purow, B. W. Notch inhibition as a promising new approach to cancer therapy / B. W. Purrow // Advances in experimental medicine and biology -2012. - Vol. 727. - P. 305-319.

103. Purow, B. W. Notch-1 regulates transcription of the epidermal growth factor receptor through p53 / B. W. Purrow, T. K. Sundaresan, M. J. Burdick, B. A. Kefas, L. D. Comeau, M. P. Hawkinson, Q. Su, Y. Kotliarov, J. Lee, W. Zhang, H. A. Fine // Carcinogenesis - 2008. - Vol. 29. - P. 918-925.

104. Quesnelle, K. M. STAT-mediated EGFR signaling in cancer / K. M. Quesnelle, A. L. Boehm, J. R. Grandis // Journal of cellular biochemistry -2007.-Vol. 102.-P. 311-319.

105. Raiborg, C. Hrs and endocytic sorting of ubiquitinated membrane proteins / C. Raiborg, H. Stenmark // Cell structure and function - 2002. - Vol. 27. -P. 403-408.

106. Rieske, P. A comparative study of epidermal growth factor receptor (EGFR) and MDM2 gene amplification and protein immunoreactivity in human

glioblastomas / P. A. Rieske, R. Kordek, J. Bartkowiak, M. Debiec-Rychter, W. Biernat, P. P. Liberski // Polish journal of pathology : official journal of the Polish Society of Pathologists - 1998. - Vol. 49. - P. 145-149.

107. Rozman, D. Perspectives of the non-statin hypolipidemic agents / D. Rozman, K. Monostory // Pharmacol Ther - 2010. - Vol. 127. - P. 19-40.

108. Rubin Grandis, J. Quantitative immunohistochemical analysis of transforming growth factor-alpha and epidermal growth factor receptor in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck / J. Rubin Grandis, M. F. Melhem. E. L. Barnes, D. J. Tweardy // Cancer - 1996. -Vol. 78.-P. 1284-1292.

109. Salomon, D. S. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies / D. S. Salomon, R. Brandt, F. Ciardiello, N. Normanno // Critical reviews in oncology/hematology - 1995. - Vol. 19. -P. 183-232.

110. Sato, J. D. Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors / J. D. Sato, T. Kawamoto, A. D. Le, J. Mendelsohn, J. Polikoff, G. H. Sato // Molecular biology & medicine -1983.-Vol. 1.-P. 511-529.

111. Schneider, M. R. Beyond wavy hairs: the epidermal growth factor receptor and its ligands in skin biology and pathology / M. R. Schneider, S. Werner, R. Paus, E. Wolf// The American journal of pathology - 2008. - Vol. 173. -P. 14-24.

112. Scita, G. The endocytic matrix / G. Scita, P. P. Di Fiore // Nature - 2010. -Vol. 463.-P. 464-473.

113. Sequist, L. V. First-line gefitinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer harboring somatic EGFR mutations / L. V. Sequist, R. G. Martins, D. Spigel, S. M. Grunberg, A. Spira, P. A. Janne, V. A. Joshi, D. McCollum, T. L. Evans, A. Muzikansky, et al. // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology -2008. - Vol. 26. - P. 2442-2449.

114. Shepherd, F. A. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer / F. A. Shepherd, J. Rodrigues Pereira, T. Ciuleanu, E. H. Tan, V. Hirsch, S. Thongprasert, D. Campos, S. Maoleekoonpiroj, M. Smylie, R. Martins // The New England journal of medicine - 2005. - Vol. 353. - P. 123-132.

115. Sibilia, M. Strain-dependent epithelial defects in mice lacking the EGF receptor / M. Sibilia, E. F. Wagner // Science - 1995. - Vol. 269. - P. 234238.

116. Sigismund, S. Clathrin-mediated internalization is essential for sustained EGFR signaling but dispensable for degradation / S. Sigismund, E. Argenzio, D. Tosoni, E. Cavallaro, S. Polo, P. P. Di Fiore // Developmental cell - 2008. - Vol. 15.-P. 209-219.

117. Sigismund, S. Clathrin-independent endocytosis of ubiquitinated cargos / S. Sigismund, T. Woelk, C. Puri, E. Maspero, C. Tacchetti, P. Transidico, P. P. Di Fiore, S. Polo // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2005. - Vol. 102. - P. 2760-2765.

118. Smyth, E. C. Targeted therapy for gastric cancer / E. C. Smyth, D. Cunningham // Current treatment options in oncology - 2012. - Vol. 13. - P. 377-389.

119. Sok, J. C. Mutant epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) contributes to head and neck cancer growth and resistance to EGFR targeting / J. C. Sok, F. M. Coppelli, S. M. Thomas, M. N. Lango, S. Xi, J. L Hunt, M. L. Freilino, M. W. Graner, C. J. Wikstrand, D. D. Bigner, et al. // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research - 2006. - Vol. 12. - P. 5064-5073.

120. Soltoff, S. P. pl20cbl is a cytosolic adapter protein that associates with phosphoinositide 3-kinase in response to epidermal growth factor in PC 12 and other cells / S. P. Soltoff, L. C. Cantley // The Journal of biological chemistry - 1996.-Vol. 271.-P. 563-567.

121. Spicer, J. F. EGFR inhibitors in non-small cell lung cancer (NSCLC): the emerging role of the dual irreversible EGFR/HER2 inhibitor BIBW 2992 / J.

F. Spicer, S. M. Rudman // Targeted oncology - 2010. - Vol. 5. - P. 245255.

122. Sporn, M. B. Autocrine growth factors and cancer / M. B. Sporn, A. B. Roberts // Nature - 1985. - Vol. 313. - P. 745-747.

123. Stark, C. BioGRID: a general repository for interaction datasets / C. Stark, B. J. Breitkreutz, T. Reguly, L. Boucher, A. Breitkreutz, M. Tyers // Nucleic acids research - 2006. - Vol. 34D. - P. 535-539.

124. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling / M. V. Sundaram // WormBook : the online review of С elegans biology - 2006. - P. 1-19.

125. Taron, M. Activating mutations in the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor are associated with improved survival in gefitinib-treated chemorefractory lung adenocarcinomas / M. Taron, Y. Ichinose, R. Rosell, Т. Мок, В. Massuti, L. Zamora, J. L. Mate, C. Manegold, M. Ono, M. Queralt, et al. // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research - 2005. - Vol. 11. -P. 5878-5885.

126. Threadgill, D. W. Targeted disruption of mouse EGF receptor: effect of genetic background on mutant phenotype / D. W. Threadgill, A. A. Dlugosz, L. A. Hansen, T. Tennenbaum, U. Lichti, D. Yee, C. LaMantia, T. Mourton, K. Herrup, R. C, Harris, et al. // Science - 1995. - Vol. 269. - P. 230-234.

127. Tong, J. Epidermal growth factor receptor phosphorylation sites Ser991 and Tyr998 are implicated in the regulation of receptor endocytosis and phosphorylations at Serl039 and Thrl041 / J. Tong, P. Taylor, S. M. Peterman, A. Prakash, M. F. Moran // Molecular & cellular proteomics : MCP - 2009. - Vol. 8. - P. 2131 -2144.

128. Trapani, L. Potential role of nonstatin cholesterol lowering agents / L. Trapani, M. Segatto, P. Ascenzi, V. Pallottini // IUBMB life - 2011. - Vol. 63.-P. 964-971.

129. Tzahar, E. A hierarchical network of interreceptor interactions determines signal transduction by Neu differentiation factor/neuregulin and epidermal

growth factor / E. Tzahar, H. Waterman, X. Chen, G. Levkowitz, D. Karunagaran, S. Lavi, B. Ratzkin, Y. Yarden // Molecular and cellular biology - 1996. - Vol. 16. - P. 5276-5287.

130. Vivanco, I. The phosphatase and tensin homolog regulates epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor response by targeting EGFR for degradation / I. Vivanco, D. Rohle, M. Versele, A. Iwanami, D. Kuga, B. Oldrini, K. Tanaka, J. Dang, S. Kubek, N. Palaskas, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2010. -Vol. 107.-P. 6459-6464.

131. Wang, Q. Identification of EGF receptor C-terminal sequences 1005-1017 and di-leucine motif 1010LL1011 as essential in EGF receptor endocytosis / Q. Wang, F. Zhu, Z. Wang // Experimental cell research - 2007. - Vol. 313. -P. 3349-3363.

132. Wei, X. Mechanism of EGER-related cancer drug resistance / X. Wei // Anti-cancer drugs - 2011. Vol. 22. - P. 963-970.

133. Weinstein, I. B. Oncogene addiction / I. B. Weinstein, A. Joe // Cancer Res - 2008. - Vol. 68. - P. 3077-3080

134. Wheeler, D. L. Mechanisms of acquired resistance to cetuximab: role of HER (ErbB) family members / D. L. Wheeler, S. Huang, T. J. Kruser, M. M. Nechrebecki, E. A. Armstrong, S. Benavente, V. Gondi, K. T. Hsu, P. M. Harari // Oncogene - 2008. - Vol. 27. - P. 3944-3956.

135. Willett, C. G. Targeted therapy in rectal cancer / C. G. Willet, D. G. Duda, B. G. Czito, J. C. Bendell, J. W. Clark, R. K. Jain // Oncology - 2007. - Vol. 21.-P. 1055-1065.

136. Xu, F. Dual roles for cholesterol in mammalian cells / F. Xu, S. D. Rychnovsky, J. D. Belani, H. H. Hobbs, J. C. Cohen, R. B. Rawson // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-2005.-Vol. 102.-P. 14551-14556.

137. Yaffe, M. B. Phosphotyrosine-bincung domains in signal transduction / M. B. Yaffe // Nature reviews Molecular cell biology - 2002. - Vol. 3. - P. 177-

138. Yang, W. Molecular targeting and treatment of composite EGFR and EGFRvIII-positive gliomas using boronated monoclonal antibodies / W. Yang, G. Wu, R. F. Barth, M. R. Swindall, A. K. Bandyopadhyaya, W. Tjarks, K. Tordoff, M. Moeschberger, T. J. Sferra, P. J. Binns, et al. // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research - 2008. - Vol. 14. - P. 883-891.

139. Yarden, Y. The EGFR family and its ligands in human cancer, signalling mechanisms and therapeutic opportunities / Y. Yarden // European journal of cancer - 2001. - Vol. 37(4). - P. 3-8.

140. Yarden, Y. Untangling the ErbB signalling network / Y. Yarden, M. X. Sliwkowski // Nature reviews Molecular cell biology - 2001. - Vol. 2. - P.

141. Zhu, C. Q. Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinib in National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group Study BR.21 / C. Q. Zhu, G. da Cunha Santos, K. Ding, A. Sakurada, J. C. Cutz, N. Liu, T. Zhang, P. Marrano, J. A. Squire, et al. // Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology - 2008. - Vol.

186.

127-137.

26.-P. 4268-4275.