Роль белков теплового шока в патогенезе альтерации миокарда, обусловленной артериальной гипертензией и её сочетанием с сахарным диабетом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат наук Склифасовская Анастасия Павловна

• Склифасовская Анастасия Павловна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Склифасовская Анастасия Павловна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ БТШ В РЕАЛИЗАЦИИ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЕ (обзор литературы)

1.1 Современные представления о свойствах и функциях БТШ

1.2 Роль БТШ в структурных и метаболических изменениях тканей при различных видах патологии

1.2.1 БТШ и воспаление

1.3.1 ШР и атеросклероз

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика групп экспериментальных животных

2.2 Моделирование инсулинозависимого СД у животных генетических линий 1^аг-Куо1о и БИЯ

2.3 Методика исследования уровня кетонурии и глюкозурии в моче у крыс линии БИЯ имеющих стрептозотоцин-индуцированный СД

2.4 Морфологические методы исследования

2.5 Методика иммуногистохимического исследования

2.6 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ АГ, ИНСУЛИНОЗАВИСИМОГО СД И СОЧЕТАНИЯ АГ И СД 1 ТИПА НА МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ МИОКАРДА ЛЖ И ЭКСПРЕССИЮ БТШ ШР60, ШР27, ШР10

3.1 Уровень кетонурии и глюкозурии у крыс линии БИЯ со стрептозотоцин-индуцированным СД

3.2 Морфологическая характеристика миокарда ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и их сочетании [Б1а§опгауоу М.Ь. е1 а1., 2020]

3.3 Экспрессия БТШ ИБР60 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа [Б^опгауоу М.Ь. е1 а1., 2020]

3.4 Экспрессия БТШ ИБР10 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа_ [Бк^авоУБкауа А.Р. е1 а1., 2021]

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АГ, ИНСУЛИНОЗАВИСИМОГО СД И СОЧЕТАНИИ АГ И СД 1 ТИПА НА ЭКСПРЕССИЮ БЕЛКОВ ВЕ^1, ВАХ, ВСЬ-2

4.2 Экспрессия белка Вах в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа [Склифасовская А.П. и соавт., 2021]

ГЛАВА 5. О РОЛИ БТШ В СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ МИОКАРДА И МЕХАНИЗМАХ ИНДУКЦИИ РЕГУЛИРУМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ ПРИ СОЧЕТАНИИ АГ С СД (обсуждение полученных результатов)

5.1 Особенности индукции БТШ ИБР60 при альтерации миокарда, вызванной гемодинамической перегрузкой и/или метаболическими нарушениями

5.3 Об особенностях механизмов регуляции апоптоза и аутофагии белками теплового шока при альтерации миокарда, вызванной гемодинамической перегрузкой и/или метаболическими нарушениями

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги выполненного исследования

Практические рекомендации

Перспективы дальнейшей разработки темы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль белков теплового шока в патогенезе альтерации миокарда, обусловленной артериальной гипертензией и её сочетанием с сахарным диабетом»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. По данным ВОЗ, от сахарного диабета (СД) страдает около 422 млн. человек во всём мире [ВОЗ, 2021]. В 2019 г. причиной 1,5 млн. смертельных исходов явился СД, а за период с 2000 по 2019 г. смертность от данного заболевания в мире выросла на 70%, при этом 80% прироста приходится на долю мужчин [ВОЗ, 2021]. От сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в 2016 г. умерло 17,9 млн. человек, что составило 31% всех случаев смерти в мире [ВОЗ, 2017]. При этом сочетание артериальной гипертензии (АГ) с СД повышает риск неблагоприятных сердечно-сосудистых событий даже в случае маскированной гипертензии по сравнению с клиническими ситуациями отсутствия подобного сочетания, что было показано в исследовании HONEST [Kushiro T. et al., 2017]. Согласно результатам анализа, выполненного по 11 регистрам ишемического инсульта стран Европы и США, его предиктором в 59,3 % является АГ, а в 19,8 % — СД [Ntaios G. et al., 2016].

Сочетание АГ и СД оказывает крайне негативное влияние на сердечнососудистую систему, приводя, в частности, к возникновению и быстрому прогрессированию хронической сердечной недостаточности [Честикова А.И. и соавт., 2016]. Несмотря на уже достигнутый прогресс в лечении как АГ, так и СД, в последнее время принципиально новых подходов к решению данной проблемы предложено не было. В этой связи остаётся актуальным вопрос дальнейшего поиска потенциальных мишеней для разработки новых методов фармакотерапии. Необходимы данные о естественных молекулярных механизмах защиты кардиомиоцитов (КМЦ) от воздействия повреждающих факторов. В настоящее время активно изучается возможность воздействия на системы контроля качества белка в клетках миокарда при сердечной недостаточности [Wang X. et al., 2006]. Данные молекулярные факторы имеют выраженное структурное и

функциональное сходство с белками, которые, участвуют в патогенезе болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний [Lackie R.E. et al., 2017].

Поддержание постоянства белкового состава клеток имеет важное значение для надлежащей клеточной функции в различных тканях, особенно в миокарде, поскольку КМЦ являются терминально дифференцированными клетками и имеют весьма ограниченный регенераторный потенциал. При этом метаболические потребности сердца требуют жесткого контроля над качеством белка [Campos J.C. et al., 2012]. Клеточный стресс в миокарде, возникающий при ишемии, АГ и метаболических расстройствах, включая СД, могут нарушать белковый гомеостаз и вызывать неправильное свертывание клеточных белков. Внутриклеточное накопление токсичных, неправильно свернутых белков и их агрегатов может способствовать развитию сердечной недостаточности [Tarone G. et al., 2014]. Клетки обладают врожденным механизмом детекции неправильного свертывания белков, с помощью которого они могут восстанавливать или удалять эти белки. Данный механизм называется "Protein quality control (PQC)" и состоит из 3 основных путей. Неправильно свернутые белки сначала подвергаются воздействию белков теплового шока (БТШ), которые являются молекулярными шаперонами. Когда система шаперона не может осуществить рефолдинг денатурированных белков, задействуется второй путь, по которому эти белки убиквитинируются и направляются в протеосомный механизм для последующей деградации. В условиях, при которых эти системы нарушены или перегружены, такие убиквитинированные белки накапливаются в околоядерных структурах, так называемых «агресомах», которые в конечном итоге утилизируются посредством третьего механизма - аутофагии [Wang X. et al., 2006].

БТШ представляют собой семейство консервативных белков, которые могут способствовать правильному сворачиванию белка, поддерживать его стабильность и регулировать клеточный метаболизм, постоянство клеточного состава тканей и другие процессы в качестве молекулярных шаперонов. БТШ также называют стресс-индуцируемыми белками, поскольку они способны в условиях воздействия на клетку неблагоприятных факторов стабилизировать и репарировать белки в

процессе их синтеза в клетке [Haslbeck M. et al., 2015]. Однако они также принимают участие в модуляции воспалительной реакции, оксидативного стресса, метаболического повреждения КМЦ [Schroder K. et al., 2010; Gomez-Pastor R. et al., 2017; Dowell J. et al., 2019].

Значительный интерес представляет влияние БТШ на процессы регулируемой клеточной гибели КМЦ, так как они вносят значительный вклад в реализацию компенсаторно-приспособительных процессов при повреждении сердца. В ряде исследований изучалась роль апоптоза и аутофагии в патогенезе ишемического повреждения сердца [Zhang H. et al., 2008; Xie M. et al., 2014; Blagonravov M.L. et al., 2016]. БТШ опосредуют многие механизмы активации апоптотического каскада, играя как про- так и антиапоптотическую роль в зависимости от их местоположения в клетке [Xu C. et al., 2011; Shan R. et al., 2020]. Такой вид клеточной гибели как аутофагия в одних случаях может приводить к гибели клеток, а в других - выступает в качестве механизма их выживания [Ковалева О.В. и соавт., 2014].

Несмотря на наличие многочисленных данных, касающихся роли БТШ и факторов, участвующих в программированной клеточной гибели, в ответных реакциях клеток на воздействие патологических факторов, в настоящее время отсутствует однозначное представление об их месте в патогенезе повреждения миокарда, обусловленного хронической гемодинамической перегрузкой и метаболическими нарушениями.

Степень разработанности темы. На сегодняшний день накоплен значительный объём данных о роли БТШ в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Особый интерес представляет их роль в механизмах поддержания тканевого гомеостаза, особенно в условиях гипоксии КМЦ на фоне ИБС. В последнее время появились исследования, касающиеся генетических основ регуляции системы БТШ и их участия в патогенезе некоторых сердечнососудистых заболеваний.

Установлена роль БТШ в процессах модуляции регулируемой (программированной) клеточной гибели, их функции в изменении аутофагического потока при адаптации к клеточному стрессу. Также рассматривается их влияние на процесс перехода физиологического уровня аутофагии на каскад активации апоптотического процесса клеточной гибели в условиях гипоксии.

Цель исследования. Изучить в эксперименте особенности экспрессии БТШ с различной молекулярной массой в КМЦ, особенности реализации отдельных видов регулируемой клеточной гибели КМЦ, а также патоморфологические изменения миокарда при генетически обусловленной АГ, инсулинозависимом СД и их сочетании.

Задачи исследования:

1. Дать качественную и количественную оценку морфологического состояния миокарда при стрептозотоцин-индуцированном СД у крыс линии Wistar-Kyoto и

2. Оценить активность экспрессии БТШ ШР60, ШРВ1 (ШР27) и ШР10 в КМЦ ЛЖ крыс при АГ разных сроков, изолированном СД, а также при сочетании АГ и СД.

3. Провести анализ активности процессов инициации ВесНп-1-опосредованной аутофагии в КМЦ ЛЖ крыс при СД у крыс линии Wistar-Kyoto и БИЯ.

4. Исследовать особенности инициации апоптотического процесса посредством оценки экспрессии уровня Вах и Вс1-2 в КМЦ ЛЖ при стрептозотоцин-индуцированном СД у крыс линии Wistar-Kyoto и SHR.

5. Изучить возможную роль БТШ в инициации аутофагии, апоптотической и антиапототической программ в КМЦ ЛЖ крыс при АГ разных сроков, изолированном СД, а также при сочетании АГ и СД.

Научная новизна. Впервые проведено исследование роли БТШ с различной молекулярной массой в процессе повреждения КМЦ ЛЖ, вызванного гемодинамической перегрузкой, метаболическими нарушениями при инсулинозависимом СД, а также в условиях сочетания АГ и инсулинозависимого СД.

Получены принципиально новые данные об активности молекулярных процессов, опосредующих два типа регулируемой клеточной гибели - апоптоз и аутофагию в КМЦ при сочетании АГ и СД. Впервые исследована Beclin-1-зависимая аутофагия КМЦ, а также экспрессия про- и антиапоптотических факторов Bax и Bcl-2 при изолированном СД 1 типа и сочетании инсулинозависимого СД с АГ.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе проведенного исследования получены данные о роли БТШ и ряда молекулярных механизмов, опосредующих отдельные виды регулируемой клеточной гибели, в патогенезе альтерации миокарда, обусловленной АГ и инсулинозависимым СД. Результаты проведённого эксперимента расширяют теоретическую базу, необходимую для поиска новых подходов к лечению сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с управлением процессами регулируемой клеточной гибели КМЦ с целью восстановления морфофункционального состояния поврежденного миокарда. Полученные результаты открывают новые перспективы для понимания молекулярных механизмов патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний. На основе представленных в работе данных могут быть проведены дальнейшие исследования, в частности, по разработке методов фармакотерапии, направленной на защиту КМЦ путём воздействия на синтез БТШ.

Методология и методы исследования. При проведении исследования проводилось моделирование инсулинозависимого СД путём введения стрептозотоцина нормотензивным крысам линии Wistar-Kyoto и спонтанно-гипертензивным крысам линии SHR. Опытные исследования проводились в соответствии с положениями Европейской конвенции о защите животных

(Директива 86/609/ЕЕС). Оценка морфологических изменений, а также результатов иммуногистохимической реакции в миокарде ЛЖ во всех группах исследования проводилась методом световой микроскопии гистологических срезов. Исследование про- и антиапоптотических процессов, аутофагии и продукции БТШ в миокарде выполнялось методом иммуногистохимии с использованием первичных кроличьих поликлональных антител ("SigmaAldrich", США) к белкам-маркерам БТШ (HSPB1 (HSP27), HSP10 и HSP60), аутофагии (Beclin-1) и апоптоза (Bcl-2, Bax) и системы детекции "Rabbit specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit" ("Abcam", Великобритания). Световая микроскопия гистологических срезов проводилась с помощью микроскопа "Nikon Eclipse E400" и видеосистемы "TauVideo" с программой "Тау Морфология" на основе видеокамеры "Watec 221s".

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии имени В.А. Фролова медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства науки и высшего образования РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Одним из механизмов патогенеза альтерации миокарда ЛЖ, обусловленного хронической перегрузкой ЛЖ на фоне первичной АГ и (или) метаболическими нарушениями при инсулинозависимом СД, можно считать снижение интенсивности продукции БТШ HSP60 в КМЦ.

2. Малые БТШ HSP10 и HSP27 показали разнонаправленный характер изменения экспрессии в КМЦ при АГ различных сроков, инсулинозависимом СД и при сочетании данных видов патологии. Белок HSP27 способен играть более значимую роль в кардиопротекции при АГ длительного срока, а белок HSP10 - при сочетании АГ и СД.

3. Снижение интенсивности Beclin-1-зависимой аутофагии КМЦ как механизма, направленного на выживание поврежденных клеток, а также

повышение апоптотического каскада реакций играет дезадаптивную роль в процессе повреждения КМЦ, вызванного АГ, на что указывает повышение экспрессии белка Bax и снижение уровня соотношения Bcl-2/Bax. При сочетании СД и АГ наблюдается увеличение базального уровня Beclin-1-зависимой аутофагии, что можно рассматривать в качестве механизма выживания поврежденных клеток в условиях снижении апоптотического каскада реакции.

Степень достоверности. Исследование проводилось на крысах линий Wistar-Kyoto (нормотензивные крысы) и SHR (животные с генетически обусловленной АГ), полученных из Питомника лабораторных животных «Пущино» (филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН), при достаточном объёме выборки. Качество животных подтверждено сертификатом качества и сертификатом здоровья, выданными поставщиком. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование проводили на оборудовании, сертифицированном для данного вида работ. Также применялись методы статистической обработки, полностью соответствующие поставленным задачам.

Апробация результатов работы. Результаты работы доложены и обсуждены на международном конгрессе "The 44-th FEBS Congress" (Краков, 2019), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы патофизиологии: теоретические и клинические аспекты», г. Уфа, 2021 г.; на XXVII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины - 2021», г. Санкт-Петербург, 2021 г.; на XVI Международной (XXV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, г. Москва, 2021 г.; на международном конгрессе "The 45-th FEBS Congress" (Любляна, 2021), на совместном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии имени В.А. Фролова и кафедры патологической анатомии медицинского института РУДН, 2021 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в числе которых 1 статья в издании из Перечня, рекомендованного Учёным советом РУДН, и 7 публикаций в журналах, индексируемых в МЦБ WoS и Scopus.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, 2-х глав, в которых изложены результаты собственного исследования, главы с обсуждением полученных результатов, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 25 рисунков. Библиография содержит 208 источников российской и зарубежной литературы.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ БТШ В РЕАЛИЗАЦИИ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ

В СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЕ (обзор литературы)

1.1 Современные представления о свойствах и функциях БТШ

В начале 1960-х годов в Международном Институте генетики и биофизики в Неаполе итальянский ученый Ферручо Ритосса опубликовал результаты исследования синтеза нуклеиновых кислот в слюнных железах дрозофилы. Ф. Ритосса отметил, что при помещении клеток в условия повышенной температуры наблюдалась транскрипционная активность полипотентных хромосом в виде формирования пуффов — характерных вздутий определённых дисков, образующихся в результате локальной реорганизации ДНК [Ritossa F. et al., 1962; De Maio A., 2012]. В результате этого в клетке происходил синтез новых белков. Спустя 12 лет Tissieres A. et al. (1974) выделили класс белков, получивших название «белки теплового шока». Активное изучение последних началось с 1980 г.

Белки теплового шока (от англ. heat shock proteins, HSP) представляют собой семейство белков с различной молекулярной массой, продукция которых усиливается в ответ на воздействие широкого спектра стрессовых факторов, таких как голодание, высокая температура, гипоксия или гипероксия, инвазия патогенов, воздействие химических веществ или ультрафиолета и т.д. [Kregel K. et al., 2002]. Они образуют сеть молекулярных факторов, способствующую или стабилизирующую правильное сворачивание субстратного белка для получения его функциональной/активной конформации. При этом они могут не ассоциироваться с субстратным белком в конечной структуре [Kim Y. et al., 2013]. В метаболизме клетки БТШ принимают активное участие, их доля от общего количества клеточных белков составляет от 2 до 20% в зависимости от того, находится ли клетка в покое или подвергается воздействию стрессовых факторов [Millar L. et al., 2012]. В этой связи БТШ принято подразделять на

конституциональные и индуцибельные в зависимости от уровня клеточного стресса [Labbadia J. et al., 2015].

В нормальных условиях БТШ действуют как молекулярные шапероны, основной функцией которых является контроль правильного формирования третичной структуры белка и ее перемещение в цитозоль на мембране шероховатого эндоплазматического ретикулума [Daniel N. et al., 2006]. Белки с неправильно сформированной третичной структурой подвергаются воздействию БТШ с последующим осуществлением их рефолдинга, утилизации в протеосомах или процессинга до молекулярных пептидов и связывания их с молекулами MCH 1. При этом они также транспортируют белковые молекулы через мембраны митохондрий и ядерную оболочку. В клетке, испытывающей стресс, БТШ взаимодействуют с белками, вставшими на путь денатурации, облегчают рефолдинг, предотвращают агрегацию неправильно свернутых белков или способствуют протеосомной деградации необратимо поврежденных белков [Hartl F. et al., 2011].

В цитоплазме клетки БТШ присутствуют в комплексе со специальным транскрипционным фактором HSF (от англ. heat shock transcription factor 1), состоящем из четырех членов (HSF1-4), которые сохраняются в неактивной мономерной форме в условиях отсутствия стрессовых факторов в клетке. HSF-1 является основным регулятором реакции теплового шока в клетках млекопитающих [Gomez-Pastor R. et al., 2018]. В нормальных условиях HSF-1 существует как неактивный мономер, активность которого подавляется при взаимодействии между комплексом HSP90 и HSP70 и доменом тримеризации HSF1. В различных стрессовых условиях, таких как тепловой шок, окислительный стресс или воспаление, HSF-1 активируется путем окисления его редокс-чувствительных цистеинов (Cys35 и Cys105) в дисульфат, что приводит к гомотримеризации и его диссоциации от комплекса HSP90/HSP70. Высвобождающийся HSF1 приобретает ДНК-связывающую активность и накапливается в ядре, где инициирует глобальную реакцию теплового шока в виде

активации генов, ответственных за продукцию БТШ и подавляет транскрипцию других генов [Neudegger T. et al., 2016].

В зависимости от молекулярной массы БТШ подразделяются на малые (с молекулярной массой до 40 кДа) и высокомолекулярные. Большую часть молекулярных шаперонов составляют малые БТШ (от англ. small heat shock proteins, sHSP). Семейство малых БТШ состоит из 10 членов (HSPB1-10), каждый из которых содержит характерный, сохраненный а-кристаллиновый домен (ACD), окруженный переменными N- и C-концевыми доменами. Распределение малых БТШ в ткани зависит от конкретного белка и варьируется от широкораспространенного до тканеспецифичесного [Bakthisaran R. et al., 2015]. Примечательной особенностью большинства малых БТШ, которая считается важной для их функционирования, является их способность образовывать широкий спектр олигомеров: малые БТШ собираются в гомо- и/или гетерогенные олигомерные комплексы, которые при стрессе диссоциируют на более мелкие мономеры. Другой важной характеристикой малых БТШ является тот факт, что различные члены их семейства могут фосфорилироваться, что изменяет их активность и олигомерное состояние [van Montfort R. et al., 2001]. Кроме того, некоторые члены sHSP ассоциируются с цитоскелетными белками в зависимости от фосфорилирования. Это приводит к стабилизации цитоскелетных структур и повышению устойчивости к стрессовым ситуациям [Golenhofen N. et al., 2004].

Малые БТШ являются АТФ-независимыми белками и представляют собой первую линию защиты в предотвращении внутриклеточной агрегации белков в условиях стресса, когда процесс денатурации резко активируется [Halsbeck M. el al., 2015]. При этом крупномолекулярные БТШ, такие как HSP60, HSP70 и HSP90, связывают развернутые или неправильно свернутые белки и способствуют их рефолдингу, используя энергию гидролиза АТФ [Nguyen V.C. et al., 2019]. Таким образом, в условиях стресса и возникшего дефицита энергии АТФ-независимые малые БТШ способны быстро предотвращать агрегацию белка с меньшими метаболическими затратами для клетки за счет удержания денатурирующих белков в свернутом состоянии и тем самым затормаживать процесс денатурации, пока

АТФ-зависимые белки теплового шока не завершат процесс рефолдинга [Carver J. et al., 2018]. Если правильное сворачивание не происходит, малые БТШ способствуют клиренсу денатурированных белков, направляя их по пути одного из механизмов деградации.

БТШ долгое время считались исключительно цитоплазматическими белками с функциями, ограниченными внутриклеточным пространством. Однако в дальнейшем было установлено, что они также способны экспонироваться на плазматической мембране и высвобождаться во внеклеточное пространство, где могут оказывать влияние на другие клетки и функции организма в целом [Tytell M. et al., 2005]. Поскольку БТШ не обладают сигнальными последовательностями, они не экспортируются через классический эндоплазматический ретикулум секреторного пути Гольджи, а задействуют альтернативные механизмы, включая высвобождение в экзосомах и/или лизосомах путем активного транспорта, а также путем пассивного транспорта из поврежденных или погибших клеток [Krause M. et al., 2015].

Внеклеточные БТШ (exHSP - extracellular HSP) вовлечены в межклеточную коммуникацию, а также в иммунные и воспалительные процессы. В сыворотке крови человека после перенесенного заболевания или стресса увеличивается концентрация exHSP. Они могут играть роль сигнала опасности (danger activated molecular pattern, DAMPs) [Ren B. et al., 2016], взаимодействуя с рецепторами распознавания (pattern recognition receptors, англ.), такими как Toll-подобные рецепторы (TLR), и активируя провоспалительную сигнализацию и транскрипцию [Calderwood S.K. et al., 2016]. БТШ, включая HSP60, HSP70, Grp 96 могут выполнять функцию DAMPs. Вместе с тем, некоторые БТШ обладают способностью связываться с молекулами, активирующими сигнализацию TLR, такими как липополисахариды, а провоспалительные свойства БТШ зависят от конкретной ткани [Taha E.A. et al., 2019].

В последнее время появляется все больше данных, указывающих на роль внутриклеточных БТШ (iHSP) в индукции ряда механизмов активации провоспалительных процессов. Так, в исследовании Krause M. et al. (2015) было

показано, что существует взаимодействие между iHSP и провоспалительными цитокинами на уровне генного регулятора. Промоторная область гена TNFa содержит сайт связывания HSF1, который подавляет транскрипцию TNFa. Это свидетельствует о том, что подавление HSF1 связано с постоянным повышением уровней TNFa и повышенной восприимчивостью к заражению эндотоксинами. Было также описано регулирование такой сети в противоположных направлениях: TNFa может временно подавлять активацию HSF1 [Knowlton A. et al., 2006]. Кроме того, JNK1 способен фосфорилировать HSF1 в его регуляторном домене, вызывая подавление активности транскрипции HSF1 [Dai R. et al., 2002]. В целом, приведенные выше данные объясняют, за счёт каких механизмов индукция БТШ in vitro (путем теплового шока или гиперэкспрессии трансгена HSP) снижает экспрессию провоспалительных генов, таких как TNFa, IL-1, IL-12, IL-10 и IL-18 [Johnson J.D. et al., 2006].

Внутриклеточные БТШ (iHSP) оказывают также и противовоспалительное действие за счет взаимодействия с ядерным фактором NF-kB, блокируя его активацию [Jones Q. et al., 2011]. NF-kB является фактором транскрипции, первоначально обнаруженным в B-лимфоцитах, который необходим для активации воспалительных реакций в ответ на различные сигналы, такие как иммунная функция, активация эндотелиальных клеток и контроль клеточного роста. iHSP препятствует активации NF-kB на нескольких уровнях, подавляя фосфорилирование ингибитора IkBs путем прямого связывания с IkB киназой гамма (IKKy), что приводит к продолжению связывания (и инактивации NF-kB). Таким образом, происходит торможение восходящих сигналов по пути активации [Chen H.W. et al., 2005]. Это подтверждается тем обстоятельством, что iHSP связывается с комплексом NF-kB / IkB в цитозоле, что препятствует транскрипции TNFa и индуцибельных генов синтазы оксида азота (NOS2), которые активируются посредством зависимого от NF-kB механизма. Индуцируемое стрессом повышение уровня iHSP ингибируют передачу сигнала с^ип№концевой киназы (JNK-), что способствует выживанию клеток [Rodrigues-Krause J. et al., 2012].

Подводя итог, можно отметить, что БТШ обладают широким спектром функций как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве, осуществляя важную цитопротективную роль в условиях клеточного стресса. В последнее время появляется всё больше данных о возможности применения HSP в качестве потенциальных терапевтических мишеней в силу их способности модулировать динамику многих патологических процессов.

1.2 Роль БТШ в структурных и метаболических изменениях тканей при

различных видах патологии

1.2.1 БТШ и воспаление

БТШ принимают участие в процессе воспаления при различных патологических процессах. В одном из исследований особое внимание было уделено роли БТШ в образовании внутриклеточных платформ инфламмасом, активируемых сигналами опасности и обеспечивающих активацию воспалительных каспаз, главным образом, каспазы-1, способствующих продукции провоспалительного цитокина IL-ip [Schroder K. et al., 2010]. Некоторые члены семейства HSP поддерживают активацию инфламмасом, тогда как другие ингибируют ее. Так, HSP60 необходим для фосфорилирования и ядерной локализации NF-kB после стимуляции провоспалительным цитокином IL-ip в микроглии. Нокдаун HSP60 приводит к ингибированию фосфорилирования субъединицы NF-kB p65 и, как следствие, к ингибированию ядерной транслокации NF-kB. Предположительно, HSP60 способствует фосфорилирования p65. Эта активация пути NF-kB приводит к сверхэкспрессии как про-IL-ip, так и NLRP3 (Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 3), что соответствует стадии «прайминга» активации инфламмасомы NLRP3. HSP60 также индуцирует повреждение митохондрий, о чем свидетельствует снижение их мембранного потенциала после сверхэкспрессии HSP60 и лечения IL-ip. Это влечет за собой

увеличение производства АФК, способствующих окислительному стрессу, который в свою очередь активирует инфламмасому NLRP3 [Swaroop S. et al., 2018].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Склифасовская Анастасия Павловна, 2021 год

т -

* т

контроль АГ 38 нед. АГ 57 нед. СД

АГ 38 нед + СД

Рисунок 4. Содержание БТШ HSP10 в КМЦ ЛЖ при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

При качественном анализе срезов миокарда ЛЖ после проведения иммуногистохимической реакции на HSP10 наблюдается следующая картина (Рисунок 5).

...

А

В

чг

ц» •

Г*--«

Б

V

л

ч

V ;.. %

Л >1 * *

Г

Рисунок 5. Экспрессия БТШ HSP10 в КМЦ в миокарде ЛЖ крыс. Иммуногистохимическая окраска. Ув. х 400.

А - контроль; Б - АГ 38 недель; В -57 недель; Г - СД; Д - АГ 38 недель + СД.

В контрольной группе отмечается положительное окрашивание цитоплазмы определённого количества КМЦ локального типа, при этом характерна различная интенсивность окрашивания, в отдельных участках - переход локального окрашивания в сплошное (Рисунок 5А). Высокая плотность окрашивания определяется преимущественно в толще миокарда, а по направлению к эпикарду и эндокарду, а также в областях миокарда, окружающих кровеносные сосуды, отмечается значительное уменьшение количества клеток с позитивной реакцией на

ИБР10 с тенденций к снижению интенсивности окраски.

В группе гипертензивных крыс в возрасте 38 недель по сравнению с контролем плотность появления положительно окрашенных КМЦ существенно не изменяется. Характерен мозаичный тип распределения окрашивания отдельных клеток большей и меньшей интенсивности (Рисунок 5Б). Относительно более высокая плотность появления положительно окрашенных участков характерна для среднего слоя миокарда. По направлению к эпикарду и эндокарду количество КМЦ с положительной окраской заметно уменьшается. Вокруг сосудов практически не выявляются участки миокарда с положительно окрашенной цитоплазмой КМЦ.

В группе гипертензивных животных в возрасте 57 недель интенсивность окрашивания находится приблизительно на одном уровне с контрольной группой. Характерно преимущественно окрашивание цитоплазмы отдельных КМЦ, однако, в отличие от группы 38-недельных гипертензивных крыс, в миокарде чаще встречаются группы КМЦ с положительной иммуногистохимической реакцией (Рисунок 5В). КМЦ с позитивной реакцией на ИБР10 в основном выявляются в среднем слое миокарда. Ближе к эпикарду и эндокарду снижается интенсивность окрашивания.

При СД отмечается уменьшение по сравнению с группой интактных животных количества положительно окрашенных КМЦ. При этом характерно окрашивание низкой интенсивности сплошного типа на значительном протяжении (Рисунок 5Г). Участки локального окрашивания встречаются редко. Окрашивание преимущественно сосредоточено в толще миокарда. По направлению к эпикарду и эндокарду снижается его интенсивность.

Для групп животных с АГ сроком 38 недель в сочетании с СД характерно повышение плотности появления КМЦ с позитивной реакцией на ИБР10. При этом окраска более интенсивная по сравнению с группой гипертензивных крыс в возрасте 57 недель и с группой животных с изолированным СД, а также с группой контроля (Рисунок 5Д). Преимущественно интенсивно окрашены отдельные КМЦ по направлению к эндокарду. В толще миокарда в основном встречаются участки с окрашиванием средней интенсивности с отдельными редко встречающимися

участками интенсивного окрашивания локального типа. Большее количество клеток с позитивной реакцией на HSP10 встречается в области миокарда, прилегающей к эндокарду. Ближе к эпикарду, напротив, интенсивность окрашивания резко снижается.

3.5 Экспрессия БТШ И8РВ1 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа ^кМаэоуэкауа А.Р. е! а1., 2021]

Согласно результатам количественного анализа, содержание БТШ HSP27 (HSPВ1) в цитоплазме КМЦ ЛЖ достоверно уменьшается по сравнению с контролем в группах животных с АГ длительностью 38 недель и сочетанием АГ с СД. В группах животных с АГ длительностью 57 недель уровень экспрессии БТШ HSP27, напротив, достоверно увеличивается. В группе животных с изолированным СД экспрессия БТШ HSP27 сохранилась на уровне контрольной группы (Рисунок 6).

Рисунок 6. Содержание БТШ HSP27 (HSPВ1) в КМЦ ЛЖ при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

При качественном анализе срезов миокарда ЛЖ после проведения иммуногистохимической реакции на HSP27 наблюдается следующая картина (Рисунок 7).

и

' к

/

Д

Рисунок 7. Экспрессия БТШ HSP27 (HSPВ1) в миокарде ЛЖ крыс. Иммуногистохимическая окраска. Ув. х 400.

А - контроль; Б - АГ 38 недель; В -57 недель; Г - СД; Д - АГ 38 недель + СД.

В контрольной группе отмечается положительное окрашивание цитоплазмы определённого количества как отдельных КМЦ, так и их групп, характерен диффузный тип распределения положительно окрашенных клеток (Рисунок 7 А). Высокая плотность появления положительно окрашенных КМЦ определяется

преимущественно в толще миокарда, а по направлению к эпикарду и эндокарду, а также в областях миокарда, окружающих кровеносные сосуды, отмечается некоторое уменьшение количества клеток с позитивной реакцией на HSP27 с тенденций к снижению интенсивности окраски вплоть до её полного исчезновения. В КМЦ, визуализируемых в продольном сечении, положительное окрашивание цитоплазмы наблюдается лишь на незначительном протяжении.

В группе гипертензивных крыс в возрасте 38 недель отмечается значительное снижение по сравнению с контролем плотности появления положительно окрашенных КМЦ. Характерен мозаичный тип распределения окрашивания отдельных клеток низкой интенсивности (Рисунок 7Б). Относительно более высокая плотность окрашивания характерна для среднего слоя миокарда по сравнению с его областями, прилегающими к эпикарду и эндокарду, где положительное окрашивание практически не прослеживается. Вокруг сосудов отмечается значительное усиление окрашивания цитоплазмы КМЦ по сравнению с контролем.

В группе гипертензивных животных в возрасте 57 недель, напротив, наблюдается значительное повышение плотности появления КМЦ с позитивной реакцией на HSP27. Положительное плотное и интенсивное на значительном протяжении окрашивание преимущественно сосредоточено по направлению к эндокарду. В среднем слое миокарда отмечается окрашивание КМЦ большей интенсивности по сравнению с контролем (Рисунок 7В), также встречаются группы КМЦ с низкой интенсивностью окрашивания, но на значительном протяжении. Вокруг сосудов отмечается выраженное локальное усиление экспрессии HSP27.

При СД по сравнению с группой интактных животных количество положительно окрашенных КМЦ существенно не изменяется. При этом окрашивание имеет мозаичный характер при визуализации препаратов как в продольном, так и в поперечном сечениях (Рисунок 7Г). При этом встречаются значительные по размеру участки миокарда, не имеющие позитивной реакции на HSP27. Как правило, положительно окрашены отдельные клетки. Окрашивание преимущественно сосредоточено в толще миокарда.

Для группы животных с АГ сроком 38 недель в сочетании с СД характерно снижение плотности появления КМЦ с позитивной реакцией на HSP27. При этом наблюдаются интенсивно окрашенные как группы КМЦ, так и отдельные клетки. Встречаются участки окрашивания мозаичного типа на значительном протяжении, но меньшей интенсивности по сравнению с группой АГ 57 недель (Рисунок 7Д). Окрашивание сосредоточено как в толще миокарда, так и по направлению к эпикарду. Большее количество клеток с позитивной реакцией встречается в области миокарда, прилегающей к эпикарду. Ближе к эндокарду, напротив, выявляются лишь единичные участки положительного окрашивания, в основном лишь вокруг микрососудов.

3.6 Сравнительная характеристика экспрессии БТШ И8РВ1, И8Р10, И8Р60 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа

Отмечается более выраженная экспрессия HSP60 по сравнению с HSP10 в группе контроля. Известно, что в условиях стресса данные БТШ являются ко-шаперонами. Это может свидетельствовать о том, что в нормальных условиях взаимодействия между ними не наблюдается (Рисунок 8). При АГ разных сроков экспрессия HSP60 и HSP10 устанавливается на одном уровне, что указывает на активацию ко-шаперонных механизмов в условиях дефицита АТФ, вызванного гемодинамической перегрузкой. При СД происходит снижение активности экспрессии HSP10 относительно HSP60, однако, не столь значительное, как в контроле. Это может указывать на снижение ко-шаперонной активности данных белков в условиях метаболических нарушений. При сочетании АГ и СД происходит увеличение экспрессии HSP10 относительно контроля и незначительная тенденция к увеличению экспрессии относительно уровня HSP60 в миокарде. Возможно, в условиях выраженного дефицита АТФ, вызванного как метаболическими сдвигами, так и гемодинамической перегрузкой, происходит активация экспрессии АТФ-независимого малого HSP10, направленная на

реализацию шаперонных механизмов, стабилизирующих поврежденные белков для дальнейшей их репарации посредством HSP60.

об.% 20 - 18 -

16 - 14 - 12 - 10 - 8 6 4 - 2 0 Ко нтроль АГ 38 АГ 57 СД АГ 38+СД □ ИБР 60 ПИБР 10

Рисунок 8. Экспрессия БТШ HSP60 и HSP10 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с ШР60.

При сравнении экспрессии белков HSP60 и HSPВ1 наблюдается следующая картина: в контроле уровень экспрессии HSPВ1 ниже, чем HSP60. Это можно объяснить тем, что в присутствии достаточного количества АТФ стационарный уровень малого HSPВ1 ниже, чем у АТФ-зависимого белка HSP60 (Рисунок 9). При АГ 38 недель содержание HSPВ1 в 2 раза ниже относительно HSP60, однако, при более длительном сроке АГ (57 недель) происходит, напротив, значимое увеличение содержания HSPВ1 по сравнению АГ 38 недель, в результате чего уровень его экспрессии становится уже выше относительно HSP60. При изолированном СД уровень экспрессии HSPВ1 также выше HSP60, однако, при сочетании АГ и СД содержание HSPВ1 достоверно меньше HSP60.

об.% 20 -

18 - 16 -- 14 -- II * ! I* 1 Контроль АГ38 АГ □ ИБР 60 к 57 СД ПИБР В1 № Ц АГ 38+СД

Рисунок 9. Экспрессия БТШ HSP60 и HSPВ1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с ИБР60.

При сравнении экспрессии ИБРВ1 и ИБР10, относящихся к группе малых БТШ, в контроле (в отсутствии клеточного стресса) отмечается, что содержание данных белков в миокарде находится на одном уровне (Рисунок 10). При АГ сроком 38 недель уровень ИБРВ1 почти в 2 раза ниже ИБР10, а при АГ 57 недель, напротив, становится выше, причём как относительно ИБР10, так и контрольных цифр. При СД наблюдается аналогичное отличие, но при более низких уровнях как ИБРВ1, так и ИБР10. Однако, при сочетании АГ 38 недель и СД, характер отличия аналогичен тому, который наблюдался при изолированной АГ 38 недель, т.е. уровень ИБРВ1 достоверно ниже по сравнению с ИБР10.

об.%

18

16 14 12 10 8 6 4 2 0

Контроль АГ 38 АГ 57 СД АГ 38+СД

□ HSP 10 □ HSP B1

Рисунок 10. Экспрессия БТШ HSP10 и HSPB1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - p<0.05 по сравнению с HSP10.

При сравнительном анализе уровней экспрессии всех исследуемых БТШ наблюдается следующая картина (Рисунок 11). В контрольной группе стационарный уровень экспрессии HSP60 выше, чем уровни малых БТШ HSP10 и HSPB1, что можно объяснить особенностями их функционирования в зависимости от содержания в клетках АТФ. При АГ 38 недель экспрессия HSP60 и HSPB1 снижаются по сравнению с контролем, а уровень HSP10 проявляет тенденцию к снижению. При АГ более длительного срока (57 недель), напротив, повышается достоверно увеличивается по сравнению с контрольной группой содержание HSPB1. При изолированном СД HSP60 также ниже относительно контроля.

об.% 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

I — * II троль А! 1 * 38 АГ ИБР 60 ПИБР 1С * 1 || 57 С, □ ИБР В1 * * * Ц АГ 38+СД

Рисунок 11. Экспрессия БТШ HSP10, HSPВ1, HSP60 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АГ, ИНСУЛИНОЗАВИСИМОГО СД И СОЧЕТАНИИ АГ И СД 1 ТИПА НА ЭКСПРЕССИЮ БЕЛКОВ BENC1, BAX, BCL-2

Регулируемые формы клеточной гибели (апоптоз, аутофагия и др.) являются одними из ключевых механизмов патогенеза хронической сердечной недостаточности [Прошина Л.Г. и др., 2010; Азова М.М. и др., 2012]. Очевидно, что гибель определённого числа КМЦ отрицательно влияет на сократительную способность сердечной мышцы. Дальнейшее исследование молекулярных процессов, опосредующих данные явления, представляется на сегодняшний день одним из наиболее перспективных подходов к разработке новых методов фармакотерапии сердечной недостаточности.

Аутофагия относится к клеточному механизму массовой деградации долгоживущих белков и поврежденных органелл и рециркуляции молекулярных компонентов [Sciarretta S. et al. 2018]. Данный процесс начинается с нуклеации и протекает через секвестрацию этих материалов в двухмембранные структуры (называемые аутофагосомами), слияние аутофагосом с лизосомами, в которых ферменты катализируют разрушение клеточных шлаков и высвобождение продуктов распада в цитозоль [Kroemer G el al., 2010]. В отличие от других форм клеточной смерти, аутофагия не всегда приводит к разрушению клетки. Самые ранние наблюдения аутофагических структур были сделаны в клетках, подвергающихся ремоделированию во время дифференцировки или в ответ на стресс [Lavandero S. et al., 2015]. Аутофагия, как правило, играет важную роль в выживании клеток за счёт мобилизации субстратов для заместительного синтеза и производства энергии. Если в результате указанных процессов нарушения структуры и функционального состояния клетки не компенсируются, аутофагия способна выступить в качестве инструмента клеточной гибели, которая может происходить одновременно с аутофагией, но не обязательно вслед за ней [Loos B. et al., 2009]. Поэтому необходимо проводить различие между ассоциированной и опосредованной аутофагией гибелью клеток.

Апоптоз является вариантом программированной гибели клеток. Он также является типовой реакцией альтерированного миокарда и относится к естественным гомеостатическим процессам в организме, регулирующим клеточный состав тканей [Благонравов М.Л., 2011]. Важную роль в регуляции клеточной гибели играют молекулярные взаимоотношения между процессами апоптоза и аутофагии.

4.1 Экспрессия белка ВесИп-1 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа [В^опгауоу М.Ь. е! а1., 2021]

При количественном анализе уровня экспрессии Beclin-1 были получены следующие данные (Рисунок 12).

Рисунок 12. Содержание Beclin-1 в КМЦ ЛЖ при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии в возрасте 38 недель). р<0.05 по сравнению * - с контролем, # - с группой СД.

В группе изолированного СД, а также при сочетании АГ с СД отмечается достоверное увеличение по сравнению с контролем экспрессии Beclin-1 в

цитоплазме КМЦ ЛЖ сердца. В группах гипертензивных крыс линии SHR как в возрасте 38, так и 57 недель, напротив, наблюдается статистически значимое прогрессирующее снижение содержания Beclin-1 в миокарде ЛЖ относительно контрольной группы.

При качественном анализе срезов миокарда ЛЖ после проведения иммуногистохимической реакции на Beclin-1 наблюдается следующая картина (Рисунок 13).

Рисунок 13. Экспрессия белка Beclin-1 в КМЦ. Миокард ЛЖ крыс. Иммуногистохимическая окраска. Ув. х 400.

А - контроль; Б - АГ 38 недель; В -57 недель; Г - СД; Д - АГ 38 недель + СД.

В контрольной группе отмечается положительное окрашивание цитоплазмы КМЦ локального типа по ходу миофибрилл, периодически окрашивание встречается в виде локальных вкраплений, распространенных диффузно (Рисунок 13А). Плотность окрашивания преимущественно одинаковая как в толще миокарда, так и по направлению к эпикарду и эндокарду. В областях миокарда, окружающих кровеносные сосуды, позитивное окрашивание не наблюдается.

В группе гипертензивных крыс в возрасте 38 недель плотность появления положительно окрашенных КМЦ снижается по сравнению с контролем. Характерен локальный тип распределения окрашивания отдельных клеток низкой интенсивности (Рисунок 13Б). По направлению к эпикарду отмечается незначительное уменьшение количества отдельно окрашенных КМЦ, а по направлению к эндокарду увеличивается интенсивность и плотность окрашивания по сравнению с толщей миокарда как отдельных КМЦ, так и их групп.

У гипертензивных крыс в возрасте 57 недель наблюдается снижение интенсивности окрашивания КМЦ (Рисунок 13В). В толще миокарда наблюдается окрашивание диффузного типа низкой интенсивности, но на значительном протяжении. Встречаются отдельно интенсивно окрашенные КМЦ. По направлению к эпикарду снижается плотность появления позитивной окраски, но увеличивается интенсивность окрашивания КМЦ. Наблюдаются редко интенсивно окрашенные КМЦ. По направлению к эндокарду усиливается интенсивность окрашивания КМЦ.

При СД отмечается увеличение по сравнению с группой интактных животных количества положительно окрашенных КМЦ. При этом характерно окрашивание высокой интенсивности сплошного типа на значительном протяжении в толще миокарда, также встречаются отдельно интенсивно окрашенные КМЦ (Рисунок 13Г). По направлению к эндокарду отмечается усиление интенсивности окрашивания сплошного типа, по направлению к эпикарду наблюдается снижение плотности и интенсивности окрашивания вплоть до его полного исчезновения.

Для групп животных с АГ сроком 38 недель в сочетании с СД характерно

усиление интенсивности окрашивания по сравнению с контролем (Рисунок 13 Д). В толще миокарда наблюдается интенсивное окрашивание отдельных волокон КМЦ, причем плотность окрашивания по направлению к эндокарду и эпикарду изменяется. Так, по направлению к эпикарду окрашивание высокой плотности приобретает точечный характер высокой интенсивности, а по направлению к эндокарду менее интенсивный, но сплошной характер, однако, встречаются участки и высокой интенсивности окрашивания.

В результате проведенного эксперимента было обнаружено значимое снижение уровня экспрессии Beclin-1 в КМЦ ЛЖ крыс при АГ разных сроков, причем при АГ 57 недель уровень Beclin-1 снижался 2 раза по сравнению с контролем. Однако при СД данный показатель увеличивался в 1.5 раза по сравнению с группой интактных животных. При сочетании АГ 38 недель с СД также происходило увеличение экспресоди Beclin-1 по сравнению с контрольной группой.

4.2 Экспрессия белка Bax в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа [Склифасовская А.П. и соавт., 2021]

При анализе уровня экспрессии Bax были получены следующие данные: во всех группах животных было получено достоверное увеличение по сравнению с контролем экспрессии Bax в цитоплазме КМЦ ЛЖ (Рисунок 14). При этом в группе животных, имеющих изолированный СД, а также при сочетании АГ с СД отмечается увеличение уровня экспрессии Bax более чем в 2 раза по сравнению с контролем.

Рисунок 14. Содержание Bax в КМЦ ЛЖ при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

При качественном анализе срезов миокарда ЛЖ после проведения иммуногистохимической реакции на проапоптотический белок Bax наблюдается следующая картина. В контрольной группе отмечается положительное окрашивание цитоплазмы КМЦ диффузного типа, при этом характерна средняя интенсивность окрашивания, в отдельных участках - локальное интенсивное окрашивание (Рисунок 15А). Высокая плотность окрашивания определяется в слоях миокарда, граничащих с эндокардом и эпикардом, а также в областях, окружающих кровеносные сосуды.

В группе гипертензивных крыс в возрасте 38 недель плотность появления положительно окрашенных КМЦ незначительно увеличивается по сравнению с контролем. Характерен мозаичный тип распределения окрашивания отдельных клеток средней интенсивности, но на большем протяжении (Рисунок 15Б). Также встречаются участки перехода в диффузный тип низкой интенсивности. В областях, окружающих кровеносные сосуды, существенной разницы в плотности появления положительно окрашенных участков миокарда не отмечается.

Рисунок 15. Экспрессия белка Bax в КМЦ. Миокард ЛЖ крыс. Иммуногистохимическая окраска. У в. х 400.

А - контроль; Б - АГ 38 недель; В -57 недель; Г - СД; Д - АГ 38 недель + СД.

В группе гипертензивных животных в возрасте 57 недель увеличивается по сравнению с контрольной группой количество положительно окрашенных КМЦ. Характерно преимущественно окрашивание цитоплазмы отдельных КМЦ высокой интенсивности (Рисунок 15В), однако, в отличие от группы 38-недельных гипертензивных крыс, местами окрашивание переходит в плотное, сплошное. Также как и в контрольной группе, существенной разницы в плотности окрашивания в различных слоях миокарда не наблюдается.

При СД отмечается значительное увеличение по сравнению с группой

интактных животных количества положительно окрашенных КМЦ. При этом окрашивание плотное и имеет высокую интенсивность. Окрашены как отдельные КМЦ, так и их группы. Участки миокарда с диффузным распределением окрашивания высокой интенсивности встречаются на значительном протяжении (Рисунок 15 Г). Локальное окрашивание отдельных КМЦ наблюдается редко. Окрашивание преимущественно сосредоточено в толще миокарда. По направлению к эпикарду снижается плотность окрашивания, оно приобретает точечный, но интенсивный характер, а по направлению к эндокарду отмечается усиление интенсивности положительно окрашенных КМЦ.

Для групп животных с АГ сроком 38 недель в сочетании с СД характерно повышение плотности появления КМЦ с позитивной реакцией на белок Bax. В толще миокарда в основном встречаются участки сплошного окрашивания высокой интенсивности с отдельными редко встречающимися участками интенсивного окрашивания локального типа (Рисунок 15 Д). Большее количество клеток с позитивной иммуногистохимической реакцией встречается в толще миокарда. Ближе к эпикарду интенсивность окрашивания резко снижается, сохраняется окрашивание отдельных КМЦ низкой интенсивности, по направлению к эндокарду снижается плотность появления клеток с положительной реакцией с сохранением отдельно интенсивно окрашенных групп КМЦ.

4.3 Экспрессия белка Вс1-2 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа [Склифасовская А.П. и соавт., 2021]

Согласно результатам количественного анализа, содержание антиапоптотического белка Bcl-2 в цитоплазме КМЦ ЛЖ достоверно уменьшается по сравнению с контролем в группах животных с АГ длительностью 38 недель, АГ длительностью 57 недель, а также в группе животных с изолированным СД. В группе животных, имеющих сочетание АГ и СД уровень экспрессии Bcl-2 статистически значимо не отличается от контрольной группы (Рисунок 16).

об.%

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

*

Т

т

—

* * * * т

т

контроль АГ 38 нед. АГ 57 нед. СД

АГ 38 нед + СД

Рисунок 16. Содержание Вс1-2 в КМЦ ЛЖ при АГ (крысы линии БИЯ 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии '^в!аг-Куо1:о в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии БИЯ в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

При качественном анализе срезов миокарда ЛЖ после проведения иммуногистохимической реакции на белок Вс1-2 наблюдается следующая картина. В контрольной группе отмечается положительное окрашивание цитоплазмы определённого количества как отдельных КМЦ, так и их групп низкой и высокой интенсивности (Рисунок 17А). Высокая плотность появления положительно окрашенных КМЦ определяется преимущественно в толще миокарда, а по направлению к эпикарду и эндокарду отмечается уменьшение количества клеток с позитивной реакцией на Вс1-2 с тенденций к снижению интенсивности окраски вплоть до её полного исчезновения.

В группе гипертензивных крыс в возрасте 38 недель отмечается значительное снижение по сравнению с контролем плотности появления положительно окрашенных КМЦ. Характерен диффузный тип распределения окрашивания отдельных волокон низкой интенсивности (Рисунок 17Б). Относительно более высокая плотность окрашивания характерна для среднего слоя миокарда по сравнению с его областями, прилегающими к эпикарду и эндокарду, где

положительное окрашивание встречается редко и имеет преимущественно локальный тип низкой интенсивности.

I л

\ Ч V * * > V •

V • \ V

4 *

ч , л

Д

V

\

Рисунок 17. Экспрессия белка Bcl-2 в КМЦ. Миокард ЛЖ крыс. Иммуногистохимическая окраска. Ув. х 400.

А - контроль; Б - АГ 38 недель; В - 57 недель; Г - СД; Д - АГ 38 недель + СД.

В группе гипертензивных животных в возрасте 57 недель наблюдается еще большее снижение плотности появления КМЦ с позитивной реакцией на белок Bcl-2. В среднем слое миокарда, а также по направлению к эндокарду и эпикарду отмечается окрашивание диффузного типа низкой интенсивности, редко встречаются участки отдельно окрашенных КМЦ средней интенсивности (Рисунок

17В).

При СД по сравнению с группой интактных животных количество положительно окрашенных КМЦ также снижается. При этом положительная реакция наблюдается в единичных клетках, окрашивание имеет низкую и среднюю интенсивность при визуализации препаратов как в продольном, так и в поперечном сечениях (Рисунок 17Г). При этом встречаются значительные по размеру участки миокарда, не имеющие позитивной реакции на Вс1-2. Окрашивание в толще миокарда отсутствует, при этом преимущественно оно определяется в зонах, прилегающих к эндокарду и эпикарду.

В группе животных с АГ сроком 38 недель в сочетании с СД плотность появления положительной окраски на Вс1-2 статистически значимо выше, чем в группе интактных животных. При этом наблюдается окрашивание групп КМЦ средней интенсивности (Рисунок 17Д), местами переходящее в сплошное окрашивание низкой интенсивности на значительном протяжении. Окрашивание сосредоточено как в толще миокарда, так и по направлению к эпикарду и эпикарду.

4.4 Сравнительная характеристика экспрессии белков Вах, Вс1-2 и Вес1т-1 в миокарде ЛЖ при АГ разных сроков, инсулинозависимом СД и сочетании АГ и СД 1 типа

При сравнении уровня экспрессии белков Bax и Bc1-2 наблюдается следующая картина: в контрольной группе содержание Bc1-2 в 2 раза ниже по сравнению с Вax. При АГ 38 недель уровень экспрессии Bc1-2 в 4.5 раза ниже по сравнению с Вax, а при АГ более длительно срока 57 недель - в 10 раз, что свидетельствует о выраженной активации апоптотического каскада. В группе СД уровень Bc1-2 также существенно ниже относительно Вах, а при сочетании АГ 38 недель и СД 30 суток уровень Bc1-2 меньше лишь в 2.5 раза относительно Вax, что, предположительно, может быть связано уже с активацией антипоптотических процессов при выраженном энергодефиците (Рисунок 18).

оЬ.% 25

20

15

10

Контроль

АГ 38

АГ 57 □ Вах [ЦВс!-2

СД

АГ 38+СД

5

0

Рисунок 18. Экспрессия белков Bax и Bcl-2 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

Уровень экспрессии Beclin-1 выше по сравнению с Bcl-2 приблизительно в 2 раза (Рисунок 19). При АГ 38 недель уровень Bcl-2 ниже почти в 3 раза относительно Beclin-1. При АГ более длительного срока 57 недель наблюдается тенденция к еще большему снижению содержания Bcl-2. При СД длительностью 30 суток отмечается наиболее выраженная разница в уровнях экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и белка аутофагии Beclin-1, при этом уровень Beclin-1 выше в 6 раз по сравнению с Bcl-2. При сочетании АГ 38 недель и СД длительностью 30 суток как и в группе интактных животных уровень экспрессии Bcl-2 поднимается относительно других групп, но остается ниже цифр Beclin-1.

18 —

16 14 12 10 8 6 4 2 0

*

*

Контроль АГ 38 АГ 57

□ Ве!-2 □ ВесПп-1

СД

АГ 38+СД

*

*

*

*

*

*

Рисунок 19. Экспрессия белков Bcl-2 и Beclin-1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). р<0.05 по сравнению * - с контролем

При сравнении уровней экспрессии Вax и Beclin-1 наблюдается следующая картина: в контрольной группе уровень экспрессии Вax и Beclin-1 находятся приблизительно на одном уровне. При АГ 38 недель уровень экспрессии Beclin-1 становится ниже относительно повышенного по сравнению с контролем уровня Вax. При АГ более длительного срока (57 недель) данное отличие становится более выраженным. При изолированном СД длительностью 30 суток уровень Beclin-1 выше относительно других групп, однако, остается ниже уровня Вax. При сочетании АГ и СД уровень Beclin-1 также достоверно ниже уровня Вax. Указанные наблюдения могут свидетельствовать о преобладании апоптотических процессов над аутофагией в условиях выраженного дефицита энергии (Рисунок 20).

об.К

25

20

15

10

Контроль АГ38 АГ57

□ Вах ПВес!т-1

СД АГ 38+СД

5

0

Рисунок 20. Экспрессия белков Bax и Beclin-1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии в возрасте 38 недель). р<0.05 по сравнению * - с контролем.

При сравнительном анализе уровня экспрессии обоих исследуемых маркеров апоптоза (Bax, Bcl-2) и аутофагии (Beclin-1) в контрольной группе наблюдается следующая картина: уровни экспрессии Вax и Beclin-1 находятся на одном уровне, а содержание Bcl-2 - ниже. При АГ разных сроков наблюдается росту уровня Вax и снижение экспрессии Beclin-1 и Bcl-2, что может свидетельствовать об интенсификации процессов апоптотической гибели клеток и угнетении процессов аутофагии и антиапоптотической защиты в модели гемодинамической перегрузки ЛЖ. При СД длительностью 30 суток увеличивается относительно контрольной группы уровень Вax и Beclin-1, т.е активируются процессы как апоптоза, так и аутофагии. При этом уровень Bcl-2 остается низким как относительно других маркеров, так и по сравнению контрольной группы. При сочетании АГ 38 недель и СД содержание Bcl-2 достоверно ниже по сравнению с Вax и Beclin-1. При этом интенсивность Beclin-1-зависимой аутофагии находится на довольно высоком уровне, как и при изолированном СД. Однако уровень

экспрессии Bcl-2 выше по сравнению с группой СД, что указывает на интенсификацию процессов антиапоптотической защиты КМЦ при сочетании АГ и СД (Рисунок 21).

об.К

* *

1 П П

* 1ЙЫ Контроль АГ 38 А □ Вах □ Вс "57 С -2 □ ВесПп-1 м Д АГ 3 ♦ * 8+СД

Рисунок 21. Экспрессия белков Bax, Bcl-2 и Beclin-1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). р<0.05 по сравнению * - с контролем.

ГЛАВА 5. О РОЛИ БТШ В СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ МИОКАРДА И МЕХАНИЗМАХ ИНДУКЦИИ РЕГУЛИРУМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ ПРИ СОЧЕТАНИИ АГ С СД

(обсуждение полученных результатов)

5.1 Особенности индукции БТШ И8Р60 при альтерации миокарда, вызванной гемодинамической перегрузкой и/или метаболическими нарушениями

Проведенные исследования продемонстрировали несомненную роль БТШ в реализации протеостатического контроля при альтерации миокарда в условиях гемодинамической перегрузки, метаболических нарушений и при сочетании данных видов патологии. Необходимо отметить особое значение БТШ в реализации механизмов программированной клеточной гибели и аутофагии в патогенезе реактивных изменений альтерированного миокарда.

В настоящем исследовании было обнаружено, что при воздействии различных стрессовых факторов продукция БТШ может как повышаться, так и снижаться. Так, экспрессия БТШ HSP60 снижалась в КМЦ ЛЖ как при гемодинамической перегрузке ЛЖ, обусловленной АГ, так и при метаболических нарушениях в миокарде, связанных с СД. Более того, их сочетание не сопровождалось развитием синергетического отрицательного эффекта в отношении данного процесса. Напротив, в данном случае отмечалось даже несколько менее выраженное угнетение продукции HSP60. Подавление синтеза БТШ HSP60, вероятнее всего, связано с энергодефицитом, развивающимся на фоне перегрузки ЛЖ и/или инсулинозависимого СД, поскольку, как было указано ранее, данный белок является АТФ-зависимым.

БТШ HSP60 является митохондриальным шапероном, однако, он также может высвобождаться в цитозоль и далее, проходя через клеточную мембрану, поступать в кровь [Grundtman С. et 8!, 2011]. Во внеклеточном пространстве он по большей части оказывает негативное влияние на состояние сердечно-сосудистой

системы, и уровень его в крови может служить маркером для диагностики прогрессирования различных видов патологии [Cappello F. et al., 2014]. Внутри клетки его основная роль заключается в участии в митохондриальном биогенезе, так как его основной функцией является сворачивание митохондриальных белков, которое имеет решающее значение для его цитопротекторной функции [Grundtman C. et al., 2011].

Некоторое время назад были проведены отдельные исследования, направленные на изучение циркулирующих маркеров воспаления и их связи с СД. Было установлено, что воспаление является важным причинным фактором в патогенезе осложнений СД и инсулинорезистентности [Creely S. J. et al., 2007]. Также отмечается связь между патогенезом инсулинорезистентности, СД, атеросклероза и активацией врожденного иммунитета Толл-подобными рецепторами (TLR) [Wong F.S. et al., 2008]. Интересно, что также была обнаружена связь между полиморфизмами генов TLR2 и TLR4 и диабетом 2 типа, что позволяет предположить, что факторы TLRs могут выступать в качестве причины активации провоспалительного каскада реакций при диабете [Gulden E. et al., 2014]. В других исследованиях была отмечена повышенная экспрессия TLR2 и TLR4 в инсулинозависимых тканях-мишенях, таких как скелетные мышцы и жировая ткань [Reyna S. M. et al., 2008]. HSP60 является лигандом для TLR2 и TLR4 [Juwono J. et al., 2016]. Кроме того, TLR4 является наиболее высоко экспрессируемым подтипом TLRs в КМЦ [Tsan M.F. et al., 2004]. Исследование Dasu M.R et al. (2010) подтвердило, что экспрессия TLR2 и TLR4 у пациентов с СД диабетом значительно повышена по сравнению с лицами, не страдающими СД. Кроме того, в результате увеличения экспрессии TLR2 и TLR4 происходит последующее усиление воспалительных механизмов, которое опосредуется ядерным фактором NF-kB p65 [Dasu M.R. et al., 2010]. Также было установлено, что концентрация провоспалительных медиаторов IL-1^, IL-6, IL-8, MCP-1 и TNF-a в сыворотке крови значительно повышена у больных СД 2 типа [Juwono J. et al., 2016]. Эти данные позволяют предположить, что HSP60 может играть модуляторную роль в воспалении, метаболической регуляции при СД через активацию TLRs.

Сердечная недостаточность, как процесс прогрессирующего повреждения сердечной мышцы, является одним из наиболее распространенных осложнений сердечно-сосудистых заболеваний [Rizzo M. et al., 2011]. Данный синдром может быть результатом развития многих заболеваний сердца, включая дилатационную и ишемическую кардиомиопатию. Было показано, что экспрессия эндогенного HSP60 значительно повышена в миокарде пациентов, страдающих данными заболеваниями [Latif N. et al., 1999]. При прогрессировании сердечной недостаточности NFkB постоянно активирован, что приводит к увеличению связывания с двумя NFkB-элементами в гене HSP60. Этим можно объяснить повышенную экспрессию HSP60 в КМЦ [Wang Y. et al., 2010]. При этом HSP60 может перераспределяться между различными субклеточными участками в КМЦ при стрессе [Duan Y. et al., 2020].

КМЦ обладают большим количеством митохондрий, что очень важно для поддержания на необходимом уровне функционального резерва миокарда, особенно в периоды повышенной нагрузки, а также в условиях его альтерации различного генеза. Помимо того что митохондрии являются центром энергетического метаболизма в клетке, они также регулируют многие звенья промежуточного метаболизма, буферизации кальция и других внутриклеточных процессов, таких как апоптоз и аутофагия [Жаворонок Т.В. и соавт., 2013; Quiros P. et al., 2016]. Митохондриальная дисфункция тесно связана с возникновением и прогрессированием различных заболеваний сердца, включая дилатационную кардиомиопатию и сердечную недостаточность [Palaniyandi S. et al., 2010]. Митохондрии содержат специальный репертуар молекулярных шаперонов, расположенных как в межмембранном пространстве (IMS), так и в матрице, что способствует эффективному сворачиванию митохондриальных белков и их сложной сборке [Mercer T. et al., 2011].

Шаперонина митохондриального БТШ HSP60 состоит из самого HSP60 и ко-шаперона HSP10, образующих бочкообразный комплекс для облегчения складывания относительно небольших, растворимых мономерных белков [Nisemblat S. et al., 2015]. Митохондриальный комплекс HSP60/HSP10 состоит из

двух гептамерных колец большой субъединицы HSP60, сложенных спина к спине [Nisemblat S. et al., 2015]. Важность данного комплекса шаперонина была продемонстрирована в работах с Escherichia coli и дрожжами, в которых потеря либо HSP60, либо HSP10 приводила к возникновению летального фенотипа [Xu Z. et al., 1997]. Делеция Hsp60 у мышей приводит к эмбриональной летальности вскоре после имплантации. Это позволяет предположить, что митохондриальный HSP60 необходим для дифференцировки клеток и выживания на ранних стадиях эмбрионального развития [Christensen J. et al., 2010]. При заболеваниях сердца экспрессия HSP60 повышается после теплового стресса и в терминальной стадии сердечной недостаточности [Cheng Y. et al., 2016]. Кроме того, избыточная экспрессия HSP60 и HSP10 в культивируемых КМЦ новорожденных крыс защищает их от апоптотической гибели, усиление которой наблюдается при ишемии (ишемией/реоксигенацией) [Cheng Y. et al., 2016], либо при доксорубициновом поражении миокарда [Лушникова Е.Л. и соавт., 2011].

Значимая роль БТШ HSP60 в поддержании функции митохондрий КМЦ была показана в исследовании Fan F. et al. (2020). Была создана индуцибельная кардиоспецифическая модель нокаута Hsp60. Было показано, что делеция гена Hsp60 в КМЦ взрослых мышей изменяет активность митохондриального комплекса, митохондриальный мембранный потенциал и продукцию АФК, что в конечном итоге приводит к развитию дилатационной кардиомиопатии и сердечной недостаточности, сопровождающихся повышенной летальностью по причине развития аномального гомеостаза и нарушения функции митохондриальных белков. Кроме того, делеция гена Hsp60 активирует митохондриальный развернутый белковый ответ, а также сопровождается усилением апоптоза клеток. Также протеомный анализ в очищенных ШР60-дефицитных митохондриях показал, что около 20% митохондриальных белков являются ШР60-зависимыми, то есть используют HSP60 для правильного сворачивания белка [Fan F. et al., 2020].

Таким образом, HSP60 обладает целым спектром регуляторных функций в физиологии сердечно-сосудистой системы. Митохондриальный HSP60 вместе со своим шаперонином HSP10 обеспечивает сворачивание митохондриального белка.

Удаление ШР60 приводит к митохондриальной дисфункции, создающей основу для последующего развития сердечной недостаточности. ШР60 подвергается субклеточной транслокации и секреции в ответ на стресс и повреждение клеток и рассматривается как патогенный сигнал при сердечной недостаточности, атеросклерозе и других сердечно-сосудистых заболеваниях. ехЖР60 может индуцировать апоптоз КМЦ и тем самым усугублять состояние сердечной недостаточности.

5.2 Об особенностях индукции малых БТШ И8Р10 и И8РБ1 при альтерации миокарда, вызванной гемодинамической перегрузкой и/или метаболическими нарушениями

Для малых БТШ, к которым, в частности, относятся ШР10 и ЖРВ1, характерны особенности экспрессии в ЛЖ, отличные от ШР60. В результате проведенного нами эксперимента было обнаружено снижение содержания малого БТШ ШР10 в КМЦ ЛЖ в группе изолированного СД и его увеличение в группе животных с сочетанием АГ 38 недель с СД. Кроме того, отмечено снижение по сравнению с контролем интенсивности экспрессии малого БТШ ШР27 в КМЦ ЛЖ при АГ 38 недель и при сочетании АГ с СД. Однако на фоне АГ большего срока (57 недель), напротив, происходило достоверное увеличение синтеза ШР27 в КМЦ ЛЖ. Что касается ко-шаперонной функции ШР10 относительно ШР60, то в результате эксперимента было обнаружено, что в контрольной группе белки ШР10 и ШР27 демонстрировали разный уровень экспрессии. Однако, во всех моделях патологии, кроме изолированного СД, они, напротив, показали сходный уровень синтеза. Это может указывать на то, что при гемодинамической перегрузке, а также сочетании АГ и СД, данные белки функционируют вместе. Что касается СД, то в данном случае скорее следует говорить о снижении ко-шаперонной активности ШР10 и ШР27 в условиях метаболической патологии.

На основании полученных данных можно высказать предположение о том, что в зависимости от причины альтерации миокарда наблюдается различная

модуляция уровней экспрессии sHSP. Экспрессия БТШ HSP10 при сердечнососудистой патологии может быть разной. В предыдущих исследованиях было показано, что при воздействии теплового стресса до t = 42° С в миокарде крыс уровень экспрессии HSP10 и HSP60 изменяется по-разному. Cheng Y. et al. (2016) показали, что уровень экспрессии HSP60 значительно повышается после 20-минутного теплового стресса и снижается после 100 мин стресса. Гистопатологический анализ ткани, подвергшейся тепловому стрессу, выявил явные повреждения тканей, в которых снижалась экспрессия HSP60, однако, при этом сывороточные уровни HSP60 были высокими, в то время как содержание его ко-фактора HSP10 оставалось на одном уровне на всех сроках воздействия теплового фактора [Cheng Y. et al., 2016]. В исследовании Kervinen H. et al. (2003) было установлено, что экспрессия HSP60 в цитоплазме клеток миокарда более выражена в интактных областях по сравнению с зонами дегенерации. Эти результаты позволили предположить, что HSP60 можно рассматривать в качестве потенциального биомаркера повреждений сердца, вызванных тепловым стрессом, так как в альтерированных участках сердечной мышцы уровень HSP60 снижен, а HSP10 - повышен. В исследовании Cheng Y. et al. (2016) также оценивалось наличие и локализация HSP60 и HSP10 в сердечной ткани крыс в ответ на тепловой стресс. Хотя HSP60 и HSP10 должны быть функционально ассоциированы, HSP10 присутствовал в большем количестве образцов и имел более высокий уровень экспрессии по сравнению с HSP60. Таким образом, можно предположить, что HSP10 может играть иную роль в миокарде крыс. Кроме того, расположение HSP60 и HSP10 было значительно изменено в периоды теплового стресса. Так, уровень экспрессии HSP10 при воздействии теплового стресса был повышен в цитоплазме КМЦ, тогда как белок HSP60 преимущественно локализовался в митохондриях [Cheng Y. et al., 2016].

В нормальных клетках HSP10, главным образом, локализован в митохондриальном матриксе. Также он был обнаружен во время и после стресса в других субклеточных компартментах, таких как цитозоль, везикулы и секреторные гранулы, отдельно или в комбинации с другими белками. При

экстрамитохондриальной локализации HSP10 играет активную роль в сигнальной трансдукции [Bross P. et al., 2016]. Регуляция транскрипции генов, кодирующих HSP10 и HSP60, происходит через различные пути в общем двунаправленном промоторе [Corydon T. et al., 2005]. Транскрипционная активность промотора в направлении HSP60 примерно вдвое выше, чем в направлении HSP10 в нормальных условиях роста, в то время как при тепловом стрессе активность возрастает примерно в 12 раз в обоих направлениях, поддерживая экспрессию HSP60 в два раза выше, по сравнению с HSP10 [Corydon T. et al., 2005]. Этим, по-видимому, можно объяснить, по какой причине в нормальных условиях стационарный уровень экспрессии HSP60 выше, чем HSP10.

К настоящему времени в литературе имеется не так много данных, касающихся функции БТШ HSP10 при альтерации миокарда. Выше был упомянут общий промотор БТШ HSP10/HSP60, регулирующий уровень экспрессии шаперонов, от которого зависит правильная функция комплекса шаперона. В экспериментах in vitro было показано, что кинетика рефолдинга малатдегидрогеназы комплексом HSP60/HSP10 зависит от соотношения HSP10 и HSP60 [Levy-Rimler G. et al., 2001]. Максимальная скорость рефолдинга была получена при молярном соотношении HSP10 и HSP60 около 2 : 1, а явно более низкая скорость рефолдинга наблюдалась при соотношении до 1 : 1. Авторы также представили доказательства того, что HSP10 стабилизирует двухкольцевую конформацию HSP60 у человека. Таким образом, можно предположить, что наблюдаемое почти 2-кратное снижение соотношения HSP10/HSP60, может поставить под угрозу способность комплекса HSP60/HSP10 к сворачиванию белковых субстратов. В свою очередь это может привести к значительному нарушению сворачивания тех белков, которые в наибольшей степени зависят от комплекса HSP60/HSP10. Кроме того, белковый тепловой ответ, митохондриальные деградирующие белки в условиях стресса также могут дополнительно модулировать экспрессию HSP10 и HSP60, адаптируя ее к конкретному фактору альтерации через активацию фактора транскрипции HSF1 [Bie A. et al., 2016]. Также посттрансляционные модификации комплекса

HSP60/HSP10 могут регулировать его активность. Было показано, что ацетилирование ко-шаперона HSP10 влияет на активность комплекса шаперона HSP10/HSP60 [Lu Z. et al., 2014].

При метаболических нарушениях, вызванных СД, происходит образование конечных продуктов гликирования Advanced Glycation End-products (AGEs), которые являются результатом реакции Майяра (Maillard reaction) белков с глюкозой. AGEs появляются за счет неферментативного гликирования белков на экспонированных с открытой цепью сахарах и дикарбонильных промежуточных продуктах [Thomas M. et al., 2011]. Гипергликемия, окислительный и термический стресс приводят к образованию оснований Шиффа с основными аминокислотами, такими как лизин и аргинин [Rabbani N. et al., 2012]. Кроме того, продукты Амадори образуются в результате перегруппировки оснований Шиффа, когда высокореактивные карбонильные промежуточные соединения накапливаются и атакуют амино-и гуанидиновые группы на белках [Monnier V. et al., 2008]. В отличие от гемоглобина и альбумина, БТШ имеют длительный период полураспада и очень низкую скорость обновления. В результате накопление гликированных БТШ может привести к необратимому нарушению их функции [Karumanchi D.K. et al., 2015].

Полученные в нашем исследовании данные свидетельствуют о том, что при СД происходит снижение экспрессии БТШ HSP10 относительно уровня HSP60. Вероятнее всего, это можно объяснить тем, что происходит гликирование белка, приводящее к угнетению его функции, включая снижение активности шаперонного комплекса HSP60/HSP10, который, как было показано в других исследованиях, чувствителен к различным посттрансляционным модификациям. Однако эта гипотеза требует дальнейшего детального изучения. С другой стороны, снижение экспрессии HSP10 при СД может быть связано со снижением экспрессии митохондриальных стресс-чувствительных систем в условиях гипоинсулинемии, контролирующих протеостаз клетки и её метаболизм при клеточном стрессе [Wardelmann K. et al., 2019]. Однако в данном случае представляется

затруднительным объяснить повышенную экспрессию HSP60 относительно HSP10 при том, что оба белка являются митохондриальными и под воздействием многих стрессовых факторов функционируют в ко-шаперонном комплексе, как было показано в нашем исследовании на модели АГ разных сроков, а также при сочетании АГ и СД.

Таким образом, регуляция активности комплекса HSP60/HSP10 на различных уровнях может быть решающим звеном в развитии митохондриальной дисфункции, которая является характерной чертой многих патологических процессов.

В отличие от HSP10, HSPB1 (HSP27) демонстрировал совершенно иной уровень продукции в представленных моделях патологии, несмотря на то что стационарный уровень экспрессии в контроле отказался схожим. Предположительно, это связано с тем, что эти белки относятся к одной группе АТФ-независимых малых БТШ.

HSPB1 является наиболее распространённым малым БТШ, экспрессируемым в ряде тканей организма, включая миокард. Как было упомянуто ранее, пострансляционные модификации sHSP приводят к модуляции их функции при воздействии различных стрессовых стимулов, и HSPB1 не является исключением. У человека в HSP27 сериновые остатки Ser-15, Ser-78 и Ser-82 распознаются как потенциальные сайты фосфорилирования [Mymrikov E. et al., 2011]. HSP27 в состоянии покоя существует как нефосфорилированная агрегированная форма, которая быстро диссоциируется на димер или мономер вследствие фосфорилирования, выполняющего функцию шарнира его связывания с субстратом и представляющего его характерные функции [Acunzo J. et al., 2012]. Кроме того, в одном из экспериментов было показано, что фосфорилирование HSPB1 влияет на его олигомерное состояние и взаимодействие с клиентскими белками, а следовательно, и на их шапероноподобную активность в модуляции различных клеточных процессов [Tokuda H. et al., 2018]. Так, HSPB1 регулирует тонус гладкой мускулатуры сосудов, тогда как фосфорилирование HSPB1 приводит к вазорелаксации [Huang J. et al., 2014]. Это может объяснить полученные

нами данными, согласно которым при АГ более длительно срока наблюдается повышение интенсивности синтеза БТШ HSP27. В свою очередь это может быть связано с тем, что данный белок снижает тонус гладкой мускулатуры.

С другой стороны, гипертоническая болезнь связана с гиперпролиферацией гладкомышечных клеток сосудов (VSMCs) и гипертрофическим ремоделированием сосудов [Huynh D. et al., 2020]. HSP27 играет ключевую роль в формировании микроструктуры актина, а также увеличение динамики его сборки при фосфорилировании БТШ, что необходимо для миграции VSMCs [Chen H.F et al., 2009]. Фосфорилирование HSP27 и его взаимодействие с актином-миозином также играют важную роль в сокращении VSMCs. Кроме того, HSP27 повышает устойчивость VSMCs к индуцированной окислительным стрессом фрагментации актина [Chen H.F et al., 2009]. В некоторых исследованиях сообщалось о способности HSP27 блокировать миграционные сигналы эндотелия и ингибировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток [Keezer S.M. et al., 2003]. Huang L. et al. (2014) предположили, что стресс вызывает индуцированные фосфорилированием конформационные изменения в олигомерах HSP27, которые модулируют активность белка на уровне динамики микрофиламентов, приводя к более высокому состоянию стабильности и восстановлению филаментов [Huang J. et al., 2014]. HSP27 необходим для опосредования хемотаксических эффектов. HSP27 регулирует миграцию, влияя на генерацию микрофиламентов ламеллоподий. Также HSP27 регулирует адгезию, удлинение и миграцию фибробластов [Ghayour-Mobarhan M. et al., 2012]. Таким образом, увеличение продукции HSP27 при АГ более длительного срока, которые мы наблюдали в настоящем исследовании, также, предположительно, может служить важным фактором защиты от пролиферации и миграции VSMCs в патогенезе прогрессирования АГ с последующим ремоделированием сердца.

При СД, помимо прогрессирования атеросклеротических изменений, с ранних стадий заболевания развивается спонтанная агрегация тромбоцитов, что приводит к увеличению риска сердечно-сосудистых осложнений [Tokuda H. et al., 2018]. Повышенная агрегация тромбоцитов коррелирует с активацией митоген-

активированной протеинкиназы р44/Р42 (MAP) и киназы р38 MAP, стимулируемой коллагеном в тромбоцитах пациентов с СД 2 типа [Hanai Y et al., 2009]. Известно, что члены суперсемейства MAP-киназ, такие как p38 MAP-киназа, участвуют в фосфорилировании HSP27 в процессе активации тромбоцитов человека [Mymrikov E.V. et al., 2011]. Ранее сообщалось, что Rac, низкомолекулярный GTP-связывающий белок, регулирует фосфорилирование HSP27, стимулируемое коллагеном через p44/p42 MAP-киназу в тромбоцитах человека [Kageyama Y. et al., 2013]. Кроме того, фосфорилированный-НЗР27, стимулированный коллагеном или пептидом, активирующим рецептор тромбина (TRAP - thrombin receptor-activating peptide) в тромбоцитах пациентов с СД 2 типа, высвобождается вместе с секрецией тромбоцитарного фактора роста PDGF-AB (platelet-derived growth factor-АВ) [Tokuda H. et al., 2016]. Установлено, что PDGF-AB участвует в развитии атеросклероза. Принимая во внимание эти данные, можно допустить, что активация тромбоцитов влияет на фосфорилирование HSP27, приводя к его высвобождению и секрецией PDGF-AB, которая может быть вовлечена в патогенез атеросклероза и воспаления [Tokuda H. et al., 2018] Таким образом, фосфорилирование HSP27 в тромбоцитах человека можно рассматривать в качестве новой терапевтической мишени для коррекции осложнений, вызванных СД.

С другой стороны, в одном из недавно проведенных исследований было показано, что существенных изменений в экспрессии белка HSP27 в миокарде у диабетических крыс не наблюдается, однако, уровень фосфорилирования HSP27 значительно снижен. Авторы предполагают, что снижение активации HSP27 (а не общее количество HSP27) связано с сердечной диастолической дисфункцией при диабете [Li S. et al., 2020]. Эти данные согласуются с результатами нашего исследования, согласно которым в контроле и при изолированном СД отмечается одинаковый уровень экспрессии HSP27. Вместе с тем, в исследовании Li S. et al. (2020) также оценивалась роль физических нагрузок в коррекции уровня экспрессии HSP27. Экспрессия и фосфорилирование белка HSP27 в миокарде диабетических крыс были значительно повышены при аэробных нагрузках. Это

свидетельствует о том, что физические упражнения стимулируют активацию белка HSP27 и восстанавливают диастолическую функцию у диабетических крыс. Данное наблюдение показало, что активация HSP27 играет важную роль в вызванном физическими упражнениями улучшении диастолической дисфункции, возникающей на фоне СД [Li S. et al., 2020].

Высокий уровень экспрессии HSP27 в сердечной мышце уменьшает повреждение миокарда, вызванное клеточным стрессом, в частности, при СД. Фосфорилированная форма HSP27 транслоцируется из цитоплазмы в саркомеры мышечных волокон при повреждении миокарда, а затем связывается с белком титином для предотвращения его неправильного свертывания и поддержания нормального состояния мышц, в том числе диастолической функции миокарда [Frankenberg N.T. et al., 2014]. Кроме того, в ряде исследований была обнаружена корреляция между прогрессирующей диастолической дисфункцией миокарда и снижением экспрессии миокардиального белка титина у диабетических крыс [Zile M.R. et al., 2015; Hopf A.E. et al., 2018]. Колокализация белков ШР27-титина значительно меньше в клетках миокарда диабетических крыс, а аэробные упражнения повышают уровень фосфорилирования HSP27 в ser82 и усиливают колокализацию в миокарде рШР27-титина. Можно предположить, что при физических упражнениях активируются молекулярные сигнальные пути, направленные на компенсацию сердечной диастолической дисфункции и восстановление поврежденных белков миокарда при СД [Li S. et al., 2020]. Таким образом, повышенное фосфорилирование HSP27 и его колокализация с титином являются важным механизмом, за счёт которого при аэробных упражнениях восстанавливается диастолическая функция у диабетических животных. Поэтому модуляция экспрессии HSP27 при СД диабете может служить важной терапевтической мишенью для замедления прогрессирования сосудистых осложнений.

HSP27 играет важную роль в защите КМЦ от воздействия различных стрессорных факторов, включая те, которые возникают при сочетании АГ и СД в результате нарастающего оксидативного повреждения клеток. HSP27 повышает

внутриклеточную концентрацию глутатиона и предотвращает фрагментацию цитоскелета, снижая восприимчивость КМЦ к окислительному стрессу [Ghayour-Mobarhan M. et al., 2012]. Некоторое время назад было установлено, что HSP27 действует как защитный фактор в клетках сердечно-сосудистой системы. В связи с этим избыточная экспрессия HSP27 приводит к защите сердечных миоцитов после ишемического повреждения [Vander Heide R.S. et al., 2002]. Данное наблюдение согласуется с результатами одного из исследований, в котором была показана защитная роль HSP27 в снижении интенсивности окислительного стресса, а также повышенная экспрессия HSP27 в КМЦ и высокий уровень циркуляторного HSP27 у пациентов с ИБС по сравнению со здоровыми лицами, у которых уровень HSP27 не отличался от контроля [Jozefowicz-Okonkwo G. et al., 2009].

В результате проведённого нами исследования было обнаружено снижение HSP27 в КМЦ ЛЖ крыс при сочетании АГ 38 недель и СД 30 суток, что согласуется с данными об отсутствии повышения HSP27 при ИБС легкой степени. С другой стороны, снижения синтеза БТШ HSP27 при сочетании АГ и СД может быть вызвано нарушениями функции микроциркуляторного русла в условиях гипергликемии, приводящими к повреждению стенки сосудов, агрегации тромбоцитов с последующим развитием микрососудистых осложнений [Tokuda H. et al., 2016]. С другой стороны, гипергликемия может представлять собой мягкий стрессовый стимул, вызывающий повышение регуляции эндогенных белков стресса, которые способны играть потенциальную роль в кардиопротекции и компенсировать патологические эффекты гипергликемии при СД, а также её сочетании с АГ [Chen H. et al., 2005].

5.3 Об особенностях механизмов регуляции апоптоза и аутофагии белками теплового шока при альтерации миокарда, вызванной гемодинамической перегрузкой и/или метаболическими нарушениями

Эндотелиальная дисфункция является важным фактором как в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, так и в развитии осложнений, вызванных СД,

поскольку эндотелий активно регулирует сосудистый тонус и проницаемость, баланс между коагуляцией и фибринолизом, воспалительной активностью и пролиферацией гладкомышечных клеток сосудов [van den Oever I.A.M. et al., 2010]. Следствием нарушения репаративных процессов в эндотелии сосудов является развитие атеросклероза, атеротромбоза, гипертрофия сосудистой стенки, воспалительная реакция, что в конечном итоге приводит к активации процессов, участвующих в развитии сосудистых осложнений СД и прогрессирования кардиоваскулярных заболеваний. В этой связи, воздействуя на механизмы, индуцирующие апоптотический каскад, в частности, посредством активации БТШ, можно замедлить прогрессирование деструктивных изменений в тканях, в частности, посредством ингибирования активации регулируемой клеточной гибели [Matsumoto T. et al., 2015].

Фактором, предрасполагающим к активации апототического каскада, является оксидативный стресс, возникающий как при повышенном АД, так и при СД, приводящий к нарушению работы системы контроля качества белка. Последняя представляет собой совокупность путей, реализуемых молекулярными шаперонами и ко-шаперонами и предназначенных для восстановления или клиренса дефектных белков в КМЦ [Wang X. et al., 2006]. При этом клетки реагируют на потерю протеостатического контроля путем индуцирования продукции БТШ, которые начинают репарацию денатурированных белков [Haslbeck M. et al., 2015]. Также к одним из основных механизмов системы контроля качества белка относится аутофагия, активация которой направлена на мобилизацию внутриклеточных ресурсов за счет деградации клеточных органелл и повторного использования белков клетки [Kroemer G. et al., 2010]. При этом сохранение функции митохондрий посредством предотвращения деградации митохондриальных белков и их способность к синтезу АТФ в условиях клеточного стресса также необходимо для выживания КМЦ. Однако в условиях выраженного оксидативного стресса, а также при возникновении глубокого энергодефицита, сопровождающегося развитием стойких метаболических изменений в клетках в результате накопления АФК и денатурированных белков, когда система контроля

качества белка перегружена, происходит увеличение аутофагического потока выше порогового уровня. Это что может привести к ее чрезмерной катаболической активации и гибели клеток, а также к активации процесса программированной клеточной гибели [Loos B. et al., 2009; Пупышев А.Б и соавт., 2014].

Отмечается, что HSP27 оказывает антиапоптотическое действие, используя несколько регуляторных участков собственной структуры и их взаимодействие с медиаторами апоптоза. Так, было показано, что HSP27 ингибирует апоптоз клеток посредством воздействия на внешний сигнальный путь. Фосфорилированный HSP27 взаимодействует с белком DAXX (death-associated protein 6) в FAS-опосредованном апоптозе, препятствуя взаимодействию DAXX-FAS и DAXX-Askl (apoptosis signal-regulating kinase 1), а также ингибируя DAXX-опосредованный апоптоз [Charette S.J. et al., 2006]. Кроме того, фосфорилированный HSP27 может связываться с киназным доменом и ингибировать Askl, что приводит к торможению трансдукции сигнала гибели клеток через MAPK/JNK путь и ингибированию апоптоза, индуцированного при ишемии или окислительном стрессе [Stetler R.A. et al., 2012]. Другое исследование показало, что HSP27 может оказывать антиапоптотическое действие через непрямое ингибирование Bax. HSP27 способствует взаимодействию Akt-Bax, ингибируя активацию Bax, олигомеризацию и митохондриальную транслокацию, что приводит к ингибированию апоптоза [Tian X. et al., 2016].

В проведенном исследовании с HUVEC (англ. - human umbilical vein endothelial cells - эндотелиальными клетками пупочной вены человека) было показано, что при повышении уровня глюкозы происходит индукция апоптоза и подавление продукции VEGF (англ. - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов) в HUVEC путем ингибирования активации киназы p42 / 44 MAP [Yang Z. et al., 2008]. На фоне высокого уровня глюкозы также значительно увеличивалось содержание белка Bax, однако уровень Bcl-2 не изменялся. Таким образом, повышалось соотношение Bax / Bcl-2, которое активирует превращение прокаспазы 3 в активную каспазу-3, в свою очередь инициируя апоптоз в HUVEC. Когда VEGF добавляли к HUVEC, подвергшимся воздействию высокого уровня

глюкозы, наблюдалось угнетение апоптоза за счет ингибирования повышенной генерации ROS, перегрузки кальция и активации митохондриального пути инициации апоптоза. VEGF значительно уменьшал экспрессию Bax, не влияя на уровень Bcl-2, а также ограничивал увеличение активности каспазы 3. VEGF в HUVECs также может уменьшить продукцию H2O2 при 48-часовой стимуляции глюкозы. Данное явление указывает на то, что VEGF ингибирует путь ROS / NF-кВ / JNK / Caspase-3 [Yang Z. et al., 2008]. Таким образом, увеличение соотношения Bax и Bcl-2 можно рассматривать в качестве условия, способствующего индукции апоптоза. При этом усиление экспрессии белка Bax говорит об активизации апоптотических процессов в КМЦ, являющейся по своей сути типовой реакцией альтерированного миокарда [Благонравов М.Л., 2011].

В результате нашего исследования было также обнаружено увеличение соотношения Bax и Bcl-2 во всех моделях, при этом в контрольной группе он было равно 2 / 1, что согласуется с предыдущими исследованиями [Salakou S. et al. 2007; Yang J. et al. 2015]. Особенно выраженным данный разрыв был в группе изолированного СД, а также в группе АГ длительного срока (57 недель), что говорит о значительной активации апоптотического каскада в как условиях дефицита инсулина, так и при хронической гемодинамической перегрузке ЛЖ. Однако содержание HSP27 оказалось на уровне контрольных цифр в группе СД, что может служить и важным прогностическим маркером. Механизмы, направленные на увеличение экспрессии данного белка, позволят уменьшить активность апоптотических процессов при данном виде метаболической патологии. В группе АГ 57 недель соотношение Bax и Bcl-2 оказалось самым выраженным, при этом уровень HSP27 оказался также самым высоким из всех групп, что может указывать на активацию защитных механизмов белка, направленную, в том числе, на связывание Bax. Управляемое увеличение индукции данного белка, предположительно, позволит уменьшить сосудистое ремоделирование и прогрессирование сердечной недостаточности. В группе АГ 38 недель в сочетании с СД белок Bcl-2 экспрессировался на уровне контрольной группы, при этом соотношение Bax и Bcl-2 также снижалось, что говорит о

сохраняющемся каскаде апоптотических процессов. При этом уровень HSP27 был снижен. Это может быть связано с тем, что уровень HSP27 при гипертензии малого срока снижается в 2 раза, при СД остается на уровне контроля, поэтому при сочетании двух видов патологии происходит незначительное снижение его уровня (Рисунок 22).

Рисунок 22. Экспрессия HSPB1 (HSP27) и белков Bax и Bcl-2 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

Стоит рассмотреть возможность повышения уровня Bcl-2 в клетках и снижения активации апототического каскада за счет HSPB1. Так, результаты исследования Tian X. et al. (2016) показали, что HSP27 может ослаблять апоптоз эндотелиальных клеток, индуцированный окислительным стрессом, повышая уровень Bcl-2 и понижая уровень расщепленной каспазы-3 и Bax. Кроме того, при ER-стрессе HSP27 способствует ERK-опосредованному фосфорилированию и деградации Bim, угнетая механизмы внутреннего пути инициации апоптоза

[Kennedy D. et al., 2017]. HSP27 также может непосредственно связываться с цитохромом С в цитозоле, ингибируя образование апоптосомы и препятствуя активации нижестоящих каспаз. Кроме того, HSP27 может подавлять апоптоз путем ингибирования высвобождения Smac митохондриями и последующей активации нисходящего каскада каспаз [Tian X. et al., 2016]. HSP27 также оказывает антиапоптотическое действие, воздействуя непосредственно на каспазу-3. HSP27 связывается с продоменом каспазы-3 и ингибирует его протеолитическую активацию [Tian X. et al., 2016].

HSP27 также способен замедлить прогрессирование сосудистых осложнений, вызванных эндотелиальной дисфункцией посредством модуляции процесса аутофагии, однако, точные механизмы, лежащие в основе HSP27-опосредованной регуляции аутофагии в КМЦ, точно не известны.

HSP27 также играет важную роль в поддержании митохондриального гомеостаза и митофагии [Kang R. et al., 2011]. Следует отметить, что HSP27 замедляет прогрессирование сердечной недостаточности и улучшает сердечную функцию за счет ингибирования окислительного стресса и активации митофагии [Lin S. et al. 2016]. Кроме того, HSP27 необходим для ER-стресс-индуцированной аутофагии, направленной на ингибирование цисплатин-индуцированного апоптоза клеток гепатомы человека [Chen R. et al., 2011]. Эти данные свидетельствуют о том, что HSP27 участвует в регуляции аутофагии.

В результате нашего исследования было установлено, что у нормотензивных крыс HSP27 и Beclin-1 экспрессировались на одном уровне. Это свидетельствует о том, что в нормальных условиях оба белка обеспечивают адекватный контроль качества белка. При АГ малого срока (38 недель) экспрессия обоих белков снижалась. Снижение синтеза Beclin-1 при АГ, вероятнее всего, связано с тем, что в условиях перегрузки давлением происходит ингибирование активности ряда генов, ответственных за митохондриальную аутофагию, в частности гена Drpl (Dynamin-1-like protein). В недавно проведенном исследовании Shirakabe A. et al. (2016) было установлено, что при перегрузке ЛЖ, вызванной сужением восходящей аорты, через 5 суток происходит снижение аутофагического потока в

миокарде ниже физиологического уровня в ответ на перегрузку давлением. Введение экзогенного Beclin-1 приводило к увеличению аутофагического потока, ослаблению митохондриальной дисфункции и замедлению прогрессирования сердечной недостаточности [Shirakabe A. et al., 2016]. Таким образом, снижение регуляции митохондриальной аутофагии играет важную роль в опосредовании развития митохондриальной дисфункции при перегрузке давлением, тогда как восстановление митохондриальной аутофагии путем активации продукции Beclin-1 ослабляет прогрессирование сердечной недостаточности при повышенном АД.

Однако при АГ более длительного срока (57 недель) наблюдается резкий рост уровня HSP27 и еще большее угнетение аутофагии, что может свидетельствовать о выраженной активации апоптотического каскада, так как и активация HSP27 участвует в процессах ремоделирования. Это связано с тем, что HSP27 может регулировать пролиферацию, реорганизацию актина и миграцию гладкомышечных клеток сосудов, а также снижать их тонус. В модели СД, напротив, происходит увеличение количества Beclin-1, что указывает на усиление аутофагии (Рисунок 23).

Рисунок 23. Экспрессия белков HSP27 и BECLIN-1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

Данное наблюдение можно объяснить тем, что AMPK (5' adenosine monophosphate-activated protein kinase - 5'АМФ-активируемая протеинкиназа), представляющая собой высококонсервативный сенсор питательных веществ/энергии в эукариотических клетках, участвует в регуляции активности PI3K III класса (PIK3C3) в аутофагическом пути. В условиях глюкозного голодания AMPK усиливает взаимодействие между Beclin-1 и PIK3C3, а также ATG14 и подавляет взаимодействие между Beclin-1 и антиапоптотическим белком Bcl-2 через фосфорилирование Beclin-1 на Thr388. Следовательно, стимулируется аутофагия [Kim J. et al., 2013]. АМ?К также может увеличивать скорость образования аутофагосом за счет фосфорилирования Beclin-1 на Ser91 и Ser94 [Kim J. et al., 2013]. HSP27, фосфорилированный через те же сигнальные пути PI3K/AKT и ERK1/2, также способен ингибировать апоптотический каскад реакций в условиях повышенного уровня глюкоза, тем самым способствуя повышению уровня базальной аутофагии.

В условиях выраженного энергодефицита, возникающего при сочетании АГ 38 недель и СД, уровень экспрессии HSP27 незначительно снижен относительно Beclin-1. Вероятнее всего, это происходит по той причине, что окислительный стресс, гипоксия, недостаточное количество метаболитов или низкий уровень внутриклеточного АТФ, вызывают ER-стресс [Tanjore H. et al., 2013]. В условиях стресса ER путь PERK/eIF2a/ATF4 активируется и способствует аутофагии посредством транскрипционной активации нескольких генов, связанных с аутофагией [Zhang J. et al., 2020]. Путь IRE1/JNK также может быть активирован в условиях стресса ER. Кроме того, JNK1 опосредует мультисайтовое фосфорилирование антиапоптотических белков Bcl-2/Bcl-XL, способствуя их диссоциации с доменом BH3 Beclin-1. Затем Beclin-1 связывается с комплексом PI3K, усиливая его активность и индуцируя аутофагию [Yang J. et al., 2015]. Стоит отметить, что активация JNK, индуцированная ER-стрессом, может индуцировать как апоптоз, так и аутофагию, что зависит от времени ER - стресса [Smith M. et al., 2017]. HSP27 также может влиять на JNK-киназу через ее регуляцию посредством Ask-1, тем самым приводя к инициации как аутофагии, так и апотоза, так как

активация JNK на ранних стадиях может способствовать аутофагии, но не индуцирует апоптоз, в то время как активация JNK после длительного периода ER-стресса вызывает апоптоз [Shan R. et al., 2020].

В обоих случаях снижение интенсивности аутофагии при перегрузке и повышение уровня базальной аутофагии при СД, а также снижение уровня HSP27 при сочетании АГ и СД и достижение цифр контроля при изолированном СД играет скорее дезадаптивную роль в процессе повреждения КМЦ, вызванного различными стрессорными факторами.

Роль шаперонного комплекса HSP60/HSP10 в модуляции процессов аутофагии и программированной клеточной гибели играет важное значение в прогрессирование сердечно-сосудистой патологии.

В процессе реализации апоптотического каскада реакций в условиях митохондриальной недостаточности по причине выраженного дефицита АТФ HSP60 защищает митохондриальные белки, облегчает их сворачивание и предотвращает деградацию. Так, при делеции гена Hsp60 в КМЦ взрослых мышей HSP60-зависимые митохондриальные белки подвергаются деградации через LONP1 и развивается митохондриальная дисфункция, которая в конечном итоге приводит к развитию дилатационной кардиомиопатии и сердечной недостаточности [Duan Y. et al., 2020]. Цитозольный HSP60 ко-локализован с Bax и играет антиапоптотическую роль в сердечных миоцитах. Потеря цитозольного HSP60 вызывает транслокацию Bax в митохондриях, высвобождение цитохрома С (Cyt C), активацию каспазы-3 и апоптоз [Gupta S., Knowlton A. A., 2005]. Кроме того, гипоксия запускает апоптоз за счет индукции диссоциации комплекса HSP60-Bax путем транслокации цитозольного HSP60 на плазматическую мембрану и Bax в митохондрии [Gupta S., Knowlton A. A., 2005].

В сердечных миоцитах HSP60 в основном находится внутри митохондрий, в то время как небольшая часть HSP60 (примерно 20-40%) может обнаруживаться в цитоплазме [Lin L. et al., 2007]. В культивируемых КМЦ новорожденных крыс сверхэкспрессия HSP60 самостоятельно или вместе с его ко-шапероном HSP10 защищала миоциты от апоптоза, индуцированного моделируемой ишемией и

реоксигенацией [Lin K. et al., 2001]. Эти результаты свидетельствуют о том, что митохондриальный шаперонный комплекс HSP60/HSP10 играет критическую роль в регуляции целостности митохондрий и способности к выработке АТФ, которые могут служить маркерами выживаемости КМЦ, подвергающихся ишемии и реперфузионному повреждению.

В результате нашего исследования было обнаружено снижение экспрессии комплекса HSP60/HSP10 относительно Вах во всех моделях патологии, при этом данное различие было менее выражено в группе АГ 38 недель в сочетании с СД. Таким образом, уменьшение продукции БТШ HSP60 можно рассматривать в качестве одного из механизмов патогенеза альтерации миокарда ЛЖ, обусловленного АГ и (или) СД (Рисунок 24).

Рисунок 24. Экспрессия белков ИБР60, ИБР10, Вах и Вс1-2 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии БИЯ 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии БИЯ в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

ИБР60 также может принимать участие в модуляции процесса аутофагии. Хотя на сегодняшний день данных о непосредственной регуляции ИБР60 ВесНп-1-зависимой аутофагии не существует, в некоторых исследованиях установлены

механизмы, за счет которых эти процессы, вероятно, реализуются. Так, Shi C.S. et al. (2008) описали участие Beclin-1 в TLR4-опосредованной аутофагии. При активации TLR4 происходит диссоциация Beclin-1 из комплекса Beclin-1-Bcl-2 и связывает Beclin-1 с белковым комплексом, содержащим MyD88 и TRIF. Точная функция Beclin-1 в этом сигнальном комплексе до сих пор не выяснена. Как мы указывали ранее, HSP60 является лигандом для TLR2 и TLR4, что позволяет ему при метаболических нарушениях, вызванных, в частности, СД, играть важную роль в активации воспалительных механизмов в миокарде. При этом, вероятнее всего, он также способен модулировать Bedm-1-зависимую аутофагию через активацию TLR2 и TLR4 в КМЦ.

Результаты нашего исследования подтверждают тот факт, что существует взаимосвязь между модуляцией Bedm-1-зависимой аутофагией и экспрессией HSP60 при СД. Так, уровень Beclin-1 был повышен в группе СД относительно HSP60/HSP10, а в группе сочетанной патологии (АГ 38 недель и СД) шаперонный комплекс HSP60/HSP10 и белок Beclin-1 экспрессировались на одном уровне (Рисунок 25).

Рисунок 25. Экспрессия белков HSP60/HSP10 и Beclin-1 в миокарде ЛЖ крыс при АГ (крысы линии SHR 38 и 57 недель), инсулинозависимом СД (крысы линии Wistar-Kyoto в возрасте 38 недель) и при сочетании АГ и СД (крысы линии SHR в возрасте 38 недель). * - р<0.05 по сравнению с контролем.

Данный факт указывает на то, что активация данных белков играет дезадаптивную роль посредством активации и в КМЦ, что может

служить важным прогностическим маркером для оценки прогрессирования

сосудистого повреждения при данном виде патологии.

* * *

БТШ являются важным компонентом системы контроля качества белка в клетке как в норме, так при патологических процессах. Они обеспечивают правильную сборку многих внутриклеточных белков, тем самым регулируя значительную часть синтетических процессов. Недостаточная или избыточная продукция БТШ приводит к нарушению гомеостаза клетки, а также может способствовать активации клеточного стресса, приводящего к повреждению эндоплазматического ретикулума, митохондриальной дисрегуляции и модуляции процессов регулируемой (программированной) клеточной гибели, включая апоптоз и аутофагический поток.

Многочисленные исследования подтверждают значимое увеличение либо снижение продукции БТШ в миокарде при широком спектре заболеваний сердца, тепловом стрессе или метаболических нарушениях. В последнее время широко обсуждается возможность их индукции для защиты клеток миокарда при оксидативном повреждении, вызванном дефицитом энергии, т.е. в качестве терапевтического подхода при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, развивающихся, в том числе, на фоне СД.

Понимание механизмов модуляции патологических процессов посредством воздействия на БТШ в сердечно-сосудистой системе может послужить основой для разработки новых методов патогенетической фармакотерапии заболеваний сердца.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги выполненного исследования

1. При гемодинамической перегрузке ЛЖ, обусловленной АГ и при его повреждении, связанном с СД 1 типа в КМЦ ЛЖ крыс происходит снижение по сравнению с контролем интенсивности экспрессии БТШ ИБР60. Сочетание АГ и СД не сопровождается развитием синергетического отрицательного эффекта в отношении данного процесса; напротив, в данном случае отмечается несколько менее выраженное угнетение продукции ИБР60.

2. При инсулинозависимом СД происходит достоверное снижение экспрессии малого БТШ ИБР10 в КМЦ ЛЖ, что указывает на ослабление механизмов кардиопротекции, реализуемых АТФ-независимым белком. В группе коморбидной патологии, напротив, происходит усиление защитных механизмов в миокарде, реализуемых малым БТШ ИБР10, о чем свидетельствует достоверное увеличение его экспрессии.

3. Для малого БТШ ИБР27 характерно снижение уровня экспрессии при сочетании АГ с СД относительно контрольной группы, что говорит об уменьшении его участия в механизмах кардиопротекции на фоне выраженного энергодефицита. При АГ большего срока (57 недель), напротив, защитная роль ИБР27 возрастает, на что указывает высокий уровень его экспрессии в КМЦ ЛЖ.

4. При хронической перегрузке ЛЖ, обусловленной АГ, происходит снижение интенсивности ВесНп-1-зависимой аутофагии КМЦ. При изолированном СД, а также при его сочетании с АГ наблюдается противоположный эффект, проявляющийся в достоверном увеличении базального уровня ВесНп-1-зависимой аутофагии, что в свете представлений о системе контроля качества белка позволяет рассматривать данное явление как механизм выживания поврежденных клеток.

5. При АГ и изолированном СД происходит усиление апоптотического каскада реакций в КМЦ ЛЖ, на что указывает повышение экспрессии белка Вах и снижение соотношения Bcl-2/Bax. В то же время, при сочетанной патологии содержание Вах увеличивается не столь существенно относительно других групп, однако, остается выше контрольной группы. При этом также достоверно повышается содержание Bcl-2, а соотношение Bcl-2/Bax приобретает тенденцию к увеличению, но остается ниже контроля, что свидетельствует о снижении апоптотического каскада реакции при коморбидной патологии, в отличие от изолированных АГ и СД.

6. В зависимости от характера альтерации миокарда, участие БТШ с различной молекулярной массой в механизмах кардиопротекции может как увеличиваться, так и уменьшаться. Снижение экспрессии HSP60 в КМЦ ЛЖ можно рассматривать в качестве механизма ослабления кардиопротекции при альтерации миокарда ЛЖ, обусловленного АГ и (или) СД. Для малых БТШ HSP10 и HSP27 характерны разнонаправленные изменения их продукции при АГ, СД и их сочетании.

Практические рекомендации

Результаты проведенного исследования могут быть использованы для разработки новых терапевтических методов, направленных на восстановление морфофункционального состояния миокарда при метаболических и гемодинамических нарушениях. Полученные данные можно учитывать при дальнейших исследованиях БТШ в качестве потенциальной патогенетической мишени, посредством которой возможна коррекция процессов регулируемой клеточной гибели.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Изучение роли БТШ в патогенезе альтерации миокарда открывает новые возможности для поиска и разработки лечебных методов, воздействующих на процессы программированной гибели КМЦ с целью компенсации нарушений, возникающих при заболеваниях сердечно-сосудистой и эндокринной систем, а также при их сочетании. В этой связи разработка новых методов фармакотерапии, направленных на защиту КМЦ посредством управления синтезом БТШ и процессом регулируемой клеточной гибели, является перспективным направлением дальнейших исследований.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертензия

БТШ - белок теплового шока

ДКМП - дилатационная кардиомиопатия

ИБС - ишемическая болезнь сердца

КМЦ - кардиомиоцит

ЛЖ - левый желудочек

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

НАЖБП - неалкогольная жировая болезнь печени

СД - сахарный диабет

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа

ФП - фибрилляция предсердий

ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2

acLDL - acetylated low density lipoprotein (ацетилированные липопротеины низкой плотности)

AGEs - advanced glycation end-products (конечные продукты гликирования) AIF - apoptosis inducing factor (фактор индукции апоптоза) ALDH2 - aldehyde dehydrogenase (альдегиддегидрогеназа)

AMPK - 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (5'АМФ-активируемая протеинкиназа)

APAF1 - apoptotic peptidase-activating factor 1 (фактор, активирующий апоп-тотические пептидазы)

APC - antigen-presenting cell (антигенпрезентирующие клетки)

AREs - antioxidant response elements (элементы антиоксидантного ответа)

Askl - apoptosis signal-regulating kinase 1 (киназа, регулирующая сигнал к апоптозу, тип 1)

AT-III - antithrombin 3 (антитромбин 3)

Bag-1 - family molecular chaperone regulator 1 ^тамген, ассоциированный c Bcl-2) Bax - Bcl-2-associated X protein (Bcl-2-ассоциированный X белок) Bcl-2 - B-cell lymphoma 2 (белок B-клеточной лимфомы-2) Bcl-XL - Bcl-2 X-linked protein (Bcl-2 X-связанный белок)

BID - BH3 interacting domain death agonist (BH3-взаимодействующий агонист домена смерти)

CHIP - chaperone-associated ubiquitin ligase (шаперон-ассоциированная убиквитинлигаза)

DAMP - damage-associated molecular pattern (ассоциированный с повреждением молекулярный паттерн)

DAXX - death-associated protein 6 (белок, связанный с доменом смерти 6)

Drp1 - dynamin related protein 1 (ГТФ-азный белок, регулирующий митохондриальное деление)

eIF2A - eukaryotic translation initiation factor 2A (эукариотический фактор инициации трансляции 2А)

ER - endoplasmic reticulum (эндоплазматический ретикулум)

ERK - extracellular signal-regulated kinase (сигнальный путь МАР-киназы)

exHSP - extracellular heat shock protein (внеклеточный белок теплового шока)

FGF21 - fibroblast growth factor 21 (фактор роста фибробластов 1) GGA - geranylgeranylacetone (геранилгеранилацетон)

G6PDH - glucose-6-phosphate dehydrogenase (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа)

GP VI - glycoprotein VI (гликопротеин VI)

GTP - guanosine-5'-triphosphate (гуанозинтрифосфат)

HFD - high fat diet (высокожировая диета)

4-HNE - 4-Hydroxynonenal (4-гидрокси-транс-2-ноненаль)

HSE - heat shock elements (элементы теплового шока)

HSF - heat shock transcription factor 1 (фактор транскрипции белков теплового шока-1)

HSP - heat shock protein (белок теплового шока) HSR - heat shock response (ответ на тепловой шок)

HUVEC - human umbilical vein endothelial cells (эндотелиальные клетки пупочной вены человека)

iHSP - intracellular heat shock protein (внутриклеточный белок теплового шока)

IKKy - inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit gamma (регуляторная субъединица ингибитора комплекса IkB-киназы (IKK), активирующая NF-kB)

IL-6 - interleukin 6 (интерлейкин 6)

IMS - intermembrane space (межмембранное пространство)

IP-10 - interferon gamma-induced protein 10 (интерферон гамма-индуцированный белок 10)

IRE1 - inositol-requiring kinase 1 (инозитол-зависимая киназа-1)

IRS-1 - insulin receptor substrate 1 (субстрат-рецептор инсулина 1)

JNK - c-Jun N-terminal kinase (Jun N-амино-терминальная киназа)

LONP1 - lon peptidase 1 (митохондриальная протеаза-1)

MAP - mitogen-activated protein (протеинкиназа, активируемая митогенами)

MAPK - mitogen-activated protein kinase (митогенактивируемая протеинкиназа)

MCH 1 - major histocompatibility complex (главный комплект гистосовместимости 1 класса)

MCP-1 - monocytic chemotactic protein-1 (моноцитарный хемотаксический белок 1)

MIRI - myocardial ischemia-reperfusion injury (ишемически-реперфузионное повреждение миокарда)

MitCHAP60 disease - mitochondrial HSP60 chaperonopathy (митохондриальная HSP60 шаперонопатия)

Mn-SOD - manganese-dependent superoxide dismutase (марганецзависимая супероксиддисмутаза)

mtROS - mitochondrial reactive oxygen species (митохондриальные активные формы кислорода)

mTOR - mammalian target of rapamycin (мишень рапамицина у млекопитающих)

NF-kB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (транскрипционный ядерный фактор «каппа-би»)

NOS2 - nitric oxide synthase (индуцибельная синтаза оксида азота)

NRF2 - nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (ядерный фактор 2 эритроидного происхождения)

PAC-1 - procaspase-activating compound 1 (компонент, активирующий прокаспазу 1 типа)

PBMC - peripheral blood mononuclear cell (мононуклеарные клетки периферической крови)

PDGF-AB - platelet-derived growth factor-АВ (тромбоцитарный фактор роста-АВ)

PI3K - phosphoinositide 3-kinase (фосфатидилинозитол-3-киназа)

PGC1-a - peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (гамма-коактиватор 1-альфа рецептор, активируемый пероксисомным пролифератором)

PKR - protein kinase R (протеинкиназа R)

PPAR-a - peroxisome proliferator-activated receptor alpha (рецептор, активируемый пероксисомным пролифератором альфа)

PQC - protein quality control (система контроля качества белка)

PTMs - post-translational modifications (посттрансляционные модификации)

ROS - reactive oxygen species (активные формы кислорода)

sHSP - small heat shock protein (малые белки теплового шока)

SHR - spontaneously hypertensive rats (спонтанно гипертензивные крысы)

siRNA - small interfering RNA (малые интерферирующие РНК)

SMAC - second mitochondria-derived activator of caspases (второй митохондриальный активатор каспаз)

SNF1 - AMP-activated serine/threonine-protein kinase catalytic subunit (АМФ-активированная каталитическая субъединица Серин/треонин-протеинкиназы)

SR-A - scavenger receptor A (рецептор-скавенджер A)

STAT3 - signal transducer and activator of transcription 3 (сигнальный белок и активатор транскрипции 3)

Tgfp! - transforming growth factor beta 1 Трансформирующий фактор роста P1)

TLR - toll-like receptor (толл-подобный рецептор)

TNF-a - tumor necrosis factor alfa (фактор некроза опухолей альфа)

TRAP - thrombin receptor activating peptides (белки, активирующие рецептор тромбина)

TRIF - TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-ß (цитозольный адаптерный белок, участвующих в передаче сигнала от толл-подобных рецепторов)

VDAC1 - voltage-dependent anion-selective channel 1 (зависимый от напряжения анион-селективный канал 1)

VEGF - vascular endothelial growth factor (фактор роста эндотелия сосудов) VSMCs - vascular smooth muscle cells (гладкомышечные клетки сосудов)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Автандилов, Г. Г. Медицинская морфометрия: Руководство / Г. Г. Автандилов // М. : Медицина, 1990. - С 384.

2. Азова, М. М. Апоптоз кардиомиоцитов и гипертрофия миокарда в динамике вазоренальной артериальной гипертензии / М. М. Азова, М. Л. Благонравов, В. А. Фролов, О. Б. Гигани, О. О. Гигани // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - № 5. - С. 17-19.

3. Благонравов, М. Л. Апоптоз кардиомиоцитов как типовая реакция альтернативного сердца: автореф. дис. ... докт. мед. наук: 14.03.03 / Благонравов М.Л. - М., 2011. - 39 с.

4. Благонравов, М. Л. Аутофагия кардиомиоцитов и морфологические изменения миокарда левого желудочка при острой очаговой ишемии / М. Л. Благонравов, А. Ю. Коршунова, М. М. Азова, С. А. Бондарь, В. А. Фролов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. - Т. 160. - № 3. - С. 398-400.

5. Губская, П. М. Индекс экспрессии факторов роста фибробластов tgf-pl и FGF-2 в левом и правом желудочках крыс линии Вистар при адренергическом и холинергическом вариантах острого стресса / П. М. Губская, М. П. Рубанова, М. Е. Евсеев, Н. А. Кулик, В. С. Бондаренко, И. А. Атаев, Д. Р. Сулиманова // Вестник НовГУ. - 2013. - Т. 42. - № 71. - С. 13-17.

6. Жаворонок, Т. В. Изменение содержания ионов кальция и экспрессии белков-регуляторов апоптоза при тканевой гипоксии / Т. В. Жаворонок, Н. В. Рязанцева, Е. А. Степовая, Т. С. Агеева, Ю. В. Стариков, О. Л. Носарева // Международный журнал экспериментального образования. - 2013. - №2 42. - С.152-153.

7. Информационный бюллетень «Диабет» // Всемирная организация здравоохранения. - 2021. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/diabetes.

8. Информационный бюллетень «Сердечно-сосудистые заболевания» // Всемирная организация здравоохранения. - 2017. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds).

9. Ковалевa, О. В. Аутофагия: клеточная гибель или способ выживания? / О.

B. Ковалева, М. С. Шитова, И. Б. Зборовслукая // Клиническая онкогематология. -2014. - № 2. - С. 103-113.

10. Лушникова, Е. Л. Структурная реорганизация миокарда крыс и численность кардиомиоцитов при действии доксорубицина и тритерпеноидов / Е. Л. Лушникова, Л.М. Непомнящих, Н. А. Молодых, М. Г. Клинникова, О. П. Молодых // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 6. - С. 98-102.

11. Прошина, Л. Г. Особенности гистохимической и иммуноцитохимической перестройки тканей сердца в процессе адаптации к экстремальным воздействиям / Л. Г. Прошина, Н. П. Федорова, О. С. Быкова // Вестник НовГУ. - 2010. - № 59. -

C. 121-123.

12. Пупышев, А. Б. Репаративная аутофагия и аутофаговая гибель клетки функциональные и регуляторные аспекты / А. Б. Пупышев // Цитология. - 2014. -Т. 56. - № 3. - С. 179-196.

13. Склифасовская, А. П. Экспрессия белков Bax и Bcl-2 в кардиомиоцитах левого желудочка сердца при инсулинозависимом сахарном диабете у крыс линий Wistar-Kyoto и SHR / А. П. Склифасовская, М. Л. Благонравов, А. Ю. Рябинина, М. М. Азова, В. А. Горячев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2021. - Том 171. - № 5. - С. 543-549.

14. Честикова, А. И. Артериальная гипертензия и коморбидность: современное состояние проблемы / А. И. Честикова, М. М. Батюшин, В. П. Терентьев // Артериальная гипертензия. - 2016. - T. 22. - № 5. - C. 432-440.

15. Acunzo, J. Small heat shock proteins HSP27 (HspB1), aB-crystallin (HspB5) and HSP22 (HspB8) as regulators of cell death / J. Acunzo, M. Katsogiannou, P. Rocchi // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. - 2012. - Vol. 44. - P. 16221631.

16. Anckar, J. Regulation of HSF1 function in the heat stress response: implications in aging and disease / J. Anckar, L. Sistonen // Annu Rev Biochem. - 2011.

- Vol. 80. - P. 1089-1115.

17. Archer, A. E. Exercise, heat shock proteins and insulin resistance / A.E. Archer, A. T. V. Schulze, P. C. Geiger // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. - 2018. - Vol. 373.

- P. 1738

18. Arndt, V. Chaperone-assisted selective autophagy is essential for muscle maintenance / V. Arndt, N. Dick, R. Tawo, M. Dreiseidler, D. Wenzel, M. Hesse // Current Biology. - 2010. - Vol. 20. - P. 8-143.

19. Arrigo, A. P. Hsp27 consolidates intracellular redox homeostasis by upholding glutathione in its reduced form and by decreasing iron intracellular levels / A. P. Arrigo, S. Virot, S. Chaufour, W. Firdaus, C. Kretz-Remy, C. Diaz-Latoud // Antioxid Redox Signal. - 2005. - Vol. 7. - P. 414-422.