Роль аномалий гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат медицинских наук Морданов, Сергей Викторович

• Морданов, Сергей Викторович
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Морданов, Сергей Викторович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. СОВРЕМННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О BCR-ABL

ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА ИМАТИНИБОМ

1.1. Цитогенетические и молекулярные основы патогенеза

хмл

1.2. Биологические основы целенаправленной терапии ХМЛ 16 ингибиторами тирозинкиназ

1.3. Механизмы резистентности ХМЛ к терапии ингибиторами 18 тирозинкиназ ,

1.4. BCR-ABL-зависимые механизмы резистентности ХМЛ к 21 терапии иматинибом

1.5.1. Амплификация гена BCR-ABL

1.5.2. Мутации гена BCR-ABL 24 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика пациентов

2.2. Методы исследования

2.2.1. Стандартное цитогенетическое исследование клеток 49 костного мозга

2.2.2. Молекулярно-цитогенетические исследования 50 2.2.3 Молекулярно-генетические исследования 55 2.2.4. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ КИНАЗНОГО ДОМЕНА ГЕНА 60 BCR-ABL НА РАЗВИТИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ПАЦИЕНТОВ С ХМЛ К ТЕРАПИИ ИМАТИНИБОМ

3.1. Мутации киназного домена гена BCR/ABL в

зависимости от типа резистентности

3.2. Влияние мутаций гена ВСЯ-АВЬ на динамику

цитогенетического и молекулярного ответов у пациентов, получающих терапию иматинибом. ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ ГЕНА ВСТАВЬ НА 76 РАЗВИТИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У ПАЦИЕНТОВ С ХМЛ К ТЕРАПИИ ИМАТИНИБОМ

4.1. Амплификация гена ВС11/АВЬ в зависимости от типа 81 резистентности

4.2. Характеристика клонов опухолевых клеток с 83 амплификацией гена ВСЯ-АВЬ

4. 3. Динамика цитогенетического и молекулярного ответов у 86 пациентов, получающих терапию иматинибом, в зависимости от наличия дополнительных копий гена ВСЫ-АВЬ 4.4. Влияние величины опухолевого клона с амплификацией 89 гена ВСЫ-АВЬ на вероятность достижения цитогенетического и молекулярного ответов ГЛАВА 5. Оценка значения аномалий гена ВСЯ-АВЬ в комплексе 92 демографических и клинико-лабораторных данных в развитии резистентности к терапии иматинибом методом дискриминантного анализа.

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Практические реко мендации:

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ELN - European LeukemiaNet

FISH - флуоресцентная in situ гибридизация

IS - International scale (международная шкала оценки уровня

транскрипта В CR/ ABL)

IRIS - international randomized study of interferon and sti57

Ph-хромосома - филадельфийская хромосома

БМО — большой молекулярный ответ

БЦО - большой цитогенетический ответ

ГО — гематологический ответ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КМ — костный мозг

МинЦО — минимальный цитогенетический ответ

МЦО — малый цитогенетический ответ

ОБМО — отсутствие большого молекулярного ответа

ОТ-ПЦР — реакция обратной транскрипции - полимеразная цепная реакция

ОЦО — отсутствие цитогенетического ответа

ПЦО — полный цитогенетический ответ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПМО — полный молекулярный ответ

РНК - рибонуклеиновая кислота

XMJI — хронический миелолейкоз

ЧЦО — частичный цитогенетический ответ

ЦО - цитогенетический ответ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль аномалий гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

В лечении хронического миелолейкоза (XMJI) ингибиторами тирозинкиназ достигнуты впечатляющие результаты, оказавшие существенное влияние на развитие таргетной терапии различных онкологических заболеваний. (Deininger М., O'Brien SG., Guilhot F., 2009) Следующим уроком, который необходимо извлечь из результатов таргетной терапии XMJ1 для использования в других областях онкологии, является установление контроля над механизмами резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с XMJI (Mughal T.I., Goldman J.M., 2007).

Наиболее известным клиническим исследованием безопасности и эффективности иматиниба по сравнению с интерфероном в лечении XMJI является Международное рандомизированное исследование IRIS, результаты которого показали беспрецедентное превосходство иматиниба (Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al., 2006). После 6 лет монотерапии иматинибом пациентов в хронической фазе XMJI их общая выживаемость составила 88%, бессобытийная выживаемость - 83%, выживаемость без прогрессии в фазу акселерации и бластный криз — 93% (Hochhaus А., Druker В J., Larson R.A. et al., 2007 ).

Однако, у части пациентов с XMJI, получающих монотерапию иматинибом, наблюдается первичная резистентность (рефрактерность) или вторичная (приобретенная) резистентность к проводимой терапии. О значении рефрактерности к терапии иматинибом для клинической практики свидетельствуют некоторые результаты исследования IRIS: в 4% вновь диагностированных случаев XMJI не удалось достичь полной гематологической ремиссии после 3 месяцев терапии иматинибом, в 16% случаев не удалось достичь большого цитогенетического ответа после 12 месяцев терапии и у 23% пациентов не был достигнут полный

цитогенетический ответ после 18 месяцев терапии (Druker В.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al., 2006).

Различные исходы лечения резистентных к иматинибу пациентов обусловлены, вероятно, разными механизмами развития резистентности. Изучение этих механизмов имеет огромное клиническое значение, поскольку может привести к выявлению прогностических факторов, позволяющих предвидеть благоприятный исход или прогрессию заболевания. Более того, выяснение причин рефрактерности может помочь оптимизировать терапию XMJ1 — повысить дозу иматиниба, перейти на терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) второго поколения (нилотиниб, дазатиниб), принять решение о трансплантации костного мозга.

Среди механизмов развития резистентностии к терапии иматинибом главная роль отводится мутациям киназного домена гена BCR-ABL (Cortes J., Jabbour Е., Kantarjian Н., 2007). Различные миссенс-мутации химерного гена BCR-ABL приводят к замене одной из аминокислот в белке Всг-АЫ, что обусловливает нарушение связывания иматиниба с Всг-АЫ тирозинкиназой (Jabbour Е., Kantaijian Н., Jones D. et al., 2006). Однако, если о роли мутаций в развитии приобретенной резистентностии накопилось довольно много данных за последние несколько лет (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2002), то частота, спектр мутаций, их потенциальное значение в развитии первичной резистентности остаются малоизученными. Ряд авторов обнаружили связь между появлением мутаций гена BCR-ABL и возрастом пациентов, наличием ранней или поздней хронической фазы на момент начала терапии иматинибом, предлеченностью, продолжительностью периода от установления диагноза до начала терапии иматинибом, длительностью терапии иматинибом (O'Hare Т., Eide С.А., Deininger М., 2008). Однако, в этих исследованиях анализировались преимущественно мутации, обусловливающие развитие вторичной резистентности.

Роль амплификации гена BCR-ABL в формировании резистентности к иматинибу отражена в единичных публикациях. Впервые амплификация гена BCR-ABL, приводящая к гиперэкспрессии BCR-ABL транскрипта, была обнаружена в экспериментах с BCR-ABL-позитивными клеточными линиями (Le Coutre Р., Tassi Е., Varella-Garcia М. et al., 2000). В клинической практике M.E.Gorre с соавт. (2001) методом FISH впервые показали амплификацию гена BCR-ABL в 3 из 9 случаев XMJI, резистентного к иматинибу. Затем А. Hochhaus (2003) также показал методом FISH увеличение количества копий гена BCR-ABL у 2 из 7 больных XMJI с первичной резистентностью. Интересно, что он не обнаружил амплификацию гена BCR-ABL ни в одном из 25 случаев вторичной резистентности ХМЛ. Однако, до сих пор не изучено влияние количества копий амплифицированного гена BCR-ABL, величины клонов с амплификацией гена BCR-ABL на развитие резистентности к терапии ИТК, четко не определена роль амплификации гена BCR-ABL в развитии первичной и вторичной резистентности.

Цель исследования - оценить роль BCR-ABL зависимых механизмов, обусловленных мутациями гена BCR-ABL и его амплификацией, в формировании резистентности к терапии иматинибом у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом.

Задачи исследования

1. Определить частоту и спектр мутаций участка гена BCR-ABL, кодирующего киназный домен 5С7?-^(Я£-тирозинкиназы (Р-петля, IB-домен, С-домен, А-петля), у больных XMJI с первичной и вторичной резистентностью к терапии иматинибом.

2. Оценить влияние мутаций гена BCR-ABL на развитие рефрактерности и приобретенной резистентности к иматинибу.

3. Выявить частоту амплификации гена ВСЯ-АВЬ в опухолевых клетках у больных ХМЛ с резистентностью к терапии иматинибом.

4. Оценить значимость амплификации гена ВСЯ-АВЬ н формировании первичной и вторичной резистентности к иматинибу.

Новизна результатов исследования

Впервые проведена комплексная оценка значения амплификации и мутаций гена ВСЯ-АВЬ в формировании резистентности к терапии иматинибом на большой выборке пациентов. Оценена роль амплификации гена ВСЯ-АВЬ в развитии первичной резистентности к терапии иматинибом. Впервые определено влияние величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ, на развитие резистентности к терапии иматинибом. Впервые оценено значение количества копий амплфицированного гена ВСЯ-АВЬ в развитии резистентности к терапии ХМЛ иматинибом.

Практическая значимость

Результаты исследования показали необходимость проведения не только анализа мутаций, но и амплификации гена ВСЯ-АВЬ в случаях выявления резистентности к терапии иматинибом, поскольку амплификация гена ВСЯ-АВЬ является одной из причин неудач терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Наличие клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ является фактором неблагоприятного прогноза ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ в хронической фазе и фазе акселерации вне зависимости от величины клона опухолевых клеток с амплификацией гена ВСЯ-АВЬ. Показано, что наличие мутаций гена ВСЯ-АВЬ и их локализация влияют на эффективность терапии иматинибом. Выявление аномалий гена ВСЯ-АВЬ (мутаций и амплификации) обусловливает необходимость изменения подходов к терапии ХМЛ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аномалии гена BCR-ABL являются одними из основных механизмов развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с XMJ1 и суммарно обнаруживаются более, чем в 50% случаев.

2. Мутации гена BCR-ABL являются основной причиной стойкой резистентности на длительных сроках наблюдения, в отличие от резистентности, обусловленной i?СУ?-/^¿-независимыми причинами.

3. Вклад амплификации гена BCR-ABL в развитие резистентности к терапии XMJI иматинибом сопоставим с ролью мутаций гена BCR-ABL.

4. Влияние аномалий гена BCR-ABL на эффективность терапии иматинибом у больных XMJI не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL.

5. Длительность периода времени от постановки диагноза XMJÏ до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификации гена BCR-ABL).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7 научно-практических форумах: Научно-практической конференции ЮФО "Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг" (Кисловодск, 2009), IV съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), 15th, 16th, 17th Congress of European Hematologists Association (Barcelona 2010, London 2011, Amsterdam, 2012), 7th Scientific Symposium "Improving Research for a Common Future" (Cologne, 2012), I Конгрессе гематологов России (Москва, 2012).

Публикации

Всего по теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из которых - 3 в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Внедрение результатов в практику здравоохранения

Полученные данные используются при чтении лекций и проведении семинаров на кафедре гематологии и трансфузиологии с курсами клинической лабораторной диагностики, генетики и лабораторной генетики ФПК и ППС ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России.

Результаты исследования проведенного Мордановым C.B. внедрены в практическую работу лаборатории медицинской генетики, отделения гематологии клиники ГБОУ ВПО Рост ГМУ Минздрава России, отделений гематологии республиканских, краевых и областных онкологических диспансеров Южного Федерального и Северо-Кавказского Федерального округов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов, сборе первичных данных, проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи. Математическая обработка данных проведена лично соискателем. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций выполнены автором самостоятельно.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания методики исследования, трех глав результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии (18 источников на русском и 177 на иностранном языках). Работа содержит 27 рисунков и 15 таблиц.

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О BCR-ABL-ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА ИМАТИНИБОМ

1.1. Цитогенетические и молекулярные основы патогенеза ХМЛ

Хронический миелоидный лейкоз является одним из клональных онкогематологических заболеваний. Повреждение кроветворной стволовой клетки приводит к увеличению числа клеток миелоидного ряда, которые сохраняют способность к созреванию. На долю ХМЛ приходится до 20% от общего количества опухолевых заболеваний системы крови у взрослых (Хорошко Н.Д., Туркина А.Г.2001; Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., 2005;).

В течении хронического миелоидного лейкоза можно выделить три стадии. Заболевание начинается с хронической фазы, протекающей вначале практически бессимптомно, а затем характеризующейся выраженным лейкоцитозом и спленомегалией. Через 2-4 года при отсутствии лечения заболевание переходит в фазу акселерации, что сопровождается утратой опухолевыми клетками способности к дифференцировке. В дальнейшем развитие ХМЛ характеризуется терминальной фазой бластного криза. Таким образом, заболевание прогрессирует в течение 3-5 лет и заканчивается летальным исходом (Perrotti D., Jamieson С. et al, 2010).

В основе патогенеза ХМЛ лежит возникновение реципрокной транслокации - t(9;22)(q34;ql 1) в стволовой кроветворной клетке. В результате этой транслокации образуется дериватная хромосома 22 -der(22)t(9;22)(q34;ql 1), которую принято называть «Филадельфийской» (Ph-хромосома), поскольку она впервые была обнаружена в городе Филадельфия (США) (Nowell P.C., Hungerford D.A., 1960). Ph-хромосома обнаруживается цитогенетическим методом в опухолевых клетках практически во всех случаях ХМЛ (в 95% ). В связи с этим, обнаружение Ph-хромосомы в клетках костного мозга используется в качестве «маркирующего» признака этого заболевания (Kawasaki E.S., Clark S.S.,

Coyne N.Y. et al., 1988; Faderl S., Talpaz M., EstrovZ. 1999). Данный факт является важным моментом, использующимся в диагностике и мониторинге хронического миелоидного лейкоза. Обнаружение Ph-позитивных клеток при цитогенетическом исследовании клеток костного мозга является «золотым стандартом» в диагностике хронического миелолейкоза, а цитогенетический ответ используется как один из наиболее важных критериев оценки эффективности терапии XMJI (De Klein A., van Kessel A.G., Grosveld G., 1982; Туркина А.Г., Челышева Е.Ю., 2004; Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др., 2005; Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин A.B., 2007).

Критическим молекулярным следствием реципрокной транслокации t(9;22) является образование химерного гена BCR/ABL1, локализованного на дериватной хромосоме 22 (Ph-хромосоме) (Lion T., Izraeli S., Henn T. et al., 1992; Lion T., Henn T., Gaiger A. et al., 1993; Lin F., van Rhee F., Goldman J.M. et al., 1996).

Протоонкоген c-ABL (ABL1) впервые был идентифицирован как нормальный клеточный гомолог вирусного онкогена v-ABL (вируса лейкоза мышей Абельсона Ab-MuLV). В норме ген ABL1 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), (MIM ID * 189980) локализован в длинном плече хромосомы 9 (09q34.1) и экспрессирует протеин р 145ABL (Van Etten R.A., 1999), который выполняет роль нерецепторной тирозинкиназы и играет важную роль в регуляции нормального клеточного цикла. В структуре р 145ABL выделен ряд доменов, отвечающих как за ферментативную составляющую его функции (домен SH1 обладает функцией тирозинкиназы), так и за регуляторные взаимодействия (домены SH2, SH3 участвуют во взаимодействиях с белками интегрином и актином, позволяющим клетке получать сигналы от микроокружения). Считается, что в норме за счет внутримолекулярных взаимодействий домен SH3 является естественным ингибитором тирозинкиназной активности. В исследовании В.J Mayer было замечено, что его удаление или перемещение

в другую позицию приводит к активации тирозинкиназы (Mayer B.J., 1994).

Ген BCR (breakpoint cluster region 1, MIM ID: * 151410) располагается в длинном плече хромосомы 22 (22qll.22). Его структура, содержащая 23 экзона, имеет протяженность около 135кБ. Он кодирует протеин с молекулярной массой 160 кД, имеющий несколько функциональных доменов: домен олигомеризации, область, определяющую серин/треонин киназную активность, Dbl- и РН-домены, область гомологии с GAP. BCR-протеин является полифункциональным белком, взаимодействующим со многими клеточными белками, что определяет его роль в передаче внутриклеточных сигналов и организации цитоскелета.

Вследствие транслокации t(9;22)(q34;ql 1) участок гена ABL перемещается с длинного плеча хромосомы 9 на длинное плечо хромосомы 22, в область расположения гена BCR. Места разрыва гена Всг могут быть различными, однако, в подавляющем большинстве случаев на основе мРНК-транскрипта гена BCR-ABL образуется химерный белок р210 с молекулярной массой 210 кДа (Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J. et al., 1990) (Shtivelman E., Lifshitz В., Gale R.P., Canaani E., 1985). Экспрессия химерного гена BCR-ABL приводит к продукции аномальной тирозинкиназы, обладающей постоянно высокой ферментативной активностью, в отличие от жестко регулируемой нормальной ABL киназы (Heisterkamp N., Stam К., Groffen J. et al., 1985; Gotoh A., Miyazawa K., Ohyashiki K., 1995).

В зависимости от локализации точек разрыва в генах BCR и ABL в результате рекомбинации могут формироваться разные варианты химерного онкогена. В более чем 95% случаев разрыв хромосомы 22 в гене BCR происходит в локусе М-Ъсг размером 5,8 тысяч пар нуклеотидов. В результате, область гена BCR, которая представляет собой участок последовательности от 5'-регуляторного региона (5'UTR BCR) до нетранслируемого региона, следующего за экзоном 13 (el3 также

обозначающийся как Ь2) или 14 (е14, ранее известный как ЬЗ), соединяется с последовательностью от нетранслируемого региона предшествующего экзону 2 гена ABL1 до его З'-нетранслируемой области (З1 UTR ABL1). Транскрипты данных вариантов гена BCR-ABL - Ь2а2 (е13а2) или Ь3а2 (е14а2) — кодируют синтез химерного белка, обладающего тирозинкиназной активностью с молекулярной массой 210 кД (так называемый вариант BCR-ABL р210 или M-bcr-abl). В более редких случаях возникают альтернативные варианты перестроек, чаще обусловленные различной локализацией разрывов в гене BCR. Так, реаранжировка с разрывом гена BCR между альтернативными экзонами 2 (локус т-Ьсг) приводит к формированию гена BCR-ABL ela2, кодирующего тирозинкиназу молекулярной массой 190 кД (BCR-ABL вариант р190, m-bcr-abl). Перестройка с разрывом между экзонами 19 и 20 гена BCR (ju-bcr) формирует ген BCR-ABL е19а2 и соответственно вариант BCR-ABL р230 {pi-bcr-abl). Описаны случаи более редких вариантов BCR-ABL траснкриптов, образующихся в результате разрывов генов BCR и ABL в нетипичных локусах. Например, разрывы гена BCR могут локализоваться в пределах интронов, лежащих вне локусов М-Ъсг, м-bcr или ¡и-Ьсг (Saussele S., Weisser A., Muller M.С. et al., 2000). В этом случае ген BCR сливается с геном ABL в локусе а2. Могут быть разрывы гена BCR, происходящие в пределах экзонов, с последующим объединением с геном ABL в локусе а2. Встречаются типичные разрыв гена BCR (M-bcr, м-bcr или ц-bcr) и слиянием с областями гена ABL, расположенными после экзона 2 - е6а2, ela3, Ь2аЗ, ЬЗаЗ. Тем не менее, все эти виды траснкриптов встречаются при XMJI с частотой не превышающей 1% (Groffen J., Stephenson J.R., Heisterkamp N., 1984; Мисюрин A.B., Аксенова E.B., Кругов A.A. 2007; Jinawath N„ Norris-Kirby A., Smith B.D. et al. 2009).

1.2. Биологические основы целенаправленной терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ

Всестороннее исследование ХМЛ (открытие реципрокной транслокации t(9;22) и гена BCR-ABL, детерминация ключевой роли BCR-ABL-тирозинкиназы в патогенезе ХМЛ) позволило приступить к разработке патогенетической терапии ХМЛ - поиску препарата целенаправленного действия. В начале поиска в качестве ингибиторов тирозинкиназ рассматривались вещества, полученнех из натуральных источников (изофлавиноид, генистеин, гербицин А, эрбстатин). Однако эти препараты не обладали достаточно специфическим действием.

Впервые в конце 80-х годов Yaish Р. с соавторами (Yaish P., Gazit А., Gilon С., Levitzki А., 1988) показали, что синтезированные вещества — тирфостины, обладают таргетным (целенаправленным) действием на BCR-ABL-тирозинкиназу. В экспериментах in vitro было показано, что данные соединения вызывают дифференцировку и гибель клеток BCR-ABL-позитивной клеточной линии, полученной от больных ХМЛ в фазе бластного криза.

В результате многолетнего поиска малых молекул, способных ингибировать ABL-киназу, используя данные о строении АТФ-связывающих центров тирозинкиназ, Brian Druker из Dana Farber Cancer Institute синтезировал препарат STI571 (signal trunsduction inhibitor), названный впоследствии иматинибом (Druker В.J., Tamura S., Buchdunger E. et al., 1996), который успешно ингибировал активность BCR-ABL— тирозинкиназы, стимулируя апоптоз опухолевых клеток при ХМЛ (Schindler Т. , Bornmann W., Pellicena P. et al., 2000).

Иматиниб (иматиниба мезилат) является производным 1Ч-фенил-2-пиримидинамина с формулой CH2S03H (Buchdunger Е., Zimmerman J., Mett H. et al., 1996). Данное соединение подавляет активность ABL-тирозинкиназ (р210 BCR-ABL, pi85 BCR-ABL, V-ABL, cABL). По своей конформации структура молекулы иматиниба соответствует АТФ-

связывающему участку тирозинкиназы (так называемому АТФ-связывающему карману). Взаимодействие АТФ с АТФ-связываюшим карманом приводит к активации BCR-ABL-тирозинкиназы, которая фосфорилирует множество эффекторных белков и передачу сигналов в клетке к ингибированию апоптоза, активации пролиферации и уменьшению адгезии опухолевых клеток. Конкурентное встраивание иматиниба в этот активный центр блокирует возможность связывания тирозинкиназы с АТФ и, тем самым, прекращает фосфорилирование эффекторных белков сигнальных путей (Druker B.J., Talpaz M., Resta D.J. et al., 2001; Lowe S.W., Cepero E., Evan G., 2004). В результате действия иматиниба происходит остановка пролиферации и индукция апоптоза в клетках, экспрессирующих BCR-ABL-тирозинкиназу (Oetzel С., Jonuleit Т., Götz A. et al., 2000). Высокая селективность иматиниба в качестве ингибитора BCR-ABL тирозинкиназы была подтверждена в ряде исследований, в которых было показано отсутствие его действия на серин-треонинкиназы, эпидермальный фактор роста (EGF) и очень низкая ингибирующая активность рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-R1 и VEGF-R2), протеинкиназ семейства Src (c-Src, c-Fgr, c-Lyn, Lck) и фактора роста фибробластов (FGF-R) Tie-2 (Tek), c-Met (Druker B.J., Tamura S., Buchdunger E. et al., 1996; Deininger M.W., Goldman J.M., Lydon N. et al., 1997; Gambacorti-Passerini C., le Coutre P., Mologni L. et al., 1997; Druker B.J., Talpaz M., Resta D.J., et al., 2001). Тем не менее, иматиниб ингибирует c-kit и ß-рецептор фактора роста тромбоцитов (PDGFR-ß) в тех же концентрациях, которые необходимы для ингибирования BCR-ABL тирозинкиназы.

В результате проведенных первых клинических исследований была показана беспрецедентно высокая эффективность лечения иматинибом больных XMJI в хронической фазе по сравнению со всеми предшествующими методами терапии XMJÏ (Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др., 2003; Ломана Е.Г., Огородникова Ю.С.,

Мартынкевич И.С., 2005; Зарицкий А.Ю., Ломана Е.Г., Виноградова О.Ю., 2007; Туркина А.Г., Виноградова О.Ю., Хорошко Н.Д., Воробьев А.И., 2008).

Высокая эффективность и безусловное превосходство таргетной терапии иматинибом хронического миелоидного лейкоза, а также её безопасность, были доказаны в "ключевом" рандомизированном сравнительном исследовании IRIS, а также в ряде других клинических исследований (Kantarjian Н., Sawyers С., Hochhaus A. et al., 2002; Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др., 2002; Kantarjian Н., Cortes J., O'Brien S. et al., 2003; O'Brien S., Guilhot F., Larson R. et al., 2003; Goldman J., Meló J., 2003; Peggs K., Mackinnon S., 2003; Kantarjian H., Cortes J., O'Brien S. et al., 2003).

Общая выживаемость пациентов, получающих иматиниб, на 7 лет наблюдений составила 86%, полный цитогенетический ответ (состояние, при котором цитогенетическое исследование клеток костного мозга Ph-хромосому не обнаруживает) был достигнут у 82% пациентов (O'Brien S.G., Guilhot F., Goldman J.M. et al., 2008).

1.3. Механизмы резистентности ХМЛ к терапии ингибиторами

тирозинкиназ

Высокая эффективность терапии ХМЛ иматинибом, тем не менее не исключает риска развития первичной или вторичной резистентности к терапии иматинибом, что предполагает необходимость регулярного цито генетического и/или молекулярно-генетического мониторинга динамики ответа на терапию и достигнутой ремиссии (Moravcova J., Lukasova М., Stary J. et al., 1998; Deininger M., Buchdunger Е., Druker В., 2005; Luzi D., Falchi L., Cambrin G.R. et al., 2007). Так, в хорошо контролируемом клиническом исследовании IRIS у больных ХМЛ, получавших терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки, признаки первичной резистентности (рефрактерности) наблюдались в достаточно

высоком проценте: полный гематологический ответ после 3 месяцев терапии не был достигнут в 4% случаев, большой цитогенетический ответ после 12 месяцев лечения не удалось получить в 16% случаев, полный цитогенетический ответ после 18 месяцев терапии не был получен у 23% пациентов (O'Brien S., Guilhot F., Larson R. et al., 2003).

Таким образом, несмотря на столь впечатляющую эффективность терапии XMJ1 иматинибом, существует проблема резистентности — приблизительно в 25-30% случаев XMJI при терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки наблюдается субоптимальный ответ или резистентность к получаемому лечению (O'Brien S., Guilhot F., Larson R. et al., 2003; Круглов С.С., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. 2007).

Резистентность к терапии иматинибом подразделяется на первичную резистентность (рефрактерность) и вторичную резистентность. Европейское общество по лечению лейкозов (ELN) разработало критерии выявления резистентности (Baccarani М. et al., 2009), согласно которым больной XMJI считается рефрактерным (первичная резистентность) к иматинибу в случаях отсутствия гематологического ответа после трех месяцев терапии, малого цитогенетического ответа (Ph-хромосома определяется в 35 — 65% клеток костного мозга) после 6 месяцев терапии, большого цитогенетического ответа (Ph-хромосома определяется менее чем в 35% клеток костного мозга) после 12 месяцев терапии, полного цитогенетического ответа (Ph-хромосома в клетках костного мозга не выявляется) после 18 месяцев терапии. Эти же рекомендации определяют вторичную (приобретенную резистентность) как утрату уже достигнутого гематологического, цитогенетического или молекулярного ответов, а также прогрессию XMJI в фазу акселерации и, затем, в фазу бластного криза (Radich J.P., Gooley Т., Bryant Е. et al., 2001; Merx К., Muller M.C., Kreil S. et al., 2002; Baccarani M., Saglio G., Goldman J. et al., 2006; Круглов C.C., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., 2007). H. Kantaijian и соавт. (Kantarjian Н., Giles F., Wunderle L. et al., 2006) рекомендуют повышение дозы

иматиниба таким пациентам с 400 мг/сутки до >600 мг/сутки и рассматривают их как резистентные в случае отсутствия эффекта после трех месяцев терапии иматинибом в повышенной дозе.

Считается, что в основе развития резистентности к терапии хронического миелоидного лейкоза иматинибом лежат несколько механизмов, которые подразделяются на: 1) BCR-ABL-зависимые; и 2) непосредственно не связанные с химерным онкопротеином, то есть BCR-ABL-независимые (Illmer T., Schaich M., Platzbecker U. et al., 2004; Kantarjian H., Talpaz M., Giles F. et al., 2006; Bixby D., Talpaz M., 2009). Среди механизмов резистентности, связанных с BCR-ABL тирозинкиназой, в первую очередь, следует отметить изменения нуклеотидной последовательности, в свою очередь приводящие к изменению аминокислотной структуры химерного онкопротеина, т.е. мутации гена BCR-ABL (Nardi V., Azam M., Daley G.Q., 2004). Немаловажное значение имеет и амплификация, т.е. появление дополнительных копий (экстракопий) гена BCR/ABL (LeCoutre P., Tassi Е., Varella-Garcia M. et al., 2000; Apperley JF., 2007; Куцев С.И., Вельченко M.B., 2008).

К не связанным с BCR-ABL механизмам резистентности можно отнести появление опухолевого клона с дополнительными хромосомными аберрациями (Nakai H., Misawa S., 1995; Marktel S., Marin D., Foot N. et al., 2003), активизация Bcr-Abl независимых сигнальных путей (в качестве примера можно указать активацию членов семейства Src киназ, усиливающих пролиферацию и подавляющих апоптоз лейкемических клеток), избыточное связывание иматиниба с транспортными белками крови (например, связывание иматиниба с сывороточным альфа-1-кислым гликопротеином приводит к повышению концентрации иматиниба в плазме крови и снижению его внутриклеточной концентрации), повышенную экспрессию белка множественной лекарственной резистентности Pgp (белок Pgp является клеточным "насосом",

выкачивающим из цитоплазмы лекарственные препараты), низкая приверженность пациента курсу проводимой терапии (Kuwazuru Y., Yoshimura A., Hanada S. et al., 1990; Kolomietz E., Al-Maghrabi J., Brennan S. et al., 2001; Gambacorti-Passerini C., Zucchetti M., Russo D., 2003; Ohmine K., Nagai T., Tarumoto T. et al., 2003; Thomas J., Wang L., Clark R.E., 2004; Домрачева E.B., Захарова A.E., Асеева E.A., 2005; Wilkinson G.R., 1996, 2005; Widmer N., Decosterd L.A., Csajka C., 2006; Мартынкевич И.С., Мартыненко JI.C., Иванова М.П., 2007; Picard S., Titier К., Etienne G. et al., 2007; Wang L., Giannoudis A., Lane S. 2008).

1.4. BCR-ABL зависимые механизмы резистентности XMJI

к терапии иматинибом 1.4.1. Амплификация гена BCR-ABL

Амплификация гена BCR-ABL рассматривается как один из механизмов развития нечувствительности опухолевого клона клеток при ХМЛ к терапии интерферонами (Collins S.J., Groudine М.Т., 1987). Тем не менее, роль амплификации гена BCR-ABL в развитии резистентности к ингибиторам тирозинкиназ у больных с ХМЛ отражена в ограниченном количестве публикаций.

Впервые M.E.Gorre с соавт. (Gorre М.Е., Ellwood-Yen К., Chiosis G. et al., 2002) обнаружили амплификацию гена BCR-ABL y 3 (33,3%) из 9 пациентов с резистентностью к иматинибу методом флуоресцентной гибридизации in situ. В дальнейшем A.Hochhaus (Hochhaus А., 2003) подтвердил данные M.E.Gorre с соавторами, обнаружив дополнительные копии гена BCR-ABL методом FISH у 2 (28,6%) из 7 обследованных пациентов с ХМЛ с первичной резистентностью. Интересно, что в данном исследовании амплификацию гена BCR-ABL не удалось обнаружить ни у одного из 25 больных ХМЛ с вторичной резистентностью (рецидивом).

Увеличение экспрессии гена BCR-ABL, в основе которой лежит амплификация гена или его повышенная транскрипция, впервые было

показано в экспериментах in vitro (Le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al. 2000, Mahon F.-X., Deininger M., Schultheis B. et al. 2000, Weisberg E., Griffïn J. 2000). В данных исследованиях были проведены преклинические исследования различных механизмов резистентности к иматинибу in vitro. Weisberg Е. и Griffïn J.D. (2000) использовали в своих исследованиях перевиваемую Ph-позитивную клеточную линию К562, полученную от пациента с ХМЛ в бластном кризе, и клеточную линию Ba/F3.p210, полученную в результате трансфекции с помощью вектора pGD комплементарной ДНК (кДНК) р210 BCR-ABL (Ь2а2) в нетрансформированные IL-3-зависимые гемопоэтические клетки мыши Ba/F3. Le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al.(2000) использовали в своей работе клеточную линию LAMA84, полученную от пациента с ХМЛ в бластном кризе и экспрессирующую белок BCR-ABL (Seigneurin D., Champelovier P., Mouchiroud G. et al., 1987). В работе Mahon F.X., Deininger M.W., Schultheis B. et al. (2000) использована клеточная линия Baf7BCR-ABL-r, созданная аналогично линии Ba/F3.p210, а также 9 BCR-ABL -позитивных клеточных линий человека К562, KYOl, LAMA84, ЕМ2, ЕМЗ, BV173, AR230, KU812, and KCL22. С целью получения иматиниб-резистентных клеточных линий во всех экспериментах клеточные линии культивировались в условиях постепенно, в течение нескольких месяцев повышаемой дозы иматиниба. В результате, у Weisberg Е. и Griffin J.D. (2000) только в резистентных Ba/F3.p210 клетках, у Le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al. (2000) в полученной через шесть месяцев культивирования резистентной линии LAMA 84R, у Mahon F.X., Deininger M.W., Schultheis В., et al. (2000) в клеточных линиях Baf/BCR-ABL-r, LAMA84-r, and AR230-r, была обнаружена амплификация гена BCR-ABL, повышенная экспрессия BCR-ABL транскрипта и, как следствие, 4-10-кратное увеличение уровня BCR-ABL белка. В работе Le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al..(2000) FISH анализ с BCR и ABL специфическими зондами показал амплификацию в среднем до 13-14

копий гена BCR-ABL на клетку. По мнению Weisberg Е. и Griffin J.D. (2006) механизмы амплификации гена BCR-ABL не вполне понятны. Авторы считают, что ген BCR-ABL может амплифицироваться in situ, интрахромосомно, с помощью механизма повторяющихся циклов разрыва-слияния, при котором разрывы хромосом возникают в сайтах фрагильности. Интрахромосомная амплификация генов обычно связана с "гомогенно окрашивающимися регионами" (homogeneously staining regions HSR) определенных хромосом. Другой возможный механизм амплификации гена связан с экстрахромосомным накоплением генетического материала в форме double minute (DB) хромосом (Coquelle A., Toledo F., Stern S., Bieth A., Debatisse M., 1998). DB хромосомы являются ацентрическими и ателомерными фрагментами хроматина, состоящего из циркулярно организованной ДНК, которые встречаются в клетках определенных видов опухолей человека. В большинстве случаев, однако, амплификация генов накоплением DB хромосом не известна.

Таким образом, по данным Le Coutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al., 2000; Mahon F.X., Deininger M.W., Schultheis В. et al., 2000; Weisberg E., Griffin J.D., 2000, полученным в экспериментах in vitro, оверэкспрессия BCR-ABL мРНК и BCR-ABL белка, в основе которой лежит амплификация гена или его повышенная транскрипция, является одним из наиболее важных механизмов развития резистентности к иматинибу.

Тем не менее, роль амплификации гена BCR-ABL в развитии первичной и вторичной резистентости до конца не определена. В литературе нет данных о влиянии размера клонов опухолевых клеток с амплификацией на развитие нечувствительности опухолевых клеток к ингибиторам триозинкиназ. Не изучена динамика опухолевых клеток с дополнительными копиями гена BCR-ABL.

1.5.2. Мутации гена BCR-ABL

Большинство исследователей резистентности XMJI к ингибиторам тирозинкиназ считают, что наиболее частой и клинически значимой причиной развития нечувствительности пациентов к иматинибу и другим ингибиторам тирозинкиназ являются точечные мутации гена BCR-ABL (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2003; Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2002; Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al., 2002; Gambacorti-Passerini C., Gunby R., Piazza R. et al., 2003; Kreill S., Mueller M., Hanfstein В. et al., 2003; Shah N., Sawyers С., 2003; AI-Ali H., Heinrich M., Lange T. et al., 2004; . Hochhaus A., La Rosee P., 2004). Точечные мутации гена BCR-ABL приводят к замене аминокислот в белке Bcr-Abl и, как следствие, изменению конформации белка или структуры активного центра Bcr-Abl киназы. Замена аминокислот обусловливает неспособность иматиниба эффективно связываться с активным центром Bcr-Abl тирозинкиназы и оказывать на нее ингибирующее действие.

Мутации слитного гена BCR-ABL впервые были выявлены в работе M. Gorre и соавт. (Gorre M., Mohammed M., Ellwood К. et al., 2001) методом прямого секвенирования кДНК. Авторы статьи показали, что эти мутации могут вызывать изменение посдовательности аминокислот в тирозинкиназе и обусловливать резистентность к иматинибу. Наиболее часто выявляемой в данном исследовании была мутация ТЗ151, которая была обнаружена у 6 из 9 больных ХМЛ в хронической фазе, нечувствительных к терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Все 9 обследованных пациентов имели признаки вторичной резистентости, поскольку в начале терапии иматинибом достигли полного цитогенетического ответа, а затем утратили его на фоне продолжающегося лечения. Авторы этой работы показали, что замена треонина на изолейцин в 315 положении белка Bcr-Abl, наблюдаемая при мутации ТЗ 151, приводит к нарушению водородной связи, которая устанавливается между иматинибом и киназным доменом Bcr-Abl тирозинкиназы. В результате

при этой мутации наблюдается активация Bcr-Abl опосредованных сигнальных путей даже на фоне высоких доз иматиниба. Интересно, что обнаружение одинаковой мутации более чем в 60% изученных случаев, вызвало недоверие ряда гематологов (Barthe С., Cony-Makhoul P., Melo J.V. et al., 2001; Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al., 2001), проводивших аналогичные исследования на группах резистентных пациентов. Однако, последующие исследования подтвердили точку зрения M. Gorre и соавт. (Mohammed M., Ellwood К. et al., 2001).

Последующие исследования показали, что частота возникновения мутаций гена BCR-ABL, обусловливающих резистентность к терапии XMJI иматинибом, зависит от фазы заболевания . Результаты исследования GIMEMA (итальянской рабочей группы по XMJI) показали, что среди 297 больных ХМЛ с первичной и вторичной резистентностью к иматинибу мутации гена BCR-ABL были выявлены у 127 (43%) (Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al. 2006). В данной работе отчетливо показано, что частота обнаружения мутаций зависит от фазы ХМЛ: в хронической фазе мутации обнаружены у 27% пациентов, в фазе акселерации — у 52 % пациентов, у пациентов с миелоидным бластным кризом - в 75 % случаев и у больных с лимфоидным бластным кризом — в 85% случаев. Также в этой работе показано, что мутации являются причиной резистентности к иматинибу у 30% пациентов с рефрактерностью к иматинибу и в 57% случаев рецидива (приобретенной резистентности к иматинибу).

В настоящее время спектр мутаций гена BCR-ABL включает более 90 точечных мутаций киназного домена гена BCR-ABL (Branford S., 2007), обусловливающих резистентность к иматинибу. Эти мутации приводят к замене одной из 53 аминокислот в белке тирозинкиназы Bcr-Abl. Частота обнаружения различных мутаций у резистентных к иматинибу пациентов с ХМЛ неодинакова. T.Hughes и соавт. (2006) проанализировали данные 20 опубликованных работ, посвященных исследованию мутационного статуса гена BCR-ABL в 245 случаях у резистентных к иматинибу больных ХМЛ и

пациентов с Ph-позитивным острым лимфобластным лейкозом (219 больных с XMJI и 26 - с Ph-позитивным острым лимфобластным лейкозом). По данным T.Hughes и соавт. (2006), чаще всего встречаются мутации E255K/V и М351Т, а также мутация ТЗ151, устойчивая не только к иматинибу, но и к ингибиторам тирозинкиназ второго поколения (рис. 1) (Hudges T., Saglio G., Branford S. et al., 2009; M.Mtiller, J.Cortes et al. 2009; Shah N., 2009) По данным итальянской рабочей группы GIMEMA (Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al., 2006), наиболее частыми мутациями при резистентных случаях XMJ1 являются мутации M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, ТЗ 151, М351Т и F359V, которые составляют 85% всех мутаций, ассоциированных с резистентностью к иматинибу.

Аминокислоты в кннашом домене белка BCR-ABL

Рисунок 1. Частота мутаций киназного домена гена BCR-ABL. Частота мутаций <2% обозначена на диаграмме столбцами серого цвета, частота мутаций 2-10% - столбцами синего цвета, частота >10% - столбцами красного цвета. В кружочках указаны аминокислоты, на которые происходит замена в результате обозначенной мутации. (Hughes Т., Deininger М., Hochhaus А. et al., 2006).

Вопрос о причинах появления мутаций киназного домена гена BCR-ABL на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ остается открытым до сих пор (Chu S., Xu H., Shah N.P., 2004). По мнению большинства исследователей, возникновение мутаций отражает процесс эволюции заболевания (Griswold IJ, MacPartlin M, Bumm T, et al., 2006; O'Hare T., Eide C.A., Deininger M., 2007). При этом иматиниб не обладает мутагенным эффектом. В частности, эту гипотезу подтверждает тот факт, что частота выявления мутаций киназного домена гена В CR-ABL существенно выше на продвинутых фазах XMJI (в фазах акселерации и бластного криза), чем в хронической фазе (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2003; Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al., 2006). Более того, частота мутаций увеличивается в отдаленные сроки терапии иматинибом больных XMJ1.

Среди механизмов возникновения мутаций гена BCR-ABL в качестве наиболее вероятного рассматривается повышенная активность белка Всг-АЫ, индуцирующего оксидативный стресс (Sattler M., Verma S., Shrikhande G. et al., 2000). Тирозинкиназа Bcr-Abl индуцирует повышенное образование свободных радикалов кислорода, обусловливающих геномную нестабильность в Bcr-Abl трансформированных клетках. Таким образом, активные формы кислорода, обладающие мутагенным действием, индуцируют мутации гена BCR-ABL. Данное обстоятельство подтверждает прямую зависимость между экспозицией воздействия Bcr-Abl тирозинкиназы, обладающей повышенной активностью, и вероятностью возникновения мутаций гена BCR-ABL, а также амплификации этого гена, клональной цитогенетической эволюции, сопровождающейся появлением дополнительных хромосомных перестроек, и прогрессией заболевания (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. , 2003; Marktel S., Marin D., Foot N. et al., 2003; Donato NJ, Wu JY et al., 2003; Willis S.G, Lange T., Demehri S. et al., 2005;). В этой связи становится очевидным, что чем быстрее пациенту с ХМЛ будет назначена терапия ингибиторами тирозинкиназ, тем меньше риск появления клона

опухолевых клеток с мутаций гена BCR-ABL, дополнительными хромосомными аберрациями, и, следовательно, прогрессии заболевания (Wang L., Pearson К., Ferguson J.E. et al., 2003; O'Hare T., Eide C.A., Deininger M., 2007).

В различных исследованиях частота мутаций киназного домена гена BCR-ABL у пациентов с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ колеблется между 50-90 % случаев XMJI. Данные различия могут быть обусловлены многими причинами, в частности - разными фазами заболевания, различиями в механизмах формирования первичной и вторичной резистентности. Одной из очевидных причин является различие методов, использованных в разных исследованиях для выявления мутаций гена BCR-ABL, отличающихся по своей чувствительности.

Наиболее часто исследование мутаций гена BCR-ABL у резистентных пациентов с XMJI проводилось методом прямого секвенирования кДНК, который позволяет получить данные о нуклеотидной последовательности всего участка гена BCR-ABL, кодирующего киназный домен тирозинкиназы (Baccarani M., Pane F., Saglio G., 2008). После выделения тотальной РНК и проведения реакции обратной транскрипции, из полученной кДНК двухэтапно амплифицируют (РТ-ПЦР) участок гена BCR-ABL, кодирующий киназный домен, и затем его секвенируют (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al., 2002; Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S., Buchdunger E., Pascal F. et al., 2002; Roche-Lestienne C., Soenen-Cornu V., Grardel-Duflos N. et al., 2002). Одна группа исследователей считает, что данный классический подход к анализу мутационного статуса больных XMJT характеризуется серьезным недостатком — довольно низкой чувствительностью (10-20%), которая может обусловливать появление ложноотрицательных результатов (Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al., 2002). Однако, по мнению других исследователей, выявление только больших клонов (не менее 20%) с

мутациями гена BCR-ABL имеет неблагоприятное прогностическое значение (Baccarani M., Pane F., Saglio G., 2008).

Наиболее точным методом для определения размера мутантного клона опухолевых клеток при XMJÏ рассматривается метод, предложенный N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al., 2002). Авторы, используя РТ-ПЦР, амплифицировали мРНК, выделенную из костного мозга или крови пациентов с XMJI, ПЦР ампликоны клонировались и затем 10 различных ПЦР продуктов от каждого пациента секвенировались. В том случае, если мутации выявлялись в двух разных клонах, полученных от пациента, мутации гена BCR-ABL считались обнаруженными, а мутантные клоны составляли примерно 20% от общего пула BCR-ABL мРНК транскрипта. Авторы данной работы исследовали 32 случая вторичной резистентности у пациентов с ХМЛ, утративших гематологический ответ на терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. В данном исследовании мутации были обнаружены в 90% случаев (29 пациентов из 32).

Наиболее чувствительным методом детекции мутаций гена BCR-ABL считается аллель-специфическая ПЦР, позволяющая выявить одну мутантную последовательность на 1-10 тысяч клеток. Одним из основных недостатков аллель—специфической ПЦР является невозможность исследовать весь ген BCR-ABL: в настоящее время известно более 90 мутаций гена BCR-ABL, а в одной реакции АС-ПЦР можно выявить только одну специфическую мутацию. Чувствительность АС-ПЦР составляет 0,1-0,01% и, действительно, позволяет выявлять низкопроцентные клоны с мутациями, в частности — до начала терапии ингибиторами тирозинкиназ. Эти случаи, так же как и появление на фоне терапии мутаций киназного домена гена BCR-ABL в небольшом проценте клеток, не имеют определенной клинической интерпретации (Baccarani M., Pane F., Saglio G., 2008). Действительно, аллель-специфическая ПЦР позволяет иногда выявить мутации киназного домена в небольшом проценте клеток даже до начала терапии ингибиторами тирозинкиназ. У

некоторых больных ХМЛ на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ наблюдается селекция мутантных клонов опухолевых клеток, резистентных к терапии. По видимому, клоны клеток с мутациями гена BCR-ABL приобретают некоторое преимущество в росте в условиях "давления" ингибиторов тирозинкиназ (Roche-Lestienne С., Soenen-Cornu V., Grardel-Duflos N. et al., 2002). Однако, у других пациентов с ХМЛ не наблюдается на фоне терапии экспансия низкопроцентного клона клеток с мутацией, выявленной до начала терапии. Описаны случаи, когда на этапе диагностики ХМЛ в лейкозных клетках выявлялась панрезистентная мутация ТЗ151. Тем не менее, на фоне терапии ингибиторами тирозинкиназ наблюдалась редукция как мутантного, так и обычного опухолевых клонов (Willis SG, Lange Т, Demehri S. et al., 2005; Khorashad J., Anand M., Marin D. et al., 2006). По-видимому, для прогрессии опухолевого клона, несущего мутацию гена BCR-ABL, необходимы какие-то дополнительные факторы. Некоторые авторы предполагают, что в некоторых случаях ХМЛ мутации гена BCR-ABL возникают в более дифференцированных клетках лейкемического пула и постепенно элиминируются, тогда как гемопоэз лейкозных клеток поддерживается стволовыми клетками (Sorel N., Bonnet M.L., Guillier M. et al., 2004; O'Hare T., Eide C.A., Deininger M., 2007).

Одним из новых методов, который внедрен в практику в последние годы, является метод денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (дВЭЖХ). Хроматографический метод используется для скрининга мутаций гена BCR-ABL. В случае обнаружения изменения хроматограммы в последующем проводится подтверждение наличия мутации методом ДНК секвенирования. Этот подход занимает промежуточное положение между прямым ДНК секвенированием и аллель-специфической ПЦР по своей чувствительностью так как его чувствительность составляет 1-5% (Deininger M., McGreevey L., Willis S. et al. 2004). Обладая довольно высокой чувствительностью, этот метод

позволяет определять весь спектр мутаций гена BCR-ABL (Soverini S., Martinelli G., Amabile M. et al. 2004).

N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al. 2002), H. Kantarjian и соавт. (Kantarjian H., Talpaz M., Giles F. et al. 2006) предложили классфицировать мутации гена BCR-ABL, основываясь на данных по изменению конформации белка Bcr-Abl. Согласно этим представлениям мутации гена BCR-ABL можно разделить на мутации, препятствующие взаимодействию Bcr-Abl киназы и иматиниба, но не изменяющие конформацию белка Bcr-Abl, и мутации, нарушающие аффиность иматиниба вследствие конформационных изменений белка Bcr-Abl. К первой группе относятся, например, мутации ТЗ151, F317L, F359V, при которых замена одной из 20 аминокислот иматиниб-связывающего активного центра киназного домена Bcr-Abl приводит к уменьшению афинности иматиниба к Bcr-Abl или ингибированию пространственного связывания иматиниба.

Ко второй группе относят мутации, измняющие конформацию белка Bcr-Abl. Это, например, мутации M244V, G250E, G252H/R, Y253F/H, Е255К, М351Т, E355G, V379I, L387M, H396R) (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002, Azam M., Latek R., Daley G.Q. 2003).

Белок Bcr-Abl тирозинкиназа в своей структуре имеет 2 гибкие петли — Р-петлю, связывающую АТФ, и А-петлю (активационную петлю). При неактивной конформации Bcr-Abl тирозинкиназы Р- и А-петли занимают специфичное, стабилизирующее структуру белка пространственное расположение. Иматиниб конкурентно взаимодействует с АТФ-связывающим доменом и устанавливает водородные связи с 21 аминокислотой, образующих киназный домен Bcr-Abl тирозинкиназы. Важно, что иматиниб вазимодействует только с неактивной формой Bcr-Abl киназы, характеризующейся тем, что А-петля закрывает каталитический центр. Мутации гена BCR-ABL, кодирующих Р- и А-петли, приводят к дестабилизации расположения петлевых структур. В

результате этих изменений киназа не способна перейти в неактивную пространственную организацию, необходимую для связывания с иматинибом (Jakob R.E.. Dumitrescu Т.Р. el al., 2009)

Также правомочно классифицировать мутации по месту их расположения в различных частях киназного домена Bcr-Abl (Deininger M., Buchdunger E., Druker B. 2005). В киназном домене Bcr-Abl тирозинкиназы можно выделить те же регионы, что и в киназном домене нормальной Abi тирозинкиназы: Р-петлю (АТФ-связывающий карман), IP-домен («промежуточную» последовательность), С-домен (каталитический домен) и A-петлю (активационная петля).

Р-петля образована аминокислотами, занимающими в белке Abi позиции с 244 по 255. Функция это гибкой структуры заключается в связывании тирозинкиназы с молекулой АТФ в нормальном белке Abi. При конкурентном связывании с Р-петлей иматиниба образуются водородные связи между аминокислотами Y253 и N322 белка Bcr-Abl. Мутации, затрагивающие аминокислоту в положении Y253, приводят к нарушению водородной связи между аминокислотами Y253 и N322 (Deininger M., Buchdunger E., Druker В., 2005). В других случаях мутации участка гена BCR-ABL, кодирующего Р-петлю, могут нарушать механизм адаптации белка Bcr-Abl для связывания с иматинибом (Cowan-Jacob S., Guez V., Fendrich G. et al. 2004). Кроме того, эти мутации могут нарушать механизмы регуляции, существующими для нормальной Abi тирозинкиназы. Например, мутация Y253F приводит к ограничению взаимодействия Abi домена с ингибиторами. Как следствие, при этой мутации наблюдается повышение активности Bcr-Abl тирозинкиназы по сравнению с немутантной формой Bcr-Abl тирозинкиназы (Roumiantsev S., Shah N., Gorre M. et al. 2002).

В результате мутации E255V/K происходит замена глутамина на валин или лизин в положении 255. Впервые эта мутация была описана С. Batrhe и соавт. (Barthe С., Cony-Makhoul Р., Meló J.V. et al. 2001), которые

\

при исследовании мутационного статуса у 12 пациентов с XMJ1 и OJ1JI с признаками вторичной резистентности, развившейся на фоне терапии иматинибом. Эта же мутация была обнаружена у одного из 32 пациентов с XMJI с первичной резистентностью (рефрактерностью) к терапии

с

иматинибом A.Hochhaus и соавт. (Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. 2001). Эти авторы, используя функциональный тест, продемонстрировали реактивацию Bcr-Abl тирозинкиназы на фоне терапии иматинибом при мутации E255V.

К второй группе мутаций относят, например, мутацию ТЗ151, приводящую к замене треонина на изолейцин. Треонин в положении ТЗ 15 в немутантном белке Bcr-Abl тирозинкиназы образует водородные связи с иматинибом. Мутация T315I и соответствующая замена аминокислот нарушают пространственное взаимодействие тирозинкиназы с иматинибом и препятствуют образованию водородной связи с иматинибом (Gorre M., Mohammed M., Ellwood К. et al. 2001). К этой же группе относятся мутации, приводящие к замене фенилаланина в положении F317, также участвующего в связывании иматиниба посредством водородных связей.

К третьей группе относится довольно часто встречающаяся мутация М351Т. Метионин, находящийся в положении 351, в норме контактирует с SH2 доменом Abi тирозинкиназы, приводя к стабилизации неактивной конформации Abi тирозинкиназы. Таким образом, нарушение связи между между киназным доменом и SH2 доменом ослабляет аутоингибирование Bcr-Abl тирозинкиназы, которое обычно частично сохраняется. При этом наблюдается константная активация Bcr-Abl тирозинкиназы и иматиниб не может связаться, так он взаимодействует только с неактивной формой Bcr-Abl тирозинкиназы (Hantschel О., Nagar В., Guettler S. et al. 2003).

Четвертая группа мутаций локализована в А-петле, образованной аминокислотами в положении с 381 по 402. Функция А-петли заключается в регулировании киназной активности Abi тирозинкиназы. Так, активация киназы сопровождается «открытой» позицией А-петли, при которой она

расположена вдали от каталитического центра киназы, а ингибирование — расположением А-петли вблизи активного центра. Мутации участка гена BCR-ABL, кодирующего А-петлю, приводят к трансформации киназы в ее активную конформацию, что препятсвует связыванию с иматинибом.

Мутации, локализованные в участках гена BCR-ABL, кодирующего Р-петлю, IP-домен, С-домен, А-пелю, рассматриваются как мутации в «горячих точках». Однако, мутации наблюдаются и в других локусах гена BCR-ABL, кодирующих киназный домен. Тесты чувствительности мутантных форм Bcr-Abl тирозинкиназы к иматинибу в экспериментах in vitro показали, что некоторые из этих мутаций обусловливают лишь невысокий уровень нечувствительности к иматинибу (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003). Наиболее вероятно, что in vivo эти мутации обусловливают резистентность к иматинибу только в случае вовлечения каких либо дополнительных механизмов развития резистентности. Например мутации F317L и F359V чаще всего обусловливают высокий уровень резистентности только в тех случаях, когда эти мутации сочетаются другими мутациями. Клинические наблюдения показали, что при этих мутациях повышение дозы иматиниба зачастую позволяет преодолеть резистентность и достич цитогенетической ремиссии.

Локализация мутаций в различных участках гена BCR-ABL обусловливает различную степень изменения функциональной активности киназного домена Bcr-Abl тирозинкиназы и разную степень нечувствительности киназы к иматинибу. Тем не менее, данные о значимости мутаций с различной локализацией для прогнозирования эффективности терапии иматинибом, их потенциальной роли в прогрессии заболевания и выживаемости пациентов с ХМЛ противоречивы (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. 2003, Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al. 2002, Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. 2002).

Для клинической практики наибольшее значение имеют данные о чувствительности мутантных форм белка Bcr-Abl к иматинибу,

позволяющие классифицировтаь мутации гена BCR-ABL по сообщаемой ими степени резистентности (Von Bubnoff N., Schneller F., Peschel C. et al., 2002; Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003). Данный подход можно рассматривать как функциональную классификацию мутаций, среди которых выделяют значительно, умеренно или незначительно снижающие чувствительность Bcr-Abl киназы к иматинибу в тестах in vitro.

Для оценки влияния различных мутаций на связывание иматиниба с Bcr-Abl киназой используются биохимический и пролиферативный тесты. Биохимический тест определения киназной активности - определяется фосфорилирующая активность изолированной мутантной формы Abi киназы в присутствии различных концентраций иматиниба in vitro. Пролиферативный тест - оценка пролиферативной активности клеточных линий, несущих мутантную форму Abi киназы, в присутствии различных концентраций иматиниба in vitro.

Чувствительность к иматинибу в биохимическом и пролиферативном тестах определяется показателем IC50 (inhibitor concentration 50%) -концентрацией иматиниба, снижающей активность фермента АЫ на 50% в биохимическом тесте и уменьшающей индекс пролиферации Ph позитивных клеточных линий in vitro на 50%.

Роль мутаций, которые выявляются у пациентов, резистентных к иматинибу, обязательно оценивается в тестах in vitro. В этих исследованиях подтверждается связь этих мутаций с резистентностью к иматинибу доказана в экспериментах in vitro измерением показателя IC50 в пролиферативном и биохимическом тестах.

В результате исследований выявлено, что степень чувствительности к иматинибу при различных мутациях варьирует, но всегда наблюдается повышение уровня 1С5о- Однако, если для одних мутаций (например, ТЗ151; Е255К) значения IC50 достоверно коррелируют с клиническим течением заболевания, то для других мутаций клиническое значение этого показателя лишь относительно (Laneuville Р, Dilea С, Yin OQ, et al., 2010).

Именно поэтому роль ряда мутаций в развитии резистентности к иматинибу остается не совсем ясной (Soverini S., Rosti G. et al., 2011).

Тем не менее, существующие данные об ингибирующей активности иматиниба и других ингибиторов тирозинкиназ в пролиферативном и биохимическом тестах in vitro являются единственными, позволяющими охарактеризовать чувствительность к иматинибу Bcr-Abl киназы с наиболее частыми мутациями и их реальную роль в развитии резистентности.

Фосфорилирующая активность АЫ киназного домена с мутацией M244V, обусловливающей замену метионина в 244 положении на валин, незначительно отличается от активности Abl-киназы дикого типа (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002, Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. 2002). Однако, анализ чувствительности в тесте на пролиферативную активность, выполненный A. Corbin и соавт. (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003) показал увеличение IC50 в 3,2 раза, а в работе Т. O'Hare и соавт. (O'Hare Т., Eide С.А., Deininger M. 2007) было выявлено увеличение IC50 в 8 раз, что свидетельствует о снижении чувствительности к иматинибу и о роли этой мутации в развитии резистентности к иматинибу. По мнению А. Corbin и соавт. (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003), клинический ответ может быть восстановлен у рецидивировавших пациентов с мутацией M244V назначением более высоких доз иматиниба. Однако, данные Т. O'Hare и соавт. (O'Hare Т., Eide С.А., Deininger M. 2007) четко указывают на необходимость использования новых ингибиторов тирозинкиназ при обнаружении данной мутации у резистентных пациентов.

Мутация L248R (замена лейцина на аргинин в 248 положении) обусловливает развитие высокого уровня резистентности, о чем свидетельствуют повышение IC50 в тесте на пролиферативную активность более чем в 30 раз (Burgess M., Skaggs В., Shah N. et al. 2005).

Мутация G250E (замена глицина в 250 положении на глутаминовую кислоту) характеризуется высоким уровнем повышения IC50 - в 25 раз в тесте определения чувствительности к иматинибу пролиферативной активности BCR-ABL экспрессирующих клеточных линий и более чем в 10 раз в биохимическом тесте (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002, O'Hare T., Eide C.A., Deininger M 2007, Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003). Полученные данные свидетельствуют о роли мутации G250E в развитии резистентности к иматинибу.

Мутация Q252H, по данным N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002), приводит к умеренному снижению чувствительности в биохимическом тесте, в связи с чем повышение дозы иматиниба в клинической практике должно приводить к преодолению резистентности к нему. Так, в тестах in vitro биохимическая чувствительность к иматинибу восстанавливалась при концентрации препарата 1-4 мкМоль.

Мутация Y253F/H, приводящая к замене тирозина в 253 положении на фенилаланин или гистидин, по данным S. Roumiantsev и соавт. (Roumiantsev S., Shah N., Gorre M. et al. 2002), N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al. 2002), ассоциирована с промежуточным уровнем резистентности к иматинибу. S. Roumiantsev и соавт. (Roumiantsev S., Shah N., Gorre M. et al. 2002) утверждают, что повышение дозы иматиниба позволяет преодолеть резистентность к иматинибу, возникающую при мутации Y253F. По крайней мере, в экспериментах in vitro активность Abi киназы с мутацией Y253F удавалось значительно снизить при концентрации иматиниба 5 мкМоль, то есть при том уровне, который на основе фармакокинетических данных достигался у пациентов в I фазе клинических исследований иматиниба. Однако по данным М. Burgess и соавт. (Burgess M., Skaggs В., Shah N. et al. 2005), T. O'Hare и соавт. (O'Hare T., Eide C.A., Deininger M. 2007) мутация Y253H приводит к значительному увеличению IC50 в пролиферативном тесте (более чем в 30 раз) и в биохимическом тесте на фосфорилирующую активность (в 18 раз).

При этих показателях IC50 трудно ожидать эффекта от эскалации дозы иматиниба.

Замена глутаминовой кислоты в позиции 255 на лизин (мутация Е255К) ассоциируется с высокой степенью резистентности к иматинибу. В тестах на биохимическую активность изолированной мутантной Abi киназы и пролиферативную активность BCR-ABL экспрессирующих клеточных линий наблюдается значительное увеличение IC50 соответственно в 200 и 15-33 раз по сравнению с диким типом АЫ (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002, O'Hare T., Eide C.A., Deininger M. 2007, Burgess M., Skaggs В., Shah N. et al. 2005). В случае мутации Е255К данные тестов in vitro достоверно коррелируют с клиническим значением этой мутации в развитии резистентности к иматинибу и отсутствием эффекта от повышения дозы иматиниба у пациентов с ХМЛ (Soverini S., Martineiii G., Rosti G. et al. 2005).

По мнению A. Corbin и соавт. (Corbin A., Buchdunger E., Pascal F. et al. 2002) другие мутации в киназном домене гена BCR-ABL, приводящие к замене аминокислот в Р-петле, приводят к более чем умеренному снижению чувствительности к иматинибу. Однако по неясным причинам пациенты с мутациями в Р-петле имеют особенно плохой прогноз по сравнению с пациентами, обладающими другими типами мутаций (Soverini S., Martineiii G., Rosti G. et al. 2005).

Интересны мутации V299L (замена валина в 299 положении на лейцин) и F311L (замена фенилаланина в 311 позиции на лейцин), поскольку их роль в развитии клинической резистентности к иматинибу установлена определенно, но в тестах in vitro показано увеличение IC50 всего лишь в 2-3 раза, и клеточные линии сохраняют высокую чувствительность к иматинибу (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002, O'Hare T., Eide C.A., Deininger M. 2007, Burgess M., Skaggs В., Shah N. 2005). Нет сомнений в том, что при обнаружении этих мутаций у пациентов с признаками резистентности показано повышение дозы

иматиниба до 600-800 мг/сутки. Пациенты с мутацией F311L достигали гематологической ремиссии даже на стандартной терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки, несмотря на то, что клон клеток с этой мутацией увеличивался в процессе лечения (Roche-Lestienne С., Soenen-Cornu V., Grardel-Duflos N. et al. 2002).

Водородные связи между иматинибом и Bcr-Abl киназой устанавливаются с 21 аминокислотой, включая треонин в 315 положении (Т315), фенилаланин в 317 (F317) и 359 (F359) положениях (Nagar В., Bornmann W., Pellicena P. et al. 2002). Поэтому значение мутациий, затрагивающих "точки" контакта иматиниба и Bcr-Abl киназы, особенно велико.

По современным данным, мутация T315I, приводящая к замене треонина в 315 положении на изолейцин, обусловливает практически полное отсутствие чувствительности к иматинибу и высочайшую степень резистентности у пациентов с XMJI (Gorre M., Mohammed M., Ellwood К. et al. 2001, Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al. 2002, Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al. 2006, Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003, Burgess M., Skaggs В., Shah N. Et al. 2005, Soverini S., Martinelli G., Rosti G. et al.2005, Corbin A., Buchdunger E., Pascal F. et al. 2002, O'Hare T., Walters D., Stoffregen E. et al. 2005). Чувствительность снижается более чем в 200 раз по данным биохимического теста фосфорилирующей активности изолированной АЫ киназы и более чем в 33 раза по данным теста на пролиферативную активность по сравнению с чувствительностью к иматинибу АЫ тирозинкиназы "дикого" типа (Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003). Резистентность к иматинибу при этой мутации гена BCR-ABL невозможно преодолеть эскалацией дозы иматиниба, так же как и терапией ингибиторами тирозинкиназ второго поколения. Поэтому при наличии совместимого донора пациентам с мутацией T315I показана аллогенная трансплантация костного мозга практически безальтернативно.

В случае другой мутации, затрагивающей треонин в 315 положении - Т315А (замена треонина на аланин), наблюдается лишь незначительное, в 2-4 раза повышение IC50 в тестах in vitro, сохранение высокой чувствительности к иматинибу и преодоление резистентности повышением дозы иматиниба (Burgess M., Skaggs В., Shah N. et al. 2005).

Мутация F317L/V, приводящая к замене фенил ал анина в 317 положении на лейцин или валин, идентифицирована у небольшого количества пациентов с резистентностью к иматинибу и ее появление обычно коррелирует не с первичной резистентностью, а с утратой цитогенетического ответа на фоне изначально успешной терапии иматинибом (Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. 2002, Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al. 2002). По современным данным, мутация F317L/V приводит к умеренному снижению чувствительности к иматинибу. Чувствительность мутантной Abi киназы примерно в 8,3 раза меньше чувствительности Abi киназы дикого типа по фосфорилирующей активности и в 2,6-13 раз по пролиферативной активности (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003). По некоторым данным, пациенты с мутацией F317L/V характеризуются умеренной резистентностью к иматинибу, в связи с чем повышение дозы препарата должно приводить к преодолению резистентности (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002). По другим данным, преодоление резистентности путем увеличения дозы иматиниба в случае мутации F317L невозможно.

Мутация М351Т, по данным N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002), T. O'Hare и соавт. (O'Hare Т., Walters D., Stoffregen E. et al. 2005) приводит к умеренному снижению чувствительности к иматинибу в тестах in vitro, которая восстанавливается при концентрации препарата in vitro 1-4 мкМоль (концентрация 4 мкмМоль соответствует суточной дозе иматиниба 800 мг/сутки). N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002), S. Soverini и соавт. (Soverini S., Martinelli G., Rosti G. et al. 2005), T. Ernst и соавт. (Ernst T., Erben P., Müller M. et al. 2008)

считают, что терапия высокими дозами иматиниба приведет к преодолению резистентности. Однако более эффективно результат достигается при применении ингибиторов тирозинкиназ второго поколения.

Мутация E355G (замена глутаминовой кислоты в 355 положении на глицин) не изменяет чувствительности к иматинибу киназного домена АЫ в биохимическом и пролиферативном тестах, по данным A. Corbin и соавт. (Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003), что, по мнению авторов не предполагает участие этой мутации в развитии рецидивов. Однако N. Shah и соавт. (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002) выявили умеренное, 4-8 кратное увеличение IC50 в тесте пролиферативной активности, что свидетельствует о роли этой мутации в развитии резистентности к иматинибу, которую, наиболее вероятно, возможно преодолеть назначением высоких доз препарата.

Мутация F359V (замена фенилаланина в 359 положении на валин) нарушает водородные связи между пиперазиновым кольцом иматиниба и АЫ киназой и наблюдается изредка у пациентов с ХМЛ в рецидиве (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002). F359V мутация вызывает слабое снижение чувствительности к иматинибу - в 1,8 и 2,8 раз в биохимическом и пролиферативном тестах соответственно. Действительно ли такого рода мутации, обусловливающие легкую степень снижения чувствительности к иматинибу, могут вызвать рецидив у пациентов в цитогенетической ремиссии ХМЛ, не известно. Однако, наиболее вероятно, что увеличение дозы иматиниба при мутации F359V и при других аналогичных по своему биологическому эффекту мутациях должно преодолевать резистентность (Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003).

Чувствительность к иматинибу АЫ киназы при наличии мутации V379I (замена валина в 379 положении на изолейцин) в тестах in vitro приблизительно такая же, как и АЫ киназы дикого типа. Поэтому не удивительно, что, несмотря на потерю цитогенетического ответа,

пациенты с этой мутацией в хронической фазе ХМЛ сохраняют гематологический ответ (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002, Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. 2003). При этом клон с мутацией V379I может быть преобладающим.

Мутации активационной петли (A-петли) в общем характеризуются средней степенью резистентности, по данным Р. La Rosee (La Rosee P., Corbin A., Stoffregen E. et al. 2002).

Мутации Н396Р и H396R (замена гистидина в 396 положении на пролин или аргинин) приводят к снижению чувствительности к иматинибу соответственно в 11,3 и 7,3 раза в биохимическом тесте; 8,6 и 10,8 раза в клеточном тесте на пролиферацию по сравнению с диким типом Bcr-Abl (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003). Аналогичные данные приводят T. O'Hare и соавт.( O'Hare Т., Walters D., Stoffregen E. et al. 2005). Эти данные недвусмысленно указывают на роль мутаций Н396Р и H396R в развитии резистентности к иматинибу у пациентов с ХМЛ.

Роль мутации L387M (замена лейцина в 387 положении на метионин) среди причин резистентности не столь очевидна (Shah N., Nicoll J., Nagar В. et al. 2002). Эта мутация демонстрирует снижение чувствительности к иматинибу в 2-4 раза как в биохимическом тесте на фосфорилирующую активность, так и в тесте на пролиферативную активность (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al.2003, O'Hare T., Walters D., Stoffregen E. et al. 2005).

Таким образом, выявленные мутантные формы Abi киназы характеризуются различным уровнем чувствительности к иматинибу. Тем не менее, А. Corbin и соавт. (Corbin A., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003) подразделяют все выявленные мутации на две четко различимые группы по уровню чувствительности к иматинибу и, как следствие, степени резистентности пациентов к терапии иматнибом.

Первая группа включает в себя мутации ТЗ151, G250E, Е255К, Н396Р, H396R, значительно или умеренно снижающие чувствительность к

иматинибу в тестах in vitro. При наличии этих мутаций в АЫ киназе доза иматиниба IC50 всегда выше 1,46 мкМ. Концентрация 1,46 мкМ используется авторами в качестве порогового значения, поскольку именно эта концентрация иматиниба достигается в плазме крови при стандартной терапии в дозе 400 мг/сутки.

Вторую группу составляют мутации F311L, E355G, F359V, V379I, L387M, незначительно изменяющие чувствительность к иматинибу в тестах in vitro и характеризующиеся значением IC50 на уровне концентрации иматиниба в плазме крови 1,46 мкМ или незначительно выше этого показателя. Поэтому эти мутации сохраняют чувствительность Abi киназы на уровне клинически достижимой концентрации иматиниба в плазме крови, и увеличение его дозы приводит к достижению ремиссии.

В случае отсутствия эффекта от эскалации дозы иматиниба при наличии одной из мутаций второй группы, речь может идти о сочетании мутации с каким-либо другим механизмом резистентности: Abl-киназа независимым или даже Bcr-Abl независимым. Например, мутации киназного домена, не влияющие на связывание иматиниба, могут нарушать взаимодействие Abl-киназы с другими сигнальными белками (Corbin А., La Rose Р., Stoffregen E. et al. 2003). A. Hochhaus и соавт. (Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. 2002) обнаружили различные комбинации мутаций киназного домена, клональной эволюции и сверхэкспрессии гена BCR-ABL у 18% пациентов, резистентных к иматинибу.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Морданов, Сергей Викторович

ВЫВОДЫ:

1. Аномалии гена BCR-ABL (мутации и амплификация) являются важными механизмами развития резистентности к терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ. Мутации гена BCR-ABL обнаружены в 40,4% случаев резистентности (первичная резистентность - 33,8%; вторичная резистентность - 52,8%). Амплификация гена BCR-ABL выявлена в 36,3% случаев (первичная резистентность — 36,8%; вторичная резистентность - 35,1%).

2. Большая часть мутаций гена BCR-ABL у первично резистентных больных (70%) локализована в кодирующем Р-петлю участке киназного домена ABL тирозинкиназы, обусловливая высокий уровень резистентности. У вторично резистентных больных мутации в участке, кодирующем Р-петлю, обнаружены в 48% случаев.

3. Мутации и амплификация гена BCR-ABL приводят к стойкому снижению частоты достижения цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом.

4. Развитие резистентности на терапию иматинибом у больных ХМЛ не зависит от величины клонов лейкозных клеток с амплификацией гена BCR-ABL.

5. Длительность периода времени от постановки диагноза ХМЛ до начала терапии иматинибом влияет на развитие BCR-ABL зависимой резистентности (появление мутаций и амплификация гена BCR-ABL).

Практические рекомендации:

1. Анализ случаев неэффективности терапии ХМЛ иматинибом должен включать в себя комплекс исследований, включающих изучение аномалий гена BCR-ABL методами FISH-анализа с ДНК зондом к гену BCR-ABL, и определение нуклеотидной последовательности гена BCR-ABL

2. Появление низкопроцентных клонов с амплификацией гена BCR-ABL является неблагоприятным прогностическим фактором и требует коррекции терапии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Морданов, Сергей Викторович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Домрачева Е.В., Захарова А.Е., Асеева Е.А. Прогностическое значение дополнительных цитогенетических аномалий при хроническом миелолейкозе // Гематол. и трансфузиол. — 2005. -50(4).-С. 37-41.

2. Дьяченко Л.В., Захарова A.B., Асеева Е.А. и др. Молекулярно-цитогенетический мониторинг различных режимов терапии у больных хроническим миелолейкозом // Тер. Архив. - 2004. - Т. 76, №7.-С. 41-44.

3. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова О.Ю. и др. Результаты многоцентрового исследования терапии гливеком больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе // Гематол. и трансфузиол. - 2007. - Т.52, № 2. - С. 13-17.

4. Круглов С.С., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. и др. Резистентность при терапии Гливеком у больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации // Гематол. и трансфузиол. - 2007. - №2. - С. 17-24

5. Куцев С.И., Вельченко М.В., Зельцер А.Н. Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ // Онкогематология. - 2009. - №3. -С. 17-26

6. Куцев С.И., Морданов C.B. Амплификация гена BCR-ABL у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом, рефрактерных к иматинибу // Онкогематология. - 2008. — №4. — С.57-61

7. Ломаиа Е.Г., Огородникова Ю.С., Мартынкевич И.С. и др. Прогностические факторы эффективности терапии Гливеком больных хроническим миелолейкозом // Вестник гематологии. -2005.-Т. 1., №1. - С. 14-21.

8. Мартынкевич И.С., Мартыненко JI.C., Иванова М.П. и др. Дополнительные хромосомные аберрации у больных хроническим миелолейкозом // Гематол. и трансфузиол. - 2007. - 52(2). - С. 28-35.

9. Мисюрин A.B., Аксенова Е.В., Кругов A.A. и др. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза // Гематол. и трансфузиол. -2007. - № 2. - С.35-40.

10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. - М.: Медиа Сфера, 2002. - 305 с.

11. Туркина А.Г. Ингибитор сигнальных путей STI571 (Signal Transductor Inhibitor) - новое направление в лечении хронического миелолейкоза // Современная онкология. - 2001. - ТЗ, №2. - С.46- 48.

12. Туркина А.Г., Виноградова О.Ю., Хорошко Н.Д., Воробьев А.И. Достижения в диагностике и лечении больных хроническим миелолейкозом в Российской Федерации (2004 — 2008 гг)// Бюллетень Сибирской медицины. — 2008. - Приложение 3. - С.76-80.

13. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Цитогенетический ответ - маркер эффективности терапии ингибитором тирозинкиназы (гливеком) у больных хроническим миелолейкозом // Тер. Архив. -2005. -Т77, N7. - С. 42-47.

14. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапии Гливеком (иматиниб мезилат, STI 571) в поздней хронической стадии миелолейкоза (XMJI) при неэффективности терапии интерфероном-альфа. // Проблемы гематологии. - 2002. - № 1.-С. 88-89.

15. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др.//Практические рекомендации по лечению больных хроническим миелолейкозом: пособие для врачей. - Москва. — Тверь : ООО "Издательство "Триада", 2005. - 78 с.

16. Туркина А.Г., Челышева Е.Ю. Цитогенетический и молекулярный ответ — ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+ хроническим миелолейкозом // Фарматека. - 2004. - №18 (95). -С. 48-53.

17. Хорошко Н.Д., Туркина А.Г. Хронический миелолейкоз; успехи современного лечения и перспективы // Гематол. и трансфузиол. -2001.- Т46, №4. - С. 3-8.

18. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В., Захарова А.В. Раннее выявление цитогенетического рецидива при динамическом исследовании уровня BCR-ABL транскрипта у больного хроническим миелолейкозом // Гематол. и трансфузиол. - 2007. — №2,- С.50-51.

19. Al-Ali Н.К., Heinrich М.С., Lange Т. et al. High incidence of BCR-ABL kinase domain mutations and absence of mutations of the PDGFR and KIT activation loops in CML patients with secondary resistance to imatinib // Hematol. J. - 2004. - V.5, № 1. - P. 55-60.

20. Apperley JF. Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia. Lancet Oncol 2007;8:1018 -1029.

21. Azam M., Latek R.R., Daley G.Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571 imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL II Cell. -2003.- V.l 12, № 6. - P. 831-843.

22. Baccarani M, Cortes J, Pane F, et al. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet // J Clin Oncol. - 2009. - V.27(35). - P.6041-6051.

23. Baccarani M., Pane F., Saglio G. Monotoring treatment of chronic myeloid leukemia // Haematologica. - 2008. - V.93, №2. - P. 161-167.

24. Baccarani M., Saglio G., Goldman J. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an

expert panel on behalf of the European LeukemiaNet // Blood. - 2006. -V.108, №6. - P. 1809-1820.

25. Barbany G., Hagberg A., Olsson-Stromberg U. et al. Manifoldassisted reverse transcription-PCR with real-time detection for measurement of the BCR-ABL fusion transcript in chronic myeloid leukemia patients // Clin. Chem. - 2000. - V.46, №7. - P. 913-920.

26. Barthe C., Cony-Makhoul P., Melo J.V. et al. Roots of clinical resistance to STI-571 cancer therapy // Science. - 2001. - V.293, №5538. - P.2163.

27. Bixby D., Talpaz M. Mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia and recent therapeutic strategies to overcome resistance. Am. Soc. of Hematol. Ed. Book, New Orleans, Dec 5-8, 2009: 461-76.

28. Branford S. Chronic myeloid leukemia: molecular monitoring in clinical practice // in: The education programm of the Am. Soc. Hematol. -2007.- P.376-383.

29. Branford S., Hughes T.P. Detection of BCR-ABL mutations and resistance to imatinib mesylate // in: Myeloid Leukemia: Methods and Protocols, Eds by Iland H., Hertzberg M. and Marlton P. - Totova, Human Press Inc., 2006. - P.69-92.

30. Branford S., Hughes T.P., Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics // Br. J. Haematol. - 1999. -V.107, №3. - P.587-589.

31. Branford S., Rudzki Z., Grigg A. et al. The incidence of BCR-ABL kinase mutations in chronic myeloid leukemia patients is as high in the second year of imatinib therapy as the first but survival after mutation detection is significantly longer for patients with mutations detected in the second year of therapy // Blood. - 2003. - V.102, № 5. - P. 414.

32. Branford S., Rudzki Z., Harper A. et al. Imatinib produces significantly superior molecular responses compared to interferon alfa plus cytarabine in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase // Leukemia. - 2003. - V. 17, № 12. - P. 2401-2409.

33. Branford S., Rudzki Z., Parkinson I. et al. Real-time quantitative PCR analysis can be used as a primary screen to identify patients with CML treated with imatinib who have BCR-ABL kinase domain mutations // Blood. - 2004. - V. 104, №9. - P.2926-2932.

34. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis // Blood. -2003. - V.102, №1. - P.276-283.

35. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance // Blood. - 2002. - V.99, № 9. - P. 3472-3475.

36. Buchdunger E., Zimmermann J., Mett H. et al. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative // Cancer Res. - 1996. - V.56, №.1. - P. 100-104.

37. Buchdunger E., Zimmermann J., Mett H. et al. Selective inhibition of the platelet-derived growth factor signal transduction pathway by a protein-tyrosine kinase inhibitor of the 2-phenylaminopyrimidine class // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - V.92, №7. - P. 2558-2562.

38. Burgess M.R., Skaggs B.J., Shah N.P. et al. Comparative analysis of two clinically active BCR-ABL kinase inhibitors reveals the role of

conformation-specific binding in resistance 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005. - V.102, № 9. - P. 3395-3400.

39. Chu S., Xu H., Shah N.P. et al. Detection of BCR-ABL kinase mutations in CD34+ cells from chronic myelogenous leukemia patients in complete cytogenetic remission on imatinib mesylate treatment // Blood. - 2004. -V.105, № 5. - P.2093 -2098.

40. Collins S.J., Groudine M.T. Chronic myelogenous leukemia: amplification of a rearranged c-Abl oncogene in both chronic phase and blast crisis // Blood. - 1987. - V. 69, № 3. - P.893-898.

41. Corbin A.S., Buchdunger E., Pascal F. et al. Analysis of the structural basis of specificity of inhibition of the Abl kinase by STI571 // J. Biol. Chem. -2002. - V.277, №35. - P. 32214-32219.

42. Corbin A.S., La Rosee P., Stoffregen E.P. et al. Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib // Blood. - 2003. - V. 101, №11. - P. 4611-4614.

43. Cortes J., Jabbour E., Kantarjian H. et al Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors // Blood. - 2007. - v. 110. -P.4005-4011

44. Cortes J.E., Talpaz M., Giles F. et al. Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy // Blood. - 2003. - V. 101, №10. -P. 3794-3800.

45. Cowan-Jacob S.W., Guez V., Fendrich G. et al. Imatinib (STI571) resistance in chronic myelogenous leukemia: molecular basis of the underlying mechanisms and potential strategies for treatment // Mini Rev. Med. Chem. - 2004. - V.4, №.3. - P.285-299.

46. Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome // Science. - 1990. - V.247, №4944. - P. 824830.

47. De Klein A., van Kessel A.G., Grosveld G. et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukemia//Nature. - 1982. - V.300, №5894. - P. 765-767.

48. Deininger M., Buchdunger E., Druker B. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. Blood 2005; 105(7): 2640-53.

49. Deininger M., O'Brien SG, Guilhot F., et al. International randomized study of interferon vs STI571 (IRIS) 8-year follow up: sustained survival and low risk for progression or events in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase (CML-CP) treated with imatinib // Blood 2009; 114: 1126 (abstr).

50. Deininger M.W., Goldman J.M., Lydon N., Melo J.V. The tyrosine kinase inhibitor STI571 selectively inhibits the growth of BCR-ABL positive cells // Blood. - 1997. - V.90, №9. - P. 3691-3698.

51. Deininger M.W., McGreevey L., Willis S. et al. Detection of ABL kinase domain mutations with denaturing high-performance liquid chromatography // Leukemia. - 2004. - V.18, №4. - P. 864-871.

52. Donato NJ, Wu JY et al. BCR-ABL indepenedce and LYN kinase overexpression in chronic myelogeneous leukemia cells selected for resistance to ST\51lBlood2003; 101:690-698

53. Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. -2006. -V.355, №23. - P.2408-2417.

54. Druker B.J., Talpaz M., Resta D.J. et al. Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 2001. - V.344, №14. - P. 1031-1037.

55. Druker B.J., Tamura S., Buchdunger E. et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells // Nat. Med. - 1996. - V.2, №5. - P. 561-566.

56. Emig M., Saussele S., Wittor H. et al. Accurate and rapid analysis of residual disease in patients with CML using specific fluorescent hybridization probes for real time quantitative RT-PCR // Leukemia. -1999. - V.13, №11. - P.1825-1832.

57. Ernst T., Erben P., Müller M.C. et al. Dynamics of BCR-ABL mutated clones prior to hematologic or cytogenetic resistance to imatinib // Haematologica. - 2008. - V.93, №2. - P. 186-192.

58. Faderl S., Talpaz M., Estrov Z., Kantaijian H.M. Chronic myelogenous leukemia: biology and therapy // Ann. Intern. Med. - 1999. - V.131, №3. -P. 207-219.

59. Gambacorti-Passerini C., LeCoutre P., Mologni L. et al. Inhibition of the ABL kinase activity blocks the proliferation of BCR/ABL1 leukemic cells and induces apoptosis // Blood Cells Mol. Dis. - 1997. - V. 23, №3. -P.380-394.

60. Gambacorti-Passerini C., Zucchetti M., Russo D. et al. Alpha-1 acid glycoprotein binds to imatinib (STI571) and substantially alters its pharmacokinetics in chronic myeloid leukemia patients // Clin. Cancer. Res.-2003.-9(2).-625-32.

61. Gambacorti-Passerini C.B., Gunby R.H., Piazza R. et al. Molecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia chromosome-positive leukaemias // Lancet Oncol. - 2003. - V.4, №2. - P.75-85.

62. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia - still a few questions // Exp. Hematol. - 2004. - V.32, №1. - P. 2-10.

63. Goldman J.M., Melo J.V. Chronic myeloid leukemia-advances in biology and new approaches to treatment // N. Engl. J. Med. - 2003. - V. 349, №15. - P.1451-1464.

64. Gordon M.Y., Goldman J.M. Cellular and molecular mechanisms in chronic myeloid leukemia: biology and treatment // Brit. J. Haematol. -1996. - V.95, №1. - P. 10-20.

65. Gorre M.E., Ellwood-Yen K., Chiosis G. et al. BCR-ABL point mutants isolated from patients with imatinib mesylateresistant chronic myeloid leukemia remain sensitive to inhibitors of the BCR-ABL chaperone heat shock protein 90 // Blood. - 2002. - V. 100, №8. - P. 3041-3044.

66. Gorre M.E., Mohammed M., Ellwood K. et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification // Science. - 2001. - V.293, №5531. - P.876-880.

67. Gotoh A., Miyazawa K., Ohyashiki K. et al. Tyrosine phosphorylation and activation of focal adhesion kinase (pl25FAK) by BCR-ABL oncoprotein // Exp. Hematol. - 1995. - V.23, №11. - P. 1153-1159.

68. Griswold IJ, MacPartlin M, Bumm T, et al. Kinase domain mutants of Bcr-Abl exhibit altered transformation potency, kinase activity, and substrate utilization, irrespective of sensitivity to imatinib // Mol Cell Biol. - 2006. - 26. -P.6082-6093.

69. Groffen J., Stephenson J.R., Heisterkamp N. et al. Philadelphia chromosome breakpoints are clustered within a limited region, bcr, on chromosome 22// Cell.- 1984. - V.36, №1. - P. 93-99.

70. Guilhot F., Apperley J., Kim D.W. et al. Dasatinib induces significant hematologic and cytogenetic responses in patients with imatinib-resistant

or -intolerant chronic myeloid leukemia in accelerated phase // Blood. -2007. - V.109, №10. - P. 4143-4150.

71. Guilhot F., Chastang C., Michallet M. et al. Interferon alfa-2b combined with cytarabine versus interferon alone in chronic myelogenous leukemia. French Chronic Myeloid Leukemia Study Group //_N. Engl. J. Med. -1997. - V.337, № 4. - P. 223-229.

72. Hantschel O., Nagar B., Guettler S. et al. A myristoyl/phosphotyrosine switch regulates c-Abl // Cell. - 2003. - V.l 12, №6. - P. 845-857.

73. Heinrich M.C., Blanke C.D., Druker B.J., Corless C.L. Inhibition of KIT tyrosine kinase activity: a novel molecular approach to the treatment of KITpositive malignancies // J. Clin. Oncol. - 2002. - V.20, № 6. - P. 1692-1703.

74. Heisterkamp N., Stam K., Groffen J. et al. Structural organization of the bcr gene and its role in the Ph' translocation // Nature. - 1985. - V315., № 6022.-P. 758-761.

75. Hochhaus A. Cytogenetic and molecular mechanisms of resistance to imatinib // Semin. Hematol. - 2003. - V.40, № 2, Suppl 2. - P.69-79.

76. Hochhaus A. Minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia patients // Best Pract. Res. Clin. Haematol. - 2002. - V.l5, № 1. - P. 159178.

77. Hochhaus A., Erben P., Branford S. et al. Hematologic and cytogenetic response dynamics to nilotinib (AMN107) depend on the type of BCR-ABL mutations in patients with chronic myelogeneous leukemia (CML) after imatinib failure // Blood. - 2006. - V. 108, № 11. - P. 225.

78. Hochhaus A., Kantarjian H.M., Baccarani M. et al. Dasatinib induces notable hematologic and cytogenetic responses in chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of imatinib therapy // Blood. - 2007. - V. 109, № 6. - P.2303-2309.

79. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. Roots of Clinical Resistance to STI-571 Cancer Therapy // Science. - 2001. - V. 293, №5531. - P. 2163.

80. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy // Leukemia. -2002.-V.16,№ 11,-P.2190-2196.

81. Hochhaus A., La Rosee P. Imatinib therapy in chronic myelogenous leukemia: strategies to avoid and overcome resistance // Leukemia. -2004.-V. 18, № 8. - P. 1321-1331.

82. Hochhaus A., Lin F., Reiter A. et al. Quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia patients on interferon-alpha therapy by competitive polymerase chain reaction // Blood. - 1996. - V.87, № 4. - P. 1549-1555.

83. Hochhaus A., Lin F., Reiter A. et al. Variable numbers of BCR-ABL transcripts persist in CML patients who achieve complete cytogenetic remission with interferon-alpha // Br. J. Haematol. - 1995. - V. 91, № 1. -P.126-131.

84. Hudges T., Saglio G., Branford S. et al Impact of baseline BCR-ABL mutations on response to nilotinib in patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase. J Clin Oncol 2009, vol.27, 25: 4204-10

85. Hughes T., Branford S. Molecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia // Blood Reviews. -2006. - V.20, № l.-P. 29-41.

86. Hughes T., Branford S. Molecular monitoring of chronic myeloid leukemia // Semin. Hematol. - 2003. - V.40, №2, Suppl.2. - P. 62-68.

87. Hughes T., Deininger M., Hochhaus A. et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting

BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results // Blood. - 2006. - V.108, №1. - P.28-37.

88. Hughes T., Kaeda J., Branford S. et al. Frequency of major molecular response to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 2003. - V.349, № 15. - P. 1423-1432.

89. Hughes T.P., Morgan G.J., Martiat P. et al. Detection of residual leukemia after bone marrow transplantation: role of PCR in predicting relapse // Blood. - 1991 - V.77, № 4. - P. 874-878.

90. Illmer T., Schaich M., Platzbecker U. et al. P-glycoprotein-mediated drug efflux is a resistance mechanism of chronic myelogenous leukemia cells to treatment with imatinib mesylate // Leukemia. - 2004. - V. 18, №3. -P.401-408.

91. Jabbour E., Kantarjian H., Jones D. et al. Frequency and clinical significance of BCR-ABL mutations in patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib mesylate // Leukemia 2006. - 20. -P.1767-1773.

92. Jakob R.E.. Dumitrescu T.P. el al Conformational disturbance in Abl kinase upon mutation and deregulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2009. -V.106(5). - P.1386-91

93. Kantarjian H., Giles F., Wunderle L. et al. Nilotinib in imatinib-resistant CML and Philadelphia chromosome-positive ALL // N. Engl. J. Med. -2006. - V.354, № 24. - P.2542-2551.

94. Kantarjian H., Sawyers C., Hochhaus A. et al. Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia // N. Engl. J. Med. - 2002. - V.346, № 9. - P.645-652.

95. Kantarjian H., Talpaz M., Giles F. et al. New Insights into the Pathophysiology of Chronic Myeloid Leukemia and Imatinib Resistance // Ann. Intern. Med. - 2006. - V.145, №12. - P. 913-923.

96. Kantarjian H.M., Cortes J.E., O'Brien S. et al. Imatinib mesylate (STI571) therapy for Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia in blast phase // Blood. - 2002. - V. 99, №10. - P.3547-3553.

97. Kantarjian H.M., Cortes J.E., O'Brien S. et al. Imatinib mesylate therapy in newly diagnosed patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia: high incidence of early complete and major cytogenetic responses // Blood. - 2003. - V.101, № 1. - P. 97-100.

98. Kantarjian H.M., Cortes J.E., O'Brien S. et al. Long-tenn survival benefit and improved complete cytogenetic and molecular response rates with imatinib mesylate in Philadelphia chromosome-positive chronic-phase chronic myeloid leukemia after failure of interferon-alpha // Blood. -2004. - V. 104, № 7. - P.1979-1988.

99. Kantarjian H.M., Dixon D., Keating M.J. et al. Characteristics of accelerated disease in chronic myelogenous leukemia //_Cancer. - 1988. -V.61, № 7. - P. 1441-1446.

100. Kantarjian H.M., O'Brien S., Cortes J.E. et al. Treatment of Philadelphia chromosome-positive, accelerated-phase chronic myelogenous leukemia with imatinib mesylate // Clin. Cancer Res. - 2002. - V.8, №7 . - P.2167-2176.

101. Kantarjian H.M., Smith T.L., McCredie K.B. et al. Chronic myelogenous leukemia: a multivariate analysis of the associations of patient characteristics and therapy with survival //Blood. - 1985. - V.66, № 6. -P. 1326-1335.

102. Kantarjian H.M., Talpaz M., Cortes J. et al. Quantitative polymerase chain reaction monitoring of BCR-ABL during therapy with imatinib mesylate

(STI571; gleevec) in chronicphase chronic myelogenous leukemia 11 Clin. Cancer Res. - 2003. - V.9, № 1. - P. 160-166.

103. Kantarjian H.M., Talpaz M., O'Brien S. et al. Imatinib mesylate for Philadelphia chromosome-positive, chronic-phase myeloid leukemia after failure of interferon-alpha: follow-up results // Clin. Cancer Res. - 2002.

- V.8, № 7. - P. 2177-2187.

104. Kawasaki E.S., Clark S.S., Coyne N.Y. et al. Diagnosis of chronic myelogenous and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia specific mRNA sequences amplified in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.

- 1988. - V.85, №15. - P. 5698-5702.

105. Khorashad J.S., Anand M., Marin D. et al. The presence of a BCR-ABL mutant allele in CML does not always explain clinical resistance to imatinib 11 Leukemia. - 2006. - V.20, №4. - P. 658-663.

106. Kolomietz E., Al-Maghrabi J., Brennan S. et al. Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis// Blood. -2001. - V.97, № 11.-P. 3581-3588.

107. Kreill S., Mueller M., Hanfstein B. et al. Management and clinical outcome of CML patients after imatinib resistance associated with ABL kinase domain mutations // Blood. - 2003. - V.102, № 12. - P.71.

108. Kuwazuru Y., Yoshimura A., Hanada S. et al. Expression of the multidrug transporter, P-glycoprotein, in chronic myelogenous leukaemia cells in blast crisis // Br. J. Haematol. - 1990. - V.74, № 1. - P.24-29.

109. La Rosee P., Corbin A.S., Stoffregen E.P. et al. Activity of the Bcr-Abl kinase inhibitor PD180970 against clinically relevant Bcr-Abl isoforms that cause resistance to imatinib mesylate (Gleevec, STI571) // Cancer Res. - 2002. - V.62, № 24. - P.7149-7153.

110. Laneuville P, Dilea C, Yin OQ, et al. Comparative in vitro cellular data alone are insufficient to predict clinical responses and guide the choice of BCR-ABL inhibitor for treating imatinib-resistant chronic myeloid leukemia // J Clin Oncol. - 2010. - 28. - el69-el71

111. Lange T., Bumm T., Otto S. et al. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction should not replace conventional cytogenetics for monitoring patients with chronic myeloid leukemia during early phase of imatinib therapy // Haematologica. - 2004. - V.89, № 1. - P. 49-57.

112. Lange T., Gunther C., Kohler T. et al. High levels of BAX, low levels of MRP-1, and high platelets are independent predictors of response to imatinib in myeloid blast crisis of CML // Blood. - 2003. - V.101, № 6. -P.2152-2155.

113. Larson R.A., Druker B.J., Guilhot F. et al. Imatinib pharmacokinetics and its correlation with response and safety in chronic-phase chronic myeloid leukemia: a subanalysis of the IRIS study // Blood. - 2008. - V.l 11, №8. - P. 4022-4028.

114. LeCoutre P., Tassi E., Varella-Garcia M. et al. Induction of resistance to the Abelson inhibitor STI571 in human leukemic cells through gene amplification // Blood. - 2000. - V. 95, № 5. - P. 1758-1766.

115. Lee W.I., Kantarjian H., Glassman A. et al. Quantitative measurement of BCR/ABL transcripts using real-time polymerase chain reaction // Ann. Oncol. - 2002. - V.13, № 5. - P.781-788.

116. Lin F., van Rhee F., Goldman J.M. et al. Kinetics of increasing BCR-ABL transcript numbers in chronic myeloid leukemia patients who relapse after bone marrow transplantation // Blood. - 1996. - V.87, № 10. -P.4473^478.

117. Lion T., Gaiger A., Henn T. et al. Use of quantitative polymerase chain reaction to monitor residual disease in chronic myelogenous leukemia

during treatment with interferon // Leukemia. - 1995. - V. 9, № 8. - P. 1353-1360.

118. Lion T., Henn T., Gaiger A. et al. Early detection of relapse after bone marrow transplantation in patients with chronic myelogenous leukaemia // Lancet. - 1993. - V. 341, № 8840 . - P.275-276.

119. Lion T., Izraeli S., Henn T. et al. Monitoring of residual disease in chronic myelogenous leukemia by quantitative polymerase chain reaction // Leukemia. - 1992. - V.6, № 6. - P.495-499.

120. Lowe S.W., Cepero E., Evan G. Intrinsic tumour suppression // Nature. -2004. - V.432, № 7015. - P.307-315.

121. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J. et al. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. -1990. - V.247, № 4946. - P. 1079-1082.

122. Luzi D., Falchi L., Cambrin G.R. et al. Response to imatinib or imatinib containing regimens of secondary clones in chronic myeloid leukemia patients with additional chromosomal abnormalities // Blood. - 2007. -V.110, №11. -P.215.

123. M.Mixller, J.Cortes et al Dasatinib treatment of chronic-phase chronic myeloid leukemia: analysis of responses according to preexisting BCR-ABL mutations // Blood. - 2009. - 114. - P.4944-4953

124. Mahon F.X., Belloc F., Lagarde V. et al. MDR1 gene overexpression confers resistance to. imatinib mesylate in leukemia cell line models // Blood. - 2003. - V. 101, № 6. - P. 2368-2373.

125. Mahon F.X., Deininger M.W., Schultheis B. et al. Selection and characterization of BCR-ABL positive cell lines with differential sensitivity to the tyrosine kinase inhibitor STI571: diverse mechanisms of resistance // Blood. - 2000. - V.96, №3. - P. 1070-1079.

126. Mahon F.X., Delbrel X., Cony-Makhoul P. et al. Follow-up of complete cytogenetic remission in patients with chronic myeloid leukemia after cessation of interferon alfa // J. Clin. Oncol. - 2002. - V.20, № 1. -P.214-220.

127. Mahon A., Etienne G, Picard S. et al. Trough plasma imatinib concentrations are associated with responses to standard-dose imatinib in chronic myeloid leukemia and could improve its clinical management// Journal of Clinical Oncology. - 2007. - Vol. 25, №18S. - P. 7027.

128. Malinge M.C., Mahon F.X., Delfau M.H. et al. Quantitative determination of the hybrid Bcr-Abl RNA in patients with chronic myelogenous leukaemia under interferon therapy // Br. J. Haematol. - 1992. - V.82, №.4. - P.701-707.

129. Marktel S., Marin D., Foot N. et al. Chronic myeloid leukemia in chronic phase responding to imatinib: the occurrence of additional cytogenetic abnormalities predicts disease progression //.Haematologica - 2003- V. 88, №3,-P. 260-267.

130. Mashal R., Shtalrid M., Talpaz M. et al. Rearrangement and Expression of p53 in the Chronic Phase and Blast Crisis of Chronic Myelogenous Leukemia//Blood.-1990.-V. 75, № 1. - P.180-189.

131. Medina J., Kantarjian H., Talpaz M. et al. Chromosomal abnormalities in Philadelphia chromosome-negative metaphases appearing during imatinib mesylate therapy in patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia in chronic phase // Cancer. - 2003. -V.98,№9.-P. 1905-1911.

132. Meló J.V. The molecular biology of chronic myeloid leukaemia // Leukemia.- 1996. - V. 10, № 5. - P.751-756.

133. Melo J.V., Chuah C. Resistance to imatinib mesylate in chronic myeloid leukaemia // Cancer Lett. - 2007. - V. 249, № 2. - P. 121-132.

134. Mensink E., Van de Locht A., Schattenberg A. et al. Quantitation of minimal residual disease in Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukaemia patients using real-time quantitative RT-PCR // Br. J. Haematol. - 1998. - V.102, № 3. - P. 768-774.

135. Merx K., Muller M.C., Kreil S. et al. Early reduction of BCR-ABL mRNA transcript levels predicts cytogenetic response in chronic phase CML patients treated with imatinib after failure of interferon alpha // Leukemia. - 2002. -V. 16, № 12. - P. 1579-1583.

136. Moravcova J., Lukasova M., Stary J. et al. Simple competitive two-step RT-PCR assay to monitor minimal residual disease in CML patients after bone marrow transplantation // Leukemia. - 1998. - V.12, № 8. - P. 1303-1312.

137. Morgan G.J., Hughes T., Janssen J.W. et al. Polymerase chain reaction for detection of residual leukaemia // Lancet. - 1989. - V.l, № 8644. - P. 928-929.

138. Muller M.C., Gattermann N., Lahaye T. et al. Dynamics of BCR-ABL mRNA expression in first-line therapy of chronic myelogenous leukemia patients with imatinib or interferon alpha/ara-C // Leukemia. - 2003. -V. 17, № 12,- P.2392-2400.

139. Nagar B., Bornmann W.G., Pellicena P. et al. Crystal structures of the kinase domain of c-Abl in complex with the small molecule inhibitors PD173955 and imatinib (STI-571) // Cancer Res. - 2002. - V.62, № 15. _ P.4236-4243.

140. Nagel S., Schmidt M., Thiede C. et al. Quantification of Bcr-Abl transcripts in chronic myelogenous leukemia (CML) using standardized, internally controlled, competitive differential PCR (CD-PCR) // Nucleic Acids Res. - 1996. - V.24, № 20. - P.4102-4203.

141. Nakai H., Misawa S. Chromosome 17 abnormalities and inactivation of the p53 gene in chronic myeloid leukemia and their prognostic significance // Leuk. Lymphoma. - 1995. - V. 19, №3-4. - P.213-221.

142. Nardi V., Azam M., Daley G.Q. Mechanisms and implications of imatinib resistance mutations in BCR-ABL // Curr. Opin. Hematol. - 2004. -V.l 1, № l.-P. 35-43.

143. Nicolini F., Basak G.W., Soverini S. et al // Blood. - 2011. - vol.118. -№20. - P.5697-5700

144. Nowell P.C., Hungerford D.A. A minute chromosome in human chronic granulocytes leukemia // Science. - 1960. - V.132, № 3438. - P. 1497.

145. O'Brien S.G., Guilhot F., Goldman J.M. et al. International randomized study of interferon versus STI571 (IRIS) 7-year follow-up: sustained survival, low rate of transformation and increased rate of major molecular response (MMR) in patients (pts) with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase (CMLCP) treated with imatinib (IM) // Blood.

- 2008. - V. 112, № 11.-P.186.

146. O'Brien S.G., Guilhot F., Larson R.A. et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 2003. - V.348, № 11. - P. 994-1004.

147. O'Hare T., Walters D.K., Stoffregen E.P. et al. In vitro activity of Bcr-Abl inhibitors AMN107 and BMS-354825 against clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants // Cancer Res. - 2005. - V. 65, №11.

- P.4500-4205.

148. Oetzel C., Jonuleit T., Gotz A. et al. The tyrosine kinase inhibitor CGP 57148 (ST1 571) induces apoptosis in BCR-ABL-positive cells by downregulating BCL-X // Clin. Cancer Res. - 2000. - V.6, № 5. - P. 1958-1968.

149. O'Hare T., Eide C.A., Deininger M. W. N. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia // Blood. - 2007. - V. 110, № 7. - P. 2242-2249.

150. Ohmine K., Nagai T., Tarumoto T. et al. Analysis of gene expression profiles in an imatinib-resistant cell line, KCL22/ SR // Stem Cells. -2003. - V.21, № 3.-P.315-321.

151. Olavarria E., Kanfer E., Szydlo R. et al. Early detection of BCR-ABL transcripts by quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction predicts outcome after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia // Blood. - 2001. - V.97, № 6. - P. 1560-1565.

152. Paschka P., Muller M.C., Merx K. et al. Molecular monitoring of response to imatinib (Glivec) in CML patients pretreated with interferon alpha. Low levels of residual disease are associated with continuous remission // Leukemia. - 2003. - V. 17, № 9. - P. 1687-1694.

153. Peggs K., Mackinnon S. Imatinib mesylate - the new gold standard for treatment of chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 2003. -V.348, № 11.- P.1048-1050.

154. Perrotti D., Jamieson C. et al Chronic myeloid leukemia. Mechanisms of blastic transformation // The Journal of Clinical Investigation. - 2010. -V. 120. - №7. - P.2254-2262.

155. Picard S., Titier K., Etienne G. et al. Trough imatinib plasma levels are associated with both cytogenetic and molecular responses to standarddose imatinib in chronic myeloid leukemia // Blood. - 2007. - V.109, № 8.-P. 3496-3499.

156. Radich J.P., Gooley T., Bryant E. et al. The significance of bcr-abl molecular detection in chronic myeloid leukemia patients late 18 months or more after transplantation // Blood. - 2001. - V.98, № 6. - P. 17011707.

157. Ray A., Cowan-Jacob S.W., Manley P.W. et al. Identification of BCR-ABL point mutations conferring resistance to the Abl kinase inhibitor AMN107 (nilotinib) by a random mutagenesis study // Blood. - 2007. -V.109, № 11.-P.5011-5015.

158. Redaelli S, Piazza R, Rostagno R et al. Activity of bosutinib, dasatinib, and nilotinib against 18 imatinib-resistant BCR/ABL mutants // J Clin Oncol. - 2009. - V.27. - P.469-471.

159. Roche-Lestienne C., Preudhomme C. Mutations in the ABL kinase domain pre-exist the onset of imatinib treatment // Semin. Hematol. -2003. - V.40, № 2, Suppl.2. - P.80-82.

160. Roche-Lestienne C., Soenen-Cornu V., Grardel-Duflos N. et al. Several types of mutations of the Abl gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment// Blood. - 2002. -V. 100, № 3. - P. 1014-1018.

161. Roumiantsev S., Shah N.P., Gorre M.E. et al. Clinical resistance to the kinase inhibitor STI-571 in chronic myeloid leukemia by mutation of Tyr-253 in the Abl kinase domain P-loop // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002. - V.99, № 16. - P.10700-10705.

162. Rowley J.D. A new consistent abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining// Nature. - 1973. - V.243, № 5405. - P. 290-293.

163. Sattler M., Verma S., Shrikhande G. et al. The BCR/ABL tyrosine kinase induces production of reactive oxygen species in hematopoietic cells // J. Biol. Chem. - 2000. - V.275, № 32. - P.24273-24278.

164. Saussele S., Weisser A., Muller M.C. et al. Frequent polymorphism in BCR exon b2 identified in BCR-ABL positive and negative individuals using fluorescent hybridization probes // Leukemia. - 2000. - V.14, № 1. - P.2006-2010.

165. Sawyers C.L, Hochhaus A., Feldman E. et al. Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study // Blood. - 2002. - V. 99, № 10. - P.3530-3539.

166. Sawyers C.L. Chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 1999. -V.340, № 17. - P.1330-1340.

167. Sawyers C.L. Research on resistance to cancer drug Gleevec // Science. -2001. - V.294, № 5548. - P. 1834.

168. Schindler T. , Bornmann W., Pellicena P. et al. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase // Science. - 2000. - V.289, №5486.-P. 1938-1942.

169. Seigneurin D., Champelovier P., Mouchiroud G. et al. Human chronic myeloid leukemic cell line with Philadelphia chromosome exhibits megakaryocyte and erythrocytic characteristics // Exp. Hematol. - 1987. - V.15, № 8. - P.822-832.

170. Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J. An International system for human cytogenetic nomenclature (2009). - Karger, 2009. - p. 181.

171. Shah N. Fine-tuning targeted therapy of CML // Blood. - 2009. - vol. 114. -№ 24. -P.4914-4915

172. Shah N.P., Nicoll J.M., Nagar B. et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia // Cancer Cell. - 2002. - V.2, № 2. - P. 117-125.

173. Shah N.P., Sawyers C.L. Mechanisms of resistance to STI571 in Philadelphia chromosome-associated leukemias // Oncogene. - 2003. - V. 22, № 47. - P.7389-7395.

174. Shah N.P., Tran C., Lee F.Y. et al. Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor // Science. - 2004. - V.305, № 5682. -P.399-401.

175. Shtivelman E., Lifshitz B., Gale R.P., Canaani E. Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukaemia // Nature. - 1985. - V. 315, № 6020.-P.550-554.

176. Skaggs BJ, Gorre ME, Ryvkin A, et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proc Natl Acad SciU S A. 2006;103:19466-19471.

177. Sorel N., Bonnet M.L., Guillier M. et al. Evidence of ABLkinase domain mutations in highly purified primitive stem cell populations of patients with chronic myelogenous leukemia // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - V. 323, № 3. - P.728-730.

178. Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia // Clin. Cancer Res. - 2006. - V.12, № 24. -P.7374-7379.

179. Soverini S., Martinelli G., Amabile M. et al. Denaturing-HPLCbased assay for detection of ABL mutations in chronic myeloid leukemia patients resistant to Imatinib // Clin. Chem. - 2004. - V.50, №. - P. 1205-1213.

180. Soverini S., Rosti G. et al Choosing the best second-line tyrosine kinase inhibitor in imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patients harboring Bcr-Abl kinase domain mutations: how reliable is the IC5o? // The Oncologist. - 2011. - 16. - P.868-876.

181. Stentoft J., Pallisgaard N., Kjeldsen E. et al. Kinetics of BCR-ABL fusion transcript levels in chronic myeloid leukemia patients treated with STI571

measured by quantitative realtime polymerase chain reaction 11 Eur. J. Haematol. - 2001. - V.67, № 5-6. - P. 302-308.

182. Talpaz M., Shah N.P., Kantarjian H. et al. Dasatinib in imatinib-resistant Philadelphia chromosome-positive leukemias // N. Engl. J. Med. - 2006. -V.354, №24. - P. 2531-2541.

183. Talpaz M., Silver R.T., Druker B.J. et al. Imatinib induces durable hematologic and cytogenetic responses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia: results of a phase 2 study // Blood. - 2002. -V. 99,№6.-P. 1928-1937.

184. Thomas J., Wang L., Clark R.E., Pirmohamed M. Active transport of imatinib into and out of cells: implications for drug resistance // Blood. -2004. - V.104, №12. - P. 3739-3745.

185. Thompson J.D., Brodsky I., Yunis J.J. Molecular quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia after bone marrow transplantation // Blood. - 1992. - V.79, № 6. - P. 1629-1635.

186. Van der Velden V.H., Hochhaus A., Cazzaniga G. et al. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects // Leukemia. -2003. -V. 17, № 6. - P. 1013-1034.

187. Von Bubnoff N., Schneller F., Peschel C. et al. BCR-ABL gene mutations in relation to clinical resistance of Philadelphia chromosome-positive leukaemia to STI571: a prospective study // Lancet. - 2002. - V.359, № 9305. - P.487-491.

188. Wang L., Giannoudis A., Lane S. et al. Expression of the uptake drug transporter hOCTl is an important clinical determinant of the response to imatinib in chronic myeloid leukemia // Clin. Pharmacol. Ther. - 2008. -83(2). - 258-64.

189. Wang L., Pearson K., Ferguson J.E. et al. The early molecular response to imatinib predicts cytogenetic and clinical outcome in chronic myeloid leukaemia // Br. J. Haematol. - 2003. - V.120, № 6. - P.990-999.

190. Wang L., Pearson K., Pillitteri L. et al. Serial monitoring of BCR-ABL by peripheral blood real-time polymerase chain reaction predicts the marrow cytogenetic response to imatinib mesylate in chronic myeloid leukaemia // Br. J.Haematol. - 2002. - V.118, № 3. -P.771-777.

191. Weisberg E., Griffin J.D. Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABL-transformed hematopoietic cell lines // Blood. - 2000. - V.95, № 11. - P. 3498-3505.

192. Widmer N., Decosterd L.A., Csajka C. et al. Population pharmacokinetics of imatinib and the role of alpal-acid glycoprotein // Br. J. Clin. Pharmacol. - 2006 - V. 62, №1 - P. 97-112.

193. Wilkinson G.R. Cytochrome P4503A (CYP3A) metabolism: prediction of in vivo activity in humans // J. Pharmacokinet. Biopharm. - 1996. - V. 24, № 5. - P.475-490.

194. Wilkinson G.R. Drug metabolism and variability among patients in drug response // N. Engl. J. Med. - 2005. - V.352, № 21. - P. 2211-2221.

195. Willis S.G., Lange T., Demehri S. et al. High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy // Blood. - 2005. - V. 106, № 6. - P. 2128-2137.