Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.02, кандидат наук Ли Цзяцзин

• Ли Цзяцзин
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Ли Цзяцзин

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология РШМ

1.2. Этиология РШМ

1.3. Патогенез РШМ

1.3.1 Роль ВПЧ в канцерогенезе РШМ

1.3.2 Роль раковых стволовых клеток в канцерогенез РШМ

1.4. Морфологическая характеристика предрака и рака шейки матки

1.4.1. Зона трансформации шейки матки - ниша стволовых клеток шейки матки

1.4.2. Классификация предрака шейки матки

1.4.3. Сфероидные структуры

1.5. Методы морфологической диагностики, ВПЧ-тестирование, кольпоскопия и скрининг РШМ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материал исследования

2.2. Методы исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Ранняя диагностика ВПЧ-ассоциированных рака и предрака шейки матки у женщин до 30 лет и старше

3.2. Определение эффективности комплексной диагностики предрака и рака

шейки матки с использованием: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ПЦР-НВ

3.3. Изучение репаративных, неопластических и раковых сфероидных

структур при ВПЧ-ассоциированном предраке и раке шейки матки:

морфологические и иммунофенотипические особенности

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Репаративные и предраковые процессы при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки»

Актуальность темы.

Рак шейки матки (РШМ) является одной из наиболее распространенных форм онкологической патологии женщин, занимая 7-е место среди всех злокачественных опухолей и 3-е место среди злокачесткенных опухолей у женщин (после рака молочной железы и рака толстой кишки). РШМ составляет 9,8% всех злокачественных опухолей у женщин [В.И. Новик, 2010]. Многолетними исследованиями установлено, что в этиологии предрака и рака шейки матки большое значение имеет вирус папилломы человека (ВПЧ), принадлежащий к семейству papova viridae и имеющий тропность к многослойному плоскому эпителию. [Bollman R., Mehes G., Torka R., 2003]. Большинство ученых считают, что при ВПЧ-инфекции в результате мутаций и эпигенетических модификаций онкобелки Е6 и Е7 приводят к генетической нестабильности, вследствие чего запускается процесс канцерогенеза и развитие РШМ. [Von Knebel, Doeberitz M, Rittmutter L,1994]. ВПЧ был обнаружен практически в 99.8% случаев инвазивной карциномы шейки матки и более чем в 60% случаев цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН). [Walboomers JM, Jacobs MV, 1999]. От момента первичной вирусной инфекции до появления рака шейки матки проходит достаточно длительный срок -5-10 лет, поэтому профилактику РШМ можно проводить путем ранней диагностики предраковых процессов, системного скрининга и вакцинации. В тех странах, где качество и

распространенность скрининга высока, отмечается снижение частоты развития инвазивного рака шейки матки на 90% [Весна Кезик, 2009].

На сегодняшний день вопросы о периодичности проведения, использования маркёров и методов диагностики и скрининга РШМ, особенно при транзиторной инфекции, остаются открытыми. Американское общество по кольпоскопии и патологии шейки матки рекомендует начинать программу скрининга РШМ с 21 года. В Дании возраст начала скрининга РШМ составляет 23 года, во Франции -25 лет, в Финляндии - 30 лет. При этом, остается дисскуссионным имеются ли особенности проведения скрининга РШМ у женщин до 30 лет и старше 30 лет. Для проведения эффективного скринингового теста и ранней диагностики РШМ необходимо найти методы с высокой специфичностью и чувствительностью. В странах с организованным скринингом РШМ, основаным на цитологии, было показано снижение заболеваемости и смертности от РШМ. [Arbyn M, Raifu AO, Weiderpass E, 2009].

При цитологическом исследовании обнаруживается большое количество пациентов с клеточными аномалиями, такими как ASC-US (клетки плоского эпителия с атипией неясного генеза), L-SIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени), с относительно низким риском развития РШМ, H-SIL (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения выcoкoй степени), с поражениями высокой степени, что требует дальнейшего обследования [Jaume O, Amaia S, Meritxell M, 2014]. Хотя ВПЧ-тестирование показало свою эффективность при скрининге женщин с ASC-US и L-SIL, было

обнаружено, что у большинства женщин до 30 лет ВПЧ-инфекций носит транзиторный характер [J Natl, 2000; Woodman CB, Collins S, Winter H, 2001].

Канцерогенез РШМ в настоящее время рассматривается с точки зрения образования раковых стволовых клеток (РСК) и сфероидных эпителиально-мезенхимальных структур (СЭМС) в тканях[Kogan E A, 2013]. Сфероидные структуры впервые были описаны в культурах стволовых клеток, они активно используются в тканевых принтерах для воссоздания тканей. В 1992г. клетки, выделенные из полосатого тела головного мозга мышей, пролиферировали in vitro под воздействием фактора роста и формировали сфероидные структуры [Reynolds BA, Weiss S, 1992]. Похожие СЭМС, включающие раковые стволовые клетки, обнаруживаются in v^ при предраке и раке простаты [Garraway IP, Sun W, Tran CP, 2010], молочной железы [Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, 2005], яичников [Zhang S, Balch C, Chan MW, 2008]. В шейки матки было обнаружено формирование СЭМС в плоском эпителии при ВПЧ-ассоциированном хроническом цервиците и ЦИН, клетки СЭМС экспрессируют маркер эмбриональных стволовых клеток Oct-4 [Коган Е.А., 2013]. Однако, участие СЭМС в репаративных процессах и канцерогенезе РШМ остается не изучено. Цель исследования

Изучить патологические, морфологические и молекулярно-генетические особенности процессов репарации и злокачественной трансформации шейки матки на фоне ВПЧ-инфекции.

Задачи исследования

1) Сравнить чувствительность и специфичность цитологического метода и ВПЧ-тестирования методом полимеразной цепной реакции в настоящем времени (ПЦР-НВ) при ранней диагностике предрака и рака шейки матки у женщин до и после 30 лет.

2) Оценить чувствительность и специфичность комплекса методов ранней диагностики предрака и рака шейки матки у женщин: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания р16/Ю67 и ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ.

3) Оценить морфологические и иммуногистохимические характеристики СЭМС разных видов, обнаруженых при репаративных и предраковых ВПЧ-ассоциированных патологических процессов в шейке матки.

4) Определить наиболее значимые дифференциренциально-диагностические морфологические признаки и молекулярные маркеры репаративных и предраковых процессов на фоне ВПЧ-инфекции.

Научная новизна предлагаемой темы по литературным источникам и патентной документации.

Проведенное исследование показало, что канцерогенез и морфогенез ВПЧ-ассоциированного плоскоклеточного рака шейки матки - это многостадийный процесс, который связан с последовательным развитием структурных изменений, характеризующихся образованием ОС4--позитивных репаративных, неопластических и раковых СЭМС.

Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<11, характеризуются отсутствием клеточного атипизма и экспрессии р53, выявляется низкая экспрессия маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim) и онкомаркеров (P16, C-MYC), а также маркера гипоксии HIF-1.

Неопластические СЭМС встречаются при ЦИН<П и ЦИН>П, их клетки характеризуются признаками клеточного атипизма и высокой экспрессией маркеров стволовости ALDH, CD34, Vim, онкомаркеров P16, C-MYC и маркера гипоксии HIF-1.

Раковые СЭМС обнаруживаются в MSCC, нередко сливаются в крупные конгломераты, формируются вне зависимости от расположения сосудов. Они построены из раковых клеток и характеризуются высокой экспрессией маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim), онкомаркеров (P16, C-MYC, P53) и маркера гипоксии (HIF-1). Также в неопластических и раковых СЭМС определяются атипичные клетки, экспресирующие одновременно онкомаркеры и маркеры стволовости.

Практическая значимость

Установлено, что для ранней диагностики и скрининга ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки следует использовать комплекс методов - жидкостную цитологию, ВПЧ тестирование методом ПЦР-НВ и ИЦХ с двойной окраской р16/Ю67, это значительно повышает их чувствительность и специфичность. Скрининг РШМ у женщин моложе 30 лет должен начинаться с жидкостной

цитологии, старше 30 лет - с ВПЧ тестирования, что определяется эволюцией патологического процесса и экономическими факторами. Положения, выносимые на защиту

1. Диагностика ВПЧ-ассоциированного предрака шейки матки и скрининг РШМ у женщин моложе 30 лет должно начинаться с жидкостной цитологии, в связи с высокой частотой транзиторной ВПЧ-инфекции. Диагностика ВПЧ-ассоциированного предрака шейки матки и скрининг РШМ у женщин старше 30 лет - с ВПЧ тестирования, что определяется эволюцией патологического процесса и экономическими факторами.

2. Ранная диагностика предрака и рака шейки матки должна базироваться на использовании комплекса методов - жидкостной цитологии, ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ и ИЦХ с двойной окраской р16/Ю67; это значительно повышает их чувствительность и специфичность.

3. Патогенез и морфогенез ВПЧ-ассоциированного плоскоклеточного рака шейки матки связан с последовательным развитием О^4-позитивных репаративных, неопластических и раковых СЭМС.

Публикации результатов работы

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе, 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК и индексируемых в SCOPUS, а также 2 тезиса на английском языке в журналах, индексируемых в SCOPUS.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов и обсуждения, выводов. Список литературы состоит из 140 источников, из которых 19 принадлежит отечественным и 121 зарубежным авторам. Диссертация проиллюстрирована и включает 4 таблицы 40 рисунков и 28диаграмм. Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на научно - методической конференции кафедры патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 19 апреля 2016 года. Результаты исследования докладывались и обсуждались на XXVI европейском патологическом конгрессе (Белград, 2015), на XXX международной конференции ВПЧ (Лиссабон, 2015). В 2014 году на научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Путь в науку» работа награждена дипломом I степени.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эпидемиология РШМ

Рак шейки матки (РШМ) является наиболее распространенной формой онкологической патологии женской репродуктивной системы. По заболеваемости РШМ занимает 7-е место среди всех злокачественных опухолей и 3-е место среди злокачественных опухолей у женщин (после рака молочной железы и рака толстой кишки), и составляет 9,8%. [16]. В 2012 году было зарегистрировано 527,624 случаев заболеваемости РШМ во всем мире [132], в 265,653 случаях отмечался летальный исход. Смертность от РШМ занимает 9-е место среди всех злокачественных опухолей и 2-е место среди эпителиальных злокачественных опухолей репродуктивной женской системы [133].

РШМ наиболее часто поражает женщин в возрасте до 35 лет, нередко с последующим летальным исходом. [33]. В РФ заболеваемость РШМ растет из года в год, что свидетельствует о недостаточности мероприятий, связанных с первичной и вторичной профилактикой данного заболевания. В 2010 г. в России было зарегистрировано 14,7 тыс. больных РШМ. Смертность от РШМ в среднем по России в 2010 г. составляла 5,2 на 100,000 и на сегодняшний день является основной причиной смерти среди всех женщин с онкологическими заболеваниями в возрасте от 15 до 40 лет (19,5). После 40 лет смертность РШМ переходит на 2-е место (9.7%). [1]. Выживаемость больных раком шейки матки зависит прежде всего от уровня системы здравоохранения в различных регионах. В менее социально-экономических развитых странах диагностика РШМ в большей

степени проводится уже на поздней стадии, поэтому регистрируется низкая выживаемость больных. 5-летняя выживаемость среди женщин с диагнозом поздней стадии рака шейки матки примерно на 30% меньше, чем в более развитых странах [110].

Клиническая симптоматика у пациенток с заболеваниями шейки матки, как правило, бывает обусловлена наличием сочетанной патологии матки (эндо- и миометрия). Сочетание миомы матки с аденомиозом и/или гиперпластическим процессом эндометрия у пациенток с ЦИН III (47,6%) и раком шейки матки (59,1%) ф<0,05) встречается значительно чаще, чем сочетание с другими патологиями шейки матки. Данный факт, по-видимому, обусловлен взаимостимулирующим влиянием патологических процессов эндо- и миометрия на состояние шейки матки, которое реализуется через механизмы межклеточных взаимодействий факторов роста [17]. 1.2. Этиология РШМ

Существует несколько факторов риска развития рака шейки матки: курение [36], употребление алкоголя, вирусная инфекция, раннее начало половой жизни, большое количество половых партнеров, частые половые контакты, наличие партнеров, имевших контакты с женщиной, больной раком шейки матки или имеющей аногенитальные кондиломы; беременность, дефицит витаминов A и ^ использование оральных контрацептивов [64], изменение иммунного статуса [107], другие гинекологические заболевания [46, 66].

Однако основным фактором риска развития РШМ является вирус папилломы человека (ВПЧ) [56, 127, 27]. Многолетние исследования установили, что в этиологии предрака и рака шейки матки большое значение имеет вирус papova viridae, тропный к многослойному плоскому эпителию. [25]. Большинство ученых полагают, что тип ВПЧ, субгеномные фрагменты региона E6 и E7, интеграционный статус ДНК у ВПЧ напрямую связаны с канцерогенезом [126, 119, 62]. ВПЧ обнаруживается практически в 99.8% случаев инвазивного рака шейки матки и в более 60% CIN [127].

Вирус папилломы человека (ВПЧ) - семейство мелких ДНК-содержащих вирусов, которые относятся к подгруппе А семейства паповирусов (Papoviridae) и способны инфицировать плоскоклеточный эпителий (или клетки с потенциалом превращения в плоский эпителий). Вирионы ВПЧ имеют сферическую форму, достигая в диаметре до 55 нм, капсид имеет кубический тип симметрии и построен из 72 капсомеров. В составе вириона присутствуют два слоя структурного белка: внутренние белки, соединенные с ДНК, являющиеся клеточными гистонами, и капсидные белки, которые являются типоспецифическими антигенами. Соответствующий ген вируса состоит из early region (E6, E7, E1, E2, E4, E5), later region (L1, L2), long control region (регулирует образование белковых вирусных частиц) [77].

В настоящее время существует около 200 видов ВПЧ, которые классифицируют по генотипам, в зависимости от последовательности генов, кодирующих основной капсидный белок L1. В пределах видов отдельные вирусы

показывают предрасположенность к поражению либо кожи, либо слизистых оболочек, а в пределах этих групп вирусы также могут быть разделены на типы, имеющие высокий или низкий риск в зависимости от канцерогенного потенциала. Пятнадцать типов ВПЧ были определены как типы с высоким онкогенным риском (16-18-31-33-35-39-45-51-52-56-58-59-68-73-82) [53]; в 95% случаев именно они являются причиной возникновения рака шейки матки. Типы 16 и 18 являются наиболее распространенными и обнаруживаются примерно в 70% случаев возникновения всех плоскоклеточных карцином и в 85% всех аденокарцином [90].

Спектр генотипов ВПЧ, ассоциированных с раковыми поражениями шейки матки в различных географических регионах варьирует. Например, при молекулярно-эпидемиологическом исследовании, проведенном среди жительниц Чехии в 1999 году методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), ВПЧ был обнаружен в 44% исследованных образцов. Анализ продуктов ПЦР позволил выявить 22 различных типа ВПЧ. Чаще всего (в 55,0% случаев) в цервикальных образцах присутствовал ВПЧ 16. Смешанная инфекция с различными типами ВПЧ была зафиксирована в 16,4% случаев. У женщин без цитологических цервикальных аномалий ВПЧ-инфекцию обнаруживали в 23,0% случаев, а у женщин с ЦИН - в 59,4% случаев. При этом частота выявления ВПЧ в образцах цервикальных карцином составляла 73,5% [117]. Среди жительниц Китая с цервикальным раком и предраковыми поражениями выявлено широкое распространение инфекции, вызванной ВПЧ 58 [34]. До сих пор точно не

определены степень вирусной нагрузки и длительность нахождения ВПЧ в

организме женщины необходимые для развития РШМ, так как в некоторых

случаях неоплазии возникают после короткого периода персистирования, а

иногда вирус самопроизвольно исчезает после длительного периода нахождения в

организме [82].

1.3. Патогенез РШМ

1.3.1 Роль ВПЧ в канцерогенезе РШМ

Развитие РШМ - это всегда многостадийный процесс. ВПЧ воздействует на эпителиальные клетки базального слоя, поэтому для возникновения инфекции, вызванной ВПЧ, необходимы микроповреждения генитального эпителия. В момент, когда происходит инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ), вирионы достигают базальной мембраны через микротравмы в зоне трансформации. Капсид ВПЧ состоит из основного капсидного белка L1 и малого капсидного белка L2. При проникновении ВПЧ в клетку капсид претерпевает многочисленные изменения конфирмации, что в результате приводит к эндосомальному поглощению вириона и последующему транспорту белка L2 вместе с вирусной ДНК в комплекс Гольджи. [44]. Далее следует первый этап развития инфекционного процесса - репликация. Сперва экспрессируют ранние гены Е1, Е2, Е5, Е6 и Е7, затем происходит снижение их экспрессии и постепенно нарастает экспрессия поздних генов L1 и L2.

При ВПЧ инфекции онкобелки Е6 и Е7 приводят к генетической нестабильности за счет мутаций и вследствие эпигенетических модификаций

(аномальное метилирование), результатом которых является усиленная опухолевая трансформация вирус-инфицированных клеток. Вирусная ДНК может находиться в опухолевых клетках в двух формах - эписомальной и интегрированной. В эписомальной форме вирусная ДНК чаще выявляется на ранних стадиях трансформации, которые являются обратимыми. На поздних стадиях вирусная ДНК находится в интегрированной форме, что часто заканчивается развитием цервикальной карциномы. [7].

Пока вирус находится в клетке в эписомальной форме, происходят доброкачественные процессы разрастания инфицированных тканей. В ходе опухолевой прогрессии вирусный геном интегрируется в геном клетки хозяина путем разрыва ДНК и утраты гена Е2, что сопровождается сверхэкспрессией генов Е6 и Е7, отвечающих за опухолевую трансформацию клеток [8, 9].

Второй этап - преобразование: ДНК ВПЧ интегрируется в ДНК хозяина. Взаимодействие E6 с p53 вызывает убиквитинирование p53, что в результате приводит к протеасомной деградации и предотвращению апоптоза [73, 104]. Супрессоры опухолей - белки семейства Ретинобластомы: Prb, p130 и P107. Они инактивируются при взаимодействии с геном E7, что приводит к высвобождению E2F, который действует на промоторные области некоторых клеточных генов, экспрессия которых специфична для S-фазы клеточного деления, также они и стимулируют активацию клеточного цикла. Отмечено увеличение экспрессии онкобелка Е7 при переходе от ЦИН I к ЦИН III [49].

Важную роль в развитии опухолевых процессов в организме человека играют эпигенетические нарушения экспрессии генов, к которым относят метилирование генов-супрессоров опухолевого роста. В результате аномального метилирования подавляется образование белковых продуктов, необходимых для нормального клеточного цикла, дифференцировки и апоптоза [7]. Метилирование ДНК участвует в регуляции экспрессии тканеспецифичных генов, клеточной дифференцировке, инактивации Х-хромосомы, репликации ДНК, регуляции структуры хроматина, канцерогенезе и старении [14, 19].

Повышенная экспрессия генов Е6 и Е7 приводит к активации патологической пролиферации, ингибированию апоптоза, усилению клеточного деления, неоангиогенеза и инвазии. Кроме того, инициируются процессы генетической нестабильности: в ДНК клетки хозяина возникают генетические мутации и эпигенетические нарушения (аномальное метилирование), что приводит к усиленной опухолевой трансформации клеток [8, 9].

Канцерогенез рака шейки матки, инициируемый вирусами папиллом, можно условно разделить на несколько этапов [10]:

1) первичное инфицирование вирусом;

2) персистенция генома вируса папиллом в эписомальной форме и продукция вирусных частиц с последующей вторичной инфекцией;

3) интеграция вирусной ДНК в клеточный геном без видимой специфичности сайта интеграции; на стадиях II и III начинают проявляться функции Е6 и Е7, нарушается регуляция клеточного деления;

4) индукция мутаций в клеточной ДНК, вызывающих нестабильность клеточного генома;

5) селекция клона клеток с мутантной ДНК, содержащих интегрированную ДНК вирусов папилломы;

6) активное размножение данного клона клеток и рост опухоли.

Такой механизм объясняет тот факт, что от момента первичной вирусной инфекции до появления опухоли шейки матки проходит достаточно длительный срок -5-10 лет.

1.3.2 Роль раковых стволовых клеток в канцерогенез РШМ.

Канцерогенез - это многостадийный процесс, в течение которого нормальная стволовая клетка проходит последовательно несколько стадий, прежде чем станет полностью злокачественной [15, 97, 105]. Процесс канцерогенеза сопровождается различными повреждениями генома стволовых клеток, что способствует развитию рака. Среди этих нарушений ключевую роль играют следующие изменения в ДНК, развивающиеся с возрастом: нестабильность генома, гипометилирование ДНК и образование аддуктов ДНК.

Попытки объяснить такую клеточную гетерогенность базируются, главным образом, на двух моделях канцерогенеза. Стохастическая модель основана на существовании клеточной гетерогенности, происходящей из биологически эквивалентной популяции, как продукт селекции и экспансии клонов клеток, имеющих преимущества роста. Согласно этой теории, любая клетка опухоли способна к формированию новой опухоли [84]. Иерархическая модель, напротив,

основана на том, что клеточная гетерогенность является результатом роста фенотипических и функционально различных клеток. Популяция клеток опухоли подразделяется на различные субпопуляции , называемые стволовыми клетками опухоли , которые являются единственными клетками, способными к образованию новых опухолей и метастазов. [97]. С середины 1990-х годов насчитывается достаточное количество экспериментальных данных, подтверждающих участие раковых стволовых клеток в развитии различных видов рака [95, 55, 115].

В конце XX - начале XXI века Reya T. [97], Crowe DL [38] и.т.д. предложили системную теорию опухолевых стволовых клеток. Считается, что среди опухолевых клеток присутствует минимальное количество клеток со свойствами стволовости, для которых характерны неограниченная пролиферация, самообновление и полипотентность [91].

Раковые стволовые клетки - популяция опухолевых клеток, основным свойством которых служит способность к самовоспроизведению и воспроизведению всех типов клеток в опухоли. Вопрос о происхождении стволовых опухолевых клеток остается нерешенным, однако, можно выделить 3 основные гипотезы их происхождения [18]: 1) из нормальных стволовых клеток;

2) из дифференцированных клеток в результате мутаций и дедифференцировки;

3) при слиянии стволовой и дифференцированной клеток. Основные характеристики раковых стволовых клеток: 1) Способность воспроизводить все типы дифференцированных клеток; 2)Способность к самовоспроизведению и

самоподдержанию собственной популяции, ассимметричное деление (с образованием стволовой и дифференцированной клеток); 3) Способность к неограниченным митотическим делениям [40]; 4) Относительная устойчивость к повреждающим факторам (химической и физической природы), высокая активность систем репарации ДНК, относительно высокая продолжительность жизни, устойчивость к апоптозу [17]; 5) Мощные антиоксидантные системы [42]; 6)Сходство клеточных маркеров [17,18]; 7) Преобладание G0 фазы в клеточном цикле [35, 124]; 8) Способность воспроизводить колонии в чужом организме при определенных условиях [13, 43], а также на питательных средах; 9) Сходство метастазирования и миграции стволовых кроветворных клеток, взаимодействие с нишей стволовых клеток [18, 71]; 10) Сходство биохимических внутриклеточных сигнальных путей Hedgehog, Wnt, Notch; 11) Высокая активность систем АТФ-зависимого выброса ксенобиотиков из цитоплазмы (ABC-транспортеры, АТР-binding cassette, или ЛВС-transporters). Это свойство лежит в основе феномена «side population» (SP, «побочная популяция»); 12)Наличие феномена Label retention cells (LRC; «клетки, содержащие метку») [58]; 13) Высокая активность альдегиддегидрогеназы 1А типа (ALDH 1A) [51, 76]. Очевидно, что основной особенностью стволовых опухолевых клеток, отличающей их от нормальных, является атипизм, связанный с мутациями (в основном, это касается нарушения регуляции клеточного цикла).

Поведение стволовых клеток, в частности поддержание баланса между самообновлением и дифференцировкой, контролируется совместным

воздействием внутренних и внешних сигналов, а также влиянием микроокружения - ниши стволовых клеток (НСК) [81, 61]. Стволовые клетки поддерживаются нишей, общая структура которой может быть различной и состоять из разных групп клеток, имеющих определенную локализацию в ткани. [72].

Попытки идентификации и выделения раковых стволовых клеток начались еще в 1994 году; Лапидот и др. обнаружили клетки, индуцирующие развитие острого миелолейкоза у человека (ОМЛ), и разделили их на фракции в соответствии с экспрессией маркеров на поверхности клеток. [68]. Боннет и др., используя популяции очищенных клеток, обнаружили, что ОМЛ-инициирующие клетки экспрессировали исключительно CD34 и CD38 маркеры [26]. Вслед за этим РСК были идентифицированы в тканях опухолей многих других органов, таких как мозг [110], предстательная железа [37], толстый кишечник [86, 39, 99], эпителий шеи и головы [93], поджелудочная железа [70], печень [135] и кожа [103].

В соответствии с теориями о стволовых клетках опухоли, РШМ можно считать заболеванием, при котором стволовые клетки зоны трансформации преобразуются в опухолевые цервикальные стволовые клетки. Этот процесс является результатом взаимодействия НК-НРУ вирусных онкогенов и поврежденных клеток, что служит триггером канцерогенеза и одним из факторов его поддержания [87]. Современные исследования стволовых клеток опухоли могут дать новый взгляд на процессы инициации и прогрессии канцерогенеза, а

также на взаимоотношения вирусных белков с микроокружением опухоли[75]. Например, ^кадгерин-положительные остеобласты трубчатой кости являются нишей для гемопоэтических стволовых клеток, в то время как клетки эндотелия образуют нишу для нервных стволовых клеток. НСК шейки матки соответствует зоне трансформации.

1.4. Морфологическая характеристика предрака и рака шейки матки

1.4.1. Зона трансформации шейки матки - ниша стволовых клеток шейки

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ли Цзяцзин, 2016 год

СЭМС

Изучение экспрессии р16 и К167 методом двойной окраски р16/ К167

При двойной окраске р16/ К167, СЭМС 1 вида содержали клетки, экспрессирующие только К167, что наблюдалось при хроническом цервиците. В СЭМС 2 вида и 3 вида, клетки экспрессировали одновременно оба маркера. При этом одновременная экспрессия р16/ К167 определялась в 7,5% клеток сфероидов при ЦИН<11, и в 72,5 % при ЦИН>11, а при микроинвазивной карциноме в 55%. В слизистой шейки матки двойная окраска не определяется при хроническом цервиците, экспрессируется только маркер пролиферации Ю67 в виде красного цвета в цитоплазме. А при ЦИН<11, ЦИН>11 и микроинвазивной карциноме, кроме Ю67, еще р16 экспрессируется в ядре коричневым цветом (рис.27). Клетки с двойной окраской определяются в слизистой шейки матки в 12.5%, 67.5% и 82.5% всех клеток слизистой шейки матки при ЦИН<11, ЦИН>11 и микроинвазивной карциноме (Диа.12).

Р16/К167 в слизистой шейки матки

100.00% 90.00% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00% 0.00%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>11 МБСС

Диаграмма 12 Экспрессия р16/К167 в эпителии шейки матки при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

Изучение экспрессии онкомаркера С-МУС

С-МУС выявлялись в виде коричневого цвета, локализуясь в цитоплазме клеток и определялись в 30% клеток СЭМС 1 вида, в 45% и 55% клеткок СЭМС 2 вида и 3 вида, соответственно (рис.28, Диа. 11). С-МУС также экспрессировался в окружающих тканях эпителия шейки матки: в 11% клеток при хроническом цервиците, в 17.5% клеток при ЦИН<11, в 45% клеток при ЦИН>11 и в 45% при микроинвазивной карциноме. Во всем пласте слизистой, экспрессия С-МУС увеличивалась со степенью злокачественности патологии шейки матки (Диа. 13).

Рисунок 28 Экспрессия С-МУС в СЭМС при ЦИН>П, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к С-МУС, х400

С-МУС в слизистой шейки матки

100.00% 90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>11 МБСС

Изучение экспрессии онкомаркера p53

При иммуногистохимическом исследовании с антителами к маркеру p53 была выявлена ядерная экспрессия белка в плоскоклеточном эпителии, крипте шейки матки, особенно в СЭМС 2 вида и 3 вида (рис.29,30).

P53 не обнаруживался в СЭМС 1 вида, выявлялся в 10% клеток СЭМС 2 вида и в 70% клеток СЭМС 3 вида (Диа. 11). В целом в эпителиальном пласте маркер не определялся при хроническом цервиците и при ЦИН<П, при ЦИН>П в 7.5% клеток, а при микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки - в 52.5% всего эпителиального пласта (Диа.14). В окружающем сфероиды эпителии, p53 экспрессируется только при ЦИН>П в 5% клеток и при микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки в 35% клеток (Диа.15).

Таким образом, на основании всех полученных данных и данных литературы [Wang N, Yao Q, Li X, 2004; Kogan E A, Fayzullina N M, Demura T A, 2013], было установлено, что процесс канцерогенеза в шейке матки связан с формированием СЭМС, которые могут быть разделены на 3 вида в соответствии с иммунофенотипом, участием в репаративных СЭМС процессах и опухолевом росте: репаративные, не экспрессирующие р16 и р53, неопластические, экспрессирующие р16 и р53 в единичных клетках, и раковые СЭМС с высокой экспрессией клетками р16 и р53.

В результате проведенного исследования установлено, что высокая экспрессия р53 (70,0%) позволяет проводить дифференциальный диагноз между ЦИН>П и MSCC шейки матки, что совпадает с данными других авторов. Согласно работе

Alan Storey [116], Wang N.[130], при злокачественной трансформации, экспрессия белка p53 увеличивается. Нами были получены новые данные о том, что р53 положительные клетки сосредоточены в основном в СЭМС 2 вида (10%) и в большей степени в СЭМС 3 вида (70%), относящихся к раковым СЭМС. Последнее может быть косвенным подтверждением развития злокачественной трансформации в клетках с признаками стволовости, экспрессирующих Oct-4, р16 и Ki67.

Рисунок 29 Экспрессия р53 в раковом СЭМС при микроинвазивном раке, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к маркеру р53,

Рисунок 30 Экспрессия р53 в раковом СЭМС при микроинвазивном раке, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к маркеру р53, х600

Р53 в слизистой шейки матки

100.00% 80.00% 60.00%% 40.00%% 20.00%% 0.00%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>11 МБСС

0.00% 0

7.50%%

Р53 в окружающем сфероиды эпителии

100.00%

80.00%

60.00%%

40.00%% 3,00%

20.00%% 0.00% 0.00%% 0.00%% 5.°°%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>11 МБСС

Диаграмма 15 Экспрессия р53 в окружающем сфероиды эпителии шейки матки при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

Изучение HIF-1 и VEGF

Одновременно с р53 нами были исследованы экспрессия маркеров: НШ-1 и УЕОБ. Известно, что р53 оказывает влияние на НШ-1 и УЕОБ, в результате чего может стимулировать процесс ангиогенеза при новообразованиях шейки матки [108, 102]. В ходе исследования в СЭМС 1 вида экспрессия р53 не выявлялась, но обнаруживалась экспрессия НШ-1 в 25% клеток и экспрессия УЕОБ в 35%; в СЭМС 2 вида экспрессия р53 была выявлена у 10% клеток, НШ-1 - в 60% и УЕОБ - в 50%; и в СЭМС 3 вида, р53 экспрессировали 70% клеток, НШ-1 и УЕОБ экспрессировали 70% и 92,5%, соответственно (Диа.11,16,17).

При иммуногистохимическом исследовании материала с использованием антител к НШ-1 было обнаружено мембранное и диффузное ядерное окрашивание в слизистой шейки матки, как в СЭМС, так и в окружающем сфероиды эпителии (рис.31, 32). Результаты, представленные на рисунках 48 - 49 показали, что при

увеличении степени злокачественности отмечается повышение экспрессии НШ-1 не только внутри, но и вне СЭМС: в слизистой шейки матки, в окружающем СЭМС эпителии шейки матки.

Рисунок 31 Экспрессия НШ-1 в репаративном СЭМС при хроническом цервиците, иммуногистохимическое исследование с использованием антитела к НШ-1, х600

• * Р Фф * • И

Ь • •# |

- 0 > ; * * .СУ г ■ %%

ь§ / У, ^ * ч< ш

м # • # ф л 4 Л • # ® «%# V • # •; ) ' ■ ' л Ш £ ГШ 'Л' ' * У. % ^ 94 ™ IV

• а 4 ' ' * * Наг * ' * % У*4, *

> ' Г 0

1 ' ^

Ш ■

»ь ^ " 'А1 " л С* ** т 1 .'л г К ~ Г

* -/ Н ' "«V/ г» ^ , «у / , Ж- •

¥ С

* ^ Кйл. 7 „ : •к _ - - и -А л.

V • МГ

Н1Р-1 в слизистой шейки матки

100.00% 90.00%% 80.00% 70.00%% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>11 МБСС

Диаграмма 16 Экспрессия НШ-1 в эпителии шейки матки при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

Н1Р-1 в окружающем сфероиды эпителии

100.00% 90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>11 МБСС

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии УЕОБ в наблюдаемых нами случаях выявлялось гранулярное окрашивание цитоплазмы в эндотелиальных клетках. Было отмечено повышение экспрессии УЕОБ при ЦИН>11 и при микроинвазивной плоскоклеточной карциноме (рис.33,34). Помимо СЭМС, УЕОБ также определяются в окружающем сфероиды эпителии в 22.5%, 18.5%, 37.5% и 75.0% от всех клеток при хроническом цервиците, ЦИН<11, ЦИН>11 и микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки (Диа.18,19).

Полученные в исследовании данные имеют соответствующие подтверждения в научной литературе [69, 83] о том, что процесс ангиогенеза в слизистой, а также в сфероидах начинается даже при хроническом цервиците, и увеличивается со степенью злокачественности патологии.

Рисунок 34 Экспрессия УЕОБ в раковом СЭМС примикроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к УЕОБ, х600

УБвР в слизистой шейки матки

100.00% 90.00% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

СИСег ЦИН<11 ЦИН>!! МБСС

УБвР в окружающем сфероиды эпителии

100.00%% 90.00%% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

СИСег ЦИН<!! ЦИН>!! МБСС

Диаграмма 19 Экспрессия УЕОБ в окружающем сфероиды эпителии шейки матки при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

Изучение экспрессии ALDH 1 и CD34

Помимо ОСТ4, нами также была изучена экспрессия и других маркеров стволовости: ЛЬБИ 1, СБ34. При этом было выявлено, что многие СЭМС локализуются в зоне трансформации шейки матки, являющейся нишей стволовых клеток, и располагаются преимущенно на базальном слое слизистого эпителия шейки матки.

В наблюдаемых нами случаях, обнаруживалась диффузная экспрессия ЛЬЭШ в отдельных клетках СЭМС, в виде гранулярной окрашенной цитоплазмы. (Рис.35,36) В результате, экспрессия СЭ34 отмечалась в эндотелии капилляров СЭМС, продукт реакции локализовался в цитоплазме эндотелиальных клеток в

центре СЭМС или в инвагинированных кровеносных капиллярах вблизи базальной мембраны. (Рис.37,38) Клетки, экспрессирующие маркеры стволовости, были обнаружены в зонах СЭМС разного вида: ЛЬБИ была обнаружена в 0.25% клеток СЭМС 1 вида, в СЭМС 2 вида - в 30%, в СЭМС 3 вида - в 40%. В клетках репаративных и неопластических СЭМС экспрессия СЭ34 не определяется, в то время как в раковых СЭМС определяется в 50% эпителиальных клеток (Диа. 24).

В окружающем сфероиды эпителии, ЛЬЭИ 1 и СЭ34 почти не определяются при хроническом цервиците и ЦИН<11. При ЦИН>11, маркер ЛЬБИ 1 экспресировался в 20% клеток, СБ34 экспрессировался в 70% клеток. При микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки, ЛЬЭИ 1 определялся в 35% клеток, а СБ34 в 55% клеток. (Диа.21,23) В целом, в отношении всего пласта слизистой, при хроническом цервиците и ЦИН<11 ЛЬЭИ 1 и СЭ34 имели низкую экспрессию (<10% всех клеток), высокая экспрессия (> 30% клеток) наблюдалась при ЦИН>11 и микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки (Диа.20,22).

В литературе обсуждается роль клеток, экспрессирующих маркеры стволовости, в развитии предрака и рака различных органов и тканей, например, универсального маркера костномозговых стволовых клеток, таких как АЬЭИ1 [74] и СЭ34 [26, 136]. На основе наших данных, клетки со свойствами стволовости появляются на стадии ЦИН>11, а значит в предраковом периоде часть из них уже завершает злокачественную трансформацию.

Рисунок 35 Экспрессия ЛЬБИ в неопластическом СЭМС при ЦИН>11, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к ЛЬЭИ, х600

Рисунок 37. Экспрессия СЭ34 в репаративном СЭМС при хроническом цервиците, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к СЭ34, х400

Рисунок 38 Экспрессия СБ34 в раковом СЭМС при ммикроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к УЕОБ, х400

100.00% 90.00% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

ALDH в слизистой шейки матки

СИСег

ЦИН<11

ЦИН>!!

МБСС

Диаграмма 20. Экспрессия ЛЬЭН 1 в эпителии шейки матки при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

100.00%% 90.00%% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

ALDH в окружающем сфероиды эпителии

СИСег

ЦИН<!!

ЦИН>!!

МБСС

Диаграмма 21. Экспрессия ALDH в окружающем сфероиды эпителии шейки

CD34 в слизистой шейки матки

100.00%% 90.00%% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

СИСег ЦИН<!! ЦИН>!! МБСС

Диаграмма 22. Экспрессия СЭ34 в эпителии шейки матки при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

CD34 в окружающем сфероиды эпителии

100.00%% 90.00%% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

СИСег ЦИН<!! ЦИН>!! МБСС

Изучение экспрессии Vim

В СЭМС 1 вида Vim определяется в 40% клеток, в СЭМС 2 вида определяется в 70% клеток и СЭМС 3 вида определяется в 75% клеток. (Диа.24, Рис.39) При оценке целого эпителиального пласта было установлено, что Vim определялся в 21.5% клеток при хроническом цервиците, в 32.5% клеток при ЦИН<11, при ЦИН>11 в 38.5% клеток, а при микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки - в 45% клеток всего эпителиального пласта.

В окружающем сфероиды эпителии Vim почти не определялся. (Диа.25)

80.00% 70.00% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%

70%

75%

ALDH CD34 Vim

репаративные неопластические раковые СЭМС СЭМС СЭМС

Диаграмма 24. Экспрессия маркёров стволовости в СЭМС разных видов.

Vim в окружающем сфероиды эпителии

100.00%

50.00%

0.00%

3.00%

7.00%

15.00%

ChCer

ЦИН<М

ЦИН>П

MSCC

Диаграмма 25. Экспрессия Vim в окружающем сфероиды эпителии шейки матки

Рисунок 39. Экспрессия Vim в раковом СЭМС при микроинвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к Vim, х 100

Изучение экспрессии ОТКВ

Экспрессия №ХВ при ВПЧ-ассоциированных патологиях шейки матки разной степени почти не отличается друг от друга, так, в СЭМС разных видов и во вне сфероидных зонах имеется его высокая экспрессия. Результаты представлены на рисунке 40 и в диаграммах 26,27,28.

Рисунок 40. Экспрессия №КВ в репаративном СЭМС при хроническом цервиците, иммуногистохимическое исследование с использованием антител к №КВ, х400

100.00% 90.00% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

№КВ в слизистой шейки матки

СИСег ЦИН<11 ЦИН>!! МБСС

№КВ в сфероидах

100.00%% 90.00%% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

СИСег

ЦИН<!!

ЦИН>!!

МБСС

Диаграмма 27. Экспрессия №КВ в сфероидах при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки.

100.00%% 90.00%% 80.00%% 70.00%% 60.00%% 50.00%% 40.00%% 30.00%% 20.00%% 10.00%% 0.00%%

№КВ в окружающем сфероиды эпителии

СИСег ЦИН<!! ЦИН>!! МБСС

Проведенное исследование также показало, что в образовании СЭМС принимают участие клетки, сохраняющие экспрессию маркеров стволовости (Oct-4, ALDH, CD34, Vim), т.е. клетки неполностью или частично дифференцированные. При этом можно предположить, что в репаративных СЭМС речь идет о потомках нормальных стволовых клеток. Тогда как, в неопластических и раковых СЭМС, построенных из атипичных клеток, экспрессирующих одновременно онкомаркеры (р16, р53, с-myc) и маркеры стволовости (Oct-4, ALDH, CD34, Vim), можно предположить, что данные клетки являются потомками трансформированной нормальной стволовой клетки, или раковых стволовых клеток. Следовательно, можно предположить, что раковые стволовые клетки могут образовываться уже на стадии ЦИН<П, что важно учитывать при лечении предрака шейки матки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

РШМ является в настоящее время одним из самых распространенных злокачественных новообразований у женщин, занимая 7-е место среди всех злокачественных опухолей и 3-е место среди рака у женщин (после рака молочной железы и рака толстой кишки). РШМ составляет 9,8% от всех злокачественных опухолей у женщин [16]. Многолетними исследованиями установлено, что в этиологии предрака и рака шейки матки большое значение имеет ВПЧ, принадлежащий к семейству papova viridae и имеющий тропность к многослойному плоскому эпителию. [25]. Большинство ученых считают, что при ВПЧ-инфекции, в результате мутаций и эпигенетических модификаций, онкобелки Е6 и Е7 приводят к генетической нестабильности, вследствие чего запускается процесс канцерогенеза и развитие РШМ. [126]. ВПЧ был обнаружен практически в 99.8% случаев инвазивной карциномы шейки матки и более чем в 60% случаев (ЦИН). [127]. От момента первичной вирусной инфекции до появления рака шейки матки проходит достаточно длительный срок: 5-10 лет. Поэтому профилактику РШМ можно проводить с посредством ранней диагностики, правильного скрининга и вакцинации. В тех странах, где качество и распространенность скрининга высока, отмечается снижение частоты заболеваемости инвазивным раком шейки матки на 90% [5]. На сегодняшний день, маркёры и методы для эффективной диагностики и скрининга РШМ, особенно для транзиторной инфекции, остаются спорными. Программы для скрининга рака шейки матки на основе цитологии показали снижение заболеваемости и

смертности, вызванной этим новообразованием. [21]. Однако цитология обнаруживает большое количество пациентов с клеточными аномалиями, такими как ASC-US и L-SIL, с относительно низким риском, с поражениями высокой степени, в результате чего требуется дальнейшее обследование [60]. Хотя ВПЧ-тестирование показало свою эффективность в скрининге женщин с ASC-US и L-SIL. Было обнаружено, что большинство ВПЧ-инфекций носит транзиторный характер [83, 131]. Для эффективности скринингового теста и ранней диагностики РШМ необходимо найти методы с достаточной специфичностью, чувствительностью. Канцергенз РШМ в настоящем времени рассматривается с патологических ниш стволовой клетки и образованием раковых стволовых клеток, а также с образованием сфероидных структур in vitro и in vivo. Сфероидные структуры впервые были описаны в культурах стволовых клеток и активно используются в тканевых принтерах для воссоздания тканей. В 1992г., клетки выделенные из полосатого тела мышей, пролиферировали in vitro под воздействием фактора роста, путём образования сфероидных структур [98]. Похожие сфероидные эпителиально-мезенхимальные структуры, включающие раковые стволовые клетки обнаруживаются in v^ при предраке и раке у человека. Также было обнаружено формирование СЭМС в плоском эпителии при ВПЧ-ассоциированном хроническом цервиците и ЦИН, клетки которых экспрессируют маркер эмбриональных стволовых клеток Oct-4 [12].

трансформации шейки матки на фоне ВПЧ-инфекции.

Для решения данного вопроса, были сформированы следующие задачи:

1) Сравнить чувствительность и специфичность цитологического метода и ВПЧ-тестирования методом полимеразной цепной реакции в настоящем времени (ПЦР-НВ) при ранней диагностике предрака и рака шейки матки у женщин до и после 30 лет.

2) Оценить чувствительность и специфичность комплекса методов ранней диагностики предрака и рака шейки матки у женщин: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания р16/Ю67 и ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ.

3) Оценить морфологические и иммуногистохимические характеристики СЭМС разных видов, обнаруженых при репаративных и предраковых ВПЧ-ассоциированных патологических процессов в шейке матки.

4) Определить наиболее значимые дифференциренциально-диагностические морфологические признаки и молекулярные маркеры репаративных и предраковых процессов на фоне ВПЧ-инфекции.

Научная новизна предлагаемой темы заключается в комплексном морфологическом и молекулярно-генетическом исследовании процессов репарации и предраковых изменениях эпителия при ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки, включающей хронический цервицит, плоскую кондилому, ЦИН разной степени и микроинвазивный рак. Проведенное исследование показало, что канцерогенез и морфогенез ВПЧ-ассоциированного плоскоклеточного рака

шейки матки - это многостадийный процесс, который связан с последовательным развитием структурных изменений, характеризующихся образованием О^4-позитивных репаративных, неопластических и раковых СЭМС. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<11, характеризуются отсутствием клеточного атипизма и экспрессии р53, выявляется низкая экспрессия маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim) и онкомаркеров (P16, C-MYC), а также маркера гипоксии HIF-1. Неопластические СЭМС встречаются при ЦИН<П и ЦИН>П, их клетки характеризуются признаками клеточного атипизма и высокой экспрессией маркеров стволовости ALDH, CD34, Vim, онкомаркеров P16, C-MYC и маркера гипоксии HIF-1. Раковые СЭМС обнаруживаются в MSCC, нередко сливаются в крупные конгломераты, формируются вне зависимости от расположения сосудов. Они построены из раковых клеток и характеризуются высокой экспрессией маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim), онкомаркеров (P16, C-MYC, P53) и маркера гипоксии (HIF-1). Также в неопластических и раковых СЭМС определяются атипичные клетки, экспресирующие одновременно онкомаркеры и маркеры стволовости.

Наше исследование позволило найти эффективные методы для ранней диагностики, скрининга РШМ и выяснить связи СЭМС между канцерогенезом и раковыми стволовыми клетками.

С целью создания групп было проведено клинико-морфологическое исследование материала от 4672 женщин в возрасте от 17 до 56 лет (средний возраст 36,5 ±4.5 лет), проходивших обследование и лечение в ФГБУ «Научный

центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова» Минздрава РФ в 2013, 2014 и 2015 годах. Обследование всех 4672 женщин проводили по общепринятому протоколу - клинический осмотр, взятие мазков в SurePath виалы (BD, США), приготовление цитологических препаратов, окрашенных по Папаниколау, с помощью TriPath процессора (BD, США), оценка мазков по системе "Bethesda" [Solomon D., Davey D., Kurman R., 2002]. В результаты были отобраны 3 группы женщин:

1) 91 женщина для оценки эффективности ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ и жидкостной цитологии при выявлении ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии у женщин до 30 лет и старше.

2) 148 женщин для оценки чувствительности и специфичности иммуноцитохимии с двойной окраской р16/К1-67 при ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии.

3) 61 женщина для изучения морфологоческих и иммуногистологических особенностей СЭМС разных видов.

Ткань фиксировали в 10% нейтральном формалине, готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и использовали для иммуногистохимических реакций по общепринятым методикам (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004), В качестве первичных антител применялись моноклональные антитела к онкомаркерам -- P53 (RTU, клон DO-7 RTU, N158187-2, DAKO), C-Myc (clone Y69, Abcam), антитела для двойной окраски p16/Ki67 (CINtec PLUS cytology kit, Рош); антитела к маркерам гипоксии и

ангиогенеза -- HIF1-alpha (клон 241812, R&D Systems), VEGF (clone EP1176Y, ab52917, Abcam), к маркерам стволовости - Oct-4 (MRQ-10, 309M-15,CELL MARQUE CORPORATION), Aldh1A1 (clone EP1933Y, cat. GTX61645, GeneTex), CD34 (Class II, clone QBEnd 10, DAKO), Vimentin (clone V9 RTU, DAKO), а также NF-kB (clone E379, Abcam). Ядра докрашивали гематоксилином. Ставились положительные и отрицательные контрольные реакции. Результаты оценивали по количеству окрашенных эпителиальных клеток СЭМС и прилежащего плоского эпителия в процентном соотношении из расчета на 300 клеток. Для статистического анализа, размерили глубину инвазии при MSCC и площади разных видов СЭМС с помощью программы cellSens Standard. Обработку результатов проводили с помощью ROC-анализа, также применяли непараметрический метод для малых выборок по Манну-Уитни.

На первом этапе, оценивали диагностическую значимость ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВ, жидкостной цитологии c РАР при ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии у женщин до 30 лет и старше. Обследовали цитологический, биопсийный, операционный материал от 91 пациентки, из которых 35 женщин были в возрасте до 30 лет и 56 пациенток старше 30 лет. Использовали методы ПЦР-НВ, жидкостной цитологии, гистологии и ИГХ р16(INK4A)/Ki67. Эффективность выявления ЦИН2+ у пациенток до 30 лет и старше 30 лет с использованием ДНК ВПЧ-тестирования составила: чувствительность - 81,8% и 90,5% , специфичность - 30,4% и 47,2 %; с

использованием жидкостной цитологии: чувствительность - 45,5% и 71,4%, специфичность - 100,0% и 97,2 %.

Не втором этапе, оценивали эффективности двойного окрашивания p16/Ki67 в сочетании с жидкостной цитологией и ВПЧ тестированием при выявлении цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки. Обследовали цитологический и биопсийный материал 148 женщин с патологией шейки матки методами жидкостной цитологии, ИЦХ с двойной окраской р16/К167 и ВПЧ-тестирования. Максимальная эффективность цитологического метода была выявлена в случаях CIN > 2 (чувствительность 96,97% и специфичность 100%), ВПЧ-тестирования —CIN < 2 ( 97,14%, 50,0%), ИЦХ - CIN > 2 ( 98,48%, 100,0%).

На третьем этапе, изучили морфологические и иммунофенотипические особенности СЭМС при ВПЧ-ассоциированном плоскоклеточном предраке и раке шейки матки. Проводили гистологическое исследование материала от 61 пациентки с цитологической и ПЦР диагностикой ВПЧ-ассоциированной патологии шейки матки: хронический цервицитом (15 женщин), ЦИН<11 (12 женщин), ЦИН>11 (25 женщин), и микро-инвазивной плоскоклеточной карциноме шейки матки (9 женщин). На серийных парафиновых срезах проводили иммуногистохимические реакции с моноклональными антителами к p53, C-Myc, HIF1-alpha, VEGF, NF-kB, Oct-4, AldhlAl, CD34, Vimentin и антител для двойной окраски p16/Ki67. Обнаружены три вида Oct4 позитивных СЭМС: репаративные, неопластические и раковые, участвующие в репаративных процессах и опухолевом росте, соответственно. Репаративные СЭМС встречаются при

хроническом цервиците и L-SIL, формируются вблизи и на территории акантотических тяжей вокруг сосудов, в них отсутствует клеточный атипизм и экспрессия р53, наблюдается низкая экспрессия P16, C-MYC, ALDH, CD34, Vimentin. Неопластические СЭМС встречаются при L-SIL и H-SIL, формируются вне связи с сосудами, клетки обладают признаками клеточного атипизма и высокой экспрессии ALDH, CD34, Vimentin и онкомаркеров P16, C-MYC. Раковые СЭМС обнаруживаются в MSCC, нередко сливаются в крупные конгломераты, формируются вне зависимости от расположения сосудов, построены из раковых клеток и обладают высокой экспрессией P16, C-MYC, P53, ALDH, CD34 и Vimentin,.

Таким образом, с помощью данного исследования можно предложить что, канцерогенез и морфогенез ВПЧ-ассоциированной плоскоклеточной карциномы шейки матки связан с последовательным развитием структурных изменений, характеризующихся образованием О^4-позитивных репаративных, неопластических и раковых эпителиально-мезенхимальных сфероидных структур.

ВЫВОДЫ

должна базироваться на комплексе цитологического метода с ИЦХ исследованием экспрессии белков р16(ШК4А)/Ю67 и ДНК ВПЧ тестировании в зависимости от возраста пациентки. При обследовании женщин моложе 30 лет обследование должно начинать с жидкостной цитологии, а старше 30 лет -с ВПЧ тестирования.

2. Проблему диагностики и скрининг предрака и рака шейки матки можно эффективно решить за счет использования комплекса методов - жидкостной цитологии, ВПЧ тестирования и ИЦХ с двойной окраской р16/Ю67.

3. Канцерогенез и морфогенез ВПЧ-ассоциированного плоскоклеточной карциномы шейки матки связан с последовательным развитием структурных изменений, характеризующихся образованием Ое14-позитивных репаративных, неопластических и раковых эпителиально-мезенхимальных сфероидных структур.

4. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<11,

2

средняя площадь их составляет 1141.1±305.0 mkm2, они формируются вблизи и на территории акантотических тяжей вокруг сосудов, характеризуются отсутствием клеточного атипизма и экспрессии р53, выявляется низкая экспрессия маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim) и онкомаркеров (P16, C-MYC), а также маркера гипоксии HIF-1.

5. Неопластические СЭМС, средняя площадь которых составляет 2553.9±656.2

л

атипизма и высокой экспрессией маркеров стволовости ALDH, CD34, Vim, онкомаркеров P16, C-MYC и маркера гипоксии HIF-1.

6. Раковые СЭМС обнаруживаются в MSCC, их средняя площадь составляет

л

7308.7±3031.3 mkm2. Раковые СЭМС нередко сливаются в крупные конгломераты, формируются вне зависимости от расположения сосудов, построены из раковых клеток и характеризуются высокой экспрессией маркеров стволовости (ALDH, CD34, Vim), онкомаркеров (P16, C-MYC, P53) и маркера гипоксии (HIF-1).

7. В неопластических и раковых сфероидах определяются атипичные клетки и одновременно онкомаркеры и маркеры стволовости. Раковые стволовые клетки, вероятно, проявляются уже на стадии ЦИН>П в зонах неопластических эпителиально-мезенхимальных сфероидных структур.

1. Аксель Е М. Статистика злокачественных новообразований женской половой сферы[1]. Онкогинекология, 2012, 1: 18-23.

2. Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. - М.: РУДН, 2008. - 109 с.

3. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1 / Под ред. М.А. Пальцева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - 272 с.: ил. - (Учеб. Лит. Для студ. мед. вузов).

4. Бурлев В. А. Пролиферативная и ангиогенная активность эутопического и эктопического эндометрия у больных с перитонеальной формой эндометриоза //Пробл репрод. - 2006. - Т. 1. - С. 78-87.

5. Весна Кезик. Скрининг рака щейки матки. ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ • Т. 10, № 2 - 2009; С. 59-61.

6. Дмитриева Е. В. и др. Роль системы Рав/РаБ-Ь в индукции апоптоза гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах //Архив патологии. - 2003. - Т. 65. - №2. 6. - С. 13-17.

7. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бочков Н.П. Метилирование ДНК как этиологический фактор канцерогенеза. Вестник РАМН. М., 2002. №4. С. 6-11.

8. Киселев В.И., Аполихина И.А., Муйжнек Е.Л. и др. Патогенетические подходы к лечению ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки. Патология шейки матки и генитальные инфекции под ред. В.Н.Прилепской. М., «МЕДпресс-информ», 2008. С.87-94.

9. Киселев В.И., Ашрафян Л.А., Бударина С.О., Киселев О.И, Пальцев М.А., Кулаков В.И., Прилепская В.Н. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы, возможности терапии профилактики. М.: «Медиа Медика». Гинекология, 2004; Т. 6, №4. С. 174-180.7; 8

10. Киселев Ф.Л. РФФИ и исследования по молекулярным механизмам опухолевых заболеваний // Врач. 1997. № 8.С. 32-33.

11. КОГАН Е А, ФАЙЗУЛЛИНА Н М, ДЕМУРА С А, ^ а1. РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ НИШИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЭНДОЦЕРВИКСА ПРИ ВПЧ-АССОЦИИРОВАННОМ ПРЕДРАКЕ И МИКРОИНВАЗИВНОМ РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИЦ]. Акушерство и гинекология, 2012 (7): 54-58.

12. Коган Е.А., Файзуллина Н.М., Ли Ц. и др. Эффективность диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки с использованием комплекса методов: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания р16/Ю67 и ВПЧ тестирования // Акушерство и гинекология.- 2014.-Ы7.- С. 43-47.

13. Кузнецов С.Л. Мушкамбаров Н.Н. «Гистология, цитология и эмбриология». Учебник для медицинских вузов. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2005 г. - 600 с. Стр. 74., 309-310.

14. Лихтенштейн А.В., Киселева Н.П. Биохимия. М. , 2001. 66 (3). С. 657-69.

16. Новик В И. Скрининг рака шейки маткиЦ]. Практическая онкология, 2010, 11(2): 66-73.

17. Пальцев М А, Иванов А А. Межклеточные взаимоотношения^]. Москва: Медицина, 1995.

18. Пальцев М.А. Аничков Н.М. «Патологическая анатомия». Учебник в 2 т.Т.2. Ч. 1 - М. Медицина, 2001. - 736 с.: ил. - (Учеб. Лит. Для студ. мед. вузов).

19. Подистов Ю.И., Лактионов К.П., Петровичев Н.И., Брюзгин В.В.Эпителиальные дисплазии шейки матки (диагностика и лечение). М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006.10;15

20. Altshuler D. et al. A haplotype map of the human genome //Nature. - 2005. - Т. 437. -№. 7063. - С. 1299-1320.

21. Arbyn M, Raifu AO, Weiderpass E, Bray F, Anttila A. Trends of cervical cancer mortality in the member states of the European Union. Eur J Cancer. 2009;45:2640-2648.

22. Arbyn M., Roelens J., Buntinx F. Human papillomavirus testing versus repeat cytology for triage of minor cytological cervical lesions // Cochrane Database Syst Rev. -2013.-Vol.28.-N3.-CD008054.

23. Arbyn M., Roelens J., Cuschieri K. et al. The APTIMA HPV assay versus the Hybrid Capture 2 test in triage of women with ASC-US or LSIL cervical cytology: A meta-analysis of the diagnostic accuracy // Int J Cancer.- 2012.-Vol. 132.-P. 101-108.

24. Bergeron C., Giorgi-Rossi P., Cas F. et al.Informed cytology for triaging HPV-positive women: substudy nested in the NTCC randomized controlled trial // J Natl Cancer Inst. - 2015.- Vol.107, N2. - dju 423.

25. Bollmann R, Mehes G, Torka R, et al. Human papillomavirus typing and DNA ploidy determination of squamous intraepithelial lesions in liquid - based cytologic samples[J]. Cancer Cytopathology, 2003, 99(1): 57-62.

26. Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 1997; 3: 730-7.

27. Bosch F X, Lorincz A, Munoz N, et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer[J]. Journal of clinical pathology, 2002, 55(4): 244-265.

28. Boulet GAV. Horvath CAJ. Berghmans S. Bogers J. Human papillomavirus in cervical cancer screening: important role as biomarker. Cancer epidemiology. Biomarkers & prevention: a publication of the American Association for Cancer Research. Cosponsored by the American Society of Preventive Oncology 17:810-817.

29. Burlev V. A., Il'yasova N. A., Dubinskaya E. D. Proliferative activity of microvessels and angiogenesis in eutopic endometrium in patients with peritoneal endometriosis //Bulletin of experimental biology and medicine. - 2005. - T. 139. - №. 6. - C. 727-731.

31. Carmeliet P. et al. Synergism between vascular endothelial growth factor and placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in pathological conditions //Nature medicine. - 2001. - T. 7. - №. 5. - C. 575-583.

32. Castle P.E., Sadorra M., Lau T., et al. Evaluation of a prototype real-time PCR assay for carcinogenic human papillomavirus (HPV) detection and simultaneous HPV genotype 16 (HPV16) and HPV18 genotyping // J Clin Microbiol. - 2009. - Vol.47. - P.3344 - 3347.

33. Cervical cancer leaflet -http://publications.cancerresearchuk.org/cancertype/cervical/cervicalleaflet.html

34. Chan P.K., Li W.H., Chan M.Y et al. High prevalence of human papillomavirus type 58 in Chinese women with cervical cancer and precancerous lesions // J Med Virol.-1999, Oct.- 59(2).- 232-238.

35. Cheng, T. Rodrigues, N. Shen, H. Yang, Y. Dombkowski, D. Sykes, M. Scadden, D. T. (2000). Hematopoietic stem cell quiescence maintained by p21cip1/waf1. Science 287, 1804-1808.

36. CLARKE E A, MORGAN R W, NEWMAN A M. Smoking as a risk factor in cancer of the cervix: additional evidence from a case-control study[J]. American journal of epidemiology, 1982, 115(1): 59-66.

37. Collins AT, Berry PA, Hyde C, Stower MJ, Maitland NJ. Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells. Cancer Res 2005; 65: 10946-51.]

39. Dalerba P, Dylla SJ, Park I-K, et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 10158-63.

40. Dalerba P., Cho R. W. Clarke M.F. Cancer stem cells: model and concepts//Annu. Rev. Med. - 2007. Vol. 58. - P. 267-284.

41. Danial N. N., Korsmeyer S. J. Cell death: critical control points //Cell. - 2004. - T. 116. - №. 2. - C. 205-219.

42. Dernbach, E, Urbich, C, Brandes, RP, Hofmann, WK, Zeiher, AM and Dimmeler, S (2004). Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood 104: 3591-3597.

43. Dick, J.E. Stem cell concepts renew cancer research. Blood 2008, 112, 4793-4807.

44. DiGiuseppe S, Keiffer T R, Bienkowska-Haba M, et al. Topography of the human papillomavirus minor capsid protein L2 during vesicular trafficking of infectious entry[J]. Journal of Virology, 2015, 89(20): 10442-10452.

45. Duesing N., Schwarz J., Choschzick M. et al. Assessment of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) with colposcopic biopsy and efficacy of loop electrosurgical excision procedure (LEEP) // Arch Gynecol Obstet. - 2012. -Vol.286. -P. 1549-1554.

46. Eifel P J, Burke T W, Morris M, et al. Adenocarcinoma as an independent risk factor for disease recurrence in patients with stage IB cervical carcinoma[J]. Gynecologic oncology, 1995, 59(1): 38-44.

47. Fang D, Nguyen TK, Leishear K, et al. A Tumorigenic Subpopulation with Stem Cell Properties in Melanomas. Cancer Res 2005; 65: 9328-37.

48. Fawcett T. An introduction to ROC analysis //Pattern Recognition Letters.- 2006. -Vol.27.-P. 861—874.

49. Fiedler M., Muller-Holzner E., Viertler H.P. et al. (2004) High level HPV-16 E7 oncoprotein expression correlates with reduced pRb-levels in cervical biopsies. FASEB J, 18(10), 1120-1122.26

50. Garraway IP, Sun W, Tran CP, et al. Human prostate sphereforming cells represent a subset of basal epithelial cells capable of glandular regeneration in vivo. Prostate 2010; 70: 491-501.

51. Ginestier C, Hur MH, Charafe-Jauffret E et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell 2007;1:555-567.

52. Girardi F, Burghardt E, Pickel H. Small FIGO stage IB cervical cancer[J]. Gynecologic oncology, 1994, 55(3): 427-432.

53. Guan P, Howell - Jones R, Li N, et al. Human papillomavirus types in 115,789 HPV

- positive women: A meta - analysis from cervical infection to cancer[J]. International Journal of Cancer, 2012, 131(10): 2349-2359.

54. Hermann PC, Huber SL, Herrler T, et al. Distinct Populations of Cancer Stem Cells Determine Tumor Growth and Metastatic Activity in Human Pancreatic Cancer. Cell Stem Cell 2007; 1: 313-23.

55. Hibi K, Takahashi T, Sekido Y, et al. Coexpression of the stem cell factor and the c-kit genes in small-cell lung cancer[J]. Oncogene, 1991, 6(12): 2291-2296.

56. Ho G Y F, Burk R D, Klein S, et al. Persistent genital human papillomavirus infection as a risk factor for persistent cervical dysplasia[J]. Journal of the National Cancer Institute, 1995, 87(18): 1365-1371.

57. Ho GY, Bierman R, Beardsley I, Chang CJ, Burk RD. Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women. The New England journal of medicine 1998;338:123-128.

58. Hong-Wu Xin et al.: Tumor-Initiating Label-Retaining Cancer Cells in Human Gastrointestinal Cancers Undergo Asymmetric Cell Division, STEM CELLS, 30: 591-598. doi: 10.1002/stem.1061, 22 MAR 2012.

59. Jacobs M V, Snijders P J, Voorhorst F J, et al. Reliable high risk HPV DNA testing by polymerase chain reaction: an intermethod and intramethod comparison[J]. Journal of clinical pathology, 1999, 52(7): 498-503.

60. Jaume O, Amaia S, Meritxell M. Usefulness of p16/ki76 immunostaining in the triage of women referred to colposcopy. Cancer Cytopathology. 2014;122:227-35.

61. Jones D L, Wagers A J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2008, 9(1): 11-21.

62. Kim M S, Bak Y, Park Y S, et al. Wogonin induces apoptosis by suppressing E6 and E7 expressions and activating intrinsic signaling pathways in HPV-16 cervical cancer cells[J]. Cell biology and toxicology, 2013, 29(4): 259-272.

63. Kim M.-J., Kim J.J., Kim S. Type-specific prevalence of high-risk human papillomavirus by cervical cytology and age: Data from the health check-ups of 7,014 Korean women // Obstet Gynecol Sci.-2013.-Vol.56.-N2.-P.110-120.

64. Kjellberg L, Hallmans G, Ähren A M, et al. Smoking, diet, pregnancy and oral contraceptive use as risk factors for cervical intra-epithelial neoplasia in relation to human papillomavirus infection[J]. British journal of cancer, 2000, 82(7): 1332.

65. Kogan E A, Fayzullina N M, Demura T A, et al. Reparative Spheroids in HPV-Associated Chronic Cervicitis[J].

66. Koskela P, Anttila T, Bjorge T, et al. Chlamydia trachomatis infection as a risk factor for invasive cervical cancer[J]. International journal of cancer, 2000, 85(1): 35-39.

67. Kurian E.M., Caporelli M.L., Baker S. et al. Cervista HR and HPV 16/18 assays vs Hybrid Capture 2 assay. Outcome comparison in women with negative cervical cytology //Am J Clin Pathol.- 2011.-Vol.136.-P. 808-816.

68. Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994; 367: 645-48.

69. Lee W Y, Huang S C, Hsu K F, et al. Roles for hypoxia-regulated genes during cervical carcinogenesis: Somatic evolution during the hypoxia-glycolysis-acidosis sequence[J]. Gynecologic oncology, 2008, 108(2): 377-384.

70. Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al. Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells. Cancer Res 2007; 67: 1030-7.

72. Li L, Xie T. Stem cell niche: structure and function[J]. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2005, 21: 605-631.

73. Li, L. et al., Ubiquitination of MDM2 modulated by Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein1[J], VirusRes,2007, 5(13): 1-6.

74. Lopez J, Poitevin A, Mendoza-Martinez V, Perez-Plasencia C, Garcia-Carranca A. Cancer-initiating cells derived from established cervical cell lines exhibit stem-cell markers and increased radioresistance. BMC Cancer 2012; 12: 48.

75. Lopez J. et al. Human papillomavirus infections and cancer stem cells of tumors from the uterine cervix //The open virology journal. - 2012. - T. 6. - №. 1.

76. Magni M, Shammah S, Schiro R et al. Induction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde-dehydrogenase gene transfer. Blood 1996;87:1097-1103.

77. Markowitz L E, Dunne E F, Saraiya M, et al. Human papillomavirus vaccination: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP)[J]. MMWR Recomm Rep, 2014, 63(RR-05): 1-30.

78. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, Wykoff CC, Pugh CW, Maher ER, Ratcliffe PJ. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. 1999;399:271-5.

79. Mesher D., Cuschieri K., Hibbitts S. et al. Type-specific HPV prevalence in invasive cervical cancer in the UK prior to national HPV immunisation programme: baseline for monitoring the effects of immunization // J Clin Pathol.- 2015.-Vol.68,N2.-P.135-140.

80. Miller D. M. et al. c-Myc and cancer metabolism //Clinical Cancer Research. - 2012. - T. 18. - №. 20. - C. 5546-5553.

81. Morrison S J, Spradling A C. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life[J]. Cell, 2008, 132(4): 598-611.;

82. Moscicki A. CIN management guidelines in adolescents and young women. Abstracts the International papillomavirus society symposium. April 13-14. 2007. Warsaw. P.17.

83. No J H, Jo H, Kim S H, et al. Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Hypoxia Inducible Factor - 1 a in Cervical Neoplasia[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2009, 1171(1): 105-110.

84. Nowell P. C. The clonal evolution of tumor cell populations //Science. - 1976. - T. 194. - №. 4260. - C. 23-28.

85. O'Brien C A, Pollett A, Gallinger S, et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J]. Nature, 2007, 445(7123): 106-110.

86. O'Brien CA, Kreso A, Dick JE. Cancer stem cells in solid tumors: an overview. Semin Radiat Oncol 2009; 19: 71-7.

87. Organista-Nava J., Gómez-Gómez Y., Gariglio P. Embryonic stem cell-specific signature in cervical cancer //Tumor Biology. - 2014. - T. 35. - №2. 3. - C. 1727-1738.

89. Petry K.U., Schmidt D., Scherbring S.et al. Triaging Pap cytology negative, HPV positive cervical cancer screening results with p16/Ki-67 dual-stained cytology// Gynecol Oncol. - 2011. - Vol. 121. - P. 505-509.

90. Pimenta J M, Galindo C, Jenkins D, et al. Estimate of the global burden of cervical adenocarcinoma and potential impact of prophylactic human papillomavirus vaccination[J]. BMC cancer, 2013, 13(1): 1.

91. Polyak K, Hahn W C. Roots and stems: stem cells in cancer[J]. Nature medicine, 2006, 12(3): 296-300.

92. Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, et al. Isolation and In vitro Propagation of Tumorigenic Breast Cancer Cells with Stem/Progenitor Cell Properties. Cancer Res 2005; 65: 5506-11.

93. Prince ME, Sivanandan R, Kaczorowski A, et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 973-78.

94. Ratnam S., Coutlee F., Fontaine D. et al. APTIMA HPV E6/E7 mRNA test is as sensitive as Hybrid Capture 2 Assay but more specific at detecting cervical precancer and cancer // J Clin Microbiol.- 2011.-Vol. 49, N2.-P.557-564.

95. Reiter R E, Gu Z, Watabe T, et al. Prostate stem cell antigen: a cell surface marker overexpressed in prostate cancer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(4): 1735-1740.

96. Reuschenbach M., Seiz M., von Knebel Doeberitz C. et al. Evaluation of cervical cone biopsies for coexpression of p16INK4a and Ki67 in epithelial cells // Int J Cancer. - 2012. - Vol.130, N 2. - P.388-394.

97. Reya T. et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells //nature. - 2001. - T. 414. - №2. 6859. - C. 105-111.

98. Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 1992; 255: 1707-10.

99. Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature 2007; 445: 111-5.13.

100. Richart R M. Cervical intraepithelial neoplasia[J]. Pathology annual, 1973, 8: 301.

101. Rijkaart D.C., Berkhof J., Rozendaal L. et al. Human papillomavirus testing for the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cancer: final results of the POBASCAM randomised controlled trial // Lancet Oncol.- 2012.- Vol.13, N1.-P. 78-88.

102. Sano M, Minamino T, Toko H, et al. p53-induced inhibition of Hif-1 causes cardiac dysfunction during pressure overload[J]. Nature, 2007, 446(7134): 444-448.

103. Schatton T, Murphy GF, Frank NY, et al. Identification of cells initiating human melanomas. Nature 2008; 451: 345-49.

104. Scheffner M, Huibregtse J M, Vierstra R D, et al. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53[J]. Cell, 1993, 75(3): 495-505.

105. Schlessinger D., Van Zant G. Does functional depletion of stem cells drive aging? //Mechanisms of ageing and development. - 2001. - T. 122. - №2. 14. - C. 1537-1553.

106. Schmidt D., Bergeron C., Denton K.J. et al. European CINtec Cytology Study Group (2011) p16/ki-67 dual-stain cytology in the triage of ASCUS and LSIL Papanicolaou cytology: results from the European equivocal or mildly abnormal Papanicolaou cytology study// Cancer Cytopathol. - 2011. - Vol. 119. -P. 158-166.

107. Schneider V, Kay S, Lee H M. Immunosuppression as a high-risk factor in the development of condyloma acuminatum and squamous neoplasia of the cervix[J]. Acta cytologica, 1982, 27(3): 220-224.

108. Semenza G L. HIF-1 and tumor progression: pathophysiology and therapeutics[J]. Trends in molecular medicine, 2002, 8(4): S62-S67.

109. Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2003;3:721-32.

110. Singh G K, Miller B A, Hankey B F, et al. Persistent area socioeconomic disparities in US incidence of cervical cancer, mortality, stage, and survival, 1975-2000[J]. Cancer, 2004, 101(5): 1051-1057.

111. Singh M., Mockler D., Akalin A. et al. Immunocytochemical colocalization of P16(INK4a) and Ki-67 predicts CIN2/3 and AIS/adenocarcinoma // Cancer Cytopathol. - 2012. - Vol.120. - P.26-34.

113. Smedts F, Ramaekers F, Leube RE, Keijser K, Link M, Vooijs P. Expression of keratins 1, 6, 15, 16, and 20 in normal cervical epithelium, squamous metaplasia, cervical intraepithelial neoplasia, and cervical carcinoma. Am J Pathol 1993; 142: 403-12.

114. Solomon D., Davey D., Kurman R., et al. The 2001 Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology // JAMA.- 2002. -Vol.287,N16. - P.2114- 2119.

115. Stadtmauer E A, O'Neill A, Goldstein L J, et al. Conventional-dose chemotherapy compared with high-dose chemotherapy plus autologous hematopoietic stem-cell transplantation for metastatic breast cancer[J]. New England Journal of Medicine, 2000, 342(15): 1069-1076.

116. Storey A, Thomas M, Kalita A, et al. Role of a p53 polymorphism in the development of human papilloma-virus-associated cancer[J]. Nature, 1998, 393(6682): 229-234.

117. Tachezy R., Hamzicova E., Hajek T. et al. Human papillomavirus genotype spectrum in Czech Women: correlation of HPPV DNA presence with antibodies against HPV-16, 18 and 33virus-like particles // J Med Virol.- 1999, Aug.- 58(4).-378-386.

118. Talks KL, Turley H, Gatter KC, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ, Harris AL. The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages. Am J Pathol. 2000;157:411-21.

119. Talora C, Sgroi D C, Crum C P, et al. Specific down-modulation of Notch1 signaling in cervical cancer cells is required for sustained HPV-E6/E7 expression and late steps of malignant transformation^]. Genes & development, 2002, 16(17): 2252-2263.

120. Tarkowski TA, Koumans EH, Sawyer M, Picrce A, Black CM, et al. Epidemiology of human papillomavirus infection and abnormal cytologic test results in an urban adolescent population. J Infect Dis 2004;189:46-50.

121. The Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions Triage Study(ALTS) Group. Human papillomavirus testing for triage of women with cytologic evidence of low-grade squamous intraepithelial lesions: baseline date from a randomized trial. J Natl Cancer Inst. 2000;92:397-402.

122. Tungsrithong N., Kasinpila C., Maneenin C. Lack of significant effects of Chlamydia trachomatis infection on cervical cancer risk in a nested case-control study in North-East Thailand // Asian Pac J Cancer Prev. -2014.-Vol.15.-N3.-P.1497-500.

123. Vaupel P. The role of hypoxia-induced factors in tumor progression. Oncologist. 2004;9(Suppl 5):10-7. 1,2.

124. Venezia TA, Merchant AA, Ramos CA et al: Molecular signatures of proliferation and quiescence in hematopoieticstem cells. PLoS Biol 2: e301, 2004.

126. von Knebel Doeberitz M, Rittmüller C, Hausen H Z. Inhibition of tumorigenicity of cervical cancer cells in nude mice by HPV e6 - e7 anti - sense RNA[J]. International journal of cancer, 1992, 51(5): 831-834.

127. Walboomers J M M, Jacobs M V, Manos M M, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. The Journal of pathology, 1999, 189(1): 12-19.

128. Waldstrom M., Christensen R.K., 0rnskov D. Evaluation of p16(INK4a)/Ki-67 dual stain in comparison with an mRNA human papillomavirus test on liquid-based cytology samples with low-grade squamous intraepithelial lesion // Cancer Cytopathol. - 2013. - Vol.121. - P. 136-145.

129. Wang GL, Semenza GL. General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:4304-8.

130. Wang N, Yao Q, Li X, et al. Detection of HPV and p53 gene expressions in cervical cancer tissue[J]. Medical Journal of Qilu, 2004, 20(2): 98-100,102.

131. Woodman CB, Collins S, Winter H, et al. Natural history of cervical human papillomayius infection in young women: a longitudinal cohort study. Lancer 2001;357:1831-1836.

132. Worldwide cancer incidence statistics -http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info/cancerstats/world/incidence/

134. Wright T C, Ferenczy A, Kurman R J. Carcinoma and other tumors of the cervix[M]//Blaustem's pathology of the female genital tract. Springer New York, 1994: 279-326.

135. Yang ZF, Ho DW, Ng MN, et al. Significance of CD90+ Cancer Stem Cells in Human Liver Cancer. Cancer Cell 2008; 13: 153-66.

136. Yao T, Chen Q, Lin Z, Zhou H, Zhang B. The expression of ALDH1 in cervical carcinoma. Med Sci Monit 2011; 17: 21-6

137. Ye Y, Yin D, Chen L, et al. Identification of Piwil2-Like (PL2L) Proteins that Promote Tumorigenesis. PLoS One 2010; 5: e13406.

138. Yoshida T., Sano T., Kanuma T. et al. Usefulness of CINtec® PLUS p16/Ki-67 double-staining in cytological screening of cervical cancer // Acta Cytol. - 2011. -Vol.55. -P.413-420.

139. Zhang S, Balch C, Chan MW, et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Res 2008; 68: 4311-20.

140. Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, Lim M, Hilton DA, Zagzag D, Buechler P, Isaacs WB, Semenza GL, Simons JW. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases.Cancer Res.1999;59:5830-5.