Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Гражданцева, Антонина Анатольевна

• Гражданцева, Антонина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гражданцева, Антонина Анатольевна

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Сифилис: характеристика инфекции и проблемы ее диагностики.

1.1. Этиология сифилиса

1.2. Патогенез, патанатомия и клинические формы заболевания.

1.3. Лабораторная диагностика сифилиса

1.3.1. Серологические методы диагностики сифилиса с использованием неспецифического антигена.

1.3.2. Серологические методы диагностики сифилиса с использованием специфических антигенов.

1.3.3. Рекомбинантные белки Treponema pallidum в диагностике сифилиса.

Антигенный состав Treponema pallidum.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса»

В России после продолжительного периода относительно низкой и стабильной заболеваемости сифилисом отмечается устойчивая тенденция ее роста с 4,3 в 1989 году до 277,3 в 1997 году (заболеваемость на 100 тыс. населения). Несмотря на некоторое снижение в 1998 заболеваемости сифилисом, ее уровень по-прежнему остается высоким и составляет 155,6. Вследствие увеличения в 1997 году числа выявленных беременных женщин, больных сифилисом, в 10 раз по сравнению с 1993 годом значительно чаще стали регистрироваться случаи врожденного сифилиса. Показатель числа случаев врожденного сифилиса на 10000 родившихся возрос с 0,3 в 1993 году до 5,6 в 1997 году [40]. Вызывает большую тревогу то, что этот подъем заболеваемости имеет некоторые признаки эпидемического характера: подавляющее преобладание в структуре заболеваемости заразных форм сифилиса (98%); высокий процент среди заразных форм первичного и вторичного свежего сифилиса (60%); снижение соотношения вторичных рецидивных и свежих форм — 1:1,6 в 1990 г., 1:2,2 — в 1994 г.; резкое увеличение числа больных сифилисом детей в возрасте до 14 лет, включая врожденный сифилис: в 1990 г. - 38 (до 14 лет) и 10 (врожденный), в 1997 г. - 2703 (до 14 лет) и 513 (врожденный) [1, 40]; выраженные различия уровня заболеваемости в отдельных регионах страны как друг от друга, так и от среднего показателя по России [1]. Наиболее значимыми причинами такого высокого уровня заболеваемости сифилисом являются изменения в социальной сфере и экономические факторы: военные, гражданские и национальные конфликты, падение уровня жизни населения, проституция и т.д. В сложившейся ситуации преодоление социального и экономического кризиса имеет большое значение, но при этом значительную роль играет и совершенствование современных методов диагностики заболевания, которые бы позволили обследовать в короткие сроки значительные группы населения с целью выявления сифилиса и проведения системы лечебных и профилактических мероприятий.

При выявлении сифилиса определяющую роль играет лабораторная диагностика. С 1985 г. практически не изменялся как комплекс стандартных серологических реакций (КСР), применяемый в медицинских учреждениях нашей страны [35], так и используемые в качестве отборочных тестов реакция микропреципитации и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). КСР включает реакцию связывания комплемента с кардиолипиновым и трепонемным антигенами (РСК), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) [34, 75]. Следует подчеркнуть, что пока ни один из этих тестов не является идеальным диагностическим методом и не может удовлетворить полностью практическую медицину. Одни из них сложны при постановке и являются дорогостоящими, другие достаточно часто дают ложноположительные результаты [13, 14, 27].

Так, реакция микропреципитации, которая применяется в основном при массовых обследованиях, является быстрой, простой в исполнении, но может давать ложноположительные, а в отдельных случаях и отрицательные результаты при активных формах сифилиса [27]. Ложноположительные ответы могут иметь место при постановке РСК с кардиолипиновым антигеном (реакция Вассермана) в случае болезней печени, желудка, желез внутренней секреции, а в РСК с трепонемным антигеном — при системной красной волчанке, болезни Лайма [22, 71]. В пожилом возрасте стандартные серологические реакции на сифилис могут быть ложнопозитивными у 60% лиц. При беременности ложнопозитивные реакции составляют 2% [25].

Реакции РИФ и РИБТ, несмотря на свою специфичность, являются сложными в постановке и дорогостоящими, поэтому они применяются в основном при диагностике латентного сифилиса и верификации ложноположительных результатов после скрининговых обследований [27].

Недостатки этих классических методов, а также успехи научно-технических разработок заставляют вводить в практику новые методы диагностики, более удобные в постановке, позволяющие обследовать в короткие сроки большое количество людей и в то же время обладающие достаточной чувствительностью и специфичностью. Одним из таких перспективных методов серодиагностики является иммуноферментный анализ (ИФА). В конце 70-х годов в работах зарубежных авторов появляются сообщения о возможности применения ИФА для определения антител к Treponema pallidum [34, 74]. В ряде работ в последующие годы содержатся данные по использованию рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для выявления сифилиса [87,91,106].

В России кроме обязательного комплекса серологических реакций в некоторых лабораториях в последние десять лет применяется ИФА с использованием антигена из непатогенных и "культуральных" трепонем [34], позволяющего определить антитела лишь к группоспецифическим антигенам спирохет. Для определения антител к видоспецифическим антигенам Treponema pallidum необходимо применять в качестве антигена патогенную трепонему - Treponema pallidum. Однако, при ее культивировании возникает ряд серьезных трудностей: необходимость пассирования трепонемы на животных (кроликах), вероятность заражения персонала, сложность стандартизации антигена, его дороговизна. Перечисленные выше недостатки ставят вопрос о разработке новых методов получения антигена. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных аналогов белков Treponema pallidum, синтезированных в экспрессирующей системе E.coli. Получению некоторых рекомбинантных белков Treponema pallidum и применению их в качестве антигена в иммуноферментном анализе и посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы является получение и сравнительное исследование природных и рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для иммуноферментной диагностики сифилиса; изучение спектра антител к антигенам 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Tr.pallidum на разных стадиях заболевания методом ИФА с помощью рекомбинантных белков.

Решение поставленной задачи включало следующие этапы:

• культивирование бледной спирохеты Treponema pallidum на кроликах;

• получение природного антигена Treponema pallidum для ИФА;

• литературно-теоретический анализ с целью выбора наиболее антигеннозначимых белков, видоспецифичных для Treponema pallidum;

• выделение ДНК Treponema pallidum;

• получение методом ПЦР генов рекомбинантных белков;

• определение структуры генов;

• клонирование генов в экспрессирующий вектор;

• наработка рекомбинантных белков в E.coli и их выделение;

• изучение возможности использования рекомбинантных белков в качестве антигена в ИФА;

• получение экспериментальных партий тест-систем;

• исследование сывороток больных сифилисом с помощью опытных партий тест-систем.

• анализ результатов использования отдельных рекомбинантных белков и их комбинации при выявлении антител при различных стадиях инфекции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Выбрана комбинация белков Treponema pallidum для использования в качестве антигена в твердофазном ИФА.

Сконструированы четыре бактериальных штамма-продуцента, экспрессирующие белки Treponema pallidum: 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa.

С использованием как отдельных, так и суммарных рекомбинантных белков проведено исследование сывороток больных сифилисом на разных стадиях заболевания. Показано преимущество использования набора четырех рекомбинантных белков по сравнению с использованием отдельных рекомбинантных белков в качестве антигена для лабораторной диагностики заболевания.

На основе рекомбинантных белков выпускаются диагностические наборы для определения антител к бледной спирохете (ТОО "Биосервис", г. Москва).

Получен патент на изобретение "Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum" (RU 2103362, см. Приложение).

Благодарности. Автор благодарен научным руководителям Звереву В.В. и Серпинскому О.И. за их постоянное внимание и помощь в ходе выполнения диссертационной работы. Автор выражает глубокую благодарность Сиволобовой Г.Ф., Кочневой Г.В., Урманову И.Х., в соавторстве с которыми были получены основные результаты работы; Курлаевой Т.Б. и Судариковой Е.Г. за оказанную помощь в сборе образцов сывороток и тестировании их стандартными лабораторными методами. и

Публикации по теме диссертации:

1. Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Урманов И.Х. и др. Клонирование и экспрессия в E.coli основных антигенов Treponema pallidum и исследование их иммунохимических свойств. // Иммунология, 1998, № 4, с. 17-20.

2. Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Цивковский Р.Ю., Серпинский О.И. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов. // Иммунология, 1998, № 4, с. 20-23.

3. Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Урманов И.Х., Серпинский О.И., Блинов В.М. и др. Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema Pallidum, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema Pallidum 15 kDa, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema Pallidum 17 kDa, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema Pallidum TMP А. // Патент RU 2103362. Бюл. № 3, 1998.

4. Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Серпинский О.И., Цивковский Р.Ю. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов. // Конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998 г., с. 133.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гражданцева, Антонина Анатольевна

Выводы.

1. Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для лабораторной диагностики сифилиса на основе антигена Treponema pallidum. Выпущено четыре серии экспериментальных тест-систем для выявления IgG человека к Treponema pallidum.

2. Получены бактериальные штаммы-продуценты E.coli, экспрессирующие белки 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Treponema pallidum в виде химер с р-галактозидазой.

3. Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для лабораторной диагностики сифилиса, основанная на рекомбинантных белках 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa. Получен патент на изобретение "Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum" (RU 2103362). Выпущено четырнадцать серий экспериментальных тест-систем для выявления IgG человека к Treponema pallidum.

4. Проведено сравнительное изучение ИФА тест-систем: а) на основе анализа 824 сывороток, полученных от больных с разными стадиями сифилиса, и 54 сывороток здоровых людей показано, что диагностикум на основе рекомбинантного антигена обладает более высокими чувствительностью и специфичностью (99,5 и 100%) по сравнению с тест-системой на основе природного антигена (96,9 и 92, 6%); б) показано, что тест-системы на основе рекомбинантных белков при хранении при 4 °С обладают большей стабильностью (9 месяцев) по сравнению с тест-системами на основе природного антигена Treponema pallidum (4 месяца). V

5. Показаны особенности накопления IgG и IgM к четырем рекомбинантным белкам в группах пациентов с различными стадиями сифилиса: а) первичный сифилис - антитела класса IgM были обнаружены у 92% пациентов, в основном, к белкам TmpA и 17 kDa; IgG определяются у всех пациентов к белку TmpA;

87 б) вторичный свежий сифилис — антитела класса ^М регистрируются в 72% случаев; регистрируются у всех больных к белкам ТтрА и 17 кСа; в) вторичный рецидивный сифилис - не определяются ^М к белку 15 кБа, а к остальным белкам определяются в 20-50%; ^О определяются у всех пациентов на все четыре белка; г) леченый сифилис - ^М к данным белкам не определяются; ^О регистрируются у всех пациентов этой группы, причем наиболее часто к белку 17 Ша - 86,3%, а в 13% — только к этому белку.

Заключение.

В России за последнее десятилетие наблюдается устойчивая тенденция роста инфекционных заболеваний, в том числе и сифилиса. По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации [40] рост заболеваемости сифилисом составил с 4,3 в 1989 году до 277,3 в 1997 году (заболеваемость на ЮОтыс. нас). В связи с этим возникла острая необходимость в создании новых методов диагностики, позволяющих одновременно обследовать большие группы населения, недорогих и удобных в практическом применении. До начала настоящей работы (1995 г.) в медицинских учреждениях применялся комплекс стандартных серологических реакций, который не изменялся с 1985 г. Эти методы не удовлетворяли практическую медицину: одни из них сложны при постановке и являются дорогостоящими, другие достаточно часто дают ложноположительные результаты. Сложившаяся ситуация требовала более совершенных методов лабораторной диагностики.

Одним из таких методов, получившим широкое применение за последнее десятилетие, стал иммуноферментный анализ. В настоящее время ИФА широко используется как при детекции антител и антигенов при вирусных, бактериальных, паразитарных заболеваниях, так и при определении белковых компонентов крови (гормоны, цитокины, онкогены) и других биологических жидкостей. Данная работа посвящена постановке и усовершенствованию иммуноферментных методов диагностики сифилиса.

На пути к достижению этой цели были оптимизированы параметры культивирования Treponema pallidum, шт. Nichols, установлена оптимальная инфицирующая доза (4±1)х107 трепонем/мл и время забора инфицированных тестикул — 2 день после появления первых симптомов орхита; получен природный антиген Treponema pallidum; сконструирована на его основе экспериментальная тест-система и выпущно 4 серии, включающие по 30 тест-систем каждая (Заключение Отдела биотехнологического контроля ГНЦ ВБ "Вектор" о качестве тест-систем).

Однако, использование в ИФА антигенов из патогенных трепонем сопряжено с рядом очевидных трудностей — необходимостью культивирования на животных активного возбудителя сифилиса и, в связи с этим, высокая вероятность заражения персонала, невозможность получения больших количеств антигена, высокая себестоимость и проблема его стандартизации. Учитывая все эти недостатки, была поставлена задача создания рекомбинантных аналогов антигенов бледной спирохеты.

На основе анализа данных литературы и GenBank был осуществлен выбор белков Тг. pallidum, видоспецифичных, обладающих выраженными антигенными свойствами. Дальнейшие исследования подтвердили, что рекомбинантные аналоги выбранных липопротеинов 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa в комплексе позволяют определить антитела практически во всех сыворотках больных первичным, вторичным сифилисом и лиц, наблюдаемых 1-2 года после лечения.

Полученные на основе комбинации рекомбинантных белков диагностические наборы превышали по чувствительности и специфичности существовавшие в то время отечественные иммуноферментные системы на основе природного антигена (в том числе и разработанные нами) и были более стабильны, удобны и безопасны в работе.

При сравнении срока хранения нативного и рекомбинантного антигенов, сорбированных на планшетах, при одинаковых условиях рекомбинантный антиген оказался более стабилен, что позволяет увеличить длительность срока хранения тест-систем.

На основании выявляемое™ антител к отдельным рекомбинантным белкам и их комплексу было установлено, что для серологической диагностики важно применять комбинацию антигенов, так как использование отдельных белков не позволяет определять антитела во всех сыворотках пациентов с первичным, вторичным и леченым сифилисом.

85

Можно предположить, что при диагностике поздних форм сифилиса (третичный и сифилис нервной системы), отличающихся слабой сероконверсией, комплексное использование рекомбинантных антигенов будет особенно необходимым.

Проведенные нами исследования появления антител к индивидуальным белкам позволили определить напряженность гуморального иммунного ответа к каждому белку на разных стадиях сифилиса, а также судить о роли полученных антигенов для серологической диагностики. Выявленная нами особая значимость 17 kDa и ТтрА антигенов была впоследствии подтверждена японскими и немецкими исследователями [61, 62].

С использованием в качестве антигена набора сконструированных нами рекомбинантных белков было выпущено 14 серий экспериментальных тест-систем по 100-200 наборов в каждой серии, чувствительность и специфичность которых составляла 98-100% (см. Заключение Отдела биотехнологического контроля ГНЦ ВБ "Вектор"). При помощи разработанной тест-системы исследовано более 800 образцов крови. Получен патент на изобретение "Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum" (RU 2103362), основанный на рекомбинантных антигенах 15 kDa, TmpA, 47 kDa и 17 kDa.

Данная работа была выполнена при финансовой поддержке ТОО "Биосервис".

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гражданцева, Антонина Анатольевна, 2000 год

1. Аковбян В.А., Тихонова Л.И., Машкиллейсон А.Д., Борисенко К.К., Прохоренко В.И. Заболеваемость сифилисом в России: опыт истории, эпидемиологический анализ, прогнозы. // ЗППП, 1995, № 4, с. 22-25.

2. Антитела. Методы. Кн.2. // под ред. Кетти Д., М.: "Мир", 1991, с. 152-238.

3. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: "Ленмедгиз", 1962.

4. Беднова В.Н., Дмитриев Г.А. и др. Новая тест-система иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса. //Вестн. дерматол. венерол. 1995, № 1, с. 19-20.

5. Беленький Г.Б. Реакция иммобилизации бледных трепонем. М.: "Медгиз", 1964.

6. Борисенко К.К., Тимченко Г.Ф., Дмитриев Г.А. и др. Первый опыт применения в России тест-системы "TPHA-NOSTICON" фирмы "Органон-Техника БВ" (Голландия) для диагностики сифилиса. // ЗППП, 1995, № 1, с. 33-34.

7. БСЭ. 1984, Т.23, с. 326-327.

8. Вектор pEL5c. // Заявка на получение патента N5027679/13/007659 от 18.02.1992 г.

9. Вербов В.Н., Золотухин В.А., Шутова О.В., и др. Модификация иммуноферментной тест-системы для серодиагностики описторхоза. // Мед. паразитол. и паразитар. бол., 1990, №2, с. 9-11.

10. Воробьев A.A., Быков A.C., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. Микробиология. М.: "Медицина", 1998, с. 297-298.

11. Гицу Г.А., Нгуен Тхи Хой, Баллад Н.Е., и др. Эффективность иммуно-ферментного теста с гомологичным и гетерологичными антигенами при клонорхозе. // Мед. паразитол. и паразит, бол., 1991, № 4, с. 20-23.

12. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть 1. // Вест. Дерматол. Венерол., 1996, № 2, с. 29-32.

13. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть 2. // Вест. Дерматол. Венерол., 1996, № 3, с. 33-38.

14. Исаков С.А., Ивлева Е.А., Эрдман Ю.С. Значение ТРНА теста в подтверждении ложноположительных реакций на сифилис. // Вопр. диагностики, лечения и профилактики ЗГТПП и дерматозов. Сб. н.-практ. конф., Рязань, 1995, с. 25.

15. Каур С., Сильм X., Виндиревских Г., Шевчук О. Усовершенствование методов диагностики сифилиса при помощи определения антител к специфическим белкам возбудителя. // ЗППП, 1998, № 4, с. 21 -22.

16. Комарова В.Д., Фриго Н.В. Результаты апробации иммуноферментной тест-системы Lues Screen для серодиагностики сифилиса. // Вопр. диагностики, лечения и профилактики ЗППП и дерматозов. Сб. н.-практ. конф., Рязань, 1995, с. 29.

17. Корбут С.Е., Каштанова М.Г., Милонова Т.И. Фильтруемость бледных трепонем через стерилизующие фильтры с различной величиной пор.// Вестн. Дерматол., 1979, № 1, с. 70-77.

18. Котровский А.В.Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса. //Дисс. канд. мед. наук. М, 1986.

19. Красильников А.П. Микробиологический словарь справочник. "Беларусь", 1986, с. 274-275.

20. Краткий определитель бактерий Берги. // под ред. Хоулта Д. Г., М.: "Мир", 1980, с. 93-97.

21. Кубась В.Г., Данилова О.П. Ложно-положительные реакции в диагностике сифилиса. // Материалы XXXIII Научно-практ. конф. дерматологов, акушер-гинекологов и урологов Санкт-Петербурга, С-Пб, 1998, с. 27-28.

22. Лосева O.K., Котровская Л.Г., Максудов Ф.М. и др. Клиническая оценка осадочных реакций Кана и Закса-Витебского. // Вестн. Дерматол., 1985, № 7, с. 69-74.

23. Ляхов В.Ф., Борисенко К.К., Потекаев Н.С., Борисова Т.К., Сидорова Е.В. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобулинемии при ранних формах сифилиса. // Вестн. Дерматол. Венерол., 1990, № 8, с. 39-42.

24. Мавров И.И. и др. Контактные инфекции, передающиеся половым путем. Киев: "Здоровье", 1989, с. 90-94.

25. Маниатис Т.М., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: "Мир", 1984.

26. Милич М.В. Эволюция сифилиса. М.: "Медицина", 1987, с. 4-120.

27. Новое в клонировании ДНК. Методы. // под ред. Гловера Д.М., М.: "Мир", 1989, с. 95-137.

28. Обрядина А.П., Фриго Н.В., Комарова В.Д., Чепурченко Н.В., Абалкина Л.М. Бурков А.Н. Ультраозвученные белки Treponema pallidum и их рекомбинантные аналоги в иммуноферментной диагностике сифилиса. // ИППП, 1999, № 1, с. 25-28.

29. Овчинников Н.М. Экспериментальный сифилис. М.: "Медгиз", 1955.

30. Овчинников Н.М., Делекторский В.В. Ультраструктура бледной трепонемы и механизмы клеточной защиты до и в процессе лечения сифилиса. // Вестн. Дерматол., 1981, № 12, с. 37-40.

31. Овчинников Н.М., Резникова Л.С., Милонова Т.И. и др. Результаты комплексного изучения ускоренного метода для серодиагностики сифилиса. // Вестн. Дерматол., 1978, № 5, с. 28-33.

32. Овчинников Н.М., Милонова Т.И., Тимченко Г.Ф. и др. Сравнительное изучение реакции пассивной гемагглютинации, иммунофлюоресценции с адсорбцией и микропреципитации с активной сывороткой крови на сифилис. // Вестн. Дерматол., 1983, № 5, с. 17-20.

33. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающимхся половым путем. М.: "Медицина", 1987.

34. О совершенствовании серодиагностики сифилиса. Приказ N 1161 от 2 сентября 1985 г., МЗ СССР.

35. Скоупс Р. К. Методы очистки белков. М.: "Мир", 1985, с. 341-342.

36. Скрипкин Ю.К. Кожные и венерические болезни. М.: "Медицина", 1980, с. 417-424.

37. Сидорова Е.В., Ляхов В.Ф. Значение определения противотрепонемных IgM-антител в серодиагностике сифилиса. // ЗППП, 1995, № 4, с. 11-14.

38. Суворова К.Н. Современный аспект неведомого сифилиса. // Вестн. Дерматол., 1969, № 3, с. 70-73.

39. Тихонова. Л.И. Обзор ситуации с ИППП. Анализ заболеваемости врожденным сифилисом в Российской Федерации. // ИППП, 1999, № 1, с. 15-19.

40. Яговдик Н.З., Сосновский А.Т., Качук М.В., Белугина И.Н. Венерические болезни. Минск: "Беларусская наука", 1997, с. 7-36.

41. Akins D.R., Purcell В.К., Mitra М.М., Norgard M.V., Radolf J.D. Lipid modification of the 17-kilodalton membrane immunogen of Treponema pallidum determines macrophage activation as well as amphiphilicity. // Infect. Immun., 1993, V. 61, p. 1202-1210.

42. Baker-Zander S.A., Hook E.W., Handsfield H.H., Lukehart S.A. Antigens of Treponema pallidum recognized by IgG and IgM antibodies during syphilis in humans. // J. Infect. Dis., 1985, V. 151, p. 264-272.

43. Baker-Zander S.A., Lukehart S.A. Antigenic cross-reactivity between Treponema pallidum and other patogenic memberrs of the family Spirochaetaceae. // Infect. Immun., 1984, V. 46, p. 116-121.

44. Baseman J.B., Hayes E.C. Molecular characterization of receptor binding proteins and immunogens of virulent Treponema pallidum. // J. Exp. Med., 1980, V. 151, p. 573-586.

45. Blanco D.R., Lovett M.A., Miller J.N. Surface antigens of the syphilis spirochete and their potential as virulence determinants. // Emerg. Infect. Dis., 1997, V. 3, p. 11-20.

46. Catteral R.D. Presidental address to the M.S.S.V.D.: systemic disease and the biological false-positive reaction. // Br. J. Vener. Dis., 1972, N 48, p. 1-12.

47. Chamberlain N.R., Brandt M.E., Erwin A.L., Radolf J.D., Norgard M.V. Major integral membrane protein immunogens of Treponema pallidum are proteolipids. // Infect. Immun., 1989, V. 57, p. 2872-2877.

48. Codd A.A., Sprott M.S., Narang H.K. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for Treponema pallidum antibodies. // J. Med. Microbiol., 1988, V. 26, p. 153-157.

49. Cunningham T.M., Walker E.M., Miller J.N., Lovett M.A. Selective release of the Treponema palidum outer membrane and associated polypeptides with Triton X-l 14. // J. Bacteriol., 1988, V. 170, p. 5789-5796.

50. Dallas W. S., Ray P.H., Leong J., Benedict C.D., Stamm L. V., Bassford P.J. Identification and purification of a recombinant Treponema pallidum basic membrane protein antigen expressed in Escherichia coli. // Infect. Immun., 1987, V. 55, p. 1106-1115.

51. Database GeneBank. rel.96. 1996

52. Fehniger T.E., Walfield A.M., Cunningham T.M., Radolf J.D., Miller J.N., Lovett M.A. Purification and characterization of cloned protease-resistent Treponema pallidum-specific antigen. // Infect. Immun., 1984, V. 46, p. 598-607.

53. Fehniger T.E., Radolf J.D., Lovett M.A. Properties of an ordered ring structure formed by recombinant Treponema pallidum surface antigen 4D. // J. Bacteriol., 1986, V. 165, p. 732-739.

54. Farshy C.E., Hunter E.F., Hensel L.O., Larsen S.A. Four-step enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Treponema pallidum antibody. // J. Clin. Microbiol., 1985, V. 21, p. 387389.

55. Farshy C.E., Hunter E.F., Larsen S.A., Gerni E.N. Double-conjugate enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulins G and M against Treponema pallidum. // J. Clin. Microbiol., 1984, Y. 20, p. 1109-1113.

56. Fieldsteel O.H., Cox D.L., Moeckli R.A. Further studies on replication of virulent Treponema pallidum in tissue cultures of sflEp cells. // Infect. Immun., 1982, V. 35, p. 449-455.

57. Fräser C.M., Norris S.J., Weinstock C.M. Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. // Science, 1998, V. 281, p. 375-388.

58. Fujimura K., Ise N., Ueno E. et al. Reactiviti of recombinant Treponema pallidum (r-Tp) antigens with anti-Tp antibodies in human syphilitic sera evaluated by ELISA. // J. Clin. Lab. Anal., 1997, V 11, N 6, p. 315-322.

59. Gerber A., Krell S., Morenz J. Recombinant Treponema pallidum Antigens in Syphilis Serology. // Immunobiol. 1996-1997, V. 196, p. 535-549.

60. Gershoni J.M., Palade G.E. Protein blotting: principles and applications. // Anal. Biochem., 1983, V. 131, p. 95 — 137.

61. Hanff P.A., Fehniger T.E., Miller J. N., Lovett M.A. Humoral immune response in human syphilis to polipeptitdes of Treponema pallidum. // J. Immunol., 1982, V. 129, p. 1287-1291.

62. Hay P.E., Clarke J.R., Strugnell R.A. et al. Use of the polymerase chain reaction to detect DNA sequences specific to pathogenic treponemes in cerebrospinal fluid. // FEMS Microbiol. Lett., 1990, V. 68, p. 233-238.

63. Hay P.E., Clarke J.R., Taylor-Robinson D., Goldmeier D. Detection of treponemal DNA in the CSF of patients with syphilis and HIV infection using the polymerase chain reaction. // Genitour. Med. 1990, V. 66, p. 428-432.

64. Kraus S.J., Haserick J.R., Logan L.C., Bullard J.C. Atipical fluorescence in the fluorescent treponemal antibody-absorbtion (FTA-ABS) test related to dezoxyribonucleic acid (DNA) antibodies. // J. Immunol., 1971, V. 106, p. 1665-1669.

65. Kox D.L., Moockli R.A., Keoney K.M. Enumeration of Treponema pallidum cell cultivated in vitro by an Enzime-Linked Immunosorbent Assay. // Infect. Immun., 1984, V. 44, p. 103-106.

66. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970, V. 227, p. 680-685.

67. Larcen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of test for syphilis. // Clin. Microbiol. Rev., 1995, V. 8, p. 1-21.

68. Larcen S.A. Siphilis. // Clin. Lab. Med., 1989, V. 9, p. 545-557.

69. Lefevre J.C., Bertrand M.A., Bauriaud R. Evaluation of the Captia enzyme immunoassays for detection immunoglobulins G and M to Treponema pallidum in syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1990, V. 28, p. 1704-1707.

70. Liu Wei, Cai Rui-kang, Zhao qing-li. Clinical evaluation of western blot assay as specific test for syphilis. // World STD/AIDS Congress 1995, 19th-23rd March 1995, Singapore 1995, p.85.

71. Lukehart S.A., Baker-Zander S.A., Gubish E.R. Identification Treponema pallidum antigens: comparison with a nonpatogenic treponeme. // J. Immunol., 1982, V 129, p. 833-838.

72. Lukehart S.A., Baker-Zander S.A., Sell S. Characterization of the humoral immune response of the rabbit to antigens of Treponema pallidum after experimental infection and therapy. // Sex. Trans. Dis., 1986, V. 13, p. 9-15.

73. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. PCR. A Practical Approach. New York: "Oxford University Press", 1991.

74. Magnuson H.J., Rosenau B.J. The rate of development and degree of acquired immunity in experimental syphilis. // Am. J. Syph., 1948, V. 32, p. 418-436.

75. Magnuson H.J., Thomas E.W., Olansky S., Kaplan B.I., DeMello L., Cutler J.C. Inoculation syphilis in human volunteers. // Medicine, 1956, V. 35, p. 33.

76. Marchito K.S., Jones S.A., Schell R.F., Holmans P.L., Norgard M.V. Monoclonal antibody analisis of specific antigenic similarities among pathogenic Treponema pallidum subspecies. // Infect. Immun., 1984, V. 45, p. 660-666.

77. Marchito K. S., Selland-Grossing C.K., Norgard M.V. Molecular speciflties of monoclonal antibodies directed against virulent Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1986, V. 51, p. 168-176.

78. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.,1977, V. 74, p. 560-564

79. Meyer M.P., EddyT., Baughn R.E. Analysis of western blotting (immunoblotting) technique in diagnosis of congenital syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1994, V. 32, p. 629-633.

80. Miller J.N., De Bruijn J.H., Bekker J.H., Onvlee P.C. The antigenic structure of Treponema pallidum, Nichols strain. // J. Immunol., 1966, V. 96, p. 450-456.

81. Moskophidis M., Muller F. Molecular analysis of immunoglobulins M and G immune response to protein antigens of Treponema pallidum in human suphilis. // Infect. Immun., 1984, V. 43, p.127-132.

82. Moskophidis M., Muller F. Molecular characterization of glycoprotein antigens on surface of Treponema pallidum. Comparison with nonpathogenic Treponema phagedenis byotype Reiter. // Infect. Immun., 1984, V. 46, p. 867-869.

83. Norgard M.V. Clinical and diagnosis issues of acquired and congenital syphilis encompassed in the current syphilis epidemic. // Curr. Opin. Infect. Dis., 1993, V. 6, p. 9-16.

84. Norgard M.V., Chamberlain N.R., Swancutt M.A., Goldberg M.S. Cloning and expression of the major 47-kilodalton surface immunogen of Treponema pallidum in Escherichia coli. // Infect. Immun., 1986, V. 54, p. 500-506.

85. Norrander J., Kempe T., Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. // Gene. 1983, V. 26, p. 101-106.

86. Norris S.J. Sell S. Antigenic complexity of Treponema pallidum: antigenicity and surface localization of major polypeptides. // J. Immunol., 1984, V. 133, p. 2686-2692.

87. Pedersen N.S., Petersen C.S., Wejtorp M., Axelsen N.H. Serodiagnosis of syphilis by an enzime-linked immunosorbent assay for IgG antibodies against the Reiter treponema flagellum. // Scand. J. Immunol., 1982, V. 15, p. 341-348.

88. Pedersen N.S., Oram O., Mouritsen. Enzime-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to veneral disease research laboratory (VDRL) antigen in syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1987, V. 25, p. 1711-1716.

89. Peterson K.M., Baseman J.B., Alderete J.F. Treponema pallidum receptor binding proteins interact with fibronectin. // J. Exp. Med., 1983, V. 157, p. 1958-1970.

90. Porcella S.F., Popova T.G., Hagman K.E., Penn C.W., Radolf J.D., Norgard M.Y. A mgl-like operon in Treponema pallidum, the syphilis spirochete. // Gene, 1996, V. 177, p. 115-21.

91. Purcell B.K., Chamberlain N.R., Golberg M.S., Andrews L.P., Robinson E.J., Norgard M.V., Radolf J.D. Molecular cloning and characterization of the 15-kilodalton major immunogen of Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1989, V. 57, p. 3708-3714.

92. Purcell B.K., Swancutt M.A., Radolf J.D. Lipid modification of the 15- kilodalton major membrane immunogen of Treponema pallidum. // Mol. Microbiol. 1990, V. 4, p. 1371-1379.

93. Rockwell D.H. The tuskegle study of untreated syphilis; the 30th year of observation. // Arch. Intern. Med., 1964, V. 114, p. 792-798.

94. RodgersG.C., Laird W.J., Coates S.R., Mack D.H., Huston M., Sninsky J.J. Serological characterization and gene localisation of an Escherichia coli-expressed 37-kilodalton Treponema pallidum antigen. // Infect. Immun., 1986, V. 53, p. 16-25.

95. Roy W.S., Schenectedy N.Y. Serological test for syphilis. // U.S. Patent 4.288.426, Sep. 8, 1981.

96. Stamm L.V, Greene S.R, Bergen H.L, Hardham J.M, Barnes N.Y. Identification and sequence analysis of Treponema pallidum tprJ, a member of a polymorphic multigene family. // Microbiol. Lett., 1998, V. 169, p. 155-63.

97. Strungell R.A., Cockayne A., Penn C.W. Molecular and antigenic analysis of treponemes. // Crit. Rev. Microbiol., 1990, V. 17, p. 231-250.

98. Thornburg R.W., Baseman J.B. Comparison of major protein antigens and protein profiles of Treponema pallidum and Treponema pertenue. // Infect. Immun., 1983, V. 42, p. 623-627.

99. Veldkamp J., Visser A.V. Application of the enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) in the serodiagnosis of syphilis. // Br. J. Vener. Dis., 1975, V. 51, p. 227-231.

100. Walfield A.M., Hanff P.A., Lovett M.A. Expression of Treponema pallidum antigens in E.coli. // Science, 1982, V. 216, p. 522-523.

101. Weigel L.M., Brandt M.E., Norgard M.V. Analisis of the N-terminal region of the 47— kilodalton integral membrane lipoprotein of Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1992, V. 60, p. 1568-1576.

102. Wicher V., Zabec J., Wicher K. Phatogen-specific humoral response in Treponema Pallidum -infected humans, rabbits and guinea pigs. // Infect. Dis., 1991, V. 163, p. 830-836.

103. Wilcox R.R. Textbook of veneral diseases and treponematoses. London, 1964.

104. White T.J., Fuller S.A. Visu Well Reagin, a nontreponemal enzime-linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1989, V. 27, p. 2300-2304.

105. Yelton D.B., Limberger R.J., Curci K. et al. Treponema phagedenis encodes and expresses homologs of Treponema pallidum TmpA and TmpB proteins. // Infect. Immun., 1991,V. 59, p. 3685.

106. Young H., Moyes A., Seagar L., Mcmillan, A. Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1998, V. 36, p. 913917.

107. Young H., Moyes A., de Ste Croix I., McMillan A. A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis. // Int. J. STD. AIDS, 1998, V. 9, p. 196-200.