Рекомбинантная щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina: получение, свойства и перспективы применения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Голотин, Василий Александрович

• Голотин, Василий Александрович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Голотин, Василий Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Фосфатазы

1.2. Распределение и физиологическая роль щелочных фосфатаз

1.3. Генетическая регуляция биосинтеза щелочных фосфатаз

1.4. Физико-химические и каталитические характеристики щелочных фосфатаз и их пространстфенная организация

1.4.1. Молекулярная масса (Мг) и изоэлектрическая точка (рГ)

1.4.2. Влияние значений рН и температуры

1.4.3. Влияние ингибиторов

1.4.4. Субстратная специфичность

1.5. Структурно-функциональные особенности щелочных фосфатаз

1.6. Структурно-функциональные особенности психрофильных щелочных фосфатаз морских бактерий

1.7. Практическое применение щелочных фосфатаз

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Реагенты и материалы, использованные в работе

2.2. Выделение геномной ДНК

2.3. Гель-электрофорез ДНК

2.4. Амплификация структурных генов белков

2.5. Рестрикция

2.6. Лигирование фрагментов ДНК в плазмиду

2.7. Подготовка компетентных клеток и трансформация E.coli

2.8. Выделение и секвенирование рекомбинантных плазмид

2.9. Получение мутантных генов

2.10. Гетерологическая экспрессия рекомбинантных генов вЕ. coli

2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков

2.12. Анализ белковой фракции телец включения

2.13. Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.14. Определение концентрации белков

2.15. Определение активности ЩФ

2.16. Определение активности лектинов

2.17. Определение активности силикатеиноподобного катепсина и анализ наноструктур

2.18. Определение каталитических параметров ОлАР

2.19. Определение pH-стабильности, pH-оптимума и влияние некоторых буферов на активность СгаАР

2.20. Определение температурного оптимума и температурной стабильности, влияния ионов магния на температурную стабильность СтАР

2.21. Влияние ионов натрия и калия на активность СтАР

2.22. Изучение влияния ЭДТА и ДСН на активность и стабильность СтАР

2.23. Субстратная специфичность щелочной фосфатазы

2.24. Статистика

2.25. Атомно-адсорбционная спектроскопия

2.26. 3D-Компьютерное моделирование пространственной структуры и молекулярный докинг

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Получение рекомбинантной щелочной фосфатазы СтАР

3.1.1. Получение плазмидных конструкций

3.1.2. Гетерологическая экспрессия и оптимизация экспрессии СтАР

3.1.3. Выделение и очистка рекомбинантной СтАР

3.2. Физико-химические свойства СтАР

3.2.1. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка

3.2.2. Оптимум рН, термостабильность и зависимость активности СтАР от присутствия ионов

3.2.3. Влияние ингибиторов

3.2.4. Субстратная специфичность

3.3. Каталитические параметры СтАР

3.4. Моделирование пространственной структуры СтАР

3.5. Сайт-направленный мутагенез СтАР

3.6. Перспективы применения рекомбинантной СтАР

3.6.1. Применение СтАР для дефосфорилирования векторов

3.6.2. Получение гибридного бифункционального силикатеиноподобного катепсина СтАР/ЬоС

3.6.3. Получение гибридных бифункциональных белков на основе генов СтАР и лектинов

3.6.3.1. Получение гибридного бифункционального галактозосвязывающего лектина СтАР/СЫ,

3.6.3.2. Моделирование пространственной структуры гибрида СтАР/СОЬ

3.6.3.3. Получение гибридного бифункционального маннан-связывающего лектина СтАР/МВЬ-Л./

3.6.3.4. Моделирование пространственной структуры маннан-связывающего лектина и его гибридного аналога СтАР/МБЬ-АЗ'

3.6.3.5. Молекулярный докинг т $Шсо и мутагенез лектина в гибридном бифункциональном белке CmAPIMSL-AJ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

blAPII

CAPS

CGL

CmAP

DsbC

ECAP

kcat

Ki

Km

LoC

MBL-AJ

Me+

Me2+

МОЕ

NADP

PDB

Pi

Pi

PLAP

PSM

RMSD

SAP

TAB

THEOS

YAP

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

-щелочная фосфатаза кишечника теленка -З-(циклогексиламино)-1 -пропансульфоновая кислота -лектин мидии Crenomitilus grayanus -щелочная фосфатаза Cobetia marina -ген, кодирующий редоксбелок DsbC Е. coli -щелочная фосфатаза Escherichia coli -количество оборотов фермента -константа конкурентного ингибирования -константа Михаэлиса-Ментен

-силикатеиноподобный катепсин Lantriculia oparinae -маннан-связывающий лектин Apostichopus japonicus -ионы одновалентных металлов -ионы двухвалентных металлов

-компьютерный пакет программ молекулярной графики

-никотинамидадениндинуклеотидфосфат

-международная база белковых структур

-изоэлектрическая точка

-неорганический фосфат

-плацентарная щелочная фосфатаза человека

-муцин желудка свиньи (pig stomach mucin)

-среднеквадратичное отклонение Ca атома

-щелочная фосфатаза Pandalus borealis

-щелочная фосфатаза антарктической бактерии TAB

-тетракис (2-гидроксиэтил) ортосиликат

-щелочная фосфатаза Vibrio sp. Gl5-21

а.о.(а.а.) -аминокислотный остаток (amino acid residue)

АМФ -аденозинмонофосфат

АТФ -аденозинтрифотфат

БСА (BSA) —бычий сывороточный альбумин (Bovine serum albumin)

ГТФ -гуанидинтрифосфат

ДНК —дезоксирибонуклеиновая кислота

flCH(SDS) -додецилсульфат Na (sodium dodecyl sulfate)

ДТТ -дитиотреитол

ДЭА (DEA) -диэтаноламин (diethanolamine)

ДЭАЭ -Диэтиламиноэтил

ИПТГ -изопропил-бета-О-тиогалактозид

КММ -коллекция морских микроорганизмов

MCJI (MBL) -Маннан-связывающий лектин (Mannan-binding lectin)

ОП -оптическая плотность

ОРС -открытая рамка считывания для белка

ОФА -онкофетальный антиген

п.н. (п.о.) -пара нуклеотидов (пара оснований)

ПААГ -полиакриамидный гель

и-НФ -иоря-нитро фенол (4-нитрофенол)

и-НФФ -иора-нитрофенилфосфат (4-нитрофенилфосфат)

ПЦР -полимеразная цепная реакция

РНК -рибонуклеиновая кислота

РЭА -раковый эмбриональный антиген

ТЛФА -трердофазный лектин-ферментный анализ

УФ -ультрафиолетовое излучение

ЩФ (АР) -щелочная фосфатаза (Alkaine phosphatase)

ЭДТА -этилендиаминтетраацетат Na

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантная щелочная фосфатаза морской бактерии Cobetia marina: получение, свойства и перспективы применения»

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время предметом особого внимания учёных являются адаптированные к холоду ферменты из-за их способности функционировать при низких температурах. Богатейшим источником таких ферментов являются морские микроорганизмы, адаптированные не только к низким температурам, но и к другим экстремальным условиям обитания: высокому давлению, вязкости и солености морской воды, а также сезонному дефициту питательных веществ (De Prada, Brenchley, 1997; Feller et al., 2003; Hoppe, 2003). Интерес к термолабильным ферментам морских организмов возник благодаря их повышенной, по сравнению с наземными аналогами, каталитической активности. Поэтому изучение структурных особенностей этих ферментов позволит выявить причины их высокой эффективности. К сожалению, такие уникальные ферменты присутствуют, как правило, в природном источнике в следовых количествах, что значительно затрудняет их выделение, к тому же многие морские микроорганизмы трудно культивировать в лабораторных условиях. Однако в настоящее время методы генной инженерии позволяют получать как рекомбинантные аналоги таких ферментов, так и создавать на их основе белки с заданными свойствами и функциями, что расширяет возможности их использования в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности (Глик, Пастернак, 2002). Возможность использования уникальных свойств ферментов морских психротрофных микроорганизмов для целей биотехнологии и медицины побуждает к исследованию их молекулярно-генетических характеристик и созданию суперпродуцентов ценных рекомбинантных белков. В качестве примера таких белков могут являться термолабильные щелочные фосфатазы (ЩФ) морского происхождения. Щелочные фосфатазы [3.1.3.1] являются неспецифическими моноэстеразами, катализирующими удаление фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и

дезоксирибонуклеозидфосфатов, что определяет их важную роль в метаболизме и круговороте фосфора. Практический интерес к ЩФ объясняется их широким использованием в генной инженерии, гибридизационной ДНК-технологии и в медицине для получения иммуноконъюгатов и рекомбинантных антител (McComb, 1979; Tu et al., 2004).

Ранее в лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН была выделена и охарактеризована ЩФ из психротрофной морской бактерии Cobetia marina КММ 296 с уникально высокой удельной активностью (> 10000 ед./мг), что является самым высоким показателем на сегодняшний день для представленных на мировых рынках коммерческих препаратов (Иванова и др., 1994; Plisova et al., 2005).Предполагалось, что морская бактерия, способная размножаться в широком интервале температур (от 4 до 42 °С), специализируется в симбиозе с моллюском Crenomytilus grayanus как участник процесса биоминерализации экзоскелета этого моллюска (Иванова и др., 1994; Léveque et al., 2004; Ivanova et al., 2005; Dorozhkin, 2009). Наличие у данной ЩФ высокой активности и стабильности в условиях различных химических модификаций белка оказалось важным фактором для получения на ее основе конъюгатов и её использования как в иммуноферментном анализе, так и в генно-инженерных исследованиях (Plisova et al., 2005).

Целью данной работы являлось получение рекомбинантной высокоактивной ЩФ морской бактерии С. marina КММ 296 в клетках продуцента Esherichia coli, изучение ее структурных особенностей, физико-химических и каталитических свойств, а также перспектив применения в генной инженерии, молекулярной биологии и диагностике.

В соответствии с заявленной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить оптимальные генетические конструкции, несущие ген ЩФ морской бактерии С. marina КММ 296, для синтеза высокоактивной рекомбинантной щелочной фосфатазы (С/иАР).

2. Оптимизировать условия для экспрессии высокоактивной СтАР.

3. Разработать и оптимизировать схему выделения СтАР.

4. Исследовать физико-химические и каталитические свойства СтАР.

5. Методами моделирования пространственной структуры и сайт-направленного мутагенеза исследовать структуру белков СтАР, СгаАР/ЬоС, СгаАР/СвЬ, СтАР/МВЬ-ЛУ.

6. Применить СтАР для дефосфорилирования концов генно-инженерных векторов перед лигированием.

7. Апробировать СтАР в составе химерных многофункциональных белков для мониторинга экспрессии и очистки различных рекомбинантных белков на примере бифункционального силикатеиноподобного катепсина губки ЬапМсиИа орагтае (СтАР/ЬоС).

8. Применить СтАР как молекулярный маркер в лектин-иммуноферментных методах с использованием гибридных бифункциональных галактозосвязывающего лектина мидии С. %гауапт (ОиАР/СОЬ) и маннан-связывающего лектина трепанга АрозйсУюртуаротсш (СтАР/МВЬ-^Ц).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Фосфатазы

Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) - ферменты, удаляющие фосфатную группу путем гидролиза, разлагая моноэфир фосфорной кислоты на фосфатный ион и молекулу со свободной гидроксильной группой:

Эти ферменты являются антагонистами других ферментов - фосфорилаз и киназ, присоединяющих фосфатную группу к субстрату и использующие для реакции энергетические молекулы, такие, как АТФ. По значению рН-оптимума фосфатазы делят на две большие группы: кислые, работающие в кислой среде (рН 4,0 - 6,0) и щелочные, работающие в щелочной среде (8,0 - 10,0). Большинство фосфатаз в живых организмах являются щелочными.

Фосфатазы также классифицируют по принципу субстратной специфичности. Так как фосфорилирование белков - наиболее часто встречающаяся форма посттрансляционной модификации для 30% всех известных белков, самый большой класс фосфатаз (англ. protein phoshatases, PPs) представлен фосфопротеиновыми фосфатазами (англ. phosphoprotein phosphatase, РРР). Класс представлен РР1, РР2А, РР2В, РР4, РР5, РР6 и РР7, а также Mg2+- и Мп2+-зависимыми РРМ-семействами фосфатаз. Тирозиновые и аспарагиновые фосфатазы формируют второй и третий класс протеиновых фосфатаз соответственно (Zhang, 2002).

Другая большая группа фосфатаз представлена рибо- и дезоксирибонуклеотидфосфатазами, или пирофосфатазами, которые катализируют гидролиз рибо- или дезоксирибонутлеотидтрифосфатов до рибо- или дезоксиибонуклеотиддифосфатов и фосфатного иона, либо до рибо- или дезоксирибонуклеотидмонофосфатов и свободного пирофосфатного иона (Davies et al., 2012).

1.2. Распределение и физиологическая роль щелочных фосфатаз

Щелочные фосфатазы (ЩФ) - широко распространенные в природе ферменты, что указывает на их важную роль в метаболизме различных фосфоросодержащих органических соединений (Вргктап, Каг1, 1994; МсСотЬ е1 а1., 1979). Многообразие этих ферментов определяется как видом синтезирующих их организмов, так и типом органов, тканей и клеток, а также их окружением, где идентифицируется ферментативная активность ЩФ. Причем качественные и количественные изменения такой активности могут зависеть от стадии роста, периода и условий развития источников. Еще очень ранние исследования показали, что ткани растений, культивируемых в условиях недостатка фосфатов, богаты содержанием ЩФ, особенно в корнях (МсСотЬ е1 а1., 1979). Позднее выяснилось, что основным источником фермента являются не сами растения, а паразитирующие на них микроскопические растения или грибы. В настоящее время некоторые исследователи утверждают, что такие организмы скорее симбиотрофы, чем паразиты, потому что индукцию экспрессии ЩФ у них вызывает фосфорное голодание растения-хозяина, поддержание которого позволяет им получать другие важные элементы для своей жизнедеятельности (Аопо а1., 2004). Много симбиотрофных форм существования можно встретить у беспозвоночных. Например, в целомической жидкости моллюсков были обнаружены морские бактерии с высоким уровнем фосфатазной активности, легко идентифицирующейся в гомогенате клеток, полученных путем ультразвуковой обработки, что указывает на периплазматическую локализацию ЩФ в клетках бактерий (Иванова е1 а1, 1992; 1994; Федосов и др., 1991). Причем ферменты оказались конститутивными и синтезировались морскими бактериями независимо от возраста животных, что свидетельствует об их важной роли как в деградации остатков нуклеиновых кислот в морских акваториях, так, вероятно, и в формировании и перманентном обновлении

раковин моллюсков в течение жизни (Иванова и др., 1992; Gonzales de Canales, Martin Rio, 1985; Dorozhkin, 2009). Однако некоторые изученные ЩФ были выделены непосредственно из тканей моллюсков (Chen et al., 2000; Xiao et al., 2002). Авторы также указывают на участие ферментов моллюсков в биоминерализации экзоскелетов. В отличие от высших растений и некоторых беспозвоночных, водоросли и грибы сами вырабатывают ЩФ, экспрессия которых также усиливается при фосфатном истощении среды обитания (Hoppe, 2003; McComb, 1979). Значительное увеличение активности ЩФ у слизевика Dictiosteliiim discoideum было связано с наступлением последней стадии жизненного цикла на фоне общего дефицита питательных веществ, когда клетки усиленно делятся для формирования мультиклеточного плодового тела (сорокарпа), в котором образуются споры. На момент завершения спороношения активность ЩФ становится минимальной (Krivanek, 1956). Было отмечено, что любое стрессовое состояние клетки, например, температурный или осмотический шок, инфекция и т.п., сопровождается всплеском экспрессии ЩФ (McComb, 1979; Gauthier et al., 1990). Исследователи полагают, что в этом случае, ЩФ играют двоякую роль: с одной стороны выполняют свою непосредственную функцию поставщика фосфора, а с другой стороны косвенную, каким-то образом влияя на проницаемость клеточной стенки через порины, синтез которых связан с синтезом ЩФ. Экспрессия и секреция ЩФ напрямую связана с проницаемостью мембран, зависящей от их состава и полиморфизма. Так, было показано, что основной мембранный фосфолипид - фосфатидилэтаноламин, вместе с кардиолипином, формирующие небислойные структуры, не только контролируют транслокацию ЩФ через мембрану, но и экспрессию фермента, благодаря участию липидов в передаче сигналов фосфатной регуляции из внешней среды (Анисимова, 2006).

В организме взрослых животных и человека активность ЩФ определяется в основном в слизистой желудочно-кишечного тракта, почках и костных тканях, в остальных органах ЩФ может синтезироваться в их эпителиальных клетках в

зависимости от стадий органогенеза. Высокая активность ЩФ наблюдается в плаценте, которая играет большую роль в периоде развития эмбриона, за счет поставляемых плоду питательных веществ (Harada et al., 2005; Manes et al., 1998; McComb, 1979).

Наконец, самый большой вклад в существование многообразия форм ЩФ, особенно растворимых, способных функционировать в окружающей среде, делают микроорганизмы. Действительно, если ЩФ животных - преимущественно гликолипопротеины, заякоренные во внешней клеточной мембране С-концами через гликозил-фосфатидилинозитол (GPI) (Гринштейн, Кост, 2001; Harada et al., 2005; Manes et al., 1998), то большинство ЩФ микроорганизмов находится либо в свободной форме в периплазматическом пространстве (Nesmeyanova et al., 1997; Angelina et al., 2001), либо выделяется во внеклеточное пространство (Beriutti et al., 2001; Moura et al., 2001). Однако среди бактериальных форм ЩФ также известны и представители периферических мембранных белков, крепящихся на поверхности клетки, по мнению одних авторов, за счет С-концевого гидрофобного липидсвязывающего домена, который, может быть результатом посттрансляционной модификации. По другой теории, в процессе эволюционной адаптации у предшественника ЩФ могли произойти аминокислотные замены в сайте сигнальной последовательности, который стал недоступен для сигнальной пептидазы, и белок, не подвергшийся химической модификации после транслокации, остается связанным с мембраной гидрофобным N-концом (Kriakov et al., 2003).

На сегодняшний день огромное количество микробиальных ЩФ изучено не только как ферменты с определенными физико-химическими свойствами, но и как продукты деятельности определенных генов и их регуляторов. Более того, большинство ЩФ стало известно лишь благодаря появлению современных технологий, позволяющих исследовать полноразмерный геном бактерии, который детально анализируется с помощью пакетов компьютерных программ, позволяющих конвертировать нуклеотидные последовательности кодирующих участков генов в

аминокислотные последовательности белков (Hou et al., 2004; Medigue et al., 2005; Jeong et al., 2005).

1.3. Генетическая регуляция биосинтеза щелочных фосфатаз

Классические ЩФ являются индуцибельными ферментами, регуляция экспрессии которых происходит на уровне транскрипции и трансляции и зависит от концентрации фосфатов в окружающей среде. Исследования регуляции гена ЩФ, встроенного в мультикопийную плазмиду в лишенные хромосомного гена ЩФ (Pho) клетки Е. coli, показали прямую зависимость между увеличением экспрессии ЩФ и дефицитом фосфатов в окружающей среде (Berg, 1981). На самом деле, хромосомные регулоны генов Pho бактерий включают в себя все гены, экспрессия которых оценивается как ответ на дефицит или избыток фосфатов в среде. Инициируется такой молекулярный ответ под контролем двухкомпонентной регуляторной системы сигнальной трансдукции (регулон Pho). Например, регулон Pho у E.coli состоит, как минимум, из 38 различных генов (Wanner, 1996), а у Bacillus subtilis - по крайней мере, из 31 известного гена (Antelmann et al., 2000). В Е. coli необходимое количество фосфора для жизнедеятельности клетки поддерживается низкоаффинной транспортной системой фосфатов (pit) до тех пор, пока концентрация фосфатов в питательной среде превышает 4 мкМ (Wanner, 1993). Как только концентрация фосфатов становится ниже этого уровня, включается высокоаффинная АТФ-зависимая транспортная система фосфора pst (phosphate-specific transport). На сегодняшний день таких высокоаффинных систем утилизации фосфата, каждая из которых имеет свои особенности, известно несколько: Е. coli (Aguena et al., 2002), В. subtilis (Qi et al., 1997), Mycobacterium tuberculosis (Braibant et al, 1996), Streptococcus pneumoniae (Novak et al., 1999), Pseudomonas aeruginosa (Nikata et al., 1996), и Clostridium acetobutylicum (Fischer et al., 2006). Оперон,

содержащий гены фосфат-специфичной АТФ-связывающей транспортной системы, считается первым локусом генов, являющимся членом регулона Pho. Структура транспортного оперона у всех бактерий идентична структуре pst у Е. coli и представляет собой совокупность таких генов как pstS, pstC, pstA, pstB и phoU (Рис. 1)

DNA

PßtS psfQj PstA У pstB )| phouf i >

pstS probe pstB probe 1710 probe

» 1.2 kb mRNA

» 4.7 kb mRNA

Рис. 1. Структура фосфат-специфичного транспортного оперона pst и его транскриптов mRNA у Clostridium acetobutylicum (Fischer et al., 2006). Стрелки серого цвета указывают относительное расположение генов оперона и направление транскрипции: pstS - рецептор (сенсор) фосфата; pstC - трансмембранный белок, формирующий канал; pstA - трансмембранный белок, формирующий канал; pstB -мембраносвязанная АТФаза; phoU - цитоплазматическая АТФаза или отрицательный регулятор Pho. Стрелки черного цвета обозначают два вида mRNA, транскрипция которых с оперона начинается через 80 нуклеотидов от начала структурного гена pstS. Короткий транскрипт оперона (1.2 kb mRNA) - продукт гена сенсора фосфата pstS, который синтезируется конститутивно при относительно высоком уровне фосфатов в среде и регулируется одним зависимым промотором Р1, тогда как полицистронный продукт оперона начинает транскрибироваться при глубоком дефиците фосфатов под регуляцией второго зависимого промотора Р2 (Pragai et al., 2004).

Помимо внешнего дефицита фосфатов на уровень формирования транскриптов оперона pst влияют и другие факторы, такие как внутренняя концентрация фосфора в клетке и значение рН среды — чем выше рН, тем больше уровень mRNA (Fischer et al., 2006). Сверхэкспрессия ЩФ в клетках Е. coli, например, наблюдали наряду с одновременным увеличением транскрипции гена индуцибельной сериновой протеиназы, вовлеченной в процесс деструкции аберрантных белков в периплазматическом пространстве, когда их концентрация выходила за пределы допустимой (Kadokura et al., 2001). Доказательства одномоментности работы генов

ЩФ и протеиназы были получены при попытке индукции сверхэкспрессии ЩФ в мутантном штамме, дефицитном по гену сериновой протеиназы. В результате в мутантном штамме наблюдалось скопление молекул предшественников ЩФ, а активной формы фермента было в несколько раз меньше, чем в тех же условиях в диком штамме. Полученные данные показывают, что ЩФ вовлечена в процесс, сопряженный с процессом протеолиза в момент увеличения экспорта белков через мембрану в стрессовых ситуациях (Darmon et al., 2006). Вероятно, по той же причине в некоторых бактериях структурный ген, кодирующий ЩФ, ассоциирован с геном, кодирующим белок, индуцируемый при повреждении ДНК (DNA-damage-inducible protein) (Рис. 2).

d'mP

phoA

fahG

M. smegmatis St. avium M. tuberculosis M bovis M leprae E. coli Salmonella

Рис. 2. Организация геномов различных бактерий относительно места расположения гена щелочной фосфатазы. Стрелками указаны гены: dinP -индуцибельный повреждением ДНК белок; рЬоА - щелочная фосфатаза; треугольником обозначены другие гены; fabG - 3-кетоацил-редуктаза белка-переносчика; // - гены разобщены в геноме.

Близкое расположение гена ацилредуктазы с геном РЬоА авторы объясняют тем, что ЩФ микобактерий является мембраносвязанным белком и дополнительно ацилируется по С-концу для крепления на внешней мембране клеток (Кпакоу еХ 2003). В некоторых бактериях эволюционная адаптация пошла дальше в

усовершенствовании механизмов регуляции биосинтеза эссенциальных белков - на уровне активации и транслокации. Обычно ЩФ экспрессируются в виде предшественника, имея классическую сигнальную последовательность для транслокации в периплазму, где претерпевают пострансляционную модификацию, после чего молекулы мономеров формируют активный гомодимер за счет образования двух дисульфидных мостиков (Karamyshev et al., 1998). Такой путь экспорта ЩФ через мембрану называется Бес-механизмом. Но существует укороченный путь биосинтеза ЩФ - Tat-механизм (twin-argenine translocation). В том случае, когда требуется экстренный экспорт белка или, в случае экстремофилов, у которых условия среды обитания усложняет экспорт белков, запускается синтез белка без лидерного пептида, после чего белок сразу же сворачивается в нужную пространственную структуру, правда, часто без кофактора. Такая практически функциональная форма белка направляется к специальному трансмембранному каналу. Гены белков (поринов), ответственных за транспорт белков, осуществляющих укладку пространственной структуры ("фолдинг") в цитозоле клетки, находятся в отдельном опероне tatABCD. Однако такая транспортная система встречается не во всех геномах (Angelina et al., 2001), так, в клетках E.coli был выделен и охарактеризован TatABCD-комплекс (Sargent et al., 2001).

Наряду с индуцибельными существуют и конститутивные ЩФ, уровень экспрессии и активность которых не зависит от концентрации фосфатов. Некоторые микроорганизмы имеют в своем арсенале оба типа ферментов, при этом, когда избытком фосфатов репрессируется индуцибельная ЩФ, продолжает экспрессироваться конститутивная ЩФ (Bhatti et al., 2000; Wagner et al., 1995). Такая картина в целом характерна для обитателей морской среды (Норре, 2003; Mudrik, 2004; Sebastián et al., 2004). В других микроорганизмах известны только конститутивные ЩФ (Nikata et al., 1996). Анализ аминокислотных последовательностей таких ЩФ показал, что они имеют необычную структуру и эволюционно далеко отстоят от остальных своих сородичей, поэтому их можно

выделить в отдельное семейство. Структурные особенности таких ЩФ, вероятно, кроются в наличии каких-либо дополнительных функций помимо транспорта фосфора. Так, например, ЩФ Chryseobacteriam meningosepticam очень хорошо расщепляет как АМФ, так и АТФ, а по гомологии первичной структуры этот фермент занимает промежуточное положение между Ca" -зависимой АТФазой и другими ЩФ (26). В морской бактерии Arthrobacter sp. были обнаружены две термолабильные ЩФ, одна из которых тоже дефосфорилировала АТФ со скоростью, равной скорости расщепления АМФ и ГТФ, тогда как другая ЩФ предпочтительно гидролизовала АМФ, глицерол-фосфат и глюкозо-6-фосфат, что более типично для ЩФ (De Prada, Brenchley, 1997). Анаэробная бактерия Prevotella intermedia, вызывающая заболевания пародонта, обладает специфической активностью по отношению к тирозин-фосфат-содержащим соединениям (De Prada, Brenchley, 1997) и имеет ближайшие структурные аналоги - фосфат-независимые ЩФ из Synechococcus sp. и Zymomonas mobilis (Wagner et al., 1995; Gomez, Ingram, 1995).

1.4. Физико-химические и каталитические характеристики щелочных фосфатаз и их пространстфенная организация 1.4.1. Молекулярная масса (Mr) и изоэлектрическая точка (рГ)

Молекулярные массы активных форм известных микробиальных ЩФ находятся в пределах от 40 до 400000 Да и выше, если фермент образует мультимерные формы. Большинство значений молекулярных масс было рассчитано из аминокислотной последовательности предшественников белков из базы GenBank, которые могут включать 2-2,5 кДа сигнального пептида, что соответствует 20-30 а.о., в зависимости от источника ЩФ (Табл. 1). Кроме того, ЩФ эукариот в разной степени гликозилированы, что тоже отражается на молекулярной массе при ее определении другими способами (гель-фильтрация, ПААГ- электрофорез) (Табл. 1 ).

Как известно, для проявления ферментативной активности фермент приобретает четвертичную структуру в виде димера, в некоторых случаях образует тетрамер (Wojciechowski et al., 2002) или активные мультимерные агрегаты (Rina et al., 2000; Poltorak et al., Moura, 2001). В последнее время показано существование мономеров ЩФ. Однако некоторые авторы подвергают сомнению факт существования таких форм в природе, по крайней мере, в некоторых случаях (59). Так, у Pyrococcus abyssi, несмотря на то, что в определенных условиях удалось выделить стабильный мономер, у него практически отсутствовала ферментативная активность (60). Установлено, что димеризация субъединиц происходит спонтанно при добавлении ионов двухвалентных металлов (Ме~ ), у большинства ЩФ это ионы Mg2+, хотя в редких случаях это может быть Со2+ или Са2+, что определяется а.о., определяющими поверхность глобулы мономера (Wojciechowski et al., 2002; Moura et al., 2001) (Табл. 1). При проведении эксперимента по мутагенезу определенных а.о. в молекуле ЩФ Е. coli был получен мономер, который не смог образовывать димер и проявлял некоторую активность, но его термостабильность была снижена на 50 % по сравнению с термостабильностью ЩФ из дикого штамма (Boulanger, Kantrowitz, 2003). Эти данные показывают, что более высокоорганизованная четвертичная структура прежде всего обеспечивает стабильность фермента, особенно, если его источник экстремотермофил (Wojciechowski, 2002; Yurchenko, 2003; Zappa et al., 2001). Эксперимент по мутагенезу эссенциальных а.о. для образования димеров в индуцибельной ЩФ В. subtilis показал, что димеризация необходима не только для фосфорилирования фермента во время катализа, но также для контролирования регуляции ответа в общей цепи сигнальной трансдукции, который либо активирует, либо подавляет активность промотора ЩФ (Chen et al., 2003).

Как видно из таблицы 1, значения pi всех исследованных ЩФ находятся в кислой области рН, особенно у бактериальных белков, чем объясняется высокая аффинность ЩФ к анионообменным смолам, позволяющая эффективно избавляться от сопутствующих белков во время выделения и очистки (McComb, 1979).

1.4.2. Влияние значений рН и температуры

В зависимости от источника фермента, ЩФ проявляют свою максимальную каталитическую активность при значениях рН от 7.0 и выше (Табл. 1). У некоторых бактерий рН-оптимум достигает рН 11.0 (Zappa et al., 2001; Yurchenko et al., 2003). В кислой среде (ниже рН 6.0) ЩФ, как правило, теряют свою активность, вероятно, в результате уменьшения контактов ионов Ме2+ с реакционными группами а.о. металлосвязывающих сайтов активного центра (Coleman, 1992). Влияние концентрации на ферментативную активность надо рассматривать одновременно с другими факторами - концентрацией и видом субстрата, ионной силой, температурой, типом буфера и его концентрации (Poltorak et al., 1999). Так, ЩФ из плаценты человека (PLAP) имеет более высокий рН-оптимум (рН 10.4) в карбонат-бикарбонатном буфере, чем в ДЭА и глицин-NaOH буферах, тогда как ЩФ из кишечника теленка имеет наибольшую активность при рН 9,8 в ДЭА-буфере (Табл. 1). Компоненты некоторых буферных растворов могут сами выступать в роли активатора или ингибитора фермента. Например, ионы СОз~~ в карбонатном буфере могут подавлять активность ЩФ, так же как некоторые аминокислоты и их спирты в больших концентрациях могут выступать как хелатирующие агенты, связывающие ионы Ме2+. Кроме того, глицин может связываться с а.о. некоторых ЩФ и понижать их активность по механизму неконкурентного ингибирования.

С увеличением концентрации соли в щелочном инкубационном растворе (рН 7.0-9.0) скорость ферментативной реакции многих ЩФ заметно увеличивается или наоборот - уменьшается (McComb, 1979). Есть предположение, что с увеличением концентрации одновалентных катионов Na+ или К+ ослабевают электростатические взаимодействия в активном центре белка в случае нековалентного связывания фермента и субстрата (Kozlenkov et al., 2002).

Таблица 1. Некоторые молекулярные и каталитические характеристики щелочных фосфатаз различного происхождения.

Источник ЩФ Молекулярная масса и форма (кДа х кол-во субъединиц) Количество а.о. РI рН-оптимум, оптимальный буфер Т°С-оптимум Т°С инактивации Удельная активность, Km, зависимость от ионов Ме2+

1 2 3 4 5 6 7 8

Pandalus borealis, гепатопанкреас арктической креветки (Nilsen, 2001) 52970 х 2 (65 кДа по ДСН ПААГ, 155 кДа по гель- фильтрации) 475 4,68 3,7 10,4 (0,1 М глицин-NaOH) 37 65°С, 100 %, 15 мин 4500 ед/мг; kcat = 11500/сек; Km = 0,54 мМ (Mg2+)

Gadus morhua, кишечник морской рыбы, (Asgeirsson et al., 2003) 52197x2 477 5,78 9,8 (1 МДЭА) 25 55°С, 50 %, 20мин Km=l,18 мМ; kcat = 5600/сек; (Mg2+)

Плацента человека (PLAP) (Le Du et al., 2001) 55493x2 512 5,79 9,8 (1 МДЭА) 37 68°С, 50 %, 30 мин kcat = 460 ±11 /сек; Km = 0,36 ± 0,03 мМ (Mg2+)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Голотин, Василий Александрович, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анисимова Е.В. Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны. Дис. канд. биол. наук. Пущино. 2006. -108 с.

2. Арсланбаева Л. Р. Получение генетических кодируемых FRET-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных фуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP // автореферат дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н., М., 20U.-c.15.

3. Булгаков А. А., Родионова О.М., Апаносевич В.И., Петрова И.Ю., Елисейкина М.Г. Способ диагностики рака шейки матки // Патент на изобретение №2343485. 2007.

4. Булгаков А.А., Родионова О.М., Петрова И.Ю., Елисейкина М.Г., Родионов

A.Ю. Разработка нового лектин-иммунноферментного метода для диагностики рака шейки матки // Тихоокеанский медицинский журнал, 2011. Т.1. 96-97 с.

5. Василенко А.А., Ковальчук С.Н., Булгаков А.А., Петрова И.Ю., Рассказов

B.А. Получение и рефолдинг рекомбинантного маннан-связывающего лектина голотурии Apostichopus japonicus II биология моря, 2012. т.38, №1,

C. 72-78

6. Галич И.П., Евтушенко Н.В.. Изменение гликозилирования при онкогенезе и развитии других патологических процессов // Онкология, 2003. Т. 5, № 1. С. 4-9

7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир. 2002. 585 с.

8. Гринштейн С.В., Кост О.А. Структурно-функциональные особености мембранных белков // Усп. биол. хим. 2001. Т. 41. С. 77—104.

9. Зернов Ю.П., Дедков B.C., Антонова Ю.А., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina Р2 // Биотехнология, 2005. № 2. С. 38-43.

10. Иванова Е.П., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю., Балабанова Л.А., Светашев В.И., Высоцкий М.В., Степаненко В.И., Рассказов В.А. Характеристика штамма морской бактерии Deleya marina - ассоцианта мидии Crenomytiliis grayaniís, продуцирующего высокоактивную щелочную фосфатазу // Биология моря. 1994. Т. 20. № 5.

11. Иванова Е.П., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю., Балабанова Л.А., Светашев В.И., Высоцкий М.В., Степаненко В.И., Рассказов В.А. Характеристика штамма морской бактерии Deleya marina — ассоцианта мидии Crenomytiliis grayanus, продуцирующего высокоактивную щелочную фосфатазу // Биология моря. 1994. Т. 20. № 5. С. 340-345.

12. Иванова Е.П., Фролова Г.М., Михайлов В.В., Горшкова Н.М. Special screening of alkaline phosphatase of bacterial origins // Ж. Прикл. Биохим. Микробиол. 1992, T. 28. С. 726-730.

13. Ковальчук С.Н., Голотин В.А., Шкрыль Ю.Н., Авраменко Т.В., Каменев Д.Г., Нарышкина H.H., Веремейчик Г.Н., Рассказов В.А., Булгаков В.П., Кожемяко В.Б. Разработка способов получения функционально активных рекомбинантных силикатеинов морских губок // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН 2013. Т. 6. С. 165—178

14. Королев В.П. Функции лектинов в клетке // Итоги науки и техники. Общие проблемы физико-химической биологии, 1984. Т. 1. С. 53-65.

15. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. / Наука, 1990, - 248с.

16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М. Мир. 1984. 479с.

17. Мецлер Д. Биохимия. М: Мир, 1980. Т. 2. -606 с.

18. Торчинский Ю.М. (под ред. Браунштейна А. Е.). Сера в белках. М.: Наука. 1977. С. 150-158.

19. Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Жигалина И.И., Иванова Е.П., Кожемяко В.Б., Оноприенко Н.В., Рассказов В.А., Еляков Г.Б. A highly active alkaline

phosphatase from marine bacteria // Док. Акад. Наук СССР, 1991, Т. 320. С. 485-487.

20. Фуртак В.А., Курика А.В., Белогорцева Н.И., Чикаловец И.В., Клещенко Ю.Е. Клеточная локализация рецепторов муцинового типа, выявляемых новым GalNac/Gal - специфичным лектином из морской мидии Crenomytilus grayanus в опухолях толстой кишки человека // Бюл. эксп. биологии и медицины. 1999. Т. 128, №10. С. 441-444.

21. Фуртак В.А., Тихонов Я.Н., Чикаловец И.В., Лукьянов П.А. Гистопатология рецепторов лектина CGL в спинномозговых ганглиях крыс // Тихоокеан. мед. журн. 2000. №4. С. 41-43.

22. Чикаловец И.В., Молчанова В.И., Булгаков А.А., Черников О.В., Петрова И.Ю., Лукьянов П.А. Использование лектинов морских гидробионтов для диагностики ряда социально значимых заболеваний человека // Вестник ДВОРАН. 2010. №5. С. 1-10

23. Чиссов В.И., Старинский В.В.,Сотникова Е.Н. Ранняя диагностика онкологических заболеваний. М.: 1994. С. 193.

24. Aguena М., Yagil Е., Spira В. Transcriptional analysis of the pst operon of Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 2002. Vol. 268. P. 518-524.

25. Akiyama Y., Ito K. Folding and assembly of bacterial alkaline phosphatase in vitro and in vivo II J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 8146-8150.

26. Ammerman J.W., Azam F. Bacterial 5'-nucleotidase in aquatic ecosystems: a novel mechanism of phosphorus regeneration // Science. 1985. V. 227. P. 13381340.

27. Angelina S., Moreno R., Gouffi K., Santini C.-L., Yamagishi A., Berenguer J., Wu L.-F. Export of Thermus thermophilus alkaline phosphatase via the twin-arginin translocation pathway in Escherichia coli // FEBS Lett. 2001. Vol. 506. P. 103-107.

28. Angelina S., Moreno R., Gouffi K., Santini C-L., Yamagishi A., Berenguer J., Wu L-F. Export of Thermus thermophilus alkaline phosphatase via the twin-

arginin translocation pathway in Escherichia coli // FEBS Lett. 2001. Vol. 506. P. 103-107.

29. Ansai T., Awano S., Chen X., Fuchi T., Arimoto T., Akifusa S., Takehara T. Purification and characterization of alkaline phosphatase containing phosphotyrosyl phosphatase activity from the bacterium Prevotella intermedia // FEBS Lett. 1998. Vol. 428. P. 157-160.

30. Antelmann H., Scharf C., Hecker M. Phosphate starvation-inducible proteins of Bacillus subtilis: proteomics and transcriptional analysis // J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 4478-4490.

31. Aono T., Maldonado-Mendoza I.E., Dewbre G.R., Harrison M.J., Saito M. Expression of alkaline phosphatase genes in arbuscular mycorrhizas // New Phytol. 2004. V. 162. P. 525-534

32. Arahal D.R., Castillo A.M., Ludwig W., Schleifer K.H., Ventosa A. Proposal of Cobetia marina gen. nov., comb, nov., within the family Halomonodaceae, to include the species Halomonas marina II Syst. Appl. Microbiol. 2002. Vol. 25. P. 207-211 [Validation list 88 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. Vol. 52. P. 1915-1916].

33. Asgeirsson B., Andresson O.S. Primary structure of cold-adapted alkaline phosphatase from a Vibrio sp. as a deduced from the nucleotide gene sequence // Biochim. Biophys. Act. 2001. Vol. 1549. P. 99-111.

34. Asgeirsson B., Hauksson J.B. and Gunnarsson H. Dissociation and unfolding of cold-active alkaline phosphatase from Atlantic cod in the presence of guanidinium chloride // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 6403-6412.

35. Asgeirsson B., Neilsen B.N., Hojrup P. Amino acid sequence of the cold-active alkaline phosphatase from Atlantic cod (Gadas morhua) II Comp. Biochem. Physiol. B. 2003. Vol. 136. P. 45-60.

36. Azam F., Cho B.C. Bacterial utilization of organic matter in the sea. In: Ecology of microbial communities // UK: Cambridge University Press. 1987. P. 261-281.

37. Belogortseva N.I., Molchanova V.I., Kurika A.V., Skobun A.S., Glazkova V.E. Isolation and characterization of new GalNAc/Gal-specific lectin from the sea

mussel Crenomytilus grayanus II Comp. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1998. V. 119. 45e50

38. Berg P.E. Cloning and characterization of the Escherichia coli gene coding for alkaline phosphatase//J. Bacteriol. 1981. Vol. 146. P. 660-667.

39. Berlutti F., Passariello C., Selan L., Thaller M.C. and Rossolini G.M. The Chyseobacterium meningosepticum PafA enzyme: prototype of a new enzyme family of prokaryotic phosphate-irrepressible alkaline phosphatases? // Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 2831-2839.

40. Bhatti A.R., Alvi A., Chaudhry G.R. Evidence on the presence of two distinct alkaline phosphatases in Seiratia marcescens II FEMS Microbiol. Lett. 2000. Vol. 182. P. 131-135.

41. Bihani S.C., Das A., Nilgiriwala K.S., Prashar V., Pirocchi M., Apte S.K., Ferrer J.L., Hosur M.V. X-Ray structure reveals a new class and provides insight into evolution of alkaline phosphatases // PloS ONE. 2011. V. 6(7). e22767.

42. Bjorkman K., Karl D. Bioavailability of inorganic and organic phosphorus compounds to natural assemblages of microorganisms in Hawaiian coastal waters // Marine Ecol. Prog. Ser. 1994. Vol. 111. P. 265-273.

43. Boulanger R.R., Kantrowitz E.R. Characterization of a Monomeric Escherichia coli Alkaline Phosphatase Formed upon a Single Amino Acid Substitution // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 23497-23501.

44. Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72 P. 248-254.

45. Braibant M., Lefevre P., de Wit L., Peirs P., Ooms J., Huygen K., Andersen A. B., Content J. A Mycobacterium tuberculosis gene cluster encoding proteins of a phosphate transporter homologous to the Escherichia coli Pst system // Gene. 1996. Vol. 176. P. 171-176.

46. Bulgakov A.A., Eliseikina M.G., Petrova I.Yu., Nazarenko E.L., Kovalchuk S.N. Isolation and properties of a mannan-binding lectin from the holothurian Apostichopus japonicus II Glycobiology 2007. V. 17, № 12, P. 1284-1298.

47. Cathala G., Brunei C., Chappelet-Tordo, Lazdunski M. Bovine kidney alkaline phosphatase. Catalytic properties, subunit interactions in the catalytic process, and mechanism of Mg2+ stimulation // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 60466053.

48. Cha J., Shimizu K., Zhou Y., Christiansen S., Chmelka B., Stucky G., Morse D. Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 361365

49. Chang W.-C., Hartshorn K.L., White M.R., Moyo P., Michelow I. C., Koziel H., Kinane B.T., Schmidt E. V., Fujita T., Takahashi K.. Recombinant chimeric lectins consisting of mannose-binding lectin and L-ficolin are potent inhibitors of influenza A virus compared with mannose-binding lectin. Biochemical Pharmacology. 2011V. 81. P. 388-395.

50. Chattopadhyaya M.K., Devi K.U., Gopishankar Y., Shivaji S. Thermolabile alkaline phosphatase from Sphingobacterium antarcticus a psychrotrophic bacteria from Antarctica I I Polar. Biol. 1995. Vol. 15. P. 215-219.

51. Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2013.

52. Chen P.S., Toribar, Ir T.Y., Warne H. Microdetermination of phosphorus // Anal. Chem. 1956. Vol. 28. P. 1756-1758.

53. Chen Q-X., Zheng W.-Z., Lin J.-Y., Shi Y., Xie W.-Z., Zhou H.-M. Effect of metal ions on the activity of green crab {Scylla serrata) alkaline phosphatase // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2000. Vol. 32. P. 879-885.

54. Chen Y., Birck C., Samama J-P. and Hulett F.M. Residue R113 Is Essential for PhoP Dimerization and Function: a Residue Buried in the Asymmetric PhoP Dimer Interface Determined in the PhoPN Three-Dimensional Crystal Structure // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185. P. 262-273.

55. Chi-Mou Juang M.D., Peng-Hui Wang M.D., Ming-Shien Yen M.D., Chiung-Ru Lai M.D., Heung-Tat Ng M.D. and Chiou-Chung Yuan M.D. Application of Tumor Markers CEA, TPA, SCC-Ag in Patients with Low-Risk FIGO Stage IB

and IIA Squamous Cell Carcinoma of the Uterine Cervix // Gynecologic Oncology. 2000. V. 76(1). P.103-106.

56. Coleman J.E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1992. Vol. 21. P. 441-83.

57. Cordell J. L., Falini B.A., Erber W.N., Ghosh A. K., Abdulaziz Z., MacDonald S., Pulford K. A., Stein H., Mason D.Y. . Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase // JHC. 1984 V. 32 P. 219-229.

58. Cotner J.B., Wetzel R.G. 5'-Nucleotidase activity in a eutrophic lake and an oligotrophic lake // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 1306-1312.

59. Darmon E., Dorenbos R., Meens J., Freudl R., Antelmann H., Hecker M., KuipersO.P., Bron S., Quax W.J., Dubois J.-Y.F.,Maarten van Dijl J. A Disulfide Bond-Containing Alkaline Phosphatase Triggers a BdbC-Dependent Secretion Stress Response in Bacillus subtilis II Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72. P. 6876-6885.

60. Davies O., Mendes P., Smallbone K., Malys N. Characterisation of multiple substrate-specific (d)ITP/(d)XTPase and modelling of deaminated purine nucleotide metabolism // BMB Reports. 2012. T45 (4). P. 259-64.

61. Davina J. H. M., Stadhouders A. M., van Haelst U. J. G. M., Lamers G.E.M., Kenemans P. Concanavalin A Peroxidase labeling in cervical exfoliative cytopathology. Gynecologic Oncology. 1985. V. 22(2) . P. 212-223.

62. de Melo F.H.M., Butera D., Medeiros R.S., Andrade L.N., Nonogaki S., Soares F.A., Alvarez R.A., Moura da Silva A.M., Chammas R., Biological Applications of a Chimeric Probe for the Assessment of Galectin-3 Ligands // JHC. 2007. V. 55(10). P. 1015-1026.

63. De Prada P., Brenchley J.E. Purification and Characterization of Two Extracellular Alkaline Phosphatases by a Psychrophilic Arthrobacter Isolate // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 2928-2931.

64. Derman A.I., Beckwith J. Escherichia coli alkaline phosphatase fails to acquire disulfide bonds when retained in the cytoplasm // J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 7719-7722.

65. Deyev S. M., Waibel R., Lebedenko E. N., Schubiger A. P., Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module // Nature biotechnology, 2003. V. 21. P. 1486-1492.

66. Donella-Deana A., Ostojic S., Pinna L.A. and Barbaric S. Specific dephosphorylation of phosphopeptides by the yeast alkaline phosphatase encoded by PH08 gene // Biochim. Biophis. Act. 1993. Vol. 1177. P. 221-228.

67. Dorozhkin SV. Calcium orthophosphates in nature // biology and medicine. 2009. V. 2 P. 399^498

68. Dorozhkin SV. Calcium orthophosphates in nature, biology and medicine. Materials. 2009. V. 2. P. 399^198.

69. Fanayan S, Hincapie M , Hancock WS. Using lectins to harvest the plasma/serum glycoproteome//Electrophoresis. 2012. V. 33(12). P. 1746-1754

70. Feller G., Gerday C.. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation // Nat. Rev. Microbiol. 2003. P. 200-208.

71. Fischer R-J., Oehmcke S., Meyer U., Mix M., Schwarz K., Fiedler T. and Bahl H. Transcription of the pst Operon of Clostridium acetobutylicum Is Dependent on Phosphate Concentration and pH // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188. P. 5469-5478.

72. Gauthier M.J., Flatau G.N., Clement R.L. Influence of phosphate ions and alkaline phosphatase activity of cells on the survival of Escherichia coli in sea water//Microb. Ecol. 1990. Vol. 20. P. 245-251.

73. Gomez P.F., Ingram L.O. Cloning, sequencing and characterization of the alkaline phosphatase gene (phoD) from Zymomonas mobilis II FEMS Microbiol. Lett. 1995. Vol. 125. P. 237-246.

74. Gonzales de Canales M.L., Martin Rio M.P. Enzymes in marine invertebrates // Rev. Int. Oceanogr. Med. 1985. Vol. 59-60. P. 9-1.

75. Griep R.A., van Twisk Ch., Kerschbaumer R.J., Harper K., Torrance L., Himmler G., van der Wolf J.M. and Schots A. pSKAP/S: An Expression Vector for the

Production of Single-Chain Fv Alkaline Phosphatase Fusion Proteins // Prot. Exprès. Purif. 1999. Vol. 16. P. 63-69.

76. Gudjônsdôttir K., Âsgeirsson B. Effects of replacing active site residues in a cold-active alkaline phosphatase with those found in its mesophilic counterpart from Escherichia coli // FEBS J. 2008. P. 117-127.

77. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. Vol. 18. P. 2714-2723.

78. Guimaràes L.H., Terenzi H.F., Jorge J.A., Leone F.A., Polizeli M.L. Extracellular alkaline phosphatase from the filamentous fungus Aspergillus caespitosus: purification and biochemical characterization // Folia Microbiol. (Praha). 2003 V.48(5) P. 627-32

79. Harada T., Koyama I., Matsunaga T., Kikuno A., Kasahara T., Hassimoto M., Alpers D.H., and Komoda T. Characterization of structural and catalytic difference in rat intestinal alkaline phosphatase isozymes // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 2477.

80. Hauksson B.J., Andresson O.S., Asgeirsson. Heat-labile bacterial alkaline phosphatase from a marine Vibrio sp. // Enzyme Microb. Technol. 2000. Vol. 27. P. 66-73.

81. Helland R, Larsen RL, Asgeirsson B. The 1.4 A crystal structure of the large and cold-active Vibrio sp. alkaline phosphatase // Biochim Biophys Acta. 2009. V. 1794. P. 297-308

82. Henney N.C., Li B., Elford C., Reviriego P., Campbell A.K., Wann K.T. A large-conductance (BK) potassium channel subtype affects bothgrowth and mineralization of human osteoblasts // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2009 V. 297 P. 1397-1408.

83. Hess B., Kutzner C., van der Spoel D., Lindahl E. GROMACS 4: algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation. J Chem Theory Comp. 2008. V. 4 P. 435-447

84. Holm L., Park J. DaliLite workbench for protein structure comparison, Bioinformatics. 2000. P. 566-567.

85. Holtz K.M., Catrina I.E., Hengge A.C. Kantrowitz E.R. Mutation of Arg-166 of alkaline phosphatase alters the thio effect but not the transition state for phosphoryl transfer. Implications for the interpretation of thio effects in reactions of phosphatases // Biochemistry 2000. Vol. 39. P.9451-9458.

86. Holtz K.M., Stec B., Myers J.K., Antonelli S.M., Widlanski T.S., Kantrowitz E.R. Alternate modes of binding in two crystal structures of alkaline phosphatase-inhibitor complexes // Protein Sci. 2000. Vol. 9. P. 907-915.

87. Hoppe H.G. Phosphatase activity in the sea // Hydrobiologia. 2003. V. 493. P. 187-200.

88. Hou Sh., Saw J.H., Lee K.Sh., Freitas T.A., Belisle C., Kawarabayasi Y. Genome sequence of the deep-sea y-proteobacterium Idiomarina loihiensis reveals amino acid fermentation as a source of carbon and energy // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2004. Vol. 101. No. 52. P. 18036-18041.

89. Hoylaerts M.F., Manes T., Millan J.L. Mammalian alkaline phosphatases are allosteric enzymes // J. Biol. Chem. 1997 P. 22781-22787.

90. Hoylaerts M.F., Millan J.L.. Site-directed mutagenesis and epitope-mapped monoclonal antibodies define a catalytically important conformational difference between human placental and germ cell alkaline phosphatase // Eur. J. Biochem. 1991. P. 605-616.

91. Hoylartes M.F., Ding L., Narisawa S., Van kerckhoven S., Millan J.L., Mammalian alkaline phosphatase catalysis requires active site structure stabilization via the N-terminal amino acids micrenvironment // Biochemistry . 2006. P. 9756-9766.

92. Hulett F.M., Kim E.E., Bookstein C., Kapp N.V., Edwards C.W., Wyckoff H.W. Bacillus subtilis alkaline phosphatases III and IV. Cloning, sequencing, and comparisons of deduced amino acid sequence with Escherichia coli alkaline phosphatase three-dimensional structure // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 10771084.

93. Ishibashi M., Yamashita S., Tokunaga M. Characterization of halophilic alkaline phosphatase from Halomonas sp. 593, a moderately halophilic bacterium. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. V. 69. P. 1213-1216

94. Ivanova E.P., Christen R., Sawabe T., Alexeeva Y.Y., Lysenko A.M., ChelominV.P.,Mikhailov V.V. Presence of ecophysiologically diverse populations within cobetia marina strains isolated from marine invertabrate, algae and the environments // Microb Environ. 2005. V.20. P.200-207.

95. Jeong H., Yim J.H., Lee Ch., Choi S.-H., Park Y.K., Yoon S.H. Genomic blueprint of Hahella chejuensis, a marine microbe producing an algicidal agent // Nuc. Acid Res. 2005. Vol. 33. No. 22. P. 7066-7073.

96. Kadokura H., Kawasaki H., Yoda K., Yamasaki M., Kitamoto K. Efficient export of alkaline phosphatase overexpressed from a multicopy plasmid requires degP, a gene encoding a periplasmic protease of Escherichia coli // J. Gen. Appl. Microbiol. 2001 Vol. 47. P. 133-141.

97. Karamyshev A.L., Karamysheva Z.N., Kajava A.V., Ksenzenko V.N., Nesmeyanova M.A. Processing of Escherichia coli alkaline phosphatase: role of the primary structure of the signal peptide cleavage region // J.Mol.Biol. 1998. Vol. 277. P. 859-870.

98. Kobori H., Sullivan C.W., Shizya H. Heat-labile alkaline phosphatase from Antarctic bacteria: rapid 5'-end-labeling of nucleic acids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 6691-6695.

99. Kobori H., Taga N. Extracellular alkaline phosphatase from marine bacteria: purification and properties of extracellular phosphatase from a marine Pseudomonas sp // Can. J. Microbiol. 1980. Vol. 26. P. 833-838.

100. Koutsioulis D., Wang E., Tzanodaskalaki M., Nikiforaki D., Deli A., Feller G., Heikinheimo P., Bouriotis V., Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase // Protein Eng. Des. Sel. 2008. P. 319-327.

101. Kovalchuk S.N., Chikalovets I.V., Chernikov O.V., Molchanova V.I., Li W., Rasskazov V.A., Lukyanov P.A. cDNA cloning and structural characterization of a lectin from the mussel Crenomytilus grayanus with a unique amino acid

sequence and antibacterial activity // Fish Shellfish Immunol. 2013. V. 35, № 4. P. 1320-1324.

102. Kozlenkov A., Manes T., Hoylaerts M.F. and Millan J.L. Function Assignment to Conserved Residues in Mammalian Alkaline Phosphatases // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 22992-22999.

103. Kozlenkov A., Manes T., Hoylaerts M.F., Millan J.L. Function Assignment to Conserved Residues in Mammalian Alkaline Phosphatases // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 22992-22999

104. Kriakov J., Lee S.H., Jacobs W.R. Identification of a regulated alkaline phosphatase, a cell surface-associated lipoprotein, in Mycobacterium smegmatis II J. Bacteriol. 2003. P. 4983-4991.

105. Krivanek J.O. Alkaline phosphatase activity in the developing slime mold, Dictiostelium discoideum raper // J.Exp. Zool. 1956. Vol. 133. P. 459.

106. Kuzmanov U., Kosanam H., Diamandis E.P.. The sweet and sour of serological glycoprotein tumor biomarker quantification // BMC Medicine 2013, V. 11. P.31

107. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of the bacteriophage T7 //Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

108. Le Du M.H., Stigbrand T., Taussig M.J., Menez A., Stura E.A., Crystal structure of alkaline phosphatase from human placenta at 1.8 A resolution. Implication for a substrate specificity//J. Biol. Chem. 2001, 9158-9165.

109. Lee S.Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. 1990. V. 9(6) P. 676-679.

110. Leveque I., Cusack M., Davis S.A., Mann S. Promotion of fluorapatite crystallization by soluble-matrix proteins from Lingula Anatina shells // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. 43:885-888.

111. Lichtenstein M, Ben-Yehudah A., Belostotsky R., Eaveri R., Sabag O., Grodzovski I., Lorberboum-Galski H. Utilizing a GnRH-based chimeric protein for the detection of adenocarcinoma// Int. J. Oncol. 2005. V. 27(1). P. 143-8

112. Lin H.Y., Shih C.Y., Liu H.C., Chang J., Chen Y.L., Chen Y.R., Lin H.T., Chang Y.Y., Hsu C.H., Lin H.J. Identification and characterization of an extracellular

alkaline phosphatase in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum II Mar Biotechnol. 2013 V. 15(4) P. 425-36.

113. Lin X., Xie J., Niu G., Zhang F., Gao H., Yang M., Quan Q., Aronova M.A., Zhang G., Lee S., Leapman R., Chen X. Chimeric ferritin nanocages for multiple function loading and multimodal imaging // Nano Lett. 2011. V.128. P. 1293-1303.

114. Lindahl E., Hess B., van der Spoel D. GROMACS 3.0: a package for molecular simulation and trajectory analysis//J. Mol. Model. 2001. Vol. 7. P. 306-317.

115. Manes T., Hoylaerts, Muller R., Lottspeich F., Holke W., Millan J.L. Genetic Complexity, Structure, and Characterization of Highly Active Bovine Intestinal Alkaline Phosphatases // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 23353-23360.

116. McComb R.B., Bowers G.N., Posen S. Alkaline Phosphatase. NY: Plenum Press, 1979. 986 p.

117. Medigue C., Krin E., Pascal G., Barbe V., Bernsel A., Bertin P.N., Cheung F., Cruveiller S., D'Amico S., Duilio A., Fang G., Feller G., Ho C., Mangenot S., Marino G., Nilsson J., Parrilli E., Rocha E.P.C., Rouy Z., Sekowska A., Tutino M.L., Vallenet D., von Heijne G. & Danchin A. Coping with cold: The genome of the versatile marine Antarctica bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 // Genome Res. 2005. Vol. 15. P. 1325-1335.

118. Menzorova N.I., Seytkalieva A.V., Rasskazov V.A. Enzymatic methods for the determination of pollution in seawater using salt resistant alkaline phosphatase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus intermedins // Mar. Pollut. Bull. 2014.V. 79. P. 188-195.

119. Menzorova N.I., Ivleva A.D., Sibirtsev Iu.T., Rasskazov V.A. Phosphatases and phosphodiesterases isolated from the red king crab (Paralithodes camtschatica) hepatopancreas // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 2008. V. 44(1) P. 106-10.

120. Moura R.S., Martin J.F., Martin A., Liras P. Substrate analysis and molecular cloning of the extracellular alkaline phosphatase of Streptomyces griseus II Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 1525-1533.

121. Moura R.S., Martin J.F., Martin A., Liras P. Substrate analysis and molecular cloning of the extracellular alkaline phosphatase of Streptomyces g?-iseus II Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 1525-1533.

122. Mudrik Z.J. Decomposition of organic and solubilisation of inorganic phosphorus compounds by bacteria isolated from a marine sandy beach // Mar. Biol. 2004. Vol. 145. P. 1227-1234.

123. Müller W.E., Wang X., Cui F.Z., Jochum K.P., Tremel W., Bill J., Schröder H.C., Natalio F., Schlossmacher U., Wiens M. Sponge spicules as blueprints for the biofabrication of inorganic-organic composites and biomaterials // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 83. P. 397-413

124. Murakawa T., Yamagata H., Tsuruta H. and Aizono Y. Cloning of Cold-active Alkaline Phosphatase Gene of a Psychrophile, Shewanella sp., and Expression of the Recombinant Enzyme // Biosc. Biotech. Biochem. 2002. Vol. 66. P. 754-761.

125. Murphy J.E., Kantrowitz E.R. Why are mammaline alkaline phosphatases much more active than bacterial alkaline phosphatases? // Mol. Microbiol. 1994. Vol. 12. P. 351-357.

126. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. Trefoil fold. Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interleukins-1 beta and 1 alpha and fibroblast growth factors // J. Mol. Biol. 1992 V. 223. 531e43.

127. Nasu E., Ichiyanagi A., Gomi K.. Cloning and expression of a highly active recombinant alkaline phosphatase from psychrotrophic Cobetia marina II Biotechnol. Lett. 2012. V. 34 P. 321-328.

128. Nesmeyanova M.A., Kalinin A.E., Karamyshev A.L., Mikhaleva N.I. and Krupyanko V.l. Overproduction, secretion, isolation and properties of recombinant alkaline phosphatase encoded in Escherichia coli II Process Biochem. 1997. Vol. 32. P. 1-7.

129. Nikata T., Sakai Y., Shibat K., Kato J., Kuroda A., Ohtake H. Molecular analysis of the phosphate-specific transport (pst) operon of Pseudomonas aeruginosa II Mol. Gen. Genet. 1996. Vol. 250. P. 692-698.

130. Nilsen I.W. Thermolabile alkaline phosphatase from Northern shrimp (Padalus borealis): protein and cDNA sequence analyses // Comp. Biochem. Physiol. B. 2001. V. 129. P. 853-861

131. Novak R., Cauwels A., Charpentier E., Tuomanen E. Identification of a Streptococcus pneumoniae gene locus encoding proteins of an ABC phosphate transporter and a two-component regulatory system // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181.P. 1126-1133.

132. Olsen R.L., Overbo K., Myrnes B. Alkaline phosphatase from the hepatopancreas of shrimp (Pandalus borealis): a dimeric enzyme with catalitically active subunits // Comp. Biochem. Physiol. B. 1991. Vol. 99. P. 755-761.

133. Olsson M.H.M., Sondergard S.R., Rostkowski M., Jensen J.H. PROPKA3: Consistent Treatment of Internal and Surface Residues in Empirical pKa predictions // J. Chem. Theory Comp. 2011. V. 7. P. 525-537.

134. Paul J.H., Jeffrey W.H. Cannon J.P. Production of dissolved DNA, RNA, and protein by microbial populations in a Florida reservoir // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. P. 2957-2962.

135. Plisova E.Yu., Balabanova L.A., Ivanova E.P., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Agafonova E.V., Rasskazov V.A. A highly active alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina // Mar. Biotechnol. 2005. Vol. 7. N 3. P. 173-178.

136. Poe R.W., Sangadala V.S., Brewer J.M. Effects of various salts on the steady-state enzymatic-activity of Esherichia coli alkaline-phosphatase // J. Inorg. Biochem. 1993. Vol. 50. P. 173-180.

137. Poe R.W., Sangadala V.S., Brewer J.M. Effects of various salts on the steady-state enzymatic-activity of Esherichia coli alkaline-phosphatase // J. Inorg. Biochem. 1993. Vol. 50. P. 173-180.

138. Poltorak O.M., Chukhray E.S., Torshin I.Y., Atyaksheva L.F., Trevan M.D., Chaplin M.F. Catalytic properties, stability and the structure of the conformational lock in the alkaline phosphatase from Escherichia coli // J. Mol. Catalys. B. 1999. Vol. 7. P. 165-172.

139. Porteus M.H., Baltimor D. Chimerik Nucleases Stimulate Gene Targeting in Human Cells // Science. 2003. V. 300 P. 736.

140. Pragai Z., Allenby N.E.E., O'Connor N., Dubrac S., Rapoport G., Msadek T., Harwood C.R. Transcriptional Regulation of the phoPR Operon in Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 1182-1190.

141. Puri R.K., Mehrotra P.T., Leland P., Kreitman R.J., Siegel J.P., Pastan I. A chimeric protein comprised of IL-4 and Pseudomonas exotoxin is cytotoxic for activated human lymphocytes. The Journal of Immunology. 1994. V. 152. P. 3693-3700.

142. Qi Y., Kobayashi Y., Hulett F.M. The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate-regulated promoter and is involved in phosphate transport but not in regulation of the Pho regulon // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179. P. 2534-2539.

143. Reddi A.L., Sankaranarayanan K., Arulraj H.S., Devaraj N., Devaraj Enzime-linked PNA lectin-binding assay of serum T-antigen in patient with SCC of the uterine cervix // Cancer letters. 2000. V. 149. P. 207-211.

144. Rina M., Pozidis C., Mavromatis K., Tzanodaskalaki M., Kokkinidis M., Bouriotis V. Alkaline phosphatase from the Antarctic strain TAB5. Properties and psychrophilic adaptations // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. P. 1230-1238.

145. Sambrook J., Fritschi E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratorymanual, CSHL Press. New York. 1989.

146. Sargent F., Gohlke U., De Leeuw E., Stanley N.R., Palmer T., Saibil H.R., Berks B.C. Purified components of the Escherichia coli Tat protein transport system form a double-layered ring structure // Eur. J. Biochem. . 2001. Vol. 268. P. 3361-3367.

147. Sayler G.S., Puziss M., Silver M. Alkaline phosphatase assay for fresh water sediments: application to perturbed sediment systems // AEM. 1979 V. 38 P. 922927.

148. Schaap P., Akhavan H., Romano L.J. Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes // Clinical Chemistry. 1989. V. 35 P. 1863-1864.

149. Schröder H.C., Schlossmacher U., Boreiko A., Natalio F., Baranowska M., Brandt D., Wang X., Tremel W., Wiens M., Müller W.E. Silicatein: nanobiotechnological and biomedical applications // Prog. Mol. Subcell. Biol. 2009. V. 47. P. 251-273.

150. Sebastián M., Arístegui J., Montero M.F., Escanez J. and Niell F.X. Alkaline phosphatase activity and its relationship to inorganic phosphorus in the transition zone of the North-western African upwelling system // Progr. Oceanogr. 2004. V. 62. P. 131-150.

151. Smalás A.O., Schroder Leiros H.-K., Os V., Willassen N.P. Cold adapted enzymes, in: M.R. El-Gewely (Ed.) // Biotechnol. Ann. Rev. 2000, P. 1-57.

152. Stec B., Holtz K.M., Kantrowitz E.R. A revised mechanism for the alkaline phosphatase reaction involving three metal ions //J. Mol. Biol. 2000. Vol. 299. P. 1303-1311.

153. Stec B., Holtz K.M., Kantrowitz E.R. A revised mechanism for the alkaline phosphatase reaction involving three metal ions // J. Mol. Biol. 299 (2000) 13031311.

154. Szeberényi J. Problem-solving test: DNA manipulation with alkaline phosphatase and polynucleotide kinase // Biochem. Mol. Biol. Educ. 2014. V. 42(4). P. 34850.

155. Takahashi K., Moyo P., Chigweshe L., Chang W.C., White M.R., Hartshorn K.L. Efficacy of recombinant chimeric lectins, consisting of mannose binding lectin and L-ficolin, against influenza A viral infection in mouse model study // Virus Res. 2013. V. 178(2) P. 495-501

156. Tibbitts T. T., Xu X., Kantrowitz E. R. Kinetics and crystal structure of a mutant Escherichia coli alkaline phosphatase (Asp-369—>Asn): a mechanism involving one zinc per active site // Protein Sei. 1994. V.3(l 1). P. 2005-2014.

157. Tu Z., Ke L.-H., He G. The application of alkaline phosphatase labeled HBV probe in serum detection//Virus Genes. 2004 V. 28 P. 151-156.

158. Urban R.G, Dreyfus L.A., Whipp S.C. Construction of a Afunctional Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STb)-alkaline phosphatase fusion protein // Infect. Immun. 1990. V. 58(11) P. 3645-3652

159. Vallee B.L., Auld D.S. Zinc metallochemistry in biochemistry. Zinc metallochemistry in biochemistry // EXS. Vol. 32. P. 6493-6500.

160. Van der Spoel D., Lindahl E., Hess B. The GROMACS development team, GROMACS User Manual version 4.6.3, 2013.

161. Van der Spoel D., Lindahl E., Hess B., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen HJC GROMACS: fast, flexible and free. J Comp Chem. 2005. V. 26 P. 1701-1718

162. Wagner K.U., Masepohl B., Pistorius E.K. The cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 contains a second alkaline phosphatase encoded by phoVII Microbiology. 1995. Vol. 141. P. 3049-3058.

163. Wang E., Koutsioulis D., Leiros H.K., Andersen O.A., Bouriotis V., Hough E., Heikinheimo P. Crystal structure of alkaline phosphatase from the antarctic bacterium TAB5 //J. Mol. Biol. 2007. V. 366 P. 1318-1331.

164. Wang H., Gao J., Wong A.H., Hu K., Li W., Wang Y., Sang J. Rfa2 is specifically dephosphorylated by Pph3 in Candida albicans // Biochem J. 2013. V. 449(3). P. 673-81.

165. Wang X., Schröder H.C., Wiens M., Schloßmacher U., Müller W.E. Biosilica: molecular biology, biochemistry and function in demosponges as well as its applied aspects for tissue // Engineering. Adv. Mar. Biol. 2012. V. 62. P. 231-271

166. Wanner B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria // J. Cell. Biochem. 1993. Vol. 51. P. 47-54.

167. Wanner, B. L. 1996. Phosphorus assimilation and control of the phosphate regulon, p. 1357-1381. In F. C. Neidhart, R. Curtis III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

168. Wojciechowski C.L., Cardia J.P., Kantrowitz E.R. Alkaline phosphatase from the hyperthermophilic bacterium T. maritima requires cobalt for activity // Protein Sci. 2002. Vol. 11. P. 903-911.

169. Xiao R., Xie L.-P., Lin J.-Y., Li C.-H., Chenc Q.-X., Zhoua X.-M., Zhang R.-Q. Purification and enzymatic characterization of alkaline phosphatase from Pinctadafucata IIJ .Mol. Cat. B. 2002. Vol. 17. P. 65-74.

170. Yan Sh.L., Liu Y.L., Tian X.J., Zhang Y.X. and Zhou H.M. Effect of Extraneous Zinc on Calf Intestinal Alkaline Phosphatase // J. Prot. Chem. 2003. Vol. 22. P. 371-375.

171. Yang J., Wang L., Zhang H., Qiu L., Wang H., Song L.. C-Type Lectin in Chlamys farreri (CfLec-1) Mediating Immune Recognition and Opsonization // PLoS ONE. 2011. V. 6(2). el7089.

172. Yuan C.C, Wang P.H., Ng H.T., Tsai L.C., Juang C.M., Chiu L.M. Both TPA and SCC-Ag levels are prognostic even in high-risk stage Ib-IIa cervical carcinoma as determined by a stratification analysis // Eur. J. Gynaecol Oncol. 2002. V. 23(1) P. 17-20.

173. Yurchenko V., Budilov A.V., Deyev S.M., Khromov I.S., Sobolev A.Y. Cloning of an alkaline phosphatase gene from the moderately thermophilic bacterium Meiothermus rubber and characterization of the recombinant enzyme // Mol. Gen. Genom. 2003. Vol. 270. P. 87-93.

174. Zalatan J.G., Fenn T.D., Herschlag D. Comparative enzymology in the alkaline phosphatase superfamily to determine the catalytic role of an active-site metal ion //J. Mol. Biol. 2008 V. 384. P. 1174-1189

175. Zappa S., Rolland J.-L., Flament D., Gueguen Y., Boudrant J., Dietrich J. Characterization of a Highly Thermostable Alkaline Phosphatase from the Euryarchaeon Pyrococcus abyssi II Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67. P. 4504-4511.

176. Zhang X., Xie J., Sun Y., Xu H., Du T., Liu Z., Chen J., Zheng Z., Liu K., Zhang J., Kan M., Li X., Xiao Y. High-level expression, purification, and

characterization of bifiinctional ScFv-9R fusion protein // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 98(12) P. 5499-5506 177. Zhang Z.Y. Protein tyrosine phosphatases: structure and function, substrate specificity, and inhibitor development // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. V. 42(1). P.209-34.