Регуляция RAL-зависимых сигнальных путей в канцерогенезе: убиквитинирование RalA и RalB тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Аушев, Василий Николаевич

• Аушев, Василий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аушев, Василий Николаевич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Основные особенности превращения нормальной клетки в опухолевую

2.2. Ras-индуцируемые сигнальные пути.

2.2.1. Суперсемейство и семейство Ras.

2.2.2. Онкобелки H-, N-, K-Ras.

2.2.3. Эффекторы Ras.

2.2.4. Raf и ERK/MAPK каскад.

2.2.5. Р13К-сигналинг.

2.2.6. RalGEF - факторы обмена нуклеотидов Ral.

2.2.7. Прочие эффекторы Ras.

2.2.8. Специфическая роль отдельных эффекторов Ras в онкогенезе человека и грызунов.

2.3. ГТФазы Ral.

2.3.1. Регуляция активности белков Ral.

2.3.2. Участие белков Ral в сортировке везикул.

2.3.3. Базолатеральная доставка мембранных белков в поляризованных клетках.

2.3.4. Ral и эндоцитоз.

2.3.5. Белки Ral и морфология клетки.

2.3.6. Белки Ral и экспрессия генов.

2.3.7. Ral белки, пролиферация клеток и канцерогенез.

2.4. Убиквитинирование как система белковой регуляции.

2.4.1. Убиквитин и модифицирующие ферменты.

2.4.2. Типы убиквитинирования.

2.4.3. Роль убиквитинирования в сигнальных путях и онкогенезе.

3. Материалы и методы.

3.1. Растворы, среды и реагенты.

3.2. Клеточные линии.

3.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.

3.4. Выделение плазмидной ДНК.

3.5. Электрофорез нуклеиновых кислот.

3.6. Белковый электрофорез и вестерн-блотинг.

3.7. Молекулярное клонирование.

3.7.1. Получение компетентных клеток E.coli.

3.7.2. Трансформация E.coli.

3.7.3. Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами.

3.7.4. Реакция лигирования ДНК.

3.7.5. Получение мутантных конструкций.

3.8. Трансфекция плазмидными конструкциями.

3.9. Трансфекция siRNA.

3.10.Определение метастатической активности.'.

3.11. Выделение His-меченых белков.

4. Результаты.

4.1. Модельная система для детекции убиквитинированных ш vivo белков

4.2. Убиквитинирование эндогенного и сверх-экспрессированного RalA.

4.3. Убиквитинирование RalA в различных клеточных линиях.

4.4. Влияние ингибиторов протеасомных и лизосомных протеаз на стабильность и убиквитинирование Ral А.

4.5. Влияние ингибитора протеасомной деградации на экспрессию различных форм RalA и RalB.

4.6. Определение возможного типа полиубиквитинирования RalA.

4.7. Стабильность RalA при подавлении клеточной трансляции.

4.8. Роль деубиквитинирующей протеазы USP25 в убиквитинировании RalA

4.9. НВХ 41,108 - ингибитор деубиквитинирующей протеазы USP7/HAUSP

4.10.HET-SR и HET-SR1 - трансформированные линии с различиями в системе контроля фолдинга и деградации белков.

4.11.Роль сигналов внутриклеточной локализации в убиквитинировании RalA

4.12.Убиквитинирование RalA, мутантного по позициям 134, 143, 191.

4.13.Убиквитинирование химерных белков RalA/RalB.

4.14. Убиквитинирование точечных мутантов RalA с различными заменами лизиновых остатков.

4.15.Убиквитинирование белков Ral с изменённой активностью.

4.16.Убиквитинирование эффекторных мутантов RalA и RalB.

5. Обсуждение результатов.

6. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция RAL-зависимых сигнальных путей в канцерогенезе: убиквитинирование RalA и RalB»

Онкологические заболевания сегодня являются одной из актуальнейших медицинских проблем, а изучение всех аспектов возникновения и развития опухолей имеет большое значение для современной медицинской науки. Процессы канцерогенеза представляют также огромный интерес для молекулярной биологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения в сложных механизмах регуляции клеточной жизнедеятельности, а многие из этих механизмов до сих пор не до конца изучены даже в норме.

В опухолевой прогрессии принимают участие не только широко изучаемые онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста, но и гены-модуляторы. Белковые продукты последних не влияют на злокачественную трансформацию клеток, но способствуют росту и распространению опухоли в организме: участвуют в процессах неоангиогенеза, инвазии и метастазирова-ния. К ним можно отнести ряд цитокинов, хемокинов, ростовые факторы и их рецепторы, некоторые гены иммунного ответа, гены контроля активности протеолитических ферментов, везикулярного транспорта, системы белковой деградации и т.п.

Целью данной работы является выявление деталей регуляции Ral-индуцированных сигнальных путей, и в частности, роль убиквити-нирования в этом процессе.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Определить статус убиквитинирования белков Ral

2. Оценить уровень убиквитинирования Ral в различных линиях трансформированных клеток

3. Найти позиции, по которым происходит убиквитинирование

4. Создать неубиквитинируемые варианты Ral путём точечного мутагенеза найденных позиций

5. Определить свойства полученных мутантов Ral по сравнению с исходными белками

6. Выявить роль ранее обнаруженных партнёров в убиквитинировании Ral.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В данной работе был впервые продемонстрирован факт убиквитинирования белков RalA и RalB; показано, что данная модификация не является сигналом протеасомной деградации. Убиквитинирование RalA найдено во всех исследованных линиях клеток человека и грызунов и является, таким образом, универсальным для различных типов клеток. В ходе работы создано более 60 новых генных конструктов, которые могут быть использованы при изучении свойств белков RalA и RalB. В том числе, получена панель мутантных форм RalA с разной степенью убиквитинирования; определены участки RalA, наиболее важные для убиквитинирования; показано критическое значение локализации RalA для его убиквитинирования. Оптимизирована методика определения убиквитинирования белков in vivo, которая позволяет уменьшить количество требуемого для исследования материала и сократить время исследования.

Работа носит в первую очередь теоретический характер, однако полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении участия белков Ral в процессах опухолевой трансформации и прогрессии, а также разработке противоопухолевых агентов, влияющих на убиквитинирование данных белков.

Апробация работы

- Диссертация апробирована и рекомендована к защите 27 сентября 2007 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина

РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «Journées scientifiques de l'Ecole doctorale de cancérologie» в 2006 и 2007 гг. (Роскофф,

Франция), «Vlème Colloque Petites Protéines G». (Муан-Сарту, Франция).

По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи и 5 тезисов докладов.

2. Обзор литературы

Процессы канцерогенеза носят комплексный характер и затрагивают многие аспекты жизнедеятельности клетки и организма. В основе этого процесса лежит накопление клетками различных генетических изменений, искажающих нормальные пути проведения сигнала и приводящие к неопластической трансформации. Малигнизация клеток происходит в результате накопления в их геноме нарушений, приводящих к неконтролируемой пролиферации клеток, их иммортализации и приобретению способности к инвазии и метастазированию. Несмотря на то, что получено множество данных о молекулярных изменениях, происходящих при трансформации клеток, картина остается неполной и многие аспекты требуют дальнейшего изучения.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Аушев, Василий Николаевич

6. Выводы

1. Впервые показано, что малые ГТФазы RalA и RalB, ключевые участники сигнальных путей, ассоциированных с канцерогенезом, подвергаются убиквитинированию во всех исследованных клеточных линиях и во всех вариантах активности Ral.

2. При анализе возможных сайтов убиквитинирования с помощью направленного мутагенеза обнаружено, что основным сайтом убиквитинирования RalA предположительно является Lysll5. Замены лизинов на аргинин в позициях 27, 179, 159, 166 ведут к значительному усилению убиквитинирования RalA.

3. Использование делеционных мутантов показало, что критическим для убиквитинирования RalA является наличие сигналов внутриклеточной локализации в виде СААХ-мотива и полилизинового тракта, а также функционирование липидных рафтов в клетке.

4. Показано, что убиквитинирование RalA и RalB не ведёт к их протеа-сомной деградации. При этом наиболее вероятным типом убиквитинирования RalA является КбЗ-полиубиквитинирование.

5. Деубиквитинирующий фермент USP25, ранее выявленный как партнёр одного из компонентов Ral-пути, не осуществляет модификацию RalA.

6. Конститутивно активный RalB убиквитинируется значительно слабее чем RalB дикого типа. Активирующая мутация RalB, напротив, снижает уровень его убиквитинирования.

7. Доминантно-негативная мутация RalA G26A усиливает, a S28N -подавляет уровень убиквитинирования RalA.

8. Убиквитинирование активированных форма как RalA, так и RalB зависит от их способности взаимодействовать с эффекторами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Аушев, Василий Николаевич, 2009 год

1. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 100 (2000).

2. Bogenrieder T, Herlyn M. Axis of evil: molecular mechanisms of cancer metastasis. Oncogene 22 (2003).

3. Hahn WC, Weinberg RA. Rules for making human tumor cells. N Engl J Med 347 (2002).

4. Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res 49 (1989).

5. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer 7 (2007).

6. Land H, Parada LF, Weinberg RA. Cellular oncogenes and multistep carcinogenesis. Science 222 (1983).

7. Shih TY, Weeks MO, Young HA, Scholnick EM. Identification of a sarcoma virus-coded phosphoprotein in nonproducer cells transformed by Kirsten or Harvey murine sarcoma virus. Virology 96 (1979).

8. DeFeo D, Gonda MA, Young HA, Chang EH, Lowy DR, Scolnick EM, Ellis RW. Analysis of two divergent rat genomic clones homologous to the transforming gene of Harvey murine sarcoma virus. Proc Natl AcadSciUSA 78(1981).

9. Ellis RW, DeFeo D, Furth ME, Scolnick EM. Mouse cells contain two distinct ras gene mRNA species that can be translated into a p21 one protein. Mol Cell Biol 2 (1982).

10. Chang EH, Gonda MA, Ellis RW, Scolnick EM, Lowy DR. Human genome contains four genes homologous to transforming genes of Harvey and Kirsten murine sarcoma viruses. Proc Natl Acad Sci USA 79 (1982).

11. Wennerberg K, Rossman KL, Der CJ. The Ras superfamily at a glance. J Cell Sci 118 (2005).

12. Colicelli J. Human RAS superfamily proteins and related GTPases. Sci STKE 2004 (2004).

13. Mor A, Philips MR. Compartmentalized Ras/MAPK signaling. Anna Rev Immunol 24 (2006).

14. Karnoub AE, Weinberg RA. Ras oncogenes: split personalities. Nat Rev Mol Cell Biol 9 (2008).

15. Buday L, Downward J. Many faces of Ras activation. Biochim Biophys Acta 1786 (2008).

16. Bos JL. All in the family? New insights and questions regarding interconnectivity of Ras, Rapl and Ral. EMBO J17 (1998).

17. Rodriguez-Viciana P, McCormick F. Characterization of interactions between ras family GTPases and their effectors. Methods Enzymol 407 (2006).

18. Vojtek AB, Hollenberg SM, Cooper JA. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell 74 (1993).

19. Zhang XF, Settleman J, Kyriakis JM, Takeuchi-Suzuki E, Elledge SJ, Marshall MS, Bruder JT, Rapp UR, Avruch J. Normal and oncogenic p21ras proteins bind to the amino-terminal regulatory domain of c-Raf-1. Nature 364 (1993).

20. Leicht DT, Balan V, Kaplun A, Singh-Gupta V, Kaplun L, Dobson M, Tzivion G. Raf kinases: function, regulation and role in human cancer. Biochim Biophys Acta 1773 (2007).

21. Leicht DT, Balan V, Kaplun A, Singh-Gupta V, Kaplun L, Dobson M, Tzivion G. Raf kinases: function, regulation and role in human cancer. Biochim Biophys Acta 1773 (2007).

22. McFarlin DR, Lindstrom MJ, Gould MN. Affinity with Raf is sufficient for Ras to efficiently induce rat mammary carcinomas. Carcinogenesis 24 (2003).

23. Yuan TL, Cantley LC. PI3K pathway alterations in cancer: variations on a theme. Oncogene 27 (2008).

24. Franke TF. PI3K/Akt: getting it right matters. Oncogene 27 (2008).

25. Zhao L, Vogt PK. Class I PI3K in oncogenic cellular transformation. Oncogene 27 (2008).

26. Rodriguez-Viciana P, Warne PH, Dhand R, Vanhaesebroeck B, Gout I, Fry MJ, Waterfleld MD, Downward J. Phosphatidylinositol-3-OH kinase as a direct target of Ras. Nature 370 (1994).

27. Campbell PM, Singh A, Williams FJ, Frantz K, Ulkii AS, Kelley GG, Der CJ. Genetic and pharmacologic dissection of Ras effector utilization in oncogenesis. Methods Enzymol 407 (2006).

28. Albright CF, Giddings BW, Liu J, Vito M, Weinberg RA. Characterization of a guanine nucleotide dissociation stimulator for a ras-related GTPase. EMBO J12 (1993).

29. Hofer F, Fields S, Schneider C, Martin GS. Activated Ras interacts with the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator. Proc Natl Acad Sci U SA91 (1994).

30. Spaargaren M, Bischoff JR. Identification of the guanine nucleotide dissociation stimulator for Ral as a putative effector molecule of R-ras, H-ras, K-ras, and Rap. Proc Natl Acad Sci USA 91 (1994).32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42.43,44,45,46,47.

31. Kikuchi A, Demo SD, Ye ZH, Chen YW, Williams LT. ralGDS family members interact with the effector loop of ras p21. Mol Cell Biol 14 (1994).

32. Ferro E, Magrini D, Guazzi P, Fischer TH, Pistolesi S, Pogni R, White GC, Trabalzini L. G-protein binding features and regulation of the RalGDS family member, RGL2. Biochem J 415 (2008).

33. Xu J, Shi S, Matsumoto N, Nöda M, Kitayama H. Identification of Rgl3 as a potential binding partner for Rap-family small G-proteins and profilin II. Cell Signal 19 (2007).

34. D Adamo DR, Novick S, Kahn JM, Leonardi P, Pellicer A. rsc: a novel oncogene with structural and functional homology with the gene family of exchange factors for Rai. Oncogene 14 (1997).

35. Bunney TD, Katan M. Phospholipase C epsilon: linking second messengers and small GTPases. Trends Cell Biol 16 (2006).

36. Boettner B, Govek EE, Cross J, Van Aelst L. The junctional multidomain protein AF-6 is a binding partner of the RaplA GTPase and associates with the actin cytoskeletal regulator profilin. Proc Natl AcadSciU SA97 (2000).

37. Han L, Colicelli J. A human protein selected for interference with Ras function interacts directly with Ras and competes with Rafl. Mol Cell Biol 15 (1995).

38. Shivakumar L, Minna J, Sakamaki T, Pestell R, White MA. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol Cell Biol 22 (2002).

39. Vavvas D, Li X, Avruch J, Zhang XF. Identification of Norel as a potential Ras effector. J Biol Chem 273 (1998).

40. Ortiz-Vega S, Khokhlatchev A, Nedwidek M, Zhang XF, Dammann R, Pfeifer GP, Avruch J. The putative tumor suppressor RASSF1A homodimerizes and heterodimerizes with the Ras-GTP binding protein Norel. Oncogene 21 (2002).

41. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell 88 (1997).

42. Kendall SD, Adam SJ, Counter CM. Genetically engineered human cancer models utilizing mammalian transgene expression. Cell Cycle 5 (2006).

43. Hamad NM, Elconin JH, Karnoub AE, Bai W, Rich JN, Abraham RT, Der CJ, Counter CM. Distinct requirements for Ras oncogenesis in human versus mouse cells. Genes Dev 16 (2002).

44. Rangarajan A, Hong SJ, Gifford A, Weinberg RA. Species- and cell type-specific requirements for cellular transformation. Cancer Cell 6 (2004).

45. Khokhlatchev A, Rabizadeh S, Xavier R, Nedwidek M, Chen T, Zhang XF, Seed B, Avruch J. Identification of a novel Ras-regulated proapoptotic pathway. CurrBiol 12 (2002).

46. Quilliam LA. Specificity and expression of RalGPS as RalGEFs.

47. Methods Enzymol 407 (2006).

48. Chardin P, Tavitian A. The ral gene: a new ras related gene isolated by the use of a synthetic probe. EMBO J 5 (1986).

49. Nakashima S, Morinaka K, Koyama S, Ikeda M, Kishida M, Okawa K, Iwamatsu A, Kishida S, Kikuchi A. Small G protein Ral and its downstream molecules regulate endocytosis of EGF and insulin receptors. EMBO J18 (1999).

50. Tian X, Rusanescu G, Hou W, Schaffhausen B, Feig LA. PDK1 mediates growth factor-induced RaLGEF activation by a kinase-independent mechanism. EMBO J 21 (2002).

51. Ramocki MB, White MA, Konieczny SF, Taparowsky EJ. A role for RalGDS and a novel Ras effector in the Ras-mediated inhibition of skeletal myogenesis. J Biol Chem 273 (1998).

52. Feig LA, Urano T, Cantor S. Evidence for a Ras/Ral signaling cascade. Trends Biochem Sci 21 (1996).

53. Bhattacharya M, Anborgh PH, Babwah AV, Dale LB, Dobransky T, Benovic JL, Feldman RD, Verdi JM, Rylett RJ, Ferguson SS. Beta-arrestins regulate a RalGDS Ral effector pathway that mediates cytoskeletal reorganization. Nat Cell Biol 4 (2002).

54. Clough RR, Sidhu RS, Bhullar RP. Calmodulin binds RalA and RalB and is required for the tlirombin-induced activation of Ral in human platelets. J Biol Chem 277 (2002).

55. Wang KL, Khan MT, Roufogalis BD. Identification and characterization of a calmodulin-binding domain in Ral-A, a Ras-related GTP-binding protein purified from human erythrocyte membrane. J Biol Chem 272 (1997).

56. Mirey G, Balakireva M, L'Hoste S, Rossé C, Voegeling S, Camonis J. A Ral guanine exchange factor-Ral pathway is conserved in Drosophila melanogaster and sheds new light on the connectivity of the Ral, Ras, and Rap pathways. Mol Cell Biol 23 (2003).

57. Rusanescu G, Gotoh T, Tian X, Feig LA. Regulation of Ras signaling specificity by protein kinase C. Mol Cell Biol 21 (2001).

58. Moskalenko S, Henry DO, Rosse C, Mirey G, Camonis JH, White MA. The exocyst is a Ral effector complex. Nat Cell Biol 4 (2002).

59. Sugihara K, Asano S, Tanaka K, Iwamatsu A, Okawa K, Ohta Y. The exocyst complex binds the small GTPase RalA to mediate filopodia formation. Nat Cell Biol 4 (2002).

60. Lipschutz JH, Mostov KE. Exocytosis: the many masters of the exocyst. CurrBiol 12 (2002).77.