Регуляция активности РНК-полимеразы белками бактерий и бактериофагов в ходе синтеза и расщепления РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Есюнина Дарья Михайловна

• Есюнина Дарья Михайловна
• доктор наук
• 2023

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция активности РНК-полимеразы белками бактерий и бактериофагов в ходе синтеза и расщепления РНК»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и разработанность темы исследования

Транскрипция - ключевая стадия экспрессии генов, отвечающая за то, какая часть генетической информации будет реализована, в какое время и насколько эффективно. У бактерий профиль экспрессии генов сильно изменяется в зависимости от условий и фазы роста бактериальной культуры. Именно поэтому важно не только понимать механизм работы РНК-полимеразы и стадии синтеза РНК, но и то, как эти процессы регулируются. Имея одну универсальную РНК-синтезирующую машину, бактерии изобрели множество способов модуляции ее работы: доступность промоторной ДНК, альтернативные сигма-факторы, регуляторные белки, взаимодействующие с ДНК, РНК и разными частями РНК-полимеразы, малые молекулы, такие как ppGpp . Кроме того, бактериофаги, использующие аппарат транскрипции бактерий в своих целях, также содержат разнообразие белковых факторов, переориентирующих работу хозяйской транскрипционной системы на нужды бактериофага.

Таким образом, исследование механизмов регуляции транскрипции у бактерий очень интересно с фундаментальной точки зрения. Изучая различные модельные бактерии, можно найти как общие схемы и закономерности работы регуляторных систем, так и совершенно уникальные механизмы, характерные для отдельных групп бактерий. Понимание механизмов работы РНК-полимеразы важно для понимания процессов регуляции экспрессии генов и взаимодействий разных молекулярных машин в клетке. Кроме того, значительная часть механизмов транскрипции и ее регуляции схожа у прокариот и эукариот. К таким универсальным механизмам относятся реакции синтеза и расщепления РНК в активном центре РНКП, наличие корректирующей активности у РНК-полимераз и общие принципы регуляции этих процессов. В связи с этим результаты исследований регуляции бактериальной транскрипции могут быть во многом аппроксимированы на соответствующие эукариотические системы. Данная область науки также важна с прикладной точки зрения. Во-первых, некоторые транскрипционные факторы определяют патогенность бактерий и вирулентность штаммов. Во-вторых, бактериальная транскрипция является мишенью для действия некоторых антибиотиков (рифампицин, фидаксомицин, миксопиронин) 8-10. Понимание детальных механизмов работы РНК-полимеразы и регуляции транскрипции позволит найти новые ингибиторы бактериальной РНК-полимеразы, на основе которых могут быть созданы новые антибиотические препараты. Поиск и разработка новых мишеней для создания

антибиотиков имеет чрезвычайно важное значение в современном мире с постоянно растущим количеством патогенных и условно патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью.

Исследования транскрипции начаты в 60-х годах XX века, с развитием методов молекулярной биологии количество публикаций по данной тематике стало экспоненциально увеличиваться. Появление методов анализа транскрипции in vitro позволило воссоздать и исследовать процессы, происходящие в клетке. Рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия позволяют на протяжении последних двух десятилетий определить функциональную связь между структурой и механизмом работы РНК-полимераз и транскрипционных факторов разных организмов. Наличие большого числа уникальных клеточных регуляторов транскрипции и белков бактериофагов, действующих на РНК-полимеразу хозяйской клетки, позволяет находить все новые способы модуляции транскрипции. Активно использующиеся в последнее десятилетие методы высокопроизводительного секвенирования также нашли широкое применение в анализе транскрипции для определения стартовых точек транскрипции, сайтов пауз in vivo, мест посадки транскрипционных факторов в геноме п. Также в последнее время исследуется взаимодействие транскрипции с другими процессами в клетке - репликацией, репарацией, трансляцией 12-15.

Однако, несмотря на большое количество публикаций и лабораторий, специализирующихся на изучении транскрипции, многие детали этого процесса остаются неизвестны. Данная работа посвящена анализу механизма работы и регуляции активности бактериальных РНК-полимераз на стадии элонгации транскрипции. Транскрипция подразделяется на 3 стадии - инициацию (узнавание промотора и начало синтеза РНК), элонгацию (непосредственно транскрипция гена) и терминацию (диссоциацию РНК и РНК-полимеразы от ДНК). Элонгация является самой протяженной из стадий транскрипции, во время которой РНК синтезируется немонотонно за счет наличия сигналов пауз транскрипции, взаимодействия с процессами трансляции и репликации, большого количества регуляторных факторов, а также ограниченной точности синтеза РНК, приводящей к периодическому включению неправильных нуклеотидов и необходимости расщепления РНК в таких комплексах. Важно, что в отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимераза катализирует синтез и расщепление РНК в одном и том же активном центре 16.

Реакция синтеза РНК довольно хорошо изучена - имеется большое количество биохимических и структурных данных, в то же время механизм расщепления РНК

2

оставался неясным помимо того факта, что катализ происходит в том же активном центре, а также стимулируется Gre-факторами 17 В частности, было непонятно, какие районы РНКП принимают участие в данной реакции, а про роль триггерной петли в катализе расщепления РНК данные противоречили друг другу. В связи с этим в представленной работе большое внимание было уделено исследованию реакции расщепления РНК на модели нескольких РНК-полимераз, для которых имелось большое количество данных о механизме синтеза РНК.

Несомненно, понимание особенностей катализа одного из важнейших ферментов клетки важно для науки. Однако в связи с тем, что в клетке транскрипция регулируется большим количеством транскрипционных факторов, в данной работе большое внимание было уделено также исследованию регуляции транскрипции. Существуют клеточные регуляторы транскрипции, причем это могут быть белки, представленные у всех организмов, например Gre-факторы бактерий и гомологичный фактор TFIIS эукариот, а могут быть уникальные факторы, представленные в одном или нескольких филумах, как например Gfh-факторы18. Также очень интересны регуляторы бактериальной транскрипции бактериофагов, так как данные белки полностью переключают активность РНК-полимеразы клетки-хозяина под нужды вируса, и их влияние на транскрипцию зачастую может быть сильнее клеточных регуляторных белков 19. Поэтому в данной работе большое внимание уделено также изучению регуляции транскрипции клеточными белками и белками бактериофагов.

В настоящей работе большее внимание уделено изучению транскрипции in vitro и пониманию механизма функционирования РНК-полимеразы, связи структуры и свойств данного фермента, роли различных элементов в катализе, а также регуляции транскрипции белками бактерий и бактериофагов. Продолжение работы в настоящее время ведется в обоих направлениях - in vitro и in vivo с применением современных методик анализа свойств ферментов и транскрипции на уровне клеток.

Цели и задачи исследования

Цель работы:

Изучить механизмы модуляции активности бактериальной РНК-полимеразы во время синтеза и расщепления РНК и под действием регуляторных белков бактериальной клетки и бактериофагов на стадии элонгации и терминации транскрипции на модельных системах Escherichia coli, экстремофильных бактерий Thermus/Deinococcus и фитопатогена Xanthomonas oryzae.

Задачи:

1. Исследовать механизмы РНК-корректирующей активности РНК-полимераз различных бактерий и выявить функциональные участки РНК-полимеразы, ответственные за расщепление РНК.

2. Изучить особенности регуляции реакции расщепления РНК белками Gre-семейства у E. coli и экстремофильных бактерий Thermus/Deinococcus.

3. Изучить механизмы подавления активности РНК-полимеразы на стадиях элонгации и терминации транскрипции Gre-подобными факторами (Gfh-белки) экстремофилов.

4. Изучить транскрипцию на поврежденных участках ДНК различными РКН-полимеразами и исследовать влияние факторов GreA, DksA и Gfh на прохождение повреждений в ДНК бактериальной РНКП.

5. Исследовать модуляцию транскрипции РНКП T. thermophilus антитерминаторным белком gp39 бактериофага Р23-45.

6. Исследовать модуляцию транскрипции РНКП X. oryzae антитерминаторным белком р7 бактериофага Xp10.

7. Найти районы РНКП, необходимые для связывания клеточных и фаговых регуляторов транскрипции и для опосредованной данными факторами модуляции транскрипции.

Научная новизна

В работе впервые исследованы детальные различия в расщеплении РНК РНК-полимеразами разных бактерий. Получены РНК-полимеразы с точечными аминокислотными заменами, а также делециями в области активного центра и мест связывания регуляторных факторов, обладающие повышенной либо пониженной скоростью расщепления РНК относительно фермента дикого типа. Изучена регуляция расщепления РНК различными транскрипционными факторами. Впервые исследованы термодинамические параметры реакции расщепления РНК у мезофильных и термофильных бактерий в сравнении с такими параметрами для реакции синтеза РНК, а также роль отдельных элементов активного центра РНК-полимеразы в реакции расщепления РНК при разных температурах. Впервые исследованы регуляторные белки Gfh бактерий рода Deinococcus, для которых показано, что они могут модулировать транскрипцию только в присутствие ионов марганца. Изучена транскрипция на ДНК-матрицах с повреждениями мутантными РНКП и в зависимости от наличия

4

транскрипционных факторов. Детально охарактеризован механизм регуляции транскрипции регуляторными белками бактериофагов Хр10 и Р23-45, установлено, с какими районами РНК-полимеразы взаимодействуют данные белки на разных стадиях транскрипции и каков основной механизм антитерминаторного действия данных белков.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования направлены на получение фундаментальных знаний как о самом механизме работы фермента РНК-полимеразы, так и модуляции ее активности в различных условиях регуляторными белками разных классов. Теоретические выводы существенно расширяют знание о реакции расщепления РНК, о работе РНК-полимеразы, о регуляции активности РНК-полимеразы в различных условиях, в том числе во время вирусной инфекции. Полученные знания могут быть использованы для создания систем для поиска и тестирования ингибиторов транскрипции, для создания ингибиторов транскрипции на основе белков-регуляторов и для экстраполяции полученных данных о механизме катализа для эукариотических РНК-полимераз.

Методы диссертационного исследования

Работа с бактериями: поддержание штаммов, подбор условий культивирования, трансформация, конъюгация, геномные манипуляции, изучение влияния мутаций в РНК-полимеразе и транскрипционных факторов in vivo. Молекулярное клонирование: ПЦР-мутагенез, сборка плазмид, в том числе кодирующих РНК-полимеразы различных бактерий и транскрипционные факторы. Экспрессия и выделение белков: подбор условий индукции в гетерологичной системе экспрессии, выделение нативных и рекомбинантных РНК-полимераз, выделение регуляторных факторов. Методы транскрипции in vitro: измерение констант скорости синтеза и расщепления РНК, констант диссоциации, дизайн и сборка искусственных элонгационных комплексов, измерение стабильности промоторных комплексов, абортивного синтеза, эффективности ухода с промотора, скоростей элонгации, времени полужизни пауз, эффективности терминации транскрипции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. РНК-полимеразы различных бактерий используют универсальный механизм расщепления РНК для коррекции ошибок транскрипции, при этом существенно различаются по скорости эндонуклеазного расщепления синтезируемой РНК.

5

Эффективность реакции расщепления РНК зависит от особенностей структуры триггерной петли в активном центре РНК-полимеразы и контактов З'-конца транскрипта с окружающими участками активного центра.

2. Gre-факторы различных бактерий стимулируют реакцию расщепления РНК в активном центре РНК-полимеразы сходным образом, снижая энергетический барьер для данной реакции. Для Gre-зависимого расщепления РНК важна триггерная петля и окружающие участки активного центра РНК-полимеразы.

3. Gfh-белки бактерий Thermus/Deinococcus стимулируют паузы и терминацию транскрипции в кооперации с белком NusA и в присутствии ионов марганца.

4. Замены в активном центре РНК-полимеразы влияют на транскрипцию поврежденных участков ДНК. Транскрипционные факторы GreA, DksA и Gfh модулируют транскрипцию на поврежденной ДНК.

5. Антитерминаторный белок gp39 бактериофага Р23-45 T. thermophilus стимулирует синтез РНК и подавляет фактор-независимую терминацию транскрипции, связываясь с РНК-полимеразой в канале выхода синтезируемой РНК и снижая продолжительность пауз на стадии элонгации транскрипции.

6. Антитерминаторный белок р7 бактериофага Xp10 X. oryzae подавляет паузы транскрипции и фактор-независимую терминацию, препятствуя формированию шпилек в канале выхода синтезируемой РНК в кооперации с белком NusA.

7. Клеточные и фаговые белки способны значительно модулировать каталитические активности РНК-полимеразы - синтез и расщепление РНК, - за счет связывания с несколькими ключевыми участками фермента, включая вторичный канал и канал выхода РНК, и изменения конформации транскрипционного комплекса.

Апробация работы

Основные научные результаты диссертационной работы были представлены автором в виде устных и стендовых докладов на российских и международных конференциях: международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2012, 2013); Международной конференции постгеномных технологий для биомедицины (Новосибирск, 2012); The 73rd Harden Conference Machines on genes II - the central dogma at the interface of biology, chemistry and physic (Oxford, UK, 2012); FASEB conference Mechanism and Regulation of Prokaryotic Transcription (Saxton River, VT, USA, 2013, 2015); FEBS

6

CONGRESS (2013 Санкт-Петербург, 2018 Prague, 2019 Krakow); EMBO/FEBS Advanced Course Host-Microbes Interactions (Spetses, 2013); Molecular Machines: lessons from integrating structure, biophysics and chemistry (Heidelberg, 2014); 76th Harden Conference Total Transcription, (Cambridge, UK, 2014); EMBL Symposium The Non-Coding Genome, (Heidelberg, 2017); SFB960 Conference on The Biology of RNA-Protein Complexes, (Regensburg, Germany, 2017); Regulatory and non-coding RNAs (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2018); VI и VII съезде биохимиков России (Сочи, 2019 и 2022).

Публикации

По теме работы опубликовано 32 статьи в журналах, индексируемых Scopus и Web of Science, входящих в квартили Q1 и Q2 Scimago Journal and Country Rank (SJR), а также 4 статьи в журналах, индексируемых Scopus и Web of Science, входящих в квартили Q3 и Q4 Scimago Journal and Country Rank (SJR).

1. Miropolskaya N, Kozlov M, Petushkov I, Prostova M, Pupov D, Esyunina D, Kochetkov S, Kulbachinskiy A. 2022. Effects of natural polymorphisms in SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase on its activity and sensitivity to inhibitors in vitro. Biochimie. Oct 14:S0300-9084(22)00271-1. doi: 10.1016/j.biochi.2022.10.007.

Импакт-фактор: 4.372, квартиль: Q2.

2. Kropocheva EV, Lisitskaya LA, Agapov AA, Musabirov AA, Kulbachinskiy AV, Esyunina DM. 2022. Prokaryotic Argonaute Proteins as a Tool for Biotechnology. Molecular Biology. 2022 Aug 30:1-20. doi: 10.1134/S0026893322060103.

Импакт-фактор: 1.54, квартиль: Q4.

3. Lisitskaya L, Shin Y, Agapov A, Olina A, Kropocheva E, Ryazansky S, Aravin AA, Esyunina D, Murakami KS, Kulbachinskiy A. 2022. Programmable RNA targeting by bacterial Argonaute nucleases with unconventional guide binding and cleavage specificity. Nature Communications. 2022 Aug 8;13(1):4624. doi: 10.1038/s41467-022-32079-5. Импакт-фактор: 17.694, квартиль: Q1.

4. Petushkov I, Esyunina D, Kulbachinskiy A. 2022. Effects of natural RNA modifications on the activity of SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase. The FEBS Journal. 2022 Aug 2:10.1111/febs.16587. doi: 10.1111/febs.16587.

Импакт-фактор: 5.622, квартиль: Q1.

5. . Miropolskaya N, Petushkov I, Esyunina D, Kulbachinskiy A. 2022. Suppressor mutations in Escherichia coli RNA polymerase alter transcription initiation but do not affect translesion RNA synthesis in vitro. Journal of Biological Chemistry. 2022 Jul; 298(7):102099. doi: 10.1016/j.jbc.2022.102099.

Импакт-фактор: 5.486, квартиль: Q1.

6. Kropocheva E, Kuzmenko A, Aravin AA, Esyunina D, Kulbachinskiy A. 2022. A programmable pAgo nuclease with universal guide and target specificity from the mesophilic

7

bacterium Kurthia massiliensis. Nucleic Acids Research. 2021 Apr 19;49(7):4054-4065. doi:

10.1093/nar/gkab182.

Импакт-фактор: 19.16, квартиль: Q1.

7. Oguienko A., Petushkov I., Pupov D., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2021. Universal functions of the g finger in alternative g factors during transcription initiation by bacterial RNA polymerase. RNA Biology. 2021 Nov;18(11):2028-2037. doi: 10.1080/15476286.2021.1889254.

Импакт-фактор: 4.766, квартиль: Q1.

8. Shin Y., Qayyum M.Z., Pupov D., Esyunina D., Kulbachinskiy A., Murakami K.S. 2021. Structural basis of ribosomal RNA transcription regulation. Nature Communications. 12(1): 528. doi: 10.1038/s41467-020-20776-y.

Импакт-фактор: 17.694, квартиль: Q1.

9. Lisitskaya L., Petushkov I., Esyunina D., Aravin A., Kulbachinskiy A. 2020. Recognition of double-stranded DNA by the Rhodobacter sphaeroides Argonaute protein. Biochemical and Biophysical Research Communications. 533(4):1484-1489. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.10.051 Импакт-фактор: 3.322, квартиль: Q2 (biochemistry) - Q3 (molecular biology).

10. Kuzmenko A, Oguienko A*, Esyunina D*, Yudin D*, Petrova M, Kudinova A, Maslova O, Ninova M, Ryazansky S, Leach D, Aravin AA, Kulbachinskiy A. 2020. DNA targeting and interference by a bacterial Argonaute nuclease. Nature. 587 (7835): 632-637 Jul 30. doi: 10.1038/s41586-020-2605-1. * - equal contribution

Импакт-фактор: 69.504, квартиль: Q1.

11. Pletnev P., Pupov D., Pshanichnaya L., Esyunina D., Petushkov I., Nesterchuk M., Oster-man I., Rubtsova M., Mardanov A., Ravin N., Sergiev P., Kulbachinskiy A., Dontsova O. 2020. Rewiring of growth-dependent transcription regulation by a point mutation in region 1.1 of the housekeeping g factor. Nucleic Acids Research. 48(19): 10802-10819. doi: 10.1093/nar/gkaa798.

Импакт-фактор: 19.16, квартиль: Q1.

12. Agapov A., Ignatov A., Turtola M., Belogurov G., Esyunina D.*, Kulbachinskiy A.* 2020. Role of the trigger loop in translesion RNA synthesis by bacterial RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 295(28), 9583-9595 * - Corresponding authors Импакт-фактор: 5.486, квартиль: Q1.

13. Olina A., Kuzmenko A., Ninova M., Aravin A.A., Kulbachinskiy A., Esyunina D. 2020. Genome-wide DNA sampling by Ago nuclease from the cyanobacterium Synechococcus elongatus. RNA Biology. 17(5): 677-688. doi: 10.1080/15476286.2020.1724716. Импакт-фактор: 4.766, квартиль: Q1.

14. Prostova M., Kulbachinskiy A., Esyunina D. 2020. Antitermination protein P7 of bacteriophage Xp10 distinguishes different types of transcriptional pausing by bacterial RNA polymerase. Biochimie 170:57-64. doi: 10.1016/j.biochi.2019.12.011.

Импакт-фактор: 4.372, квартиль: Q2.

15. Miropolskaya N., Kulbachinskiy A., Esyunina D. 2020. Factor-specific effects of mutations in the active site of RNA polymerase on RNA cleavage. Biochemical and Biophysical Research Communications. 523: 165-170. doi 10.1016/j.bbrc.2019.12.045. Импакт-фактор: 3.322, квартиль: Q2 (biochemistry) - Q3 (molecular biology).

16. Agapov A., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2019. Gre-family factors modulate DNA damage sensing by Deinococcus radiodurans RNA polymerase. RNA Biology. 16(12):1711-1720. doi: 10.1080/15476286.2019.1656027.

Импакт-фактор: 4.766, квартиль: Q1.

17. Шикалов А.Б., Есюнина Д.М., Пупов Д.В., Кульбачинский А.В., Петушков И.В. 2019. о24-субъединица РНК-полимеразы Escherichia coli способна вызывать паузы транскрипции in vitro. Биохимия, 84(4): 571-579. doi: 10.1134/S0006297919040102 \ Импакт-фактор: 2.824, квартиль: Q3.

18. Esyunina D., Pupov D., Kulbachinskiy A. 2019. Interactions in the active site of Deinococ-cus radiodurans RNA polymerase during RNA proofreading. Biochemical and Biophysical Research Communications. 509(1): 161-166. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.12.095. Импакт-фактор: 3.322, квартиль: Q2 (biochemistry) - Q3 (molecular biology).

19. Esyunina D., Pupov D., Kulbachinskiy A. 2019. Dual role of the a factor in primer RNA synthesis by bacterial RNA polymerase. FEBS Letters. 593(3):361-368. doi: 10.1002/18733468.13312

Импакт-фактор: 3.864, квартиль: Q1 (biochemistry) - Q2 (molecular biology).

20. Liu Y*, Esyunina D*, Olovnikov I, Teplova M, Kulbachinskiy A, Aravin AA, Patel DJ. 2018. Accommodation of Helical Imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute Ternary Complexes with Guide RNA and Target DNA. Cell Reports. 24(2): 453-462. * - equal contribution

Импакт-фактор: 9.995, квартиль: Q1.

21. Олина А.В., Кульбачинский А.В., Аравин А.А., Есюнина Д.М. 2018. Белки-аргонавты и механизмы РНК-интерференции у эукариот и прокариот. Биохимия 83: 645-661. Импакт-фактор: 2.824, квартиль: Q3.

22. Pupov D., Petushkov I., Esyunina D., Murakami K.S., Kulbachinskiy A. 2018. Region 3.2 of the g factor controls the stability of rRNA promoter complexes and potentiates their repression by DksA. Nucleic Acids Research. 46(21): 11477-11487. doi: 10.1093/nar/gky919 Импакт-фактор: 19.16, квартиль: Q1.

23. Petushkov I., Esyunina D., Mekler V., Severinov K., Pupov D., Kulbachinskiy A. 2017. Interplay between g region 3.2 and secondary channel factors during promoter escape by bacterial RNA polymerase. Biochemical Journal. 474: 4053-4064. doi: 10.1042/BCJ20170436. Импакт-фактор: 3.766, квартиль: Q1 (biochemistry) - Q2 (molecular biology).

24. Petushkov I., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. Possible roles of G-dependent RNA pol-

ymerase pausing in transcription regulation. RNA Biology. 14(12): 1678-1682. doi:

10.1080/15476286.2017.1356568.

Импакт-фактор: 4.766, квартиль: Q1.

25. Miropolskaya N., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. Conserved functions of the trigger loop and Gre factors in RNA cleavage by bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 292(16):6744-6752. doi: 10.1074/jbc.M116.766592.

Импакт-фактор: 5.486, квартиль: Q1.

26. Agapov A., Olina A., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. Gfh factors and NusA cooperate to stimulate transcriptional pausing and termination. FEBS Letters. 591(6):946-953. doi: 10.1002/1873-3468.12609.

Импакт-фактор: 3.864, квартиль: Q1 (biochemistry) - Q2 (molecular biology).

27. Petushkov I., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. a38-dependent promoter-proximal pausing by bacterial RNA polymerase. Nucleic Acids Research. 45(6):3006-3016. doi: 10.1093/nar/gkw1213

Импакт-фактор: 19.16, квартиль: Q1.

28. Agapov A., Esyunina D., Pupov D., Kulbachinskiy A. 2016. Regulation of transcription initiation by Gfh factors from Deinococcus radiodurans. Biochemical Journal. 473(23):4493-4505. doi: 10.1042/BCJ20160659.

Импакт-фактор: 3.766, квартиль: Q1 (biochemistry) - Q2 (molecular biology).

29. Esyunina D., Agapov A., Kulbachinskiy A. 2016. Regulation of transcriptional pausing through the secondary channel of RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113(31): 8699-8704. doi/10.1073/pnas.1603531113.

Импакт-фактор: 12.779, квартиль: Q1.

30. Esyunina D., Turtola M., Pupov D., Bass I., Klimasauskas S., Belogurov G., Kulbachinskiy A. 2016. Lineage-specific variations in the trigger loop modulate RNA proofreading by bacterial RNA polymerases. Nucleic Acids Research. 44(3):1298-1308. doi: 10.1093/nar/gkv1521.

Импакт-фактор: 19.16, квартиль: Q1.

31. Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В. 2015. Выделение и характеристика рекомбинант-ной РНК-полимеразы Deinococcus radiodurans. Биохимия. 80(10): 1542-1550. doi: 10.1134/S0006297915100077.

Импакт-фактор: 2.824, квартиль: Q3.

32. Esyunina D., Klimuk E., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2015. Distinct pathways of RNA polymerase regulation by a phage-encoded factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. USA. 112(7): 2017-2022. doi: 10.1073/pnas.1416330112.

Импакт-фактор: 12.779, квартиль: Q1.

33. Basu R.S., Warner B.A., Molodtsov V., Pupov D., Esyunina D., Fernández-Tornero C., Kulbachinskiy A., Murakami K.S. 2014. Structural basis of transcription initiation by bacterial RNA polymerase holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 89(35): 24549-24559. doi: 10.1074/jbc.M114.584037.

Импакт-фактор: 5.486, квартиль: Q1.

34. Tagami S., Sekine S., Minakhin L., Esyunina D., Akasaka R., Shirouzu M., Kulbachinskiy

A., Severinov K., Yokoyama S. 2014. Structural basis for promoter specificity switching of

RNA polymerase by a phage factor. Genes and Development. 28: 521-531. doi:

10.1101/gad.233916.113.

Импакт-фактор: 12.89, квартиль: Q1.

35. Miropolskaya N., Esyunina D., Klimasauskas S., Nikiforov V., Artsimovitch I., Kulb-achinskiy A. 2014. Interplay between the trigger loop and the F loop during RNA polymer-ase catalysis. Nucleic Acids Research. 42: 544-552. doi:10.1093/nar/gkt877. Импакт-фактор: 19.16, квартиль: Q1.

36. Pupov D, Esyunina D, Feklistov A, Kulbachinskiy A. 2013. Single-strand promoter traps for bacterial RNA polymerase. Biochemical Journal. 1;452(2):241-8. doi: 10.1042/BJ20130069. Импакт-фактор: 3.766, квартиль: Q1 (biochemistry) - Q2 (molecular biology).

Личный вклад автора

Представленные данные получены большей частью лично автором, либо при непосредственном его участии и руководстве, в том числе в рамках диссертационных и дипломных работ, выполненных под руководством автора. Автору принадлежит ключевая роль в планировании выполненных исследований, обработке данных и их интерпретации. Часть экспериментов проведена совместно с сотрудниками Федерального государственного бюджетного учреждения Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» Миропольской Н.А. (изучение роли триггерной петли и F-петли в реакциях синтеза и расщепления РНК, а также Gre-факторов), Петушковым И.В. (исследование инициации транскрипции в присутствии различных транскрипционных факторов), Лисицкой Л.А. (изучение взаимодействия РНК-полимеразы с белками-Аргонавтами), Кропочевой Е.В. (применение бактериальных Аргонавтов для исследования структуры транскриптов), Агаповым А.А. (исследование Gfh-факторов D. radiodurans и транскрипции на поврежденной ДНК), Простовой М.А. (взаимодействие р7 и NusA на различных типах пауз), Пуповым Д.В. (исследование транскрипции на неканонических матрицах и в присутствии ингибиторов РНК-полимеразы), Олиной А.В. (влияние транскрипции на расщепление ДНК белками-Аргонавтами).

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Есюнина Дарья Михайловна

Выводы

1. РНК-полимеразы различных бактерий используют универсальный механизм расщепления РНК для коррекции ошибок транскрипции, но могут существенно различаться по скорости эндонуклеазного расщепления синтезируемой РНК на стадии элонгации транскрипции. Эффективность реакции расщепления РНК зависит от особенностей структуры триггерной петли в активном центре РНК-полимеразы и контактов З'-конца транскрипта с окружающими участками активного центра.

2. Gre-факторы различных бактерий стимулируют реакцию расщепления РНК в активном центре РНК-полимеразы сходным образом, связываясь во вторичном канале РНК-полимеразы и значительно снижая энергетический барьер для данной реакции. Для Gre-зависимого расщепления РНК важна триггерная петля и окружающие участки активного центра РНК-полимеразы.

3. Gfh-белки бактерий ШвгтшЮвтососсш стимулируют паузы и терминацию транскрипции, стабилизируя неактивную конформацию транскрипционного комплекса. Ингибиторная активность Gfh-факторов стимулируется ионами марганца и белком NusA.

4. Эффективность транскрипции поврежденных участков ДНК зависит от структуры триггерной петли в активном центре РНК-полимеразы. Факторы, связывающиеся во вторичном канале РНК-полимеразы - белки GreA, DksA и Gfh, - способны подавлять транскрипцию поврежденных участков и потенциально могут играть роль в сопряжении транскрипции и репарации, в том числе у экстремофильных бактерий.

5. Антитерминаторный белок gp39 бактериофага Р23-45 Т. ^вгторЫ1т стимулирует синтез РНК и подавляет фактор-независимую терминацию транскрипции, связываясь с РНК-полимеразой в канале выхода синтезируемой РНК и снижая продолжительность пауз на стадии элонгации транскрипции.

6. Антитерминаторный белок р7 бактериофага Хр10 X. о^ав подавляет паузы транскрипции и фактор-независимую терминацию, препятствуя формированию шпилек в канале выхода синтезируемой РНК. Активность белка р7 зависит от ш-субъединицы РНК-полимеразы и стимулируется белком NusA.

7. Клеточные и фаговые белки способны значительно модулировать каталитические активности РНК-полимеразы - синтез и расщепление РНК, - за счет связывания с несколькими ключевыми участками фермента, включая вторичный канал и канал выхода РНК, и изменения конформации транскрипционного комплекса.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Есюнина Дарья Михайловна, 2023 год

Список цитируемой литературы

1. Tagami, S. et al. Structural basis for promoter specificity switching of RNA polymerase by a phage factor. Genes Dev 28, 521-31 (2014).

2. Sekine, S., Murayama, Y., Svetlov, V., Nudler, E. & Yokoyama, S. The ratcheted and ratchetable structural states of RNA polymerase underlie multiple transcriptional functions. Mol Cell 57, 408-21 (2015).

3. Abdelkareem, M. et al. Structural Basis of Transcription: RNA Polymerase Backtracking and Its Reactivation. Mol Cell 75, 298-309 e4 (2019).

4. Liu, B. et al. The sabotage of the bacterial transcription machinery by a small bacteriophage protein. Bacteriophage 4, e28520 (2014).

5. Murakami, K.S. X-ray crystal structure of Escherichia coli RNA polymerase sigma70 holoenzyme. J Biol Chem 288, 9126-34 (2013).

6. Wang, D. et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science 324, 1203-6 (2009).

7. Tagami, S. et al. Crystal structure of bacterial RNA polymerase bound with a transcription inhibitor protein. Nature 468, 978-82 (2010).

8. Boyaci, H. et al. Fidaxomicin jams Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase motions needed for initiation via RbpA contacts. Elife 7(2018).

9. Campbell, E.A. et al. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell 104, 901-12 (2001).

10. Tupin, A., Gualtieri, M., Brodolin, K. & Leonetti, J.P. Myxopyronin: a punch in the jaws of bacterial RNA polymerase. Future Microbiol 4, 145-9 (2009).

11. Vvedenskaya, I.O. et al. Massively Systematic Transcript End Readout, "MASTER": Transcription Start Site Selection, Transcriptional Slippage, and Transcript Yields. Mol Cell 60, 953-65 (2015).

12. Adebali, O., Chiou, Y.Y., Hu, J., Sancar, A. & Selby, C.P. Genome-wide transcription-coupled repair in Escherichia coli is mediated by the Mfd translocase. Proc Natl Acad Sci U S A 114, E2116-E2125 (2017).

13. Bharati, B.K. et al. Crucial role and mechanism of transcription-coupled DNA repair in bacteria. Nature 604, 152-159 (2022).

14. Garcia-Muse, T. & Aguilera, A. Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nat Rev Mol Cell Biol 17, 553-63 (2016).

15. Proshkin, S., Rahmouni, A.R., Mironov, A. & Nudler, E. Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation. Science 328, 504-8 (2010).

16. Sosunov, V. et al. The involvement of the aspartate triad of the active center in all catalytic activities of multisubunit RNA polymerase. Nucleic Acids Res 33, 4202-11 (2005).

17. Borukhov, S., Sagitov, V. & Goldfarb, A. Transcript cleavage factors from E. coli. Cell

72, 459-66 (1993).

18. Laptenko, O. et al. pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation. EMBO J25, 2131-41 (2006).

19. Yang, H. et al. Transcription regulation mechanisms of bacteriophages: recent advances and future prospects. Bioengineered 5, 300-4 (2014).

20. Vassylyev, D.G. et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417, 712-9 (2002).

21. Cramer, P., Bushnell, D.A. & Kornberg, R.D. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science 292, 1863-76 (2001).

22. Zenkin, N., Yuzenkova, Y. & Severinov, K. Transcript-assisted transcriptional proofreading. Science 313, 518-20 (2006).

23. Zhang, G. et al. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell 98, 811-24 (1999).

24. Komissarova, N. & Kashlev, M. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc Natl Acad Sci USA 94, 1755-60 (1997).

25. Nudler, E., Mustaev, A., Lukhtanov, E. & Goldfarb, A. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell 89, 3341 (1997).

26. Chen, J. et al. E. coli TraR allosterically regulates transcription initiation by altering RNA polymerase conformation. Elife 8(2019).

27. Nickels, B.E. & Hochschild, A. Regulation of RNA polymerase through the secondary channel. Cell 118, 281-4 (2004).

28. Prasch, S. et al. RNA-binding specificity of E. coli NusA. Nucleic Acids Res 37, 4736-42 (2009).

29. Pupov, D.V., Barinova, N.A. & Kulbachinskiy, A.V. Analysis of RNA cleavage by RNA polymerases from Escherichia coli and Deinococcus radiodurans. Biochemistry (Mosc)

73, 725-9 (2008).

30. Cheung, A.C. & Cramer, P. Structural basis of RNA polymerase II backtracking, arrest and reactivation. Nature 471, 249-53 (2011).

31. Sosunova, E., Sosunov, V., Epshtein, V., Nikiforov, V. & Mustaev, A. Control of transcriptional fidelity by active center tuning as derived from RNA polymerase endonuclease reaction. J Biol Chem 288, 6688-703 (2013).

32. Fouqueau, T., Zeller, M.E., Cheung, A.C., Cramer, P. & Thomm, M. The RNA polymerase trigger loop functions in all three phases of the transcription cycle. Nucleic Acids Res 41, 7048-59 (2013).

33. Miropolskaya, N., Artsimovitch, I., Klimasauskas, S., Nikiforov, V. & Kulbachinskiy, A. Allosteric control of catalysis by the F loop of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18942-7 (2009).

34. Marr, M.T. & Roberts, J.W. Function of transcription cleavage factors GreA and GreB at a regulatory pause site. Mol Cell 6, 1275-85 (2000).

35. Stepanova, E. et al. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro. J Bacteriol 189, 8772-85 (2007).

36. Nechaev, S., Yuzenkova, Y., Niedziela-Majka, A., Heyduk, T. & Severinov, K. A novel bacteriophage-encoded RNA polymerase binding protein inhibits transcription initiation and abolishes transcription termination by host RNA polymerase. J Mol Biol 320, 11-22 (2002).

37. Berdygulova, Z. et al. Temporal regulation of gene expression of the Thermus thermophilus bacteriophage P23-45. J Mol Biol 405, 125-42 (2011).

38. Didovyk, A., Borek, B., Tsimring, L. & Hasty, J. Transcriptional regulation with CRISPR-Cas9: principles, advances, and applications. Curr Opin Biotechnol 40, 177-184 (2016).