Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Сурова, Наталья Владимировна

• Сурова, Наталья Владимировна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сурова, Наталья Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Роль ионов Са2+ в активности нейронов и синапсов

1.1. Системы поддержания постоянного уровня [Са2+]внутр. в покое

1.2. Способы повышения [Са2 ]вн}тр в нейронах и нервных терминалях

а) Са2+ -каналы наружной мембраны

б) Са2+ -связывающие белки и внутриклеточные мембраны

в) Инверсия Ыа /Са -транспортера

г) Внутриклеточные депо кальция

И. Характеристика внутриклеточных цистерн эндоплазматического

ретикулума (ЭР)

II. 1. Микроструктура и назначение цистерн ЭР в различных типах

клеток

II.2 Функции цистерн ЭР, не связанные с метаболизмом Са

2+

Н.З. Функции цистерн ЭР как депо и источников внутриклеточного Са

а) Са2+-депо в мышечных клетках

б) Са2+-депо в нейронах

А,

в) Са -депо в нервных терминалях синапсов

III. Типы кальциевых депо и внутриклеточных Са2+-каналов

III. 1. Разновидности Са -депо эндоплазматического ретикулума

а) Рианодиновые рецепторы

IV. Характеристика рианодиновых рецепторов (РиР) Са -депо

IV. 1. Молекулярная структура РиР

Р/.2. Взаимодействие РиР с другими белками

IV. 3. Эндогенные регуляторы РиР (стимуляторы и блокаторы)

IV.4. Экзогенные регуляторы РиР (стимуляторы и блокаторы)

а) Характеристика кофеина как стимулятора активности РиР

б) Характеристика рианодина как модулятора активности РиР

V. Роль Са2+

-депо в функционировании нейронов

VI. Роль кальция и кальциевых депо в секреции медиатора

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Объект исследования

II. Методика получения изолированного нервно-мышечного препарата двубрюшной шейной мышцы мыши

III. Электрофизиологические методы

IV. Методы обработки и статистического анализа результатов

V. Используемые в работе вещества

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Действие кофеина и рианодина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов мыши

1.1. Одиночные вызванные потенциалы концевой пластинки на фоне действия кофеина и рианодина

1.2. Изменение рисунка ритмической активности нервно-мышечных синапсов мыши под действием кофеина

II. Увеличение частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши

под действием агентов, высвобождающих Ca2 из кальциевых депо

II. 1. Влияние кофеина на частоту миниатюрных потенциалов концевой

пластинки

II.2. Влияние рианодина на частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки

III. Действие кофеина на амплитудно-временные характеристики спонтанных миниатюрных потенциалов и токов концевой пластинки мыши

III. 1. Дозозависимое воздействие кофеина на амплитуду и временной ход

миниатюрных потенциалов мыши

III.2. Анализ постсинаптических эффектов кофеина на примере холинергических миниатюрных токов концевой пластинки мыши

IV. Изменение распределения амплитуд миниатюрных потенциалов концевой пластинки на фоне действия кофеина

IV. 1. Дозозависимость эффекта кофеина

IV.2. Изменение дисперсии амплитуд миниатюрных потенциалов

концевой пластинки в бескальциевом растворе на фоне кофеина

при разных температурах

IV. 3. Анализ эффектов кофеина на фоне блокады выброса кальция из

кальциевых депо терминали 10 мкМ рианодином

1У.4. Подавление везамиколом прироста дисперсии амплитуд миниатюрных

потенциалов концевой пластинки на фоне кофеина

V. Изменение распределения амплитуд миниатюрных потенциалов концевой

пластинки мыши на фоне действия рианодина

V.!. Дозозависимость эффектов рианодина,

У.2. Зависимость эффектов рианодина от присутствия кальция в наружной

среде

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В современной физиологии расширяются исследования внутриклеточных цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭР), называемых кальциевыми депо, способных не только запасать, но и высвобождать Са2+ в цитоплазму клетки (Berridge, 1993; 1995а,Ь, 1997; Miller, 1991; Kasai et al., 1994; Kasai, 1999). Известна роль таких цистерн ЭР в функционировании мышечных клеток (Melzer et al., 1995), однако их участие в работе нейронов и синаптических терминалей только начинает изучаться (Kuba, 1994; Henzi, MacDermott, 1992; Pozzan et al., 1994; Cohen et al., 1997). У разных типов нейронов и терминален с помощью

Ca -красителей обнаружены Ca -депо, выброс Ca из которых осуществляется по специальным Са2+-активируемым Са2+-каналам, получившим название рианодиновых рецепторов (Coronado et al., 1994; Hernandez-Cruz, 1995). Открывание этих каналов может регулироваться, наряду с Ca 5 двумя растительными алкалоидами - рианодином и кофеином. Использование кофеина и рианодина для мобилизации Са2+ из Са2+-депо позволило обнаружить существенный вклад внутриклеточного депонированного Са2+ в регуляцию возбудимости, ритмической активности и постсинаптической пластичности нейронов (Brorson et al,, 1991; Капо et al., 1995; Simpson et al., 1995; Cohen et al, 1997).

У синапсов процесс вызванной секреции медиатора, как известно, обусловлен повышением уровня ионизированного кальция в аксоплазме за счет его поступления из наружной среды (Katz, Miledi, 1965; 1968). Вместе с тем, в последние годы показана возможность выброса Са2+ из Са2+-депо терминалей у многих центральных и периферических синапсов (Blaustein, 1978a,b; Cunnan, Smith, 1997), однако, роль этой системы в регуляции процессов секреции медиатора остается во многом не ясной. В частности, у нервно-мышечных синапсов скелетных мышц при действии кофеина (Wilson, 1973; Onodera, 1973; Roed, 1982) или рианодина (Nishimura et al., 1990), облегчающих выброс Ca из Са2+-депо нервных терминалей, наблюдается увеличение частоты спонтанной и уровня вызванной секреции квантов медиатора. Систематический анализ этого явления не проводился. В связи с этим, в данной работе предпринято специальное

изучение пресинаптических эффектов кофеина и рианодина, нацеленное на получение новой информации о роли внутриклеточного депонированного Са2+, выбрасываемого из кофеин- и рианодин-чувствительных Са2-депо в регуляции активности нервно-мышечных синапсов мыши.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении роли системы внутриклеточного депонирования и высвобождения ионов Са2+ в регуляции спонтанной и вызванной активности нервно-мышечных синапсов мыши. В связи с поставленной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать характер вызванной активности синапсов на фоне действия двух модуляторов работы Са -депо - кофеина и рианодина, потенциирующих либо тормозащих мобилизацию депонированного Са2+ в терминалях.

2. Сопоставить действие кофеина и рианодина как миметиков выброса Са2+ из Са2+-депо на частоту и характер спонтанной секреции квантов медиатора.

3. Исследовать среднюю величину квантов медиатора и распределение их размеров на фоне действия кофеина и рианодина.

4. Рассмотреть характер секреции «гигантских» квантов медиатора на фоне действия рианодина и кофеина как модуляторов активности Са2 -депо нервных терминалей.

Положения, выносимые на защиту:

1. В нервных терминалях моторных синапсов внутриклеточный депонированный Са2 , мобилизуемый действием кофеина и рианодина, участвует в регуляции разных типов квантовой секреции ацетилхолина: усиливает Са2+-зависимый вызванный выброс медиатора в ответ на нервный импульс, увеличивает частоту спонтанного высвобождения отдельных квантов медиатора.

2. Специфическая роль депонированного Са , мобилизуемого кофеином и рианодином, заключается в усилении спонтанной секреции особого пула крупных по размеру - т.н. «гигантских» - квантов медиатора, способных поддерживать передачу и возбуждение мышечного волокна без участия наружного кальция.

Новизна полученных результатов.

В работе получен ряд новых фактов, касающихся вклада депонированного Са2+ в регуляцию процессов секреции медиатора у синапсов. Впервые установлено, что при действии кофеина и рианодина, имеющих разный механизм и кинетику мобилизации Са2+ из Са2+-депо, наблюдается качественно сходный эффект -

дозозависимое усиление спонтанной и вызванной квантовой секреции медиатора,

2+ 2+

тогда как блок выброса Са из Са -депо (с помощью 10 мкМ рианодина) приводит к значительному снижению уровня вызванной секреции медиатора. Впервые показано, что в условиях ритмической активности синапса усиленная мобилизация внутриклеточного Са кофеином может приводить к ограничению количества медиатора, выбрасываемого на каждый ритмический стимул, на всем протяжении залпа.

Впервые выявлена специфическая роль депонированного

Са2+ в регуляции

определенных режимов спонтанной секреции квантов медиатора. На фоне кофеина или рианодина значительно возрастает особый вид спонтанной секреции в виде так называемых «гигантских» квантов медиатора, в 2-10 раз превышающих размеры стандартного кванта медиатора.

Новыми являются также данные о том, что в бескальциевой среде потенциирующие эффекты кофеина и рианодина на частоту и размеры спонтанно секретируемых квантов медиатора становится более выраженными. Это позволяет думать, что при ограниченном поступлении наружного Са2 в терминаль мобилизация внутриклеточного депонированного Са2+ может играть роль резервного физиологического механизма регуляции секреции квантов и поддержания синаптической активности.

Научно-практическая ценность. Полученные в работе данные расширяют современные представления о роли кофеин- и рианодин-чувствительных Са2 -депо в активности нервных терминалей на примере периферических синапсов млекопитающих. В работе получены новые важные доказательства способности таких Са2+-депо и мобилизуемого из них

Са2+

участвовать в регулировании всех режимов секреции медиатора: спонтанного, вызванного и ритмического. Это позволяет взглянуть на внутриклеточные Са -

депо и депонированный Са2+ как на новый механизм и точку приложения медикаментозных средств, направленных на лечение нарушений синаптической передачи. Проведенное в работе сопоставление эффектов кофеина и рианодина как двух разных по механизмам действия модуляторов мобилизации депонированного могут оказаться полезными при разработке фармакологических аналогов этих препаратов, способных, избирательно воздействуя на рианодиновые рецепторы нервных терминалей, усиливать или модулировать синаптическую передачу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Роль ионов Ca в активности нейронов и синапсов.

Нормальное функционирование клетки во многом определяется ионным составом ее внутренней и наружной среды (Berne, Levy, 1990; Албертс и др., 1994). Среди ионов, регулирующих жизнедеятельность клеток, кальцию принадлежит

л,

особое место. Ca является самьм представительным из всех катионов у позвоночных (20-30 г/кг веса тела). Большая часть кальция в организме запасена в костной ткани, но практически все остальные клетки организма также запасают кальций в достаточно высоких количествах (в общей сумме - 2-10 мМ на клетку); при этом клеточный кальций находится на 90-95% в связанном или депонированном состоянии (Berne, Levy, 1990).

Впервые внимание нейрофизиологов к ионам кальция было привлечено в связи с открытием в 70-ые годы "кальциевых" потенциалов действия (ПД) у нейронов, сердечных и других возбудимых клеток. Стало очевидным, что, наряду с ионами Na , ионы

Са2+, входя в клетку при возбуждении по специальным кальциевым каналам, могут играть ведущую роль в деполяризации мембраны и генерации ПД в соме нейронов (Kostyuk et al., 1974; Костюк, Крышталь, 1981), в их коротких отростках - дендритах (Pockberger, 1991; Konnerth et al,, 1992; Schiller et al., 1997), a также в нервных терминалях аксонов (Katz, Miledi, 1965; 1968). Однако уже в конце 70-х - начале 80-х годов стало очевидным, что роль ионов Ca2 как катионов, деполяризующих мембрану при генерации ПД, не является единственной и, по-видимому, главной ролью этих катионов у возбудимых клеток.

В последние 10 лет в практику физиологических экспериментов широко вошли новые методы флуоресцентного мшфоскопического отслеживания так называемого кальциевого сигнала - то есть колебаний уровня внутриклеточного кальция. Благодаря компьютерному мониторингу кальциевого сигнала, удалось воссоздать картину пространственно-временных колебаний уровня кальция в цитоплазме клетки (Tsien, 1980; 1981; Neher, Zucker, 1993). Изучение широкого круга эукариотических клеток (ооциты лягушки, железистые и секреторные клетки млекопитающих, мышечные клетки, центральные и периферические нейроны и их

отростки) показало, что ионы Са2+ играют роль универсальных внутриклеточных посредников как у невозбудимых клеток (Berridge, 1993; 1995; 1997), так и у электровозбудимых клеток (Kuba, 1994; Brorson et at, 1991), В частности, у нейронов такие процессы, как дифференцировка и экспрессия генов, программируемая клеточная смерть нейронов, прорастание и спрутинг аксонов, синаптическая пластичность, нейрональная память, секреция медиатора и многие другие прямо зависят от регионального или генерализованого повышения уровня Са2+ внутри нервной клетки (Албертс и др., 1994; Brorson et.ai., 1991; Berridge, 1993; 1995; 1997; Simpson et al., 1995; Mironov, Hermann, 1996). Очевидно, что кальций как универсальный внутриклеточный посредник должен иметь возможность строго дифференцированно менять свою концентрацию и во времени, и в пространстве клетки. Для решения этой непростой задачи в клетке существует многоуровневая система депонирования и регионального высвобождения Ca2 в цитоплазму.

1.1. Системы поддержания постоянного уровня fCa^L»^ в покое.

У нейронов и других клеток уровень свободного ионизированого Са2+ в цитоплазме очень низок и составляет порядка 1СГ8-1(Г7 М (Kuba, Nishi, 1976; Ashley, 1989; Костюк, 1986). Основная часть внутриклеточного кальция находится в связанном или депонированном виде (Шеперд, 1987; Албертс и др., 1994).

В нейронах существует четыре основных системы, поддерживающих постоянно низкий уровень ионизированного Ca2 в цитоплазме: а) Са2 -АТФ-азы, встроенные в мембраны цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭР), а также в наружную мембрану, выкачивающие Са2+ из цитоплазмы либо в наружную среду, либо - в полость цистерн ЭР (Deamer, Baskin, 1969; Herbette et al, 1985; Stewart, Maclennan, 1974; Litton et al., 1992; Pozzan et al., 1994); б) выведение Ca2+ за счет системы сопряженного Na /Са -транспорта (Allen, Baker, 1985; DiPolo, Beauge, 1986; 1987; 1990; Furman, Raiiamimoff, 1990; Taglialatela et al., 1990; Wier, 1990); в) связывание

Ca2+ Ca2+ -связывающими белками цитоплазмы (Means et al., 1982; Seto-Oshima et al., 1984; Heizmann, Hunziker, 1990; Persechini et al., 1989); г) аккумуляция Ca митохондриями (Авдонин, Ткачук, 1994; Pozzan et al., 1994).

Существование всех вышеназванных четырех систем забуферивания Ca в цитоплазме детально описано не только у нейронов, но и у нервных окончаний нейросекреторных клеток гипофиза, а также у нервных терминалей многих центральных и периферических нейронов (Brorson et al., 1991; Horrigan, Bookman, 1994; Stuenkel, 1994). Относительный вклад каждой из систем в поддержании кальциевого гомеостаза может существенно различаться в разных типах нейронов и нервных терминалей. По данным ряда авторов, у моторных нервных терминалей нервно-мышечных синапсов главную роль в поддержании постоянно низкого уровня Са2+ в состоянии покоя играют Са2 -АТФ-азы наружной мембраны (Inesi, Sagara, 1994; Brorson et al., 1991; Henzi, MacDermott, 1992; Pozzan et al., 1994). При работе в режиме ритмических серий, а также в постактивационный период весьма важную роль в регуляции уровня Ca2 и восстановлении его гомеостаза играют и митохондрии (Fisher et al., 1997; Tang, Zucker, 1997).

Таким образом, нервная клетка в состоянии покоя располагает запасами Ca2 и системами поддержания постоянства его низкой концентрации в цитоплазме.

Наряду с многообразными системами забуферивания свободного Ca2 , существует множество способов регионального или генерализованного повышения уровня Са2+ в клетке.

1.2. Способы повышения [Са2+]науш в нейронах и нервных термина лях. а) Ca2!

-каналы наружной мембраны. В настоящее время известно целое семейство потенциал-активируемых Са2+-каналов (L-, T-, Р-, N-типа) и хемоактивируемых

Са2+ -каналов, открывание которых во время возбуждения нейрона приводит к кратковременному повышению концентрации свободного Ca в клетке в 20-100 раз (Миронов и др., 1988).

В нервных терминалях синапсов описано семейство Са2 -каналов, отличное по своей потенциалозависимости и фармакологическим свойствам от Ca -каналов (L-, Т- и Р-типа), присутствующих в соме различных нейронов. Это так

4-

называемые N- и P/Q-типы Ca -каналов, которые являются разновидностями потенциал-активируемых

Са2+

-каналов: N-тип избирательно блокируется одним из ядов скорпиона - ожонотоксином, а у P\Q типа Ca -каналов выявлена большая чувствительность к другому яду - ю-агатоксину (Dunlap et al., 1995; Tareilus, Breer,

41995; Fisher, Bourque, 1996). Хорошо известно, что в нервных терминалах эти Ca -

каналы концентрируются в непосредственной близости от мест секреции

медиатора. Именно открывание этих быстрых потенциал-зависимых Са2-каналов

обусловливает вход Ca в нервную терминаль (при распространении нервного

импульса к синапсу) и локальное повышение концентрации Са2+ на 2-3 порядка (до

КГМСГ4 М) в области активных зон нервной терминали (Van der Kloot, Molgo,

1994; Stanley, 1997; Smith, Cunnan, 1996).

б) Ca2-связывающие белки и внутриклеточные мембраны. Хорошо известно, что уменьшение pH клетки приводит к увеличению уровня [Ca ]шгутр.. Одной из главных причин является замещение ионами Н ионов Ca2 в их связи с Са2+-связывающими белками. Аналогичный механизм имеется и в составе нервных терминалей: экспериментально вызываемое закисление их цитоплазмы, а также закисление вследствие гипоксии сопровождается ростом [Ca ЗВНуц>. и учащением спонтанной секреции медиатора (Nishimura, 1986; Van der Kloot, Molgo, 1994).

в) Инверсия Na /Ca -транспортера. В литературе имеются свидетельства того, что увеличение внутриклеточной концентрации натрия может приводить к обращению направления работы Na /Са -транспортера, то есть к закачиванию кальция в клетку (Brorson et al., 1991). Это один из возможных путей повышения кальция в цитоплазме, который имеет место при изменении потенциала на мембране (деполяризации) или уменьшении трасмембранного натриевого градиента (при длительном возбуждении). В частности, в нервных терминалях периферических синапсов в процессе их интенсивной ритмической активности может происходить накопление Na внутри терминали, что сопровождается торможением работы Ыа /Са2 -обменника и, как следствие, приростом [Са2+]внутт?. (Fisher et al, 1997; Tang, Zucker, 1997).

г) Внутриклеточные депо кальция. В 80-ые годы, благодаря внутриклеточным Са2 -красителям (ФУРА 2, квин-2) и компьютерному мониторингу Са2+-сигнала, появилась возможность не только качественно, но и количественно оценить уровень и характер высвобождения Са2+ из разных внутриклеточных компартментов (Tsien, 1980; 1981; Brorson et al., 1991),

Оказалось, что практически все внутриклеточные мембраны, органеллы и компартменты связывают кальций (Litton, Nigam, 1992; Pozzan et at., 1994;

Оегазтепко е! а1., 1996). Тем не менее, в настоящее время хорошо установлено, что среди многочисленных Са2+-запасающих внутриклеточных компартментов наиболее динамичным - как с точки зрения сродства к ионам Са2\ так и с точки зрения скорости двустороннего обмена с цитоплазмой ионами Са2+ - являются цистерны ЭР (Роггап et а1., 1994; 8Щко, Акеу, 1996).

II. Характеристика внутриклеточных цистерн >нд онлаз м а ги чес кого ретикулума (ЭР).

11.1. Микроструктура и назначение цистерн ЭР в различных типах клеток.

Эндоплазматический ретикулум (ЭР) - это система замкнутых в единую сеть анастомизирующих полых трубочек и пузырьков, берущих начало от ядра, и пронизывающая весь объем клетки (Албертс и др., 1994). Полость ЭР занимает от 2% до 10-12% от общего объема клетки. За счет мембран ЭР площадь поверхности внутриклеточных мембран в 12-25 раз больше площади поверхности наружной плазматической мембраны клетки.

112. Функции цистерн ЭР. не связанные с метаболизмом Са2.

Различают шероховатый ЭР, который прилежит к ядру и покрыт рибосомами, и гладкий ЭР (ГЭР), являющийся продолжением шероховатого и называющийся гладким из-за отсутствия там рибосом. Известно, что на мембранах ГЭР происходит синтез липидов, а также окисление ксенобиотиков. Наряду с невозбудимыми клетками, в конце 70-х годов были описаны и электровозбудимые клетки, где объем ГЭР очень велик. Это скелетные мышечные волокона: здесь объем саркоплазматического ретикулума (СР) достигает 12% от общего объема волокна (Альберте и др., 1994). Однако в них СР предназначен для выполнения другой специфической функции - регуляции Са2+-гомеостаза.

Н.З. Функции цистерн ЭР как депо и источников внутриклеточного Са .

а) Са -депо в мышечных клетках. Уникальная функция цистерн ЭР - не только закачивать кальций в свою полость с помощью Са -АТФ-азы, но и

высвобождать его - была впервые описана у скелетных мышечных волокон, а затем и у кардиомицитов, и у гладкомьппечных клеток (Костюк, 1986). Было показано, что выброс Са2+ из цистерн CP происходит при действии ионов Са2+ на специальные Са2 -активируемые Са2 -каналы, находящиеся в составе мембран CP и получившие название рианодиновых рецепторов (Martonosi, 1984; Ashley et al., 1991).

б) Са2+-депо в нейронах. У нервных клеток цистерны ЭР не столь развиты, как в скелетных мышечных волокнах или кардиомиоцитах. Тем не менее уже в 80-ые годы делались попытки микроскопического и биохимического анализа нервной ткани, подтвердившие существование в нейронах микросомальных фракций (ЭР), способных поглощать ионы

Са АТФ -зависимым образом (Henkart et al., 1978; McGraw et al,, 1980). Далее было показано, что нагружение нервных препаратов кальцием приводит к появлению его как в полости митохондрий, так и в полости пузырьков и цистерн, относящихся к системе ЭР клетки. Причем наполненные кальцием органеллы выявлялись в различных частях нейрона - и в его соме, и в нервных терминалях (Fujimoto et al., 1980; Hwang et al., 1990; Andrews et al., 1987; Parducz et al., 1987) и в дендритах (Andrews et al., 1988; Parducz et al,, 1987), и в аксонах (Henkart, 1980). Нагруженные кальцием внутриклеточные органеллы часто выглядели как стопки цистерн и трубочек и, похоже, являлись продолжением сети ЭР нейронов. Причем в некоторых исследованиях такие стопки трубочек и цистерн описывались поблизости от наружной мембраны, в других они были диффузно распределены вблизи ядра. Более того, в некоторых работах подчеркивалось, что аккумулирующие Са2 цистерны и трубочки ЭР располагаются в очень тесной связи или близости с митохондриями нервных клеток. Были сделаны предположения, что столь тесный контакт отражает кооперативную работу и тесное взаимодействие этих органелл в обеспечении эффективного контроля за Са

-гомеостазом в нейроне (Brorson et al., 1991).

В нейронах и нервных терминалях - в отличие от мышечных клеток - полная реконструкция геометрии цистерн ЭР пока еще не сделана (Litton, Nigam, 1992; Pozzan et al., 1994). Трудности такой реконструкции понятны в связи с малым объемом и цистерн ЭР, и самих объектов (нейронов, терминалей). Тем не менее, в ряде работ с помощью микроскопического анализа идентифицированы места

локализации цистерн ЭР в нейронах и их отростках, а также подтверждена их способность аккумулировать Са2+, то есть играть роль Са2+-буферов или Са2+-депо и в нейронах, и в нервных терминалах (Brorson et al., 1991).

В конце 80-х годов началось использование эффективных витальных Са -красителей - арсеназо III, ФУРА 2, которые легко проникают в клетку и, связываясь с Са2+, меняют характер своей флуоресценции (Tsien, 1980; Tsien, 1981; Smith et al., 1983). Такая Са2+-зависимая флуоресценция получила название Са2 -сигнала. Регистрация Са2+-сигнала наряду с использованием фармакологических агентов, избирательно стимулирующих или блокирующих выброс Са из Са -депо (например, кофеина, рианодина, 1Рз и других) позволили обнаружить и описать особенности освобождения Са2+ из цистерн ЭР у разных типов нервных клеток (Tayer et al., 1988).

Подавляющее большинство обследованных нейронов демонстрируют присутствие в их цитоплазме, как минимум, двух типов Са2-депо, способных высвобождать Са2+ в цитоплазму под действием либо Са2\ либо инозитолтрифосфата (IP3) (Berridge, Irvine, 1984; Tsien, Tsien, 1990). Первый тип Са -депо - это Са -чувствительные депо, выброс Са из которых стимулируется самим кальцием (см. обзор Kuba, 1994). Этот тип депо часто называют кофеин- или рианодин-чувствительным, так как, помимо самого кальция и кофеина (в миллимолярных концентрациях), рианоднн (в нано-микромолярных концентрациях) также способен, действуя на Са -каналы этих Са -депо, вызывать выброс Са2+ в цитоплазму (Brorson et al, 1991; Henzi, MacDeraiott, 1992).

Анализ связывания радиоактивно меченного рианодина и 1Р3 микросомальными фракциями разных отделов мозга показал, что разные типы Са2+-депо по-разному представлены в разных отделах мозга. В частности, гиппокампальные нейроны области СА1 богаты 1Р3-рецепторами (хотя их плотность там на порядок ниже, чем в клетках Пуркинье мозжечка), тогда как в клетках САЗ зоны гиппокампа, а также у нейронов зубчатой извилины коры преобладают рианодин-чувствительные Са2+-депо (Sharp et al., 1993).

Высокоразрешающий иммуноцитохимический анализ локализации мест связывания антител к рианодиновым рецепторам показал в соме клеток Пуркинье мозжечка самую высокую в нейронах плотность рианодиновых рецепторов - до

500/j.i2, причем места распределения 1Р3-рецепторов и рианодиновых рецепторов перекрьгоаются в пространстве клетки (Pozzan et al., 1994). Выявлено присутствие рианодиновых рецепторов и в дендритах клеток Пуркинье мозжечка (Капо et al., 1995).

уу,

в) Са -депо в нервных терминалях синапсов. В нервных терминалях синапсов присутствие Са2 -депо, способных высвобождать Са2+ под действием Са2+ или экзогенных агентов - кофеина и рианодина - изучено слабее. Тем не менее, с помощью иммуноцитохимических методов маркирования 1Рз-рецепторов они сейчас обнаружены в пресинаптических нервных терминалях фоторецепторных и биполярных клеток сетчатки, а также в синаптических бутонах нейронов таламических ядер (Llinas et al., 1992; Sharp et al., 1993; Peng et al., 1991). Кроме того, исследования А.Мартинес-Серрано и Й.Сатрустеги на фракции синаптосом мозга крыс показали, что при действии кофеина в синаптосомах растет уровень цитозольного Са2 , причем сопоставимо с приростом Са2" при действии 10-15 мМ КС1 (Martinez-Serrano, Satrastegui, 1989).

Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что и в составе сомы, и дендритов (в том числе шипиков) и нервных терминалей аксонов имеются специальные цистерны ЭР, способные - в зависимости от условий - играть двоякую роль, выступая то как запасник, то как источник ионизированного Са2+ внутри клетки (Brorson et al., 1991; Henzi, MacDermott, 1992; Pozzan et al., 1994). Активность таких депо в клетке во многом определяется спецификой работы Са -каналов, встроенных в их мембрану. В последнее десятилетие достигнут большой прогресс в понимании особенностей нейрональных Са2-депо и встроенных в их мембрану внутриклеточных Са2+-каналов.

III. Типы кальциевых депо и внутриклеточных Са -каналов.

III. 1. Разновидности Са2-депо эндоплазматического ретикулума,

Са2+-депо классифицируют по их чувствительности к специфическим агентам, способным избирательно стимулировать выброс из них ионов

Са2+. В

настоящее

время хорошо известны два типа Са2+-депо: так называемые кофеин-

чувствительные Са2+-активируемые депо и 1Р3- чувствительные Са2+-депо. Разная химическая реактивность этих депо связана с присутствием на их мембране разных типов внутриклеточных хемоактивируемых Са2-каналов, которые получили название рианодиновых рецепторов (РиР) и 1Р3-рецепторов.

В настоящее время окончательно не решен вопрос о том, являются ли Са2+-депо, содержащие 1Р3-рецепторы, пространственно разъединенными от цистерн, содержащих рианодиновые рецепторы. В последнее время большинство исследователей склоняются к мнению, что у возбудимых клеток (в том числе у нейронов) в нормальных условиях существует тесное взаимодеиствие и пространственная взаимосвязь между работой этих двух типов Са2+-депо и Са2 -каналов в одной клетке, тогда как у невозбудимых клеток эти депо пространственно разъединены (Mironov, Usachev, 1991; Walton et al., 1991; Mironov, 1994).

а) Рианодиновые рецепторы. В настоящее время молекулы рианодиновых рецепторов (РиР) выделены из разных типов мышечной и нервной ткани: РиР1 - из скелетной мускулатуры, РиР2- из сердечной ткани, РиРЗ- из нервной ткани. Однако в составе нервных клеток представлен не только РиРЗ, но и РиР2, и РиР (Pozzan et al., 1994). В настоящее время идентифицированы три разных гена, кодирующих каждый из трех подтипов рианодиновых рецепторов (Zorzato et al., 1990). Тем не менее, все три типа РиР сходны по первичной структуре. Наибольшая степень гомологии (до 66%) существует между РиР1 и РиР2, Что касается РиРЗ, то его молекулярная масса меньше, чем у РиР1 и РиР2, и этот тип (РиРЗ) не чувствителен к кофеину и рианодину.

IV. Характеристика рианодиновых рецепторов (РиР) Са2 -дено.

В настоящее время имеется обширная литература, касающаяся рианодинового рецептора (Coronado et al., 1994; Melzer et al., 1995; Sutko, Airey, 1996; Рубцов, Батрукова, 1997).

IV. 1. Молекулярная структура РиР.

В настоящее время хорошо установлено, что РиР - это тетрамер, состоящий из четырех идентичных субъединиц или мономеров. Мономер РиР представляет собой полипептид с молекулярной массой 400-500 кДа. Это трансмембранный белок; небольшая его часть встроена в мембрану саркоплазматического ретикулума (СР), а значительно большая часть выдается в цитоплазму (на 12 нм), причем имеет латерально изогнутую форму и напоминает цветочный лепесток. Внутримембранный фрагмент РиР представляет собой а-спирализованную аминокислотную цепь, многократно пересекающую мембрану (от четырех до десяти раз, по данным разных авторов). При определенных условиях внутримембранный фрагмент способен образовывать Са2~канал, по которому Са2+ поступает из полости ретикулума в цитоплазму. Цитоплазматический фрагмент молекулы РиР также является важной частью канальной структуры и ориентирует направление выхода кальция. Предполагают, что именно внутримембранный фрагмент молекулы РиР имеет активные центры связывания ионов Са , что и приводит к открыванию самого кальциевого канала. Са2+

-канал РиР представляет собой высокопроводящий (порядка 100 пСм), но низкоселективный кальциевый канал, через который происходит выброс Са2+ из цистерн ЭР в цитоплазму клетки (Рубцов, Батрукова, 1997),

В составе молекулы РиР есть два типа независимых активных центров, ответственных за открывание Са2+-канала. Это место связывания ионов Са2 и место связывания АТФ (а точнее - Mg2+-ATФ). Каждый из активаторов - и Са2" (в микромолярных концентрациях), и М§ -АТФ (1-5 мМ) - способны при связывании с РиР приводить к открыванию Са2+-канала. При этом между этими двумя центрами РиР существует положительное аллостерическое взаимодействие.

В отсутствии других регуляторных лигандов (то есть М§2+ и АТФ), кривая

4-

зависимости активности Са -каналов РиР от концентрации кальция имеет колоколообразную зависимость с максимумом в области микромолярных

■у л

концентраций Са (Рубцов, Батрукова, 1997). Это означает, что незначительное повышение уровня кальция в цитоплазме поблизости от РиР будет активировать Са -канал РиР, а повышение уровня [Са ]внухр. выше 10 мкМ будет приводить к инактивации Са2+-канала РиР и прекращению выброса Са2+ из ЭР.

IV. 2. Взаимодействие РиР с другими белками.

Установлено, что ш vivo Са2+-каналы РиР взаимодействуют с большим числом других белков, находящихся или в полости ретикулума (типа кальсеквестрина), или в составе мембраны ЭР, или в цитоплазме (типа кальмодулина). Эти взаимодействия во многом определяют функциональное состояние Са -каналов РиР. Взаимодействие РиР с кальмодулином играет особенно важную роль в его функционировании. Установлено, что тетрамер РиР в состоянии покоя и при концентрации Са2 <0.1 мкМ в цитоплазме находятся в связи с 16 молекулами кальмодулина (СаМ). Пока концентрация Са в цитоплазме остается на низком уровне (порядка 0.1-0.2 мкМ) СаМ поддерживает Са2+-каналы РиР в частично активированном состоянии, а при повышении Са вблизи РиР СаМ, связывая Са , способен переводить РиР в закрытое состояние.

IV. 3. Эндогенные регуляторы РиР (стимуляторы и блокаторы).

В настоящее время известен длинный список метаболитов, способных опосредованно через РиР активировать, облегчать или тормозить выброс Са из Са -депо. Помимо кальция и АТФ, к числу эндогенных метаболитов, способных вызвать открывание Са -канала РиР, относятся нуклеотиды (АМФ, АДФ, ц-АМФ, а также аденозин), метаболит NAD+, циклическая АДФ-рибоза, кальмодулин, дипептиды ансерин и карнозин, жирные кислоты и их метаболиты (например, гликолипид сфингозин и пальмитилкарнитин). Инактивируются РиР высоким содержанием Са в среде (выше 5-10 мкМ), а также ионами Mg .

На выброс Са из депо влияют ионная сила, анионный состав среды и рН: скорость выхода Са значительно уменьшается при снижении рН с 7.5 до 6.0 (Sumbilla, Inesi, 1987).

IVA Экзогенные регуляторы РиР (стимуляторы и блокаторы).

К числу экзогенных фармакологических агентов, эффективно регулирующих активность Са2 -канала РиР, прежде всего следует отнести рианодин (в нано-микромолярных концентрациях) и кофеин (в миллимолярных концентрациях). В

качестве экзогенных блокаторов РнР в эксперименте широко применяются рианодин (10 мкМ), прокаин, дантролен натрия и рутений красный,

а) Характеристика кофеина как стимулятора активности РиР. Кофеин - 1,3,5-метилксантин - алкалоид растительного происхождения, получаемый экстракцией из листьев чая и кофейных зерен. В организме животных и человека кофеин как таковой не присутствует, однако имеет структурное сходство с целым рядом биологически активных соединений: ксантинами, производными пуринов, аденозином, мочевой кислотой. Кофеин - известный пищевой продукт, психостимулятор и фармакологический препарат с широким спектром действия.

Первой была открыта способность кофеина выступать в качестве блокатора фосфодиэстеразы (ФДЭ) циклических нуклеотидов клеток и приводить к повышению уровня цАМФ в клетках. Именно этот эффект кофеина долго считался главным в реализации его психостимулирующего действия (Харкевич, 1986; Машковский, 1977). Однако в последние 10 лет детальный анализ эффектов кофеина in vivo и in vitro в опытах на нервной, сердечной и других тканях убеждает, что дозы кофеина, требуемые для эффективной блокады ФДЭ (0.5-1.0 мМ), находятся в диапазоне, не достигаемом при приеме кофеина ни в качестве пищевого продукта (после приема нескольких чашек кофе - порядка 0.01-0.02 мМ кофеина в крови), ни в качестве фармакологического средства, где верхним допустимым пределом считается 0.05 мМ кофена в крови (Fredholm, 1995),

В последние годы все более популярным становится представление, согласно которому основные физиологические эффекты кофеина in vivo обусловлены его структурным сходством с аденозином и способностью кофеина выступать в качестве блокатора аденозиновых рецепторов возбудимых клеток организма (Fredholm, 1980; 1982; 1995; Holtzman et al., 1991).

Кофеин как модулятор РиР. Уже более 20 лет в физиологических экспериментах in vitro широко используется еще одно важное свойство кофеина -его способность (в миллимолярных концентрациях) связываться с внутриклеточными рианодиновыми рецепторами и способствовать выбросу кальция из цистерн ЭР. Первоначально эта способность кофеина была обнаружена на цистернах CP скелетных мышечных волокон. Впоследствии оказалось, что кофеин обладает аналогичным действием и на другие возбудимые и невозбудимые

клетки, в том числе и на нейроны. Использование высокочувствительных витальных кальциевых индикаторов типа ФУРА 2 показало, что под действием миллимолярных концентраций кофеина in vitro очень быстро, в течение десятков секунд, наблюдается повышение [Са 38Hyip. в 5-10 раз за счет активации РиР и высвобождения Са из цистерн СР. Кофеин способен связываться с РиР 1-го и 2-го типа, но не активирует РиРЗ.

При взаимодействии с молекулой РиР кофеин способен оказывать два типа эффектов. Во-первых, он выступает в роли сенсибилизатора молекулы РиР к ионам кальция: на фоне кофеина увеличивается сродство и связывание РиР с Са даже при его низких концентрациях в цитоплазме (около 0.1 мкМ и ниже), что приводит к отбыванию канала РиР и выбросу Са из ЭР в цитоплазму (Melzer et al., 1995; Рубцов, Батрукова, 1997).

На целом ряде нейронов и других клеток показано, что способность кофеина высвобождать Са2 из депо имеет колоколообразную зависимость от концентрации в цитоплазме клетки. Эффекты кофеина по высвобождению Са из депо являются дозо- и время-зависимыми (Hermandez-Cmz et al., 1995). Пороговой для активации выброса Са из

Са

-депо считается доза 0.5-1.0 мМ кофеина, однако, в зависимости от объекта используют дозы кофеина от 0.5 до 10-50 мМ (Brorson et al., 1991; Kuba, 1994; Kasai, Petersen, 1994).

Высокая миллимолярная концентрация, в которой кофеин оказывает свое сенсибилизирующее действие на РиР, неизбежно порождает вопрос о физиологичности этого эффекта кофеина. Есть основания считать, что кофеин имитирует действие эндогенного лиганда РиР - циклической АДФ-рибозы (Lee, 1997). цАДФ-рибоза - естественный продукт метаболизма NAD+ в клетке. В настоящее время известно уже 23 клеточных объекта, в том числе - центральные и периферические нейроны, в которых при активации реакций метаболизма NAD+ или при непосредственном введении цАДФ-рибозы в клетку (в низких, микромолярных концентрациях) происходит активация РиР Са -депо и выброс Са в цитоплазм>' (Lee, 1997). Причем действие цАДФ-рибозы является более эффективным в смысле стимуляции выброса Са2 из Са2+-депо, чем аналогичное действие 1Р3. По мнению Х.Ч.Ли (Lee, 1997), механизм действия цАДФ-рибозы сходен с таковым кофеина: она сенсибилизирует РиР к кальцию (связываясь с

белком 140 кДа, находящимся во взаимодействии с молекулой РиР), облегчая в 1050 раз открывание Са2+-канала под действием Са2+ в среде. Так же, как и эффекты кофеина, эффекты цАДФ-рибозы можно заблокировать прокатом или подобными блокаторами РиР, Считается, что кофеин, проникая в клетку, действует на РиР по типу цАДФ-рибозы, но, являясь менее специфическим экзогенным их миметиком, осуществляет свое действие в значительно более высоких - миллимолярных -концентрациях.

Кофеин (1-10 мМ) облегчает связывание не только кальция, но и АТФ, и рианодина с молекулой РиР. Наконец, имеются свидетельства того, что кофеин при определенных условиях способен не только модулировать, но и сам открывать кальциевый канал РиР и приводить к выбросу Са из цистерн ЭР. Возможно, что в этом случае кофеин (благодаря структурному сходству в нуклеотидами) конкурирует с АТФ за место связывания на РиР.

Кофеин способен связываться не только с молекулой РиР, но и с молекулой 1Р3-рецептора, причем у некоторых типов нейронов кофеин выступает как блокатор ТР3-рецепторов, а в других - как активатор выброса кальция из 1Р3-активируемых Са2+-депо.

В одном из последних обзоров Майкла Берриджа приводятся также данные анализа эффектов кофеина на изолированные гладкомышечные клетки сосудов, где показано, что аппликация 5 мМ кофеина сопровождается не только выбросом Са

"^4- 'У—

из Са -депо, но и входом Са из наружной среды внутрь клетки (Berridge, 1995).

б) Характеристика рианодина как модулятора активности РиР. Рианодин -алкалоид растительного происхождения, выделенный из южноамериканского растения Ryania speciosa. По химическому строению рианодин - это полициклический полигидроксильный дитерпен (Sutko, Airey, 1996).

В работах in vitro, а также на молекулах РиР, встроенных в искусственный липидньтй бислой, было показано, что рианодин способен избирательно и с высоким сродством связываться с молекулой РиР. В составе молекулы РиР существует два типа участков связывания рианодина - с высоким и с низким сродством, для которых константы диссоциации равны соответственно 5-10 нМ и 3 мкМ. Соответственно, при действии рианодина в концентрации порядка 5-10 мкМ наблюдается связывание рианодина с РиР в участках с низким сродством^ и это

приводит к закрыванию РиР и блокаде выброса Ca из Ca -депо. При действии в низких концентрациях (порядка 10~9-10"6 М) этот агент также способен связываться с молекулой РиР, но только в определенном ее конформационном состоянии, когда открыт Са2+-канал молекулы РиР. Высокоаффинное связывание рианодина с соответствующими сайтами на молекуле РиР приводит к "запиранию" РиР в открытом, но низкопроводящем состоянии (25-50% от максимальной проводимости). Центры связывания рианодина в молекуле РиР пока не идентифицированы. Но примечательно, что рианодин в низких концентрациях связывается только с тетрамером РиР.

Вопрос о том, имитирует ли рианодин действие какого-то эндогенного регулятора РиР и какого именно, остается открытым. Тот факт, что в составе молекулы РиР имеются сайты с очень высоким сродством к рианодину, говорит, по-видимому, в пользу существования такого эндогенного лиганда.

V. Рель Са2+-депо в функционировании нейронов.

Физиологическая роль внутриклеточных Са2+-депо как системы, способной регионально повышать уровень Са2+ в цитоплазме нейрона, еще только начинает изучаться. В настоящее время имеются убедительные экспериментальные доказательства непосредственного участия Ca2 , высвобождаемого из кофеин-чувствие льных Са2+-депо нейрона, в регуляции таких важных свойств и процессов как: а) возбудимость нейрона (осцилляции мембранного потенциала и ионнной проводимости мембраны в покое); б) импульсная залповая активность нейрона (регуляция следовой гиперполяризации); в) активность и состояние метаботропных рецепторов нейрона; г) нейросекреция медиатора.

Описаны спонтанные колебания уровня внутриклеточного Ca2 (Wakui et al., 1989) за счет его выброса из цистерн ЭР у нейронов моллюсков (Kostyuk et al, 1989), лягушки (Kuba, 1980; Lipscombe et al, 1988), симпатических (Kawai, Watanabe, 1989), парасимпатических (Cohen et al., 1997), сенсорных (Shmigol et al., 1995), гиппокампальных нейронов крысы (Murphy, Miller, 1989), у клеток мозжечка (Irving et al., 1992; Капо et al., 1995), а также у астроцитов коры мозга крыс (Jensen,

Chiu, 1990). Одновременно со спонтанными осцилляциями уровня внутриклеточного Са2+ у нейронов симпатических, парасимпатических ганглиев и многих других обнаруживаются периодические гиперполяризационные сдвиги или волны мембранного потенциала. В условиях фиксации потенциала показано, что каждая гиперполяризационная волна обусловлена появлением "малых миниатюрных выходящих токов" (SMOCs). SMOCs - это следствие увеличения числа открытых Са2+-активируемых калиевых каналов нейронов. Главную роль в их активации, как оказалось, играет депонированный Ca2 , выбрасываемый через рианодиновые рецепторы в нейроплазму из примембранных Ca -содержащих цистерн ЭР (Kuba, Nishi, 1976; Mathers, Baker, 1981; Satin, Adams, 1987; Suzuki, Kasano, 1978; Fujimoto et al., 1980; Gallagher et al, 1980; Skok et al., 1978; Sah, 1996).

Анализ Са2+-сигнала во время импульсной активности нейронов показал, что Са2+, входящий в нейрон при генерации ПД часто необходим, главным образом, для активации рианодиновых рецепторов и выброса Ca2 из примембранных Ca2 -депо нейрона (Kuba 1980; Brorson et al., 1991; Henzi, MacDermott, 1992). Следовательно,

Ca2' -депо и выбрасываемый из них Ca2* играют роль усилителем Ca2*-сигнала, поступающего в клетку снаружи.

Гипотеза о возможном предназначении Ca -депо в качестве усилителей Ca -сигнала, находит в последние годы все большее подтверждение. Так, в недавних работах Акивы Коэна и сотрудников на первичной культуре парасимпатических нейронов кроликов подсчитано, что при возбуждении нейрона и генерации даже одиночного ПД уже активируется система Са2+-индуцированного выброса Ca2 из ЭР, который вносит свой вклад в повышение уровня кальция в нейроне при каждом акте возбуждения. В результате, наблюдаемое в нейроне повышение уровня ионизированого Са2+ происходит не менее чем наполовину (то есть на 40-50%) за счет Са2+, высвобождаемого из Са2+-депо клетки (Cohen et al., 1997). Аналогичные данные приводят и другие исследователи (Simpson et al., 1995). При ритмическом разряде (в виде серии ПД) - в зависимости от частоты - роль Ca -депо как усилителя Ca2 -сигнализации может меняться на противоположную (то есть на роль ограничителя Са2+-сигнала).

В некоторых типах нейронов депонированный Ca , выходя из цистерн ЭР, при высокочастотной импульсной активности клетки способен связываться и

инактивнровать Ca -каналы наружной мембраны по принципу отрицательной обратной связи.

На симпатических и других типах нейронах показано, что и другие ионные проводимости наружной мембраны, например, Са2+-активируемый хлорный ток, также активируются, главным образом, за счет Са2+, выбрасываемого из Са2+-депо.

В работах Эндрюса и соавторов было установлено, что при активации синаптических глутаматных входов на клетках Пуркинье можно наблюдать быстро развивающуюся депрессию синаптических ответов (Andrews et al., 1988). Оказалось, что важную роль в этой депрессии играют Са2+-депо, локализованные в

дендритных шипиках клеток Пуркинье. При активации глутаматных рецепторов и

2+

поступлении ионов Са в нейрон происходит активация РиР, имеющихся в составе примембранных Са -депо поблизости от постсиналтической мембраны шипика. В результате, выброс Са2+ из депо приводит к инактивации глутаматных рецепторов и депрессии синаптической передачи.

В пирамидных клетках гиппокампа, где описан феномен длительной посттетанической потенциации (ПТП) синаптической активности, доказано участие Са2-депо в реализации ПТП. Оказалось, что обработка пирамидных нейронов дантроленом натрия (блокирующим выброс Са из РиР), а также тапсигарджином (опустошающим Са2+-депо) приводит к исчезновению ПТП вследствие торможения активности NMDA-рецепторов (Simpson et al., 1995). В работах на нейронах моллюсков и высших животных показано, что выключение рианодином работы Са2 -депо изменяет активность холинорецепторов и снижает ответы нейрона на АХ (Pivovarov, Walker, 1997),

VI. Роль кальция и кальциевых депо в секреции медиатора.

Основные представления квантово-везикулярной теории выброса медиатора и представления о Са -зависимом механизме высвобождения квантов медиатора из нервных окончаний химических синапсов были сформулированы в работах Б.Катца и Р.Миледи на нервно-мышечных синапсах лягушки. Было показано, что при деполяризации терминали (с помощью ПД или искусственного стимула)

повышение уровня свободного Са в цитоплазме нервных терминалей является необходимым и достаточным условием для осуществления синхронной вызванной квантовой секреции медиатора (Katz, Miledi, 1965, 1968). При этом считалось, что такое повышение [Са ]В!!уТр. происходит исключительно за счет его поступления по быстрым (Р-, Q-, или N-типа) Са2+-каналам из наружной среды, так как удаление Са2 из наружной среды (в присутствии EGTA) полностью прекращает вызванный выброс медиатора (Katz, Miledi, 1965, 1968; Каменская, 1972; 1976).

В 90-ые годы были предприняты первые попытки ревизии этих классических представлений. В работах Й.Дуделя, а также Ж. Мосье и Ж.Зенгель было показано,

уу,

что при удалении С а из наружной среды можно на некоторое (хотя и короткое) время сохранить и поддержать вызванный выброс (ПКП) в ответ на прямую деполяризацию терминали, если усилить кальциевую нагрузку в Са -депо и выброс из них Са2+ (Dudel, 1990; Dudel et al., 1991; Mosier, Zengel, 1994).

В пользу гипотезы о потенциально возможном участии Са2+, выбрасываемого из Са -депо в секреции медиатора из терминали, говорит и тот факт, что в нервных терминалях в последние годы обнаружено множество Са -зависимых белков (кальмодулин, синапсин, нейрексин, синаптотагмин и др.), ферментов (например, Са2+-зависимые протеинкиназы) и промежуточных реакций (мобилизация везикул, заякоривание везикул в активных зонах, эндоцитоз и рециклизация везикул и т.д.), принимающих участие в секреции медиатора. Многие из них пространственно разъединены и достаточно удалены от мест

"У А-

концентрации Са каналов наружной мембраны. В настоящее время показано, что

УУЛ- 'У-3-

кальциевое "облако", образующееся при открывании Са -каналов и входе Са в аксоплазму, не превышает в диаметре 40-60 нм, то есть очень строго локализовано и предназначено в основном для "насыщения" белка синаптотагмина, отвечающиего за последний этап слияния везикулы с наружной мембраной (Van

"Уа-

der Kloot, Molgo, 1994). Вместе с тем, в терминали имеется множество других Са -зависимых реакций, требующих локального повышения Са2+ и принимающих участие в электро-секреторном сопряжении. Так, показано, что процесс освобождения везикул из связи с актиновыми нитями цитоскелета осуществляет белок синапсин, регулируемый кальцием и кальмодулин-зависимой протеинкиназой. Многие белки, участвующие в сцепке везикулы с активной зоной

(нейрексин, синаптотагмин), также относятся к Са -связывающим и

Са -

зависимым белкам. В связи с этим, по мнению ряда исследователей, несомненно, что хотя бы часть из них может находиться под контролем региональных "вспышек" уровня Са2+, имеющих своим источнком депонированный Са2+ (Mosier, Zengel, 1994; Van der Kloot, Molgo, 1994; Smith, Cumian, 1996).

Это утверждение кажется особенно убедительным по отношению к особенностям Са -зависимых механизмов спонтанной секреции квантов АХ.

Хорошо известно, что, в отличие от вызванного выброса медиатора, спонтанный асинхронный выброс отдельных квантов медиатора не столь жестко и однозначно детерминирован поступлением Са извне (Каменская, 1972; 1976; Van der Kloot, Molgo, 1994). И в центральных, и в периферических синапсах в бескальциевом растворе с EGTA спонтанная секреция квантов сохраняется, хотя и претерпевает определенные изменения. Так, в периферических моторных синапсах млекопитающих секреция стандартных по величине квантов медиатора ацетилхолина (АХ), регистрируемая на постсинаптической мембране в виде миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП), уменьшается в 5-10 раз, однако, не исчезает полностью (Lupa et al., 1986). В работе Пэвсона и Гринелла на синапсах лягушки также показано, что стимуляция нерва в бескальциевой среде с EGTA (50 Гц, 40 сек) сопровождается приростом частоты спонтанной секреции (МПКП) после выключения ритмической стимуляции. Прирост частоты МПКП сохраняется на протяжении нескольких минут и носит характер периодических "пачек" или учащений МПКП (Pawson, Grinell, 1984). Этот феномен заслуживает особого внимания в связи с тем, что в работе А.Тсе и соавторов на гонадотропных клетках гипофиза крысы прямо показано, что осцилляции кальциевого сигнала в этих клетках коррелируют с ритмикой экзоцитоза гормона (Tse et al., 1995). По

4-

мнению В.Ван дер Клоота и Дж.Молго, осцилляции Са -сигнала в нервных терминалях моторных синапсов должны проявляться в периодических колебаниях межимпульсных интервалов МПКП, причем периодика может быть очень короткой (с периодом не более 2 секунд) (Van der Kloot, Molgo, 1994). Интересно заметить, что частота спонтанных вспышек Са2+ в гладкомьппечных клетках также колеблется около 0.5-3 Гц (Knot et al., 1998), то есть близка к частоте спонтанной секреции МПКП.

Если спонтанное высвобождение квантов медиатора из нервной терминали действительно отражает периодику микрофлуктуаций Ca -сигнала в терминалях, то это должно выявляться на автокорреляционных рядах или периодограммах межимпульсных интервалов следования отдельных МПКП (Van der Kloot, Molgo, 1994). К сожалению, все попытки выявить периодичность в характере спонтанной секреции МПКП пока не увенчались успехом (в том числе -и в последней работе В.Ван дер Клоота, посвященной анализу межимпульсных интервалов МПКП у синапсов лягушки и мыши при разной концентрации Ca2 в наружной среде (Van der Kloot et al,, 1999, в печати).

Наряду с "обычным", существует особый тип спонтанной секреции медиатора, который, как считают, практически не зависит от поступления Ca2* снаружи внутрь терминали. Этот тип спонтанной секреции был подробно описан в работах С.Теслеффа, Дж.Молго и соавторов на нервно-мышечных синапсах, где можно наблюдать спонтанную секрецию очень больших по размеру порций ацетилхолина, вызывающих на постсинаптической мембране высокоамплитудные сигналы, сопоставимые иногда с вызванными ПКП, получившие название гигантских МПКП (гМПКП). Спонтанная секреция с помощью гМПКП в моторных терминалях преобладает в случаях, когда у терминалей долгое время оказывается заниженным или полностью блокированным вызванный выброс медиатора (например, в раннем онтогенезе или при патологически долгом "неупотреблении" синапсов, блокаде импульсной активности), у "молчащих" синапсов, а также у терминалей в моменты интенсивных пластических перестроек синапсов, то есть при спрутинге (Thesleff et al., 1983; Gundersen, 1990). В отличие от стандартных МПКП, частота гМПКП не возрастает при калиевой деполяризации нервной терминали. Отсюда был сделан вывод, что гМПКП практически на зависят от поступления Ca2 в терминаль из наружной среды. В связи с этим, данный тип секреции гигантских квантов медиатора получил название Са2+-независимой спонтанной секреции крупных (гигантских) квантов медиатора (Thesleff, Molgo, 1983; Lupa et al, 1986; Molgo et al., 1990; Sellin et al., 1996). Вместе с тем, известно, что частота гМПКП увеличивается при действии на терминаль 4-аминопиридина, который, как выяснилось недавно, является не только блокатором калиевых каналов плазматической мембраны, но и эффективным блокатором активности

Са2+-АТФ-азы, то есть приводит к усилению утечки Са2+ из Са2+-депо (Lee, 1997). Поэтому вопрос о Са -зависимой регуляции активности гМПКП остается окончательно не решенным.

Весьма спорным и малоизученным является и вопрос о том, зависит ли и каким образом, размер отдельного кванта медиатора от повышения [Са2+] в цитоплазме терминали. Показано, что под действием калиевой деполяризации уменьшается размер кванта в моторных синапсах, причем этот эффект развивается только в присутствии Са2+ в наружной среде. Таким образом, можно предполагать что при калиевой деполяризации Са , поступающий внутрь по Са -каналам наружной мембраны, способен действовать на какие-то Са2 -зависимые ферменты, способные снижать размер кванта (Van der Kloot, 1991). Предполагается, что

Са2+,

поступающий по Са2+-каналам внутрь терминали, может активировать протеинкиназу С, которая катализирует реакции, приводящие к уменьшению размера кванта. По данным литературы, такие агенты, как кофеин и рианодин, повышающие уровень [Са ]вн>1р за счет его выброса из Са -депо, не меняют амплитуду МПКП и размер кванта АХ в моторных синапсах (Onodera, 1973; Roed, 1982; Nishimura et al,, 1990).

2+

Возможное участие Са -депо в работе нервных терминалей долгое время связывали только со способностью этих цистерн забуферивать и убирать кальций, накапливающийся в результате его поступления из наружной среды по Са2+-активируемым Са2 -каналам (Каменская, 1972; 1976). Однако, начиная с 80-х годов, накапливаются свидетельства того, что в нервных терминалях центральных и периферических синапсов имеет место физиологически значимый механизм выброса Са2+ из Са2+-депо. Так, одними из первых были выполнены работы Фьюджимото и соавторов на культуре симпатических нейронов, где с помощью кофеина и Са2+-красителей было выявлено присутствие Са2+-депо непосредственно вблизи активных зон нервных терминалей (Fujimoto et al., 1980). Далее, в работах Мелдолези и соавторов (Meldolezi et al., 1984), а также А. Мартинез-Серрано и Й.Сатрустеги с использованием флуоресцентных красителей ФУРА 2 и квин-2 на синаптосомах мозга было прямо показано, что при действии на синаптосомы кофеина (10 мМ) имеет место повышение цитозольной [Са2 ], сопоставимое по кинетике и величине с эффектами 15 мМ КС1 (Martinez-Serrano, Satrustegui, 1989).

Зачетти и соавторы (Zacchetti et al., 1991), а также Т. Авидор и соавторы проводили эксперименты на клетках феохромоцитомы PC 12. Показано, что кофеин, во-первых, вызывает повышение уровня Са2+ в цитозоле этих клеток и, во-вторых, усиливает высвобождение катехоламинов из этих клеток, благодаря усилению выброса Са2+ из Са2+-депо (Avidor et al., 1994). Аналогичные результаты получены при анализе хромаффинных клеток надпочечников: здесь также наблюдали усиление секреции катехоламинов в результате выброса Са2+ из Са2+-депо под действием 5-10 мМ кофеина (Neher, Zucker, 1993).

Возможное участие Ca , высвобождаемого из Ca -депо, в работе периферических моторных нервных терминалей изучено в основном косвенными методами. В электрофизиологических исследованиях спонтанной и вызванной активности нервно-мышечных синапсов показано, что кофеин (1-5 мМ) усиливает как вызванную, так и спонтанную активность нервно-мышечного синапса. В работах Вилсона, Онодеры, Роеда и других на изолированных нервно-мышечных препаратах холоднокровных и теплокровных животных было установлено, что кофеин (1-10 мМ) увеличивает амплитуду и квантовый состав ПКП в моторных синапсов лягушки и крысы. Установлено также, что кофеин (в этом же диапазоне концентраций) увеличивает частоту спонтанного выброса медиатора (МПКП) в нервно-мышечных синапсах амфибий и млекопитающих без изменения амплитуды МПКП. Исходя из диапазона концентраций кофеина (1-10 мМ), оказывающих облегчающий эффект на секрецию АХ, авторы приходят к выводу, что эти эффекты кофеина - пресинаптические и опосредованы его способностью действовать на внутриклеточные депо кальция в нервных терминалях, приводя к выбросу кальция из этих депо и повышению его уровня в аксоплазме терминали. Это, в свою очередь, может быть причиной увеличения и квантового состава ПКП, и частоты МПКП (Wilson, 1974; Onodera, 1973; Roed, 1982; Hofmaim, 1969; Blaustaein et al., 1978; McGraw et al., 1980).

Интерпретация данных, касающихся эффектов кофеина, осложняется наличием у кофеина других точек приложения и действия на нервную термина ль, упоминавшихся выше. Поэтому в работе Нишимуры и соавторов были сопоставлены пресинаптические эффекты двух агентов - кофеина (2 мМ) и рианодина (0.1-1.0 мкМ), каждый из которых способен усиливать выброс Ca из

Са2+-депо терминалей. Была исследована спонтанная и вызванная секреция медиатора в моторных синапсах мыши. Эти исследования показали, что кофеин и рианодин вызывают качественно сходные эффекты: увеличивают квантовый состав вызванных ПКП и частоту спонтанных МПКП. Однако кофеин оказывал более выраженные эффекты и на частоту МПКП, и на квантовый состав ПКП. Кроме того, потенциирующие эффекты обоих агентов зависели от уровня Са2+ в цитоплазме терминали и в особенности - потенциирующие эффекты рианодина. Важно подчеркнуть, что разная степень выраженности потенциирующих эффектов кофеина и рианодина на секрецию АХ объясняется разной спецификой их действия на РиР.

Весьма важным и малоизученным остается вопрос о роли Ca -депо в секреции медиатора в условиях ритмической активности синапсов. Известно, что в зависимости от частоты стимуляции в нервно-мышечных синапсах имеют место закономерные изменения амплитуды и квантового состава ПКП по ходу ритмического залпа. При низких частотах преобладают процессы депрессии, то есть снижение амплитуды и квантового состава ПКП в начале залпа с постепенным выходом на постоянный уровень секреции АХ и амплитуды ПКП (т.н. фаза "плато"). При повышении частоты стимуляции в головной части залпа наблюдается кратковременное облегчение (прирост амплитуды ПКП), который быстро переходит в депрессию и заканчивается выходом на сниженный стабильный уровень секреции и амплитуды ПКП (фазу "плато"). В целом, рисунок залпа обусловлен сложным взаимодействием и наложением целого ряда процессов, усиливающих выброс (т.н. "облегчение" 1 и 2, "усиление", "потенциация") и снижающих выброс ("депрессия") (Каменская, 1972),

В работах Зенгеля, Маглеби, Цукера (Magleby, 1973; Zucker, 1973; Magleby, Zengel, 1975; Magleby, Zengel, 1976) и многих других на нервно-мышечных синапсах, а также в многочисленных работах, выполненных на центральных синапсах нейронов моллюсков и высших животных (Fisher, Bourque, 1996) показано, что и процессы облегчения, и динамика потенциации, и посттетанической потенциации, то есть рисунок ритмического залпа в синапсе, могут во многом быть обусловлены колебаниями уровня ионизированного кальция в области активных зон в ходе импульсной активности терминали и сразу после

нее (Zucker, 1973; Kamiya, Zucker, 1994; Fisher et al., 1997). В свою очередь, уровень Са2+ в терминали определяется балансом двух основных составляющих -количеством "впрыскиваемого" при ПД наружного Ca и интенсивностью откачки Са2+ или ограничения его поступления внутрь. Причем баланс этих процессов во многом зависит от частоты стимуляции синапса. Вклад Ca -депо в баланс этих составляющих и рисунок залпа только начинает изучаться.

Согласно классической гипотезе "остаточного кальция", высказанной впервые Катцем и Миледи в 1973 году, прирост амплитуды ПКП в начальной части залпа обусловлен быстрым накоплением Ca2 внутри терминали и ускоренным насыщением Са2+-связывающих участков на белках, непосредственно отвечающих за слияние везикул с наружной мембраной и экзоцитоз (в первую очередь - с насыщением синаптотагмина). В связи с этим, можно было предполагать, что определенный вклад в накопление "остаточного кальция" может вносить Ca -индуцированный выброс Ca2 из

Са2+

-депо вблизи активных зон. Однако эксперименты показали, что это не так. В работе Вилсона, а также Нишимуры было специально исследовано, как меняется процесс раннего тетанического облегчения выброса медиатора на фоне действия кофеина и рианодина. Несмотря на то, что на фоне кофеина и рианодина увеличивался уровень выброса медиатора в периферических синапсах в ответ на одиночный стимул, при высокочастотной стимуляции не удалось доказать участие Са2+-депо в реализации феномена раннего тетанического облегчения ПКП: ни кофеин (4 мМ), ни рианодин (0.1-1.0 мкМ) не вызывали достоверных изменений величины раннего тетанического облегчения квантового состава ПКП в моторных синапсах (Wilson, 1973; Nishimura et al., 1990). Это значит, что Ca -депо не вносят существенного вклада в повышение уровня свободного Са2+ в самом начале залпа, то есть не участвуют в создании пула "избыточного" или остаточного кальция, который обусловливает прирост амплитуды ПКП и облегчение передачи в начале залпа.

Постулат о сложном взаимодействии наружного и внутриклеточно депонированного кальция в регуляции секреции медиатора в процессе ритмической активности получил свое развитие и подтверждение в работах А.Смита и Т.Куннана, где были исследованы процессы секреции АТФ и норадреналина из постганглионарных симпатических нервных терминалей. Оказалось, что

поступление Ca внутрь терминалей при их импульсной активности опосредовано открыванием двух типов потенциал-активируемых кальциевых каналов. При низкой частоте импульсной активности (менее 1 Гц) открывается одна популяция каналов (N-типа), которые полностью блокируются ш-коноксином. В условиях полной блокады этого типа каналов высокими дозами токсина можно вызвать секрецию медиатора из тех же окончаний, но только при высокочастотной стимуляции окончаний (30-50 Гц). При этом поступление Са2 в терминали осуществляется по другому типу Са -каналов. При этом кофеин и рианодин дозо-и время-зависимым образом усиливали секрецию медиатора (АТФ) при низкочастотном режиме работы терминали, но тормозили секрецию медиатора при высокочастотном режиме работы терминали. Авторы приходят к выводу, что в нервных терминалях симпатических постганглионаров в ответ на приходящий нервный импульс и поступление Са2 из наружной среды имеет место Са2 -индуцируемый выброс Са2+ из Са2-депо, который может избирательно

л,

регулировать работу разных типов Са -каналов: усиливать Са -сигнал,

■у 5

поступающий по одним каналам, и тормозить Са -сигнал, приходящий по другим Са2+

-каналам (Smith, Cumiarte, 1996; Cunnane, Smith, 1997).

Таким образом, в настоящее время имеются немногочисленные, но достаточно убедительные свидетельства сложной роли пресинаптических

Са -

депо в регуляции рисунка вызванной ритмической активности синапса.

Подводя итог анализу литературы, касающейся свойств внутриклеточных Са2+-депо, можно сделать следующее заключение. В настоящее время методами флуоресцентного, микроскопического и фармакологического анализа убедительно показано присутствие Са2+-запасающих цистерн эндоплазматического ретикулума как в самих нейронах, так и в нервных терминалях. Прямо показано, что под действием эндогенных либо экзогенных стимуляторов (типа кофеина и рианодина) Са2+

может высвобождаться из этих

Са2'

-депо. Уже описан ряд специфических процессов и реакций, избирательно чувствительных и зависимых от Са2+, мобилизуемого из Са2+-депо в нейронах. В отношении нервных терминалей синапсов также имеются - хотя и немногочисленные - свидетельства того, что

депонированный мобилизованный Са способен участвовать в регуляции секреции медиатора. Вместе с тем, реальные физиологические условия, при которых происходит высвобождение депонированного

Са2+ в нервных терминалях и его специфическая роль в регуляции различных режимов квантовой секреции, еще нуждаются в специальном систематическом изучении.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение диссертации по теме «Физиология», Сурова, Наталья Владимировна

выводы

1, Действие на нервные терминали кофеина (0,5 мМ) и рианодина (1 мкМ), способствующих мобилизации депонированного внутриклеточного Са , приводит к увеличению амплитуды одиночных ПКП, соответственно в 1.51 и 2.13 раза - за счет возрастания уровня вызванного выброса медиатора на нервный импульс,

2, Блокада выброса Са2+ из Са2 -депо нервных терминалей рианодином (10 мкМ) приводит к снижению вызванного выброса квантов медиатора и уменьшению средней амплитуды одиночных ПКП в 2.86 раза.

3, В условиях ритмической активности синапсов (4-20 Гц) в присутствии 0.5 мМ кофеина наблюдается частотно-зависимое затормаживание выброса медиатора по всему ходу залпа, выражающееся в подавлении начального облегчения амплитуды ПКП, углублении начальной депрессии и снижении амплитуды ПКП на фазе «плато»,

4, Кофеин (0.5-5,0 мМ) и рианодин (0,1-1.0 мкМ) вызывают однонаправленный дозозависимый прирост частоты МПКП в 3-4 раз, при этом эффекты рианодина характеризуются более медленной динамикой развития.

5, При действии кофеина (5 мМ) и рианодина (1 мкМ) в бескальциевом растворе с ЕвТА наблюдается в 9-45 раз более выраженный, но кратковременный прирост частоты спонтанной секреции квантов медиатора.

6, Кофеин и рианодин дозозависимым образом увеличивают дисперсию амплитуд МПКП и видоизменяют характер гистограмм амплитудных распределений МПКП за счет преимущественной секреции пула «гигантских» квантов медиатора, в 2-10 раз превышающих средние значения размера кванта ацетилхолина.

7, Стимулирование кофеином (1,0 мМ) и рианодином (1 мкМ) секреции увеличенных по размеру «гигантских» квантов медиатора усиливается в 2-3 раза в бескальциевом растворе.

8, Секреция пула «гигантских» квантов медиатора затормаживается при действии на терминали блокатора накачки медиатора в везикулы везамикола (1 мкМ).

9. Внутриклеточный депонированный Са2+ нервных терминалей синапсов является специфическим и многосторонним регулятором спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе была исследована спонтанная и вызванная секреция квантов медиатора ацетилхолина (АХ) в нервно-мышечных синапсах мыши в условиях острого действия кофеина и рианодина, являющихся эффективными фармакологическими модуляторами активности внутриклеточных Са2 -депо.

На основании полученных результатов и их анализа можно сделать ряд общих заключений.

Удалось показать, что действие и кофеина, и рианодина сопровождается специфическими изменениями активности синапсов, главным образом, на пресинаптическом уровне. Пресинаптические эффекты кофеина (миметика выброса Са из Са -депо) и рианодина (двунаправенного модулятора активности выброса С а2 из Са2 -депо) затрагивают как спонтанную, так и вызванную активность синапсов и имеют характерные концентрационную, временную и температурную зависимости.

И кофеин (0.5 мМ) и рианодин (1 мкМ), усиливая (хотя и с помощью разных механизмов) выброс Са2+ из Са2+-депо ЭР нервных терминалей, вызывают качественно сходные эффекты - достоверное увеличение уровня вызванного выброса медиатора АХ в ответ на одиночные нервные импульсы с частотой 0.3 Гц. При этом потенциирующие эффекты кофеина и рианодина имеют разную кинетику и степень выраженности. На наш взгляд, эти различия хорошо укладываются и могут быть объяснены спецификой механизмов, с помощью которых кофеин и рианодин открывают Са2 -каналы рианодиновых рецепторов в составе Са2 -депо (см. «Результаты и обсуждение»). Мы также установили, что блокада выброса Са из Са2 -депо с помощью высокой (10 мкм) дозы рианодина (приводящей к запиранию

Са2+

-каналов рианодиновых рецепторов в закрытом состоянии) сопровождается значительным снижением уровня выброса медиатора, которое развивается на протяжении десятка минут.

Согласно традиционным представлениям, и сам акт выброса медиатора, и его уровень определяются кальцием, поступающим по Са2 -каналам синаптической мембраны из наружной среды. Однако входящий снаружи Са2+ имеет строго ограниченный пространственный ареал действия - в пределах десятка нанометров удаления от Са -каналов термина ли (Kasai, Petersen, 1994; Kasai, 1999). Поэтому роль наружного Са2+ ограничивается воздействием лишь на строго локализованный и тесно сцепленный с

Са2+ -каналами комплекс белков (типа синаптотагмина), определяющих лишь самый последний, конечный акт слияния везикул с синаптической мембраной (Van der Kloot, Molgo, 1994), Тогда как многие другие Са2+-зависимые белки и реакции, являющиеся составной частью механизма электросекреторного сопряжения, пространственно отставлены от наружной мембраны, могут регулироваться лишь за счет Са , выбрасываемого из внутриклеточных источников. у*

Вопрос о том, достаточными ли являются количества Са , поступающие из наружной среды при нервном импульсе, для поддержания необходимого уровня выброса медиатора, по существу, мало изучен. Известно лишь, что забуферивание колебаний внутриклеточной концентрации кальция органическими хелатирующими буферами типа АМ-ВАРТА приводят к снижению (но не полной блокаде) вызванного выброса (Van der Kloot, Molgo, 1994).

Наши данные свидетельствуют, что одним из физиологически значимых источников Са2+ в нервной терминали могут быть Са2+-депо ЭР, чувствительные к действию кофеина и рианодина. Мы показали, что вызванный выброс медиатора может существенно зависеть и регулироваться за счет депонированного Са2+ как при одиночной, так и при ритмической активности синапса. Мы впервые провели систематический анализ и описание рисунка залповой ритмической активности синапса в зависимости от частоты имульсации (0.3-20 Гц), Были выявлены диапазоны частот, при которых наиболее выражены характерные процессы, имеющие место при ритмической стимуляции, а именно - начальное облегчение, депрессия и фаза плато. Мы установили, что кофеин, несмотря на его способность усиливать квантовый состав и амплитуду одиночных ПКП, не влияет на процесс начального облегчения выброса в ритмическом залпе, и, более того, способствует развитию депрессии передачи в ходе ритмической активности во всем обследованном диапазоне частот. Хорошо известно, что агенты, усиливающие работу Са2+-каналов наружной мембраны и увеличивающие «вброс» Са2+ из наружной среды во время нервного импульса, вызывают аналогичные изменения в рисунке ритмического залпа - менее выраженным становится облегчение в начале залпа и более выраженной - депрессия и скорость выхода на плато (Маепо, Enomoto, 1988; Van der Kloot, Molgo, 1994), Считается, что увеличение квантового состава одиночных ПКП в случае усиления поступления наружного Са2+ приводит к более быстрому расходу пула готового к высвобождению медиатора и, как следствие, к более быстрым и выраженным процессам депрессии квантового состава и амплитуды ПКП в ритмическом залпе (Каменская, 1972; Vau der Kloot,

2+

Molgo, 1994). Наши исследования показали, что усиление поступления Ca из

А, другого источника - из Ca -депо - под действием кофеина, по существу, вызывает аналогичные эффекты. Однако важно отметить, что в случае действия кофеина (то есть усиленного выброса депонированного Са2+) оказывается менее выраженными не только процесс начального облегчения, и не только усиливается процесс начальной депрессии, но также снижается средний уровень выброса АХ и в «хвосте» залпа, на стадии плато (когда имеет место уже установившийся баланс межу количеством расходуемого (выбрасываемого) и пополняемого медиатора).

Наши результаты, в общем, совпадают с немногочисленными данными ряда других авторов, проводивших анализ эффектов кофеина и рианодина на некоторых центральных и периферических синапсах теплокровных и холоднокровных (Wilson, 1973; Roed, 1982; Nishimura et al„ 1990; Cumian, Smith, 1997) и показавших, что под действием кофеина (в миллимолярных дозах) и рианодина (в нано-субмикромолярных дозах) увеличивается уровень вызванного выброса медиатора в ответ на нервный импульс.

Полученные нами данные подтвердили и значительно расширили представление о том, что депонированный Са2+ может усиливать не только вызванную, но и спонтанную секрецию медиатора, В работе удалось впервые выявить специфическую роль депонированного Са2+ как эндогенного внутриклеточного регулятора и усилителя секреции «гигантских» квантов медиатора, проявлением которых являются так называемые «гигантские» МПКП (гМПКП), Особенностью «гигантских» квантов или порций АХ является тот факт, что, во-первых, они столь велики, что выброс одного такого кванта часто может вызвать генерацию мышечного ПД и сокращение мышечного волокна, и, во-вторых, в нормальных условиях работы синапса спонтанная секреция таких «гигантских» порций АХ крайне редка (частота гМПКП обычно ниже 0.01 Гц), Мы впервые показали, что усиленное кофеином (1-5 мМ) и рианодином (1 мкМ) поступление депонированного Са2+ в аксоплазму терминали сопровождается резким приростом частоты гМПКП, свидетельствуя о возрастании частоты секреции гигантских порций АХ под действием именно и только депонированного внутриклеточного Са2. В пользу такой интерпретации данных говорит и тот факт, что на фоне блокирования рианодиновых рецепторов и выброса Са2+ из Са2+-депо (с помощью 10 мкМ рианодина) кофеин (1 мМ) оказался не способным вызвать секрецию гигантских квантов АХ. Кроме того, обнаружена еще одна интересная и, на наш взгляд, принципиальная особенность секреции гМПКП. Оказалось, что индуцируемый кофеином (1-5 мМ) или рианодином (1 мкМ) прирост частоты гМПКП ставится значительно более выраженным в бескальциевом растворе. Это п позволяет сделать заключение, что в отсутствии поступления Са из наружной среды система мобилизации депонированного кальция становится более активной и значимой в секреции квантов медиатора и работе синапса.

На наш взгляд, Са2 -депо и мобилизуемый из них Са2 могут играть роль особого резервного механизма, поддерживающего и усиливающего Са2+-зависимую секрецию медиатора при длительном отсутствии нервных импульсов и поступления Са2+ снаружи. При патологических или функциональных нарушениях «срабатывания» нервного импульса и поступления Са2+ из наружной среды в терминаль, спонтанная секреция гигантских квантов АХ, усиливаемая за счет депонированного Са , фактически может имитировать импульсную активность синапса и поддерживать мышечный тонус при отсутствии естественной нервной им пульсации мотонейрона.

Таким образом, полученные в работе данные позволяют рассматривать Са2 -депо и мобилизуемый из них внутриклеточный

Са2+ как систему многообразной функционально значимой регуляции спонтанной и вызванной секреции медиатора в нервных терминалях синапсов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сурова, Наталья Владимировна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. - М.: Наука, 1994.

2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К,, Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки; в 3-х т., 2-е изд., перераб. и доп. Пер, с англ. - М.: Мир,, 1994,

3. Балезина О.П. Сравнительная организация нервно-мышечных синапсов фазных скелетных мышц позвоночных. - Успехи физиол. наук, 1989, 20, N 1, С. 68-89,

4. Балезина О.П. Функциональная организация двигательной иннервации осевой скелетной мускулатуры позвоночных, Диссер... д-ра биол. наук - М,, 1990, С, 1042, 50-57, 65-66, 73-81, 111-124, 251-341.

5. Балезина О.П., Посконова М.А. Функциональная организация и двигательная иннервация шейной скелетной мышцы млекопитающих. - Ж, эвол. биохим, и физиол,, 1990, 26, N 5, С. 606-612.

6. Воробьев А,, Синельников Б, Атлас анатомии человека, - М,;Медицина. 1960, Т.1, С. 10-32.

7. Воронин Л.Л. Анализ пластических свойств центральной нервной системы. -Тбилиси; Мецниереба, 1982, С. 110-123,131-135, 160-181.

8. Катц Б. Нерв, мышца и синапс. - М.: Мир, 1968, С. 142-169.

9. Каменская М.А. Современные представления о механизме квантового освобождения медиатора из моторных нервных окончаний скелетной мышцы. -Усп. физиол. наук, 1972, 3, N 3, С, 22-63,

Ю.Каменская М.А. Физиологический анализ процесса секреции медиатора из нервных окончаний скелетной мышцы животных и человека. Автореф. дне... д-ра биол, наук. - М,; МГУ, 1976, С, 1-18.

И.Костюк П.Г, Кальций и клеточная возбудимость, - М,; Наука, 1986, С, 5-256,

12,Костюк П.Г,, Крышталь O.A. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. - М.: Наука, 1981, С. 25-57.

13,Куффлер С,, Николе Дж. От нейрона к мозгу, - М,; Мир, 1979, С. 156-162, 171173, 177-178, 182-183.

14.Магазаник Л.Г., Федоров В.В., Снетков В.А. Факторы, определяющие длительность одиночного постеинаптического ответа в нервно-мышечных соединениях. - Нейрофизиология, 1984, 16 (5), С. 590-602.

15.Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2-х т. - М.: Медицина, 1977, Т. 1, С. 127.

16.Миронов С.Л., Тепикин А.В., Белан П.В. Механизмы регуляции внутриклеточной концентрации Са2+ в изолированных нейронах моллюсков, выявляемые по флуоресценции зонда фура-2. - В сб.-ке «Внутриклеточная сигнализация» (ред. КостюкП.Г,, Островский М.А.), 1988, С. 21-32.

17.Персон Р.С. Спинальные механизмы управления мышечным сокращением. - М.: Наука, 1985, С. 15-110.

18.Привес М.Г., Лысенков Н.К., Буткович В.И. Анатомия человека. - М. .Медицина, 1985, С. 432.

19.Рубцов A.M., Батрукова М.А, Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства. - Ж. Биохимия, 1997, 62, N 9, С. 1091-1105.

20.Тонков В.Н, Учебник анатомии человека. - М.: Наука, 1982, T.I, С, 210.

21.Харкевич Д.А. Фармакология. -М.: Медицина, 1986, С. 125.

22.Шеперд Г.М. Нейробиология. -М.: Мир, 1987, Т. 1, С. 78-264.

23.Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека: В 3-х томах. - М.: Мир, 1996, Т. 1, С. 7150.

24.Allen T.J., Baker P.P. Intracellular Са2+ indicator quin-2 inhibits Ca2 inflow via NaVCa2+0 exchange in squid axon. - Nature, 1985, V. 315, P. 755-756.

25.Andrews S.B., Leapman R.D., Landis D.M.D., Reese T.S. Activity dependent accumulation of calcium in Purkinje cell dendritic spines. - Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A., 1988, V. 85, P. 1682-1685.

26. Andrews S.B., Leapman R.D., Landis D.M.D., Reese T.S. Distribution of calcium and potassium in presynaptic nerve terminals from cerebellar cortex. - Proc, natn. Acad. Sci, U.S.A., 1987, V. 84, P. 1713-1717.

27.Ashley C.C., Mulligan LP., Lea T.J. Ca2+ and activation mechanisms in skeletal muscle, - Q. Rev. Biophys., 1991, V, 24, P. 1-73.

28,Ashley R.H. Activation and conductance properties of ryanodine-sensitive calcium channels from brain microsomal membranes incorporated into planar lipid bilayer. - J. Membrane Biol., 1989, V. Ill, P. 179-189.

29,Avidor T,, Clementi E., Schwart L., Atlas D. Caffeine-induced transmitter release is mediated via ryanodine-sensitive channel. - Neurosci.Lett, 1994, V. 165, P. 133-136.

30,Berne P., Levy M. Principles of physiology. - U.S.A. Mossby Com., 1990, P. 115189.

31,Berridge MJ, Calcium signalling and cell proliferation, - Bioessays, 1995a, V, 17, P. 491-500.

32,Berridge M.J. Capasitative calcium entry. - J, Biochem., 1995b, V. 312, P. 1-11. -

33,Berridge M.J. Elementary and global aspects of calcium signalling. - J, Physiol,, 1997, V. 449.2, P. 291-306.

34,Berridge MJ, Inositol triphosphate and calcium signalling. - Nature, 1993, V, 361, P. 315-325.

35,Berridge M.J,, Irvine R.F. Inositol triphosphate: a novel second messenger in cellular signal transduction, - Nature, 1984, V. 312, P, 315-321,

36,Blaustaein M.P., Ratzlaff R.W., Kendrick N.C., Schweitzer E.S, Calcium buffering in presynaptic nerve terminals I, Evidense for involvement of a non-mitochondrial ATP dependent sequestration mechanism. - J. Gen, Physiol., 1978a, V, 72, P. 15-41,

37,Blaustaein M.P., Ratzlaff R.W., Schweitzer E.S. Calcium buffering in presynaptic nerve terminals II. Kinetic properties of nonmitochondrial sequestrarion mechanism. -J. Gen. Physiol., 1978b, V. 72, P. 43-66.

38,Brorson J.R., Bleakman D., Gibbons S.J., Miller R.J. The properties of intracellular calcium stores in cultured rat cerebellar neurons. - J, Neuroscience, 1991, V, 11, P. 4024-4043.

39,Cohen A.S., Moore K.A., Bangalore R., Jafri M.S., Wemreich D,. Kao J.P.Y. Ca2+-induced Ca release transients evoked by single action potentials in rabbit vagal afferent neurons. - J. Physiol., 1997, V. 499.2, P. 315-328.

40,Coronado R., Morrissette J., Sukhareva M., Vaughan D.M. Structure and function of ryanodine receptors, - Am. J. Physiol,, 1994, V, 266, P. 1485-1504,

41,Cunnan T.C., Smith A.B, Characteristics of trasmitter secretion from individuals sympathetic varicosities. - Br. J. Pharmacol,, 1997, V. 120 (5), P. 769-776.

42,Deamer D.W., Baskin R,J, Ultrastructure of sarcoplasmic reticulum preparations. - J. Cell. Biol., 1969, V. 42, P. 296-307.

43,DiPolo R,, Beauge L. Calcium transport in excitable cells, - In; Intracellular Calcium Regulation (Ed. F. Bronner, Alan R. Liss, Inc.), 1990, P. 381-413.

44,DiPolo R.? Beauge L. Characterizarion of the reverse Na /Ca exchange in squis axons and its modulation by Ca2 , and ATP. - J. Gen. Physiol., 1987, V. 90, P. 505525.

45,DiPolo R., Beauge L. Reverse Na7Ca2+ exchange requires Ca2+ and/or ATP in squid axons. - Biochem. Biophys. Acta, 1986, V, 854, P. 298-306.

46,Dodge F,A. J,R. and Rahaminoff R. Cooperative action of calcium ions in transmitter release. - J. Physiol, 1967, V. 193, P. 419-432.

47,Dudel J. Inhibition of Ca2+ inflow at nerve terminals of frog muscle blocks facilitation while phasic transmitter release is still sonsiderable. - Pflug, Arch,, 1990, V. 415, P. 566-574.

48,Dudel J,, Parnas H,, Parnas I. Evoked phasic release in frog nerve terminal obtained after block of Ca2+ entry by Cd2+. - Pflug. Arch., 1991, V. 419, P. 197-204.

49,Dunlap K., Luebke J.L., Turner T.J. Exocitotic Ca channels in mammalian central neurons, - Trends Neurosci,, 1995, V, 18, P. 89-98,

50,Fisher S.A,, Fischer T,M,, Carew T.J, Multiple overlapping processes underlying short-term synaptic enhancement. - Trends Neurosci., 1997, V, 20, P. 170-177,

51,Fisher T,E., Bourque C,W, Calcium-channel subtypes in the somata and axon terminals of magnocellular neurosecretory cells, - Trends Neurosci,, 1996, V, 19 (10), P. 440-444.

52,Forman S.A,, Righi D.L., Miller K,W, Ethanol increases agonist affinity for nicotinic receptors from Torpedo. - Biochim, Biophys. Acta, 1989, V. 987 (1), P. 95-103.

53,Fredholm B.B, Adenosine actions and adenosine receptors after 1 week treatment with caffeine. - Acta Physiol. Scand,, 1982, V. 115, P. 283-286.

54,Fredholm B.B. Adenosine, adenosine receptors and the actions of caffeine. -Pharmacol, Toxicol,, 1995, V, 76, P, 93-101.

55,Fredholm B.B, Are methylxantine effects due to antagonism of endogenous adenosine? - Trends Pharmacol,, 1980, V. 1, P. 129-132.

56,Fujimoto S., Yamamoto Y., Kuba K., Morita K., Kato E, Calcium localization in sympathetic ganglion of the bullfrog and effects of caffeine, - Brain, Res,, 1980, V, 202, P. 21-32.

57,Furman I., Rahamimoff H, The expression of rat brain synaptic plasma membrane Na7Ca2+ exchange activity in Xenopus oocytes, - Brain Res., 1990, V. 532, P. 41-46.

58,Gage P.W,, McBurney R.N., Schneider G.T, Effects of some aliphatic alcohols on the conductance change by a quantum of acetylcholine at the toad end-plate, - J, Physiol. (Lond.), 1975, V, 244 (2), P. 409-429,

59,Gallagher J,P„ Shinniek-Gallagher P., Cole A.E,, Griffith W.H., Williams B.J, -Current hypotheses for the slow inhibitory postsynaptic potential in sympathetic ganglia. - Fed. Proc., 1980, V. 39 (12), P. 3009-3015.

60,Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Belan P,V., Petersen O.H. Inositol triphosphate and cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca2 from single isolated pancreatic zymogen granules. - Cell, 1996, V. 84, P. 473-480.

61,Gundersen K, Spontaneous activity at long-term silenced synapses in rat muscle, - J. Physiol, (Lond.), 1990, V. 430, P. 399-418,

62,Heizmann C.W., Hunziker W. Intracellular calcium binding molecules, - In; Intracellular Calcium Regulation (Ed, F, Bronner, Alan R, Liss, Inc,), 1990, P. 211248.

63,Henkart M. Identification and function of intracellular calcium stores in axons and cell bodies of neurons, - Federation Proc,, 1980, V, 39, P, 2783-2789,

64,Henkart M.P., Reese T.S,, Brinley F.J, Endoplasmic reticulum sequesters calcium in the squid giant axon. - Science, 1978, V, 202, P, 1300-1302.

65,Henzi V., MacDermott A.B. Characteristics and function of Ca and inositol 1,4,5-triphosphate-releasable stores of Ca2+ in neurons. - Neuroscience, 1992, V. 46, P. 251274.

66,Herbette L., Defoor P,, Fleischer S,, Pascolini D., Scarpa A., Blasie J,K, The separate profile structures of the functional calcium pump protein and the phospholipid bilaeyer within isolated sarcoplasmic reticulum membranes determined by H-ray and neutron diffraction, - Biochem, Biophys, Acta, 1985, V, 817, P. 103-122,

67,Hernandez-Cruz A,, Diaz-Munoz M., Gomez-Chavarin M,, Canedo-Merino R,, Protti D.A,, Escobar A.L., Sierralta J., Suarez-Isla B.A, Properties of the ryanodine-sensitive

release channels that underlie caffeine-induced Ca2+ mobilization from intracellular stores in mammalian sympathetic neurons, - Eur. J, Neurosci., 1995, V. 7, P. 16841699.

68,Heuser J.E., Reese T.S. Evidence for recycling of synaptic vesicles membrane during transmitter release. -1 Cell. Biol., 1974, V, 57, P. 315-344.

69,Hofmann W.W. Caffeine effects on transmitter depletion and mobilization at motor nerve terminals, - Am. J. Physiol,, 1969, V. 216, P. 621-627.

70,Holtzman S.G., Mante S,, Minneman K.P. Role of adenosine receptor in caffeine tolerance, - J. Pharmacol, Exp. Therap,, 1991, V. 256, P. 62-68.

71,Horrigan F.T., Bookman R.J. Relesable pools and the kinetics of exocytosis in adrenal chromaffin cells. - Neuron, 1994, V, 13 (5), P. 119-1129.

72,Hwang P.M., Bredt D.S,, Snyder S.H, Autographic imaging of phospholinositide turnover in brain, - Science, 1990, V, 249, P, 802-804,

___

73Inesi G., Sagara Y. Specific inhibitors of intracellular Ca transport ATPases. J. Membr. Biol., 1994, V. 141, P. 1-6.

74Irving A.J., Collingridge G.L., Schofield J.G. Interactions between Ca2+ mobilizing mechanisms in cultured rat cerebellar granule cells. - J. Physiol., 1992, V, 456, P, 667680.

75,Jensen A.M., Chiu S,Y, Fluorescent measurement of changes in intracellular calcium induced by excitatory amino acids in cultured cortical astrocytes. - J. Neurosci,, 1990, V. 10, P. 1165-1175.

76,Kamiya H., Zucker R.S. Residual Ca and short-term cynaptic plasticity. - Nature, 1994, V. 371, P. 603-606.

77,Kano M, Garaschuk O,, Verkhratsky A,, Konnerth A, Ryanodine receptor-mediated intracellular calcium release in rat cerebellar Purkinje neurones. - J. Physiology, 1995, V. 487.1, P. 1-16.

78,Karadsheh N,, Kussie P., Linthicum D.S. Inhibition of acetylcholinesterase by caffeine, anabasine, methyl pyrrolidine and their derivatives. - Toxic. Lett,, 1991, V, 55, P. 335-342.

79,Kasai H,, Petersen O.H, Spatial dynamics of second messengers; IP3 and cAMP as long-range and associative messengers, - TINS, 1994, V, 17 (3), P. 95-101.

80.Kasai K. Comparative biology of Ca -dependent exocytosis: implications of kinetic diversity for secretory function, - TINS, 1999, V. 22 (2), P. 88-93,

Sl.Katz B., Miledi K, Further study of the role of calcium in synaptic transmission. - J. Physiol,, 1970, V, 207, N 3, P. 789-801.

82,Katz B., Miledi R. The binding of acetylcholine to receptors and its removal from the synaptic cleft. - J. Physiol, (Lond.), 1973, V. 231 (3), P, 549-574.

83,Katz B,, Miledi R, The effect of calcium on acetylcholine release from motor nerve terminals. - Proc. R. Soc„ 1965, V. 161, P. 495-503.

84,Katz B,, Miledi R. The role of calcium in neuromuscular fasilitation. - J, Physiol., 1968, V. 195, P. 481-492.

85,Katz B., Miledi R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission, -J. Physiol,, 1967, V. 189, P, 535-544.

86,Kawai T,, Watanabe M, Effects of ryanodine on spike afterhyperpolarization in sympathetic neurons of the rat superior cervical ganglion. - Pflugers Arch., 1989, V. 413, P. 470-475.

87,Knot H.J., Standen N.B,, Nelson M.T. Ryanodine receptors regulate arterial diameter and wall [Ca2 ] in cerebral arteries of rat via Ca2+-dependent K+ channels. - J. Physiol., 1998, V. 508.1, P. 211-221.

88,Konnerth A,, Dreessen J., Augustine G.J, Brief dendritic calcium signals initiate long-lasting synaptic depression in cerebellar Purkinje cells. - Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1992, V, 89, P. 7051-7055,

89,Kostyuk P.G., Krishtal O.A., Doroshenko P,A. Calcium currents in snail neurones. I, Identification of calcium current, - Pflugers Arch., 1974a, V. 348 (2), P, 83-93,

90,Kostyuk P.G., Krishtal O.A., Doroshenko P.A. Calcium currents in snail neurones. II. The effect of external calcium concentration on the calcium inward current, - Pflugers Arch,, 1974b, V, 348 (2), P. 95-104,

91,Kostyuk P.G., Mironov S.C., Tepikin A.V., Belan P.V. Cytoplasmic free Ca2+ in isolated snail neurons as revealed by fluorescent probe fura-2: mechanisms of Ca2+ recovery after Ca2+ load and Ca2+ release from intracellular stores. - J. Membr. Biol., 1989, V. 110, P. 11-18.

92,Kuba K. Ca -induced Ca release in neurones. - Jap. J. Physiol., 1994, V. 44, P. 613650.

93,Kuba K. Release of calcium ions linked to the activation of potassium conductance in caffeine treated sympathetic neurons, - J. Physiol., 1980, V. 298, P. 251-259,

94.Kuba K., Nishi S. Rhythmic hyperpolarizations and depolarization of sympathetic ganglion cells induced by caffeine,- J. Neurophysiol,, 1976, V, 39, P, 547-563,

95,Lee H.C, Cyclic ADP-ribose: a mediator of a calcium signaling pathway, - In; Ryanodine receptors, CRC Series on Pharmacology and Toxicology (ed. V.Sorrentino. Boca Raton, FL.; CRC), 1995, P. 31-50.

96.Lee H.C, Mechanisms of calcium signalling by cyclic ADP-ribose and NAADP, -Physiol. Rev,, 1997, V. 77, P. 1133-1164.

97,Linder T.M., Pennefather P,, Quastel D,M, The time course of miniature endplate cwrents and its modification by receptor blockade and ethanol, - J, Gen. Physiol., 1984, V. 83 (3), P. 435-468,

98,Lipscombe D,, Madison D.V., Poenie M,, Reuter H,, Tsien R.W., Tsien R.Y, Imaging of cytosolic Ca2+ transients arising from Ca2+ stores and Ca2+ channels in sympathetic neurons. - Neuron, 1988a, V. 1, P. 355-365.

99.Lipscombe D,, Madison D.V., Poenie M., Reuter H,, Tsien R.W., Tsien R.Y, Spatial distribution of calcium channels and cytosolic calcium transients in growth cones and cell bodies of sympathetic neurons. - Proc, natn, Acad, Sci. U.S.A., 1988b, V, 85, P, 2398-2402.

100.Litton J., Nigam S,K, Intracellular calcium; molecules and pools, - Curr. Biol, 1992, V. 4, P. 220-226.

101.Llinas R.R., Sugimori M., Silver R,B, Microdomains of high calcium concentration in presynaptic terminal, - Science Wash, DC, 1992, V, 256, P. 677-679.

102,Lupa M.T,, Tabti N, Facilitation, augmentation and potentiation of transmitter release at frog neuromuscular junctions poisoned with botulinum toxin, - Pflugers Arch., 1986a, V, 406, P. 636-640,

103,Lupa M.T., Tabti N,, Thesleff S,, Vyskocil F,, Yu S,-P, The nature and origin of calcium-insensitive miniature end-plate potentials at rodent neuromuscular junctions, -J. Physiol (Lond,), 1986b, V, 381, P. 607-618.

104. Maeno T., Enomoto K, Kinetic analysis of transmitter release in neuromuscular transmission, - Adv, Biophys,, 1988, V, 24, P, 93-122.

105,Maeno T,, Shibuya Y, Effects of 2-(4-phenylpiperidino)cyclohexanol (AH5183) and barium ions on frog neuromuscular transmission, - J, Physiol,, 1988, V. 401, P, 671685.

106,Magleby K.L. The effects of tetanic and post-tetanic potentiation on facilitation of transmitter release at frog neuromuscular junction, - J, Physiol,, 1973, V, 294, N 2, P, 353-371.

107,Magleby K.L., Zengel J.E, A quantitative description of tetanic and post-tetanic release at the frog neuromuscular junction, - J, Physiol., 1975, V. 245, P. 183-208.

108,Magleby K.L,, Zengel J.E, Long term changes in augmentation potentiation and depression of transmitter release as a function of repeated activity at the frog neuromuscular junction, - J. Physiol,, 1976, V, 257, P, 471-494,

109,Martinez-Serrano A., Satrustegui J. Caffeine-sensitive calcium stores in presynaptic nerve endings; a physiological role, - Biochem, and Biophys, Research Communications, 1989, V. 161, No, 3., P, 965-971.

HO.Martonosi A. Mechanisms of Ca release from sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. - Physiol. Rev,, 1984, V, 64, P. 1240-1320,

111.Mathers D.A,, Baker J,C. Spontaneous hyperpolarizations at the membrane of cultured mouse dorsal root ganglion cell, - Brain Res,, 1981, V, 211, P. 451-455,

112.McGraw C,F,, Somlyo A.U., Blaustaein M,P, Localization of calcium in presynaptic nerve terminals, - J, Cell. Biol., 1980, V, 85, P, 228-241.

113.Means A, R,, Tash J,S,, Chagoulecs J.G. Physiological implications of the presence, distribution and regulation of calmodulin in eukaryotic cells, - Physiol, Rev,, 1982, V. 62, P. 1-39.

114.Meldolezi J., Huttner W.B., Tsien R.Y, Pozzan T. Free cytoplasmic Ca2 and neurotransmitter release; studies on PC12 cells and synaptosomes exposed to a-latrotoxin. - Proceed, of National Academy of Sci, U,S,A„ 1984, V, 81, P, 620-624,

115.Melzer W., Herrmann-Frank A., Liittgau H.Ch. The role of Ca2+ ions in excitation-contraction coupling of skeletal muscle fibres, - Biochimica et Biophysica Acta, 1995, ¥. 1241, P. 56-116.

116.Miller R.J. The control of neuronal Ca2+ homeostasis. - Progress in Neurobiol., 1991, V. 37, P. 255-285.

117.Mironov S.L, Hermann A. Ethanol actions on the mechanisms of Ca2+ mobilization in rat hippocampal cells are mediated by protein kinase C. - Brain Research, 1996, V. 714, P. 27-37.

118.Mironov S.L. Mechanisms of Ca mobilization in chick sensory neurons. -NeuroReport, 1994, V. 5, P. 445-448.

119.Mironov S.L., Usachev Y.M, Caffeine affects Ca uptake and Ca release from intracellular stores, - Neurosci Lett., 1991, V, 123, P, 200-202,

120.Molgo J., Cornelia J.X., Angaut-petit D,, Pecot-Dechavassine M,, Tabti N,, Faille L,, Mallart A., Thesleff S. Presynaptic actions of botulinal neurotoxins at vertebrate neuromuscular junctions, - J. Physiol, (Paris), 1990, V, 84, P. 152-166.

121.Mosier D,R,, Zengel J,E. Evoked transmitter release at the frog neuromuscular junction in the presence of very low extracellular Ca2+. - Neurosci.Lett., 1994, V. 174, P. 1-4.

122.Murphy S.N., Miller R.J. Two distinct quisqualate receptors regulate Ca2 homeostasis in hippocampal neurons in vitro, - Molec. Pharmacol,, 1989, V, 35, P, 671-680.

123.Neher E., Zucker P.S. Multiple calcium-dependent processes related to secretion in bovine chromaffin cells, - Neuron, 1993, V, 10, P. 21-30.

124.Nishimura M, Factors influencing an increase in spontaneous neurotransmitter release by hypoxia at the mouse neuromuscular junction, - J, Physiol,, 1986, V. 372, P, 303-314.

125.Nishimura M,, Tsubaki K,, Yagasaki O,, Ito K. Ryanodine facilitates calcium-dependent release of transmitter at mouse neuromuscular junctions, - Br, J, Pharmacol., 1990, V, 100, P, 114-118,

126,Onodera K. Effect of caffeine on the neuromuscular junction of the frog, and its relation to external calcium concentration. - Jap. J. Physiol., 1973, V, 23, P. 587-597,

127.Parducz A,, Toldi J., Joo F., Siklos L,, Wolff J,R. Transient increase of calcium in pre and postsynaptic organelles of rat superior cervical ganglion after tetanizing stimulation. - Neurosci., 1987, V, 23, P, 1057-1061,

128,Parsons St.M,, Prior Ch,, Marshallt I.G. Acetylcholine transport, storage and release, - kit Rev. of Neurobiol., 1993, V, 35, P, 279-347,

129,Pawson P.A., Grinell A,D, Posttetanic potentiation in strong and weak neuromuscular junctions: physiological differences caused by a differential Ca -influx, - Brain, Res., 1984, V, 323, P, 311-315,

130,Peng Y.-W., Sharp A.M., Snyder S.H., Yau K.-W. Localization of the inositol 1,4,5-triphosphate receptor in synaptic terminals in the vertebrate retina, - Neuron, 1991, V, 6, P. 525-531.

131,Persechini A,, Moncrief N.D., Kretsinger R.H, The EF-hand family of calcium modulated proteins. - Trends Neurosci,, 1989, V, 11, P. 462-467,

132,Pivovarov A.S., Walker R.J, SEPYLRF-AMID modifies acetylcholine-induced currents of Helix aspersa neurons through cyclic ADP-ribose and ryanodine receptors. - Abstracts of XXXIII International Congress of Physiological Sciences, 1997, POM. 19.

133,Pockberger H. Electrophysiological and morphological properties of rat motor cortex neurons in vivo, - Brain Res,, 1991, V, 539 (2), P, 181-190,

134,Pozzan T,, Voipe P., Rizzuto R., Meldolesi J, Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores, - Physiol, Rev,, 1994, V, 74, P. 595-636,

135,Richmond FJ.R,, Armstrong J.B, Fiber architecture and histochemistry in the cat neck muscle, biventer cervicis, - J, Neurophysiol., 1988, V, 60, N 1, P, 46-59,

136,Roed A. Caffeine-induced blockade of neuromuscular transmission and its reversal by dantrolene sodium. - Eur, J, Pharmacol, 1982, V, 83, P. 83-90.

137.Sah P. Ca2+-activated K+ currents in neurons: types, physiological roles and modulation. - Trends in Neurosci., 1996, V. 11, P, 150-154.

138.Satin L.S., Adams P R. Spontaneous minituare outward currents in cultured bullfrog neurons. - Brain. Res,, 1987, V, 401, P. 331-339.

139,Schiller J,, Schiller Y., Stuart G,, Sakmann B, Calcium action potentials restricted to distal apical dendrites of rat neocortical pyramidal neurons, - J. Physiol. (Lond. ), 1997, V. 505 (3), P, 605-616.

140,Sellin L.C., Molgo J,, Tornquist K,, Hansson B,, Thesleff S, On the possible origin of "giant or slow-rising" miniature end-plate potentials at the neuromuscular junction, -Pflugers Arch, - Eur, J, Physiol,, 1996, V, 431, P. 325-334,

141,Seto-Oshima S., Kitajima S., Sano M., Kato K., Mizatuni A, Immunohistochemical localization calmodelin in mouse brain, - Histochem,, 1984, V. 79, P. 251-257.

142,Sharp A.H., McPherson P.S., Dawson T.M., Aoki C„ Campbell K.P., Snyder S.H, Differential immunohistochemical localization of inositol 1,4,5-triphosphate- and ryanodine-sensitive Ca2+ release channels in rat brain. - J. Neurosci., 1993, V. 13, P. 3051-3063.

143.Shimamura K,, Moriyama K,, Sunano S, Caffeine-induced contraction of rat portal vein and effects of K-depolarization, Na-removal and low temperature, - J, Smooth Muscle Res., 1991, V, 27 (2), P. 75-85. 144.Shmigol A,, Verkhratsky A,, Isenberg G, Calcium-induced release in rat semsory

neurons, - J. Physiol., 1995, V. 489, 627-636. 145.Simpson P.B., Challiss R.A.J., Nahorski S.R. Neuronal Ca stores: activation and

function, - Trends Neurosci., 1995, V. 18, P. 299-306, 146,Skok V,I,, Storch N,N,, Nighi S, The effect of caffeine on the neurons of a

mammalian sympathetic ganglion, - Neurosci,, 1978, V, 3, P. 697-708, 147,Smith A.B., Cunnan T.C. Omega-conotoxin GVIA-resistant neurotransmitter release in postganglionic sympathetic nerve terminals. - Neurosci,, 1996b, V, 70 (3), P, 817824.

148,Smith A,B,, Cunnan T.C. Ryanodine-sensitive calcium stores involved in neurotransmitter release from sympathetic nerve terminals of the guinea-pig, - J. Physiol. (Lond,), 1996a, V, 493 (3), P. 657-664. 149.Smith S J., MacDermott A.B., Weight F.F. Detection of intracellular Ca2 transients

in sympathetic neurons using arsenazo III, - Nature, 1983, V, 304, P, 350-352. 150.Sollner T„ Bennett M.K., Whiteheart S.W., Scheller R.H., Rothman J.E. A protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic docking, activation and fusion. - Cell, 1993a, V. 75, P. 409-418, 151.Sollner T,, Whiteheart S,W,, Brunner M,, Erdjument-Bromage H,, Geromanos S,, Tempst P., Rothman J,E. SNAP-receptors, implicated in vesicle targeting and fussion, - Nature, 1993b, V, 362, P, 318-324. 152,Stanley E.F, The calcium channel and the organization of the presynaptic transmitter

release face, - Trends Neurosci,, 1997, V. 20, P. 404-409, 153.Stewart P.S., Maclennan D.H. Surface particles of sarcoplasmic reticulum membranes. - J. Biol, Chem., 1974, V, 249, P. 985-993,

154,Stuenkel E.L. Regulation of intracellular calcium and calcium buffering properties of rat isolated neurohypophysial nerve endings, - J, Physiol, 1994, V, 481,2, P. 251-271,

155.Sumbilla C., Inesi G. Rapid filtration movements of Ca2+ release from cisternal sarcoplasmic reticulum vesicles, - FEBS Lett., 1987, V, 210, P, 31-36,

156.Sutko J.L., Airey J.A. Ryanodine receptor Ca2+ release channels: does deversity in form equal diversity in function? - Physiol. Rew„ 1996, V. 76,1027-1071.

157.Suzuki T., Kasano N, Hyperpolarizing potentials induced by Ca-mediated K-conductance increase in hamster submandibular ganglion cells. - J, Neurobiol,, 1978, V. 9, P. 367-392.

158.Taglialatela M., Canzoniero L.M.T., Cragoe E.J,, Di Renzo G,, Annuziato L, Na+/Ca2+ exchange activity in central nerve endings II. Relationship between pharmacological blokade by amiloride analogues and dopamine release from tubero-infundibular hypothalamic neurons. - Molec. Pharmacol,, 1990a, V, 38, P. 393-400,

159.Taglialatela M., Di Renzo G., Annuziato L. Na+/Ca2+ exchange activity in central nerve endings I. Ionic conditions that discriminaye 45Ca2+ uptake through the exchanger from that occurring through voltage operated Ca2+ channels. - Molec. Pharmacol., 1990b, V, 38, P. 385-392.

160.Tang ¥,, Zucker R,S, Mitochondrial involvement in post-tetanic potentiation of synaptic transmission, - Neuron, 1997, V. 18, P. 483-491.

161.Tareilus E,, Breer H, Presynaptic calcium channels; pharmacology and regulation, -Neurochem. Int., 1995, V. 26 (6), P, 539-558.

162.Tayer S.A., Perney T.M., Miller R.J. Regulation of calcium homeostasis in sensory neurons by bradykinin, - Neuroscience, 1988, V. 8, P, 4089-4097,

163.Thesleff S,, Molgo J. A new type of transmitter release at the neuromuscular junction, - Neuroscience, 1983a, V.9. P. 1-8.

164.Thesleff S,, Molgo J,, Lundh H. Botulinum toxin and 4-aminoquinoline induce a similar abnormal type of spontaneous quantal transmitter release at the rat neuromuscular junction. - Brain Res., 1983b, V. 264, P. 89-97,

165.Tse A.? Tse F.W., Hille B. Modulation of Ca2+-oscillation and apanin-sensitive, activated Kcurrents in rat gonadotropes. - Pflugers Arch., 1995, V. 430 (5). P. 645652.

166.Tsien R.W., Tsien R.Y. Calcium channels, stores and oscillations. - A. Rev. Cell. Biol., 1990, V. 6, P. 715-760.

167.Tsien R,Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. - Nature, 1981, V. 290, P. 527-528.

168.Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and proteins; design, synthesis and properties of prototype structure, -Biochem., 1980, V, 19, P. 2396-2404.

169. Van der Kloot W. The regulation of quantal size, - Progress in Neurobiol., 1991, V, 36, P. 93-130.

170.Van der Kloot W., Andricioaei P., Balezina O.P, Stochastic properties of spontaneous and evoked potentials at the frog and mouse neuromuscular junctions, - J, Biophys., 1999, in press.

171. Van der Kloot W., Molgo J. Facilitation and delayed release at about 0 degree C at the frog neuromuscular junction: effects of calcium chelators, calcium transport inhibitors, and okadaic acid, - J, Neurophysiol,, 1993, V, 69, P. 717-729,

172.Van der Kloot W., Molgo J, Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction, - J, Physiol. Rev., 1994, V, 34, P. 1-105,

173.Wakui M., Potter B,V,L., Petersen O.H. Pulsative intracellular calcium release does not dependent on fluctuations in inositol triphosphate concentration. -Nature, 1989, V. 339, P. 317-320.

174.Walton P.D., Airey J,A„ Sutko J,L„ Beck C.F., Mignery G,A„ Sudhof T.C., Deerinck T.J., Ellisman M.H, Ryanodine and inositol triphosphate receptors coexist in avian cerebellar Purkinje neurons, - J, Cell. Biol., 1991, V, 113, P. 1145-1157,

175.Wier W.G. Cytoplasmic [Ca2+]i in mammalian ventricle: dynamic control by cellular processes. - A, Rev, Physiol., 1990, V, 52, P. 467-488,

176. Wilson D.F, Effects of caffeine on neuromuscular transmission in the rat - Am. X Physiol,, 1973, V, 225, P. 862-865.

177.Wilson D.F, Facilitation of transmitter release at the mammalian neuromuscular junction, - Am. J, PhysioL, 1974, V. 227, P. 1098-1102.

178.Zacchetti D,, Clementi E,, Fasolato C., Lorenzon P,, Zottini M., Grohovaz F,, Fumagalli G., Pozzan T., Meldolesi J. Intracellular Ca2+ pool in PC 12 cells. A unique

rapidly exchanging pool is sensitive to both inositol 1,4,5-triphosphate and caffeine-ryanodine, - J, Biol. Chem., 1991, V. 266, P. 20152-20158.

179,Zorzato F., Fujii J,, Otsu K., Phillips M., Green N.M. et al. Molecular cloning of cDNA encoding human and rabbit forms of Ca2 release channel (ryanodine receptor) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. - J, Biol. Chem,, 1990, V. 265, P. 22442256.

ISO.Zucker P.S. Changes in statistics of transmitter release during facilitation, - J. Physiol,, 1973, V, 229, P, 787-810,