Регуляторный потенциал эмбриональных стадий развития актинии Nematostella vectensis, выявленный в экспериментах по диссоциации-реагрегации клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.05, кандидат наук Кириллова, Анастасия Олеговна

• Кириллова, Анастасия Олеговна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Кириллова, Анастасия Олеговна

Содержание.....................................................................................................2

I. Введение...................................................................................................5

Актуальность проблемы............................................................................5

Научная новизна работы...........................................................................6

Практическая и теоретическая значимость.............................................7

Апробация диссертации............................................................................7

Публикации по теме диссертации............................................................8

Структура и объем диссертации...............................................................8

II. Обзор Литературы..................................................................................9

1. Nematostella vectensis - особенности жизненного цикла, эмбрионального и личиночного развития..........................................................9

1. 1 Бесполое размножение Nematostella.........................................10

1.2 Эмбриональное развитие Nematostella........................................10

2. Осевая организация Nematostella.......................................................13

3. Регион-организатор в развитии Nematostella....................................15

4. Регенерация Nematostella....................................................................17

5. Обзор исследований по диссоциации-реагрегации..........................18

5.1. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток взрослых особей (полипов и медуз)...............................................................................18

5.1.1. Эксперименты по диссоциации - реагрегации клеток колониальных гидроидов...............................................................................19

5.1.2. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток гидроидного полипа Hydra.............................................................................21

5.1.3. Эксперименты по диссоциации - реагрегации клеток

гидромедуз.......................................................................................................22

2

5.1.4. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток Anthozoa и Scyphozoa.....................................................................................23

5.2 Развитие агрегатов эмбриональных клеток книдарий.............25

5.3 Клеточные и молекулярные механизмы, обеспечивающие восстановление плана строения в экспериментах с агрегатами клеток книдарий..........................................................................................................27

5.3.1. Развитие агрегата может зависеть от происхождения составляющих его клеток...............................................................................27

5.3.2. Роль пролиферации клеток, межклеточной адгезии и подвижности клеток в развитии агрегатов Hydra........................................30

5.3.3. «Организатор гипостома» и восстановление плана строения полипа Hydra...................................................................................................32

III. Материалы и методы...........................................................................37

1.Культивирование и индукция гаметогенеза.......................................37

2.Эксперименты по диссоциации эмбрионов и последующей' агрегации их клеток............................................................................................38

3.Микрохирургические манипуляции с эмбрионами...........................38

4. Цейтраферная съёмка живых агрегатов...........................................40

5.Конфокальная микроскопия................................................................40

6. In situ гибридизация..........................................................................42

6. Эксперименты с использованием морфантов ................................46

7. Методы световой' и электронной' микроскопии.............................47

9.Используемые растворы.......................................................................49

IV. Результаты...........................................................................................51

1. Морфологическое развитие агрегатов............................................51

2. Формирование орально-аборальной полярности на молекулярном уровне 54

3. Роль гена brachyury в формировании орально-аборальной полярности ...........................................................................................................55

5. Проспективные потенции разных регионов эмбриона вдоль орально-аборальной оси тела.............................................................................56

6. Сегрегация зародышевых листков и формирование эндодермы. 57

7. Потенции зародышевых листков к развитию и трансдифференцировке......................................................................................58

7. Роль белка Cadherin-3 в развитии агрегатов...................................59

V. Обсуждение...........................................................................................62

1. Формирование орально-аборальной полярности у агрегатов........63

2. Роль Cadherin-3 в развитии агрегатов................................................66

3. Потенции клеток зародышевых листков к развитию и трансдифференцировке......................................................................................67

4. Самоорганизация эмбриональных клеток Nematostella vectensis ... 68

5. Пластичность развития Nematostella.................................................70

VI. Выводы.................................................................................................75

VII. Заключение.........................................................................................77

VIII. Список сокращений и условных обозначений..............................79

IX. Список Литературы............................................................................81

Приложение 1. Таблицы........................................................................100

Приложение 2. Рисунки.........................................................................102

I. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляторный потенциал эмбриональных стадий развития актинии Nematostella vectensis, выявленный в экспериментах по диссоциации-реагрегации клеток»

Актуальность проблемы.

Вопрос о реализации спектра проспективных потенций эмбриональными клетками является одним из фундаментальных в биологии развития. Изучение этой проблемы позволяет лучше понять общие закономерности эмбриогенеза, а также выявить "скрытые" механимы регуляции развития.

Метод диссоциации-реагрегации [Wilson, 1907; 1911] позволяет оценить регуляторный потенциал эмбрионов в условиях, когда первичный план строения полностью разрушен и формируется заново. Особый интерес представляет вопрос о том, сохраняют ли отдельные клетки информацию о своём изначальном положении в организме или они способны изменить свою судьбу под действием регионов-организаторов.

Nematostella vectensis - представитель типа книдарий, сестринской группы билатерально симметричных животных. Этот вид является модельным объектом биологии развития. N. vectensis легко культивируется в лаборатории [Fritzenwanker, Technau, 2002], её геном полностью отсеквенирован, многочисленные работы посвящены молекулярным и морфогенетическим аспектам её развития [Finnerty et al.2004; Fritzenwanker et al. 2004; Extavour et al. 2005; Kusserow et al. 2005; Torras, Gonzales-Crespo, 2005; Kraus, Technau, 2006; Saina et al., Layden et al.2016]. Несмотря на то, что для эмбрионов Nematostella была выявлена высокая способность к регуляции развития [Fritzenwanker et al., 2002], спектр проспективных потенций отдельных клеток эмбрионов все еще остается неисследованным.

Исследование регуляторного потенциала на модельном виде книдарий имеет большой интерес для эволюционной биологии развития,

5

так как позволяет глубже понять механизмы регуляции развития низших многоклеточных животных, а также способен пролить свет на раннюю эволюцию эмбрионального развития.

1. Цель и задачи работы

Цель диссертационной работы - охарактеризовать регуляторный потенциал эмбриональных клеток актинии Nematostella vectensis с помощью экспериментов по диссоциации-реагрегации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить морфогенетические процессы, обеспечивающие регуляцию развития агрегированных эмбриональных клеток N.

vectensis;

2. Сравнить развитие агрегатов N. vectensis с нормальным развитием этого вида и с развитием других представителей типа стрекающих;

3. Выявить молекулярные механизмы формирования полярности в агрегатах;

4. Изучить проспективные потенции разных регионов эмбриона, расположенных вдоль орально-аборальной оси тела в экспериментах по диссоциации-реагрегации;

5. Изучить проспективные потенции клеток двух зародышевых листков в экспериментах по диссоциации-реагрегации;

Научная новизна работы.

Впервые показана способность агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis к восстановлению первичного плана строения и формированию зародышевых листков. С помощью методов иммуноцитохимии, конфокальной микроскопии, электронной

микроскопии и тайм-лэпс видеосъемки было подробно изучено развитие агрегатов на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях. Были выявлены морфогенезы и основные сигнальные пути, вовлеченные в формирование орально-аборальной полярности de novo. Благодаря использованию трансгенных линий, в развивающемся агрегате удалось проследить за судьбой эндодермальных клеток, а также впервые на молекулярном уровне показать способность эктодермальных клеток к трансдифференцировке в клетки эндодермы. Был проведён сравнительный анализ развития агрегатов N. vectensis и нормального эмбриогенеза этого вида и других представителей книдарий.

Практическая и теоретическая значимость.

Агрегаты N. vectensis являются удобной моделью для изучения регуляторного потенциала эмбриональных клеток. В ходе диссоциации эмбрионов разметка тела полностью ''сбрасывается'' и ее формирование начинается de novo. Это позволяет в полной мере описать спектр проспективных потенций клеток эмбрионов. Исследование альтернативных морфогенезов, вовлеченных в развитие агрегатов, и сравнение их с нормальным развитием этого и других видов книдарий, помогает лучше понять эволюцию эмбрионального развития многоклеточных животных.

Предложенная модель агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis может быть в дальнейшем использована для исследования спектра проспективных потенций эмбриональных клеток. Полученные в диссертационной работе результаты могут быть использованы в рамках лекций по эмбриологии в высших учебных заведениях.

Апробация диссертации.

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на следующих научных мероприятиях:

1. Summer School in Evolutionary Developmental Biology. Conceptual and Methodological Foundations, 3rd Edition. From Gene Networks to Organismal Systems (Венеция, Италия, 2327 сентября, 2013г)

2. The fifth meeting of the European Society for Evolutionary Developmental Biology (Вена, Австрия, 22-25 июля, 2014 г.)

3. OIST Winter Course "Evolution of Complex Systems" (Онна-Сон, Окинава, Япония, 8-12 декабря, 2014г.)

4. EMBO Practical Course: Multi-level Modelling of Morphogenesis (Норидж, Великобритания, 12-24 июля, 2015г.)

5. EMBO Practical Course: 3D developmental imaging (Оэйраш, Португалия, 1-9 июля, 2016 г.)

Публикации по теме диссертации.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 статьи в изданиях из Перечня ВАК РФ, и 3 статьи - в материалах международных конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы, включающего 160 наименования. Работа изложена на 117 страницах, содержит 18 рисунков и 2 таблицы.

II. Обзор Литературы

1. Nematostella vectensis - особенности жизненного цикла, эмбрионального и личиночного развития.

Nematostella vectensis (отряд Actinaria, класс Anthozoa) относится к типу ^idaria (стрекающие), являющийся сестринским по отношению к Bilateria [Technau, Steele, 2011; Dunn et al., 2014; Zapata et al., 201З] (Рисунок 1). Вместе с Porifera, Ctenophora и Placozoa он входит в группу низших многоклеточных животных. Книдарии имеют всего два зародышевых листка (экто- и эндодерму), разделенные межклеточным веществом -мезоглеей. В типе Cnidaria сейчас выделяют пять классов: Anthozoa, Hydrozoa, Scyphozoa, Staurozoa и Cubozoa [Collins et al., 2006]. Представители класса Anthozoa имеют только одну жизненную форму -полипа, в то время как у представителей других классов в жизненном цикле присутствует еще и форма медузы.

Nematostella vectensis является одним из наиболее изученных видов в типе книдарий. Этот вид легко культивируется в лаборатории [Fritzenwanker, Technau, 2002], и его геном полностью отсеквенирован [Finnerty et al. 2004; Fritzenwanker et al. 2004; Extavour et al. 200З; Kusserow et al. 200З; Torras, Gonzales-Crespo, 200З; Kraus, Technau, 2006; Fritzenwanker et al. 2007; Saina et al., Layden et al.2016]. Оказалось, что у генома Nematostella больше сходства с геномом человека, чем с геномами других беспозвоночных: модельными объектами Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans [Sullivan, et al. 2006. цит. по Reitzel 2012]. Помимо геномных исследований, множество работ посвящено изучению онтогенеза N. vectensis. Онтогенез этой актинии можно исследовать в трёх разных направлениях: различные типы бесполого размножения, эмбриональное и личиночное развитие, и регенерация.

1.1 Бесполое размножение Nematostella

Бесполое размножение N. vectensis происходит путём формирования перетяжки [Hand, Uhlinger 1995, цит. по Darling, 2005]. Чаще всего происходит поперечное разделение туловища полипа. Полип перешнуровывается, отделяясь от дистальной части ноги и через несколько дней аборальный фрагмент регенерирует недостающий гипостом. Реже наблюдается формирование нового гипостома вместо ноги с реверсией орально-аборальной полярности. В этом случае центральная часть тела удлиняется, а новая нога формируется посередине тела между двух гипостомов. Кольцевая перетяжка в области новой сформировавшейся ноги разделяет особь на два обособленных полипа.

1.2 Эмбриональное развитие Nematostella

Полипы Nematostella - раздельнополые животные. Взрослые особи, и самки, и самцы, имеют 8 мезентериев - складок гастродермы, и гаметогенез происходит непосредственно в них. Самки Nematostella через ротовое отверстие выбрасывают слизистые шнуры, содержащие яйцеклетки.

В целом, ранний эмбриогенез Nematostella vectensis отличается большой вариабельностью. Например, различно расположение бластомеров относительно друг друга после первых делений дробления; первый цитокинез может завершиться уже после первого деления ядер, но нередки случаи, когда цитотомия происходит только после второго или третьего кариокинеза, а также в результате дробления образуются бластомеры разной величины.

Начиная со стадии 16 клеток, начинается эпителизация, и между клетками появляются точечные адгезионные контакты [Fritzenwanker et al., 2007]. На стадии бластулы наблюдаются субапикальные адгезионные

контакты. Апико-базальная протяженность этих контактов уменьшается в клетках презумптивной эндодермы, вовлеченных в инвагинационные процессы [Kraus, Technau, 2006; Magie et al., 2007]. На ранних стадиях эмбриогенеза у Nematostella нет септальных контактов [Magie et al., 2007], щелевые контакты тоже не были обнаружены [Mackie et al., 1984 цит. по Magie, 2008]. К тому же, у Nematostella отсутствуют гены коннексина и паннексина, белков, входящих в состав щелевых контактов. Интегрины, найденные у всех многоклеточных животных, позволяют клетке взаимодействовать с внеклеточным матриксом. Они существуют в виде гетеродимеров и состоят из альфа и бета субъединиц. У Nematostella есть как минимум 2 альфа и 5 бета субъединиц, хотя количество существующих гетеродимеров у данного вида не известно [Magie, 2008].

Через 6-10 часов после оплодотворения у Nematostella образуется целобластула. Затем на стадии 7-12 часов развития поверхность эмбриона проходит 4-5 циклов впячиваний и выпячиваний, строго сопряженных с клеточными циклами. Экспериментальные данные показали, что зона впячивания совпадает с анимальным полюсом зиготы и соответствует зоне формирования бластопора, а, следовательно, и оральному полюсу полипа [Fritzenwanker et al., 2007]. После 12 цитокинеза пульсации прекращаются, деления клеток становятся асинхронными, и в результате формируется округлая прегаструла. Гаструляция начинается через 18-20 часов после оплодотворения, а хорошо сформированный бластопор можно наблюдать через 21-23 часа (Рисунок 2 В). Обычно инвагинация происходит только в одной зоне эмбриона, хотя изредка возможно наличие одного или двух зачаточных очагов инвагинации [Fritzenwanker et al., 2007]. Гаструляция начинается с формирования преэндодермальной пластинки, содержащей клетки презумптивной эндодермы. Эти клетки начинают эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП): они приобретают колбовидную форму, формируя ламеллоподии и филоподии на своем базальном конце; ядра

мигрируют из апикальной в базальную часть клетки, и площадь субапикальных контактов уменьшается. Показано, что ген snail, консервативный регулятор ЭМП, экспрессируется в клетках преэндодермальной пластинки N. vectensis. [Fritzenwanker et. al. 2004]. Клетки бластодермы, находящиеся вокруг преэндодермальной пластинки, формируют губу бластопора, а сам бластопор формируется при инвагинации преэндодермальной пластинки. Преэндодермальная пластинка никогда не имеет правильной округлой формы, и форма бластопора очень изменчива. Существует две точки зрения на дальнейшую судьбу клеток преэндодермальной пластинки Nematostella. Исследования Краус и Технау показали, что после инвагинации клетки преэндодермальной пластинки завершают ЭМП, ослабляя контакт с внутренним краем губы бластопора [Kraus, Technau, 2006]. Согласно этим авторам, преэндодермальная погружается внутрь пассивно, выталкиваясь в глубину бластоцеля заворачивающейся внутрь губой бластопора. Через 12 часов после начала гаструляции все клетки завершают ЭМП, и бластопор замыкается. Маги с соавторами полагают, что гаструляция протекает только посредством инвагинации, и ЭМП клеток преэндодермальной пластинки не доходит до конца [Magie et al., 2007]. Основным механизмом инвагинации они считают подтягивание преэндодермальной пластинки к аборальному полюсу при помощи базальных филоподий колбовидных клеток. Не исключено, что у Nematostella vectensis гаструляция обладает внутривидовой изменчивостью.

В течение следующих 12 часов эмбрион превращается в планулу (Рисунок 2 Г). Личинка обладает антеропостериорной осью, теменным султанчиком и глоткой. Глотка планулы формируется из материала губы бластопора и эндодермы, образовавшейся в результате инвагинации. Начало метаморфоза определяется реорганизацией эндодермы планулы, что приводит к появлению мезентериев. Затем в оральной области

зародыша образуются четыре щупальцевых почки, в гастральной полости формируются радиальные мезентеральные камеры, редуцируется теменной султанчик. Личинка приобретает способность к мышечному сокращению, прекращает плавать и оседает на субстрат. Метаморфоз завершается к 5-10 дню после оплодотворения и приводит к формированию первичного полипа (Рисунок 2 Д) [Fritzenwanker, Technau, 2002].

2. Осевая организация Nematostella

В отличие от представителей других классов книдарий, у Anthozoa есть две оси тела: первичная или орально-аборальная и вторичная или направительная ось тела. Направительная ось распологается ортогонально по отношению к первичной и характеризуется ассиметричным расположению мышц ретракторов в мезентериях и щелевидной в разрезе формой глотки. За разметку направительной оси отвечает BMP каскад совместно с антагонистом Chordin [Saina et.al 2009].

Тема данной диссертационной работы посвящена формированию орально-аборальной оси тела агрегатов Nematostella vectensis, поэтому рассмотрим более подробно ее формирование в нормальном развитии.

Уже яйцеклетки Nematostella vectensis отличаются чётко выраженной первичной полярностью: базофильные гранулы расположены в основном у анимального полюса яйцеклетки, а желточные пластинки - на противоположном (вегетативном) полюсе. Женский пронуклеус, находясь вблизи мембраны, также маркирует анимальный полюс. На этом же полюсе инициируются две первых борозды делений дробления [Fritzenwanker et al., 2007].

На стадии 8-16 бластомеров чётко выраженная морфологическая полярность клеток отсутствует: ядра находятся в центре, а желток в субкортикальном слое бластомеров. На стадии бластулы клетки приобретают апикобазальную (эпителиальную) полярность: ядра перемещаются к апикальному полюсу, а желток - к базальному.

В онтогенезе Nematostella сохраняется чёткая преемственность между первичной полярностью яйцеклетки, полярностью гаструлы, антеропостериорной осью личинки и орально-аборальной осью взрослого организма. Экспериментальные данные с мечением разных областей ооцита стеклянными капиллярами показали, что полюс первичной полярности яйцеклетки совпадает с зоной формирования бластопора, задним полюсом планулы и с оральным полюсом полипа [Fritzenwanker et al., 2002].

Полюса эмбриона можно различить с помощью генетических маркёров. Локальные различия в распределении материнских детерминантов хорошо выражены ещё в ооците. Например, наблюдается градиент белка Dishevelled, концентрация которого максимальна на анимальном полюсе [Lee et al., 2007]. На более поздних стадиях эмбриогенеза ген nanos маркирует аборальную часть зародыша, а vasa -оральную [Extavour et al., 2005; Torras, Gonzales-Crespo, 2005]. Также у Nematostella vectensis имеется 13 Wnt-генов, паттерны экспрессии которых, начиная со стадии предгаструлы, локализуются вдоль орально-аборальной оси [Kusserow et al. 2005; Lee et.al. 2006]. О важной роли Wnt- каскада говорят и экспериментальные данные: при гиперактивации этого сигнального пути формируется эктопический оральный полюс [Trevino et al. 2011].

Экспериментальные данные показали, что при разрезании гаструлы пополам, только та половинка, которая содержит бластопор, способна развиться в нормальную личинку, а вторая половинка образует только

покрытую ресничками эпителиальную сферу (Рисунок 3) [Fritzenwanker et а1., 2007]. Таким образом, спектр проспективных потенций оральной области эмбриона Nematostella значительно шире, чем аборальной. Результаты этих опытов позволили предположить, что регион-организатор у эмбрионов N. \ectensis локализуется в области бластопора.

3. Регион-организатор в развитии Nematostella

Организатором считается та область эмбриона, индукционная активность которой необходима для формирования плана строения, в том числе для корректного формирования полярности эмбриона [De Robertis et al., 2000]. Как правило, регионы - организаторы определяются по способности их фрагментов индуцировать образование эктопического осевого комплекса при пересадке другим зародышам. Исследования регионов-организаторов начались со ставшей классической работы Шпемана и Мангольд, выявившей способность дорзальной губы бластопора амфибий индуцировать второй осевой комплекс [Spemann, Mangold, 1924]. Исследование регионов-организаторов других позвоночных животных показали, что зародышевый щиток рыб, дорзальная губа бластопора амфибий и рептилий, гензеновский узелок птиц и узелок млекопитающих формируются вследствие аналогичных морфогенезов во время гаструляции, имеют сходный паттерн экспрессии генов и играют ключевую роль в формировании комплекса осевых структур [Smith, Schoenwolf, 1998]. Таким образом, можно утверждать, что организаторы всех позвоночных животных гомологичны.

Регионы - организаторы так же были выявлены и у беспозвоночных

животных (Таблица 1). Так, оскулум губок обладает индукционной

способностью [Windsor, Leys, 2010]. У представителей надтипа Spiralia

15

такой способностью обладает D -квадрант [Martindale, 1986; Henry, Martindale, 1987; Lambert, Nagy, 2001; Lambert, Nagy, 2003; Nakamoto et.al 2010]. Вторичная ось формируется при пересадке центральных клеток бластопора мечехвоста и клеток кумулюса паука [Itow et al. 1991; Holm, 1952]. У морского ежа Strongylocentrotus пересаженные вегетативные микромеры способны индуцировать формирование эктопической первичной кишки [McClay et al., 2000].

В отличие от большинства других животных, регионы-организаторы активны у книдарий не только в период эмбриогенеза, но также на стадии личинки и во взрослом состоянии. Так, с помощью трансплантационных экспериментов показано, что у представителей класса Hydrozoa регионами-организаторами являются задний кончик тела личинки -планулы и ротовой конус (гипостом) взрослых полипов: пересадка этих частей тела стимулирует формирование дополнительных осей тела у реципиента [Browne, 1909; Stumpf et al., 2010; Краус, 2011; Mayorova et al., 2015].

У Nematostella vectensis только заворачивающийся внутрь участок клеточного пласта, примыкающий к будущим эндодермальным клеткам, т.е. губа бластопора, способен индуцировать образование второй оси [Kraus et al., 2007]. У таких зародышей образуется вторая глотка и дополнительные мезентерии. Для регионов-организаторов хордовых характерна экспрессия целого ряда генов, продукты которых являются компонентами разнообразных сигнальных путей, в особенности BMP и Wnt [DeRobertis et al., 2000]. Было показано, что при индукции вторичной оси Nematostella vectensis ключевую роль играют компоненты сигнального пути Wnt (wnt1 и wnt3), экспрессирующиеся в эктодерме вокруг бластопора гаструлы. При инъекции плазмиды с одним из этих генов с промотором EF1a в бластомер эмбриона на стадии 8-16 клеток, происходила индукция неполной вторичной оси. Полная индукция

достигалась при одновременной инъекции wnt1 и wnt3. Несмотря на то, что у Nematostella, как и у хордовых на стадии гаструлы экспрессируются bmp и chd, гиперэкспрессия этих генов не приводит к индукции эктопической оси [Kraus et.al. 2016].

4. Регенерация Nematostella

Все представители книдарий обладают удивительной способностью к регенерации и регуляции плана строения [Trembley, 1744; Bode P., Bode H., 1984; Dubuc et al., 2014; Bradshaw et al., 2015]. Предполагают, что эта особенность основана на уникальной способности клеток книдарий к трансдифференцировке и на действии сигнальных центров - регионов-организаторов [Holstein et al., 2003].

Особи Nematostella способны к восстановлению недостающих частей тела при разрезании пополам: оральная половина образует новую ногу, а аборальная регенерирует новый гипостом [Darling, 2005]. Регенерация гипостома проходит в несколько этапов. Сначала мезентерии сливаются друг с другом и соприкасаются с местом ампутации. На этом этапе регенерации большую роль играет высокая транскрипционная активность. Затем появляются щупальцевые почки, а мезентерии опускаются вниз, создавая тем самым пространство для будущей глотки. Сама глотка формируется путем реорганизации уже существующих мезентериев и деления клеток [Amiel et al. 2012]. В отличие от гидры, для N. vectensis для этого процесса нужна клеточная пролиферация [Passamaneck et al. 2012]. Особенно, она важна на более поздних стадиях регенерации во время формирования новой глотки и удлинения щупалец. На протяжении всей регенерации наблюдается высокий уровень апоптоза, клеточной смерти, и,

вероятно, сигнальные молекулы апоптоза запускают механизм пролиферации [DuBuc et al., 2014].

Экспериментальные данные показали, что при гиперактивации сигнального пути Wnt во время регенерации полипа формируется эктопический оральный полюс вместо ноги [Trevino et al., 2011]. Так как схожая картина наблюдается и в экспериментах, проведенных на эмбрионах Nematostella, можно заключить, что Wnt каскад необходим для разметки орально-аборальной оси тела на всех стадиях онтогенеза.

5. Обзор исследований по диссоциации-реагрегации.

Восстановление плана строения из отдельных клеток или небольших кластеров клеток является крайней формой регенерации. Отличительной чертой реагрегации является то, что план строения начинает восстанавливаться практически «с нуля». Это не характерно для обычной регенерации, которая начинается в условиях поврежденной, но не уничтоженной разметки плана строения. В связи с этим, большой интерес представляют эксперименты по восстановлению плана строения в опытах по диссоциации - реагрегации клеток книдарий.

5.1. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток взрослых особей (полипов и медуз)

Первые работы по диссоциации - реагрегации клеток книдарий были выполнены в первой трети XX века на представителях класса Hydrozoa. В этих экспериментах различные участки тела унитарного полипа Hydra, а также колоний гидроидов измельчались механическим путем до состояния небольших фрагментов ткани, групп клеток или отдельных клеток.

Основной целью экспериментов было изучение восстановления плана строения организма и формирования у него полярности de novo.

5.1.1. Эксперименты по диссоциации - реагрегации клеток колониальных гидроидов

В 1911 г. Уилсон разрезал гидранты и фрагменты колоний Pennaria tiarella и Eudendrium carneum на небольшие фрагменты, а затем пропускал их через планктонную сетку. В морской воде диссоциированные на клетки и группы клеток эмбрионы реагрегировали и формировали «клеточные массы» 0.1 - 5 мм диаметром. Через несколько дней некоторые из «клеточных масс» давали начало гидрантам. Уилсон полагал, что в ходе эксперимента клетки проходят через процесс дедиференцировки [Wilson,1911].

Следующая серия экспериментов была проведена в 1928 г. Чайлдом на колониальном гидроиде Corymorpha palma [Child, 1928]. Автор перетирал ткани гидроида с песком, а затем пропускал через тонкое сито, в результате чего получались отдельные клетки и небольшие кластеры клеток (диаметром 30-40 мкм). Суспензию клеток он помещал в пробирку, где клетки оседали на дно и самопроизвольно агрегировали. Сначала агрегаты имели неправильную форму, но постепенно она становилась сферической. Большинство крупных агрегатов (более 1 мм в диаметре) погибали в течение первых 2-3 дней развития. Чайлд объяснял это нарушением у них оптимального соотношения поверхности и объема. Более мелкие агрегаты выживали и продолжали развитие: в последующие 2-4 дня у них формировались экто- и эндодерма, а затем они вытягивались, и из них дифференцировались гидранты.

Интересно, что к реагрегации были способны не все клетки колонии:

19

агрегаты формировались из клеток ценосарка (тела колонии) и из клеток почек гидрантов. В то же время клетки диссоцированных гидрантов погибали через несколько дней, так и не сформировав агрегаты. Чайлд полагал, что формирование экто- и эндодермы и развитие агрегатов в обусловлено не сортировкой клеток, а их де- и редифференцировкой [Child, 1928]. Известно, что гидрант является наиболее дифференцированной и специализированной частью колонии, а время его жизни ограничено -старые гидранты подвергаются аутотомии и регрессии и заменяются новыми гидрантами [Tardent, 1963]. Можно предположить, что клетки гидранта в гораздо меньшей степени, чем клетки ценосарка, способны к редифференцировке, а значит, и к восстановлению плана строения после диссоциации.

В 1937 г. Бидл и Бут [Beadle, Booth, 1937] измельчали ткани колонии гидроида Cordylophora lacustris на небольшие фрагменты (0.1 - 0.2 мм диаметром), а затем давали им агрегировать. В ходе развития у агрегата выделялись внешний слой и внутренняя масса клеток. Объем внутренней массы постепенно уменьшался, и в ней формировались полости нерегулярной формы. Затем у агрегатов дифференцировались экто- и эндодерма, формировались щупальца и гипостомы. Интересно, что из одного агрегата могло сформироваться до пяти сросшихся гидрантов, взаимная ориентация которых была произвольной. При совместной агрегации фрагментов колоний двух видов гидроидов (C lacustris и Obelia gelatinosa) независимо формировались нормальные гидранты обоих видов. Таким образом, при совместной диссоциации тканей двух видов происходит сортировка клеток и их селективная агрегация [Beadle, Booth, 1937]. Клеточные деления при реорганизации гидранта не были обнаружены.

Эти же авторы воспроизвели эксперимент Этель Браун по пересадке кончика гипостома Hydra в середину тела полипа - реципиента, в

результате которого происходила индукция эктопической оси тела полипа [Browne, 1909]. Бидл и Бут провели такой эксперимент c C. lacustris, используя в качестве реципиента клеточный агрегат. Авторы обнаружили, что гипостом этого гидроида может играть роль региона - организатора, так же, как и гипостом Hydra. Новый гидрант C. lacustris образовывался на месте трансплантации, а его оральные структуры формировались из тканей реципиента. В большинстве случаев из такого агрегата формировался только один гидрант, т. е. регион-организатор подавлял формирование других оральных структур в близлежащей к нему области агрегата [Beadle, Booth, 1937].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кириллова, Анастасия Олеговна, 2018 год

IX. Список Литературы

1. Григорян Э.Н. Исследование регенерации у амфибий в эпоху молекулярно-генетических подходов и методов / Э.Н. Григорян, Ю.В. Маркитантова, П.П. Авдонин, Е.А. Радугина // Генетика. -2013. - Т. 49. - № 1. - С. 55-72.

2. Иванова-Казас О.М. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Иглокожие и полухордовые / M.: Наука, 1978. - С. 166.

3. Иванова-Казас О.М. Эволюционная эмбриология животных / О.М. Иванова-Казас. - СПб.: Наука, 1995. - 565 с.

4. Краус Ю.А. Morphomechanical programming of morphogenesis in cnidarian embryo / Ю.А Краус. // Онтогенез. - 2006. С. 55-72.

5. Краус Ю.А. Индукционная активность заднего конца планулы морского гидроида Dynamena pumila / Ю.А Краус. // Онтогенез. -2011. - Т. 42. - № 2. - С. 116-125.

6. Черданцев В.Г. Морфогенез и эволюция / В.Г. Черданцев. - М.: Т-во науч. изд. КМК, 2003. -360 с.

7. Akam M. The molecular basis for metameric pattern in the Drosophila embryo / M. Akam // Development. - 1987. - V. 101. - № 1. - P. 1-22.

8. Allman G.J. A Monograph on the gymnoblastic or tubularian Hydroids. In two parts / G.J. Allman. - London: Roy Society, 1871. - P. 154.

9. Amiel A.R. Characterization of morphological and cellular events underlying oral regeneration in the sea anemone, Nematostella vectensis / A.R. Amiel, H.T. Johnston, K. Nedoncelle, J.F. Warner, S. Ferreira, E. Rottinger // Int. J. Mol. Sci. - 2015. - V. 16. - № 12. -P. 28449-28471.

10. Aschwanden M. Self-organized criticality in astrophysics: the statistics of nonlinear processes in the universe / M. Aschwanden. - Heidelberg: Springer Science and Business Media, 2011. - P. 415.

11. Augustin R. Dickkopf related genes are components of the positional value gradient in Hydra / R. Augustin, A. Franke, K. Khalturin, R. Kiko, S.Siebert, G. Hemmrich, T.C. Bosch // Dev. Biol. - 2006. -V. 296. - № 1. - P. 62-70.

12. Beadle L.C. The reorganization of tissue masses of Cordylophora lacustris and the effect of oral cone grafts, with supplementary observations on Obelia gelatinosa / L.C. Beadle, F.A. Booth // J. Exp. Biol. - 1937. - V. 15. - № 3. - P. 303-326.

13. Ben Khadra Y. Wound repair during arm regeneration in the red starfish Echinaster sepositus / Y. Ben Khadra, C. Ferrario, C. Di Benedetto, K. Said, F. Bonasoro, M.D. Carnevali, M. Sugni // Wound Repair. Regen. - 2015. - V. 23. - № 4. - P. 611-622.

14. Black R.E. Dissociation and reaggregation of cells of Chrysaora quinquecirrha (Cnidaria, Scyphozoa) / R.E. Black, G.K. Riley // J. Exp. Zool. - 1985. - V. 233. - № 3. - P. 369-375.

15. Blitzer J.T. A critical role for endocytosis in Wnt signaling / J.T. Blitzer, R. Nusse // BMC Cell Biolo. - 2006. - V. 7. - № 28.

16. Bode H. The head organizer in Hydra / H. Bode // Int. J. Dev. Biol. -2012. - V. 56. - № 6-8. - P. 473-478.

17. Bode H. The interstitial cell lineage of hydra: a stem cell system that arose early in evolution / H. Bode // J. Cell. Sci. - 1996. - V. 109. -№ 6. - P. 1155-1164.

18. Bode H. Transdifferentiation occurs continuously in adult hydra. / H. Bode, J. Dunne, S. Heimfeld, L. Huang, L. Javois, O. Koizumi, J. Westerfield, M. Yaross // Curr. Top. Dev. Biol. - 1986. - V. 20. -P. 257-280.

19. Bosch T.C.G. Hydra and the evolution of stem cells / T.C.G. Bosch // Bioessays. - 2009. - V. 31. - P .478-486.

20. Bosch T.C.G. Why polyps regenerate and we don't: Towards a cellular and molecular framework for Hydra regeneration / T.C.G. Bosch // Dev. Biol. - 2007. - V. 303. - P. 421-433.

21. Bossert P. Inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone Nematostella vectensis / P. Bossert, G.H. Thomsen // J. Vis Exp. - 2017. - V. 14. - № 119. - doi: 10.3791/54626.

22. Bossert P.E. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis / P.E. Bossert, M.P. Dunn, G.H. Thomsen // Dev. Dyn. - 2013. - V. 242. -P. 1320-1331.

23. Bradshaw B. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata / B. Bradshaw, K. Thompson, U. Frank // Elife. - 2015. - V. 17. - № 4.

24. Broun M. Formation of the head organizer in Hydra involves the canonical Wnt pathway / M. Broun, L. Gee, B. Reinhardt, H.R. Bode // Development. - 2005. - V. 132. - № 12. - P. 2907-2916.

25. Browne E. N. The production of new hydrants in hydra by insertion of small grafts / E. N. Browne // J. Exp. Zool. - 1909. - V. 7. - P. 1-37.

26. Burton P.M. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis / P.M. Burton, J.R. Finnerty // Dev. Genes Evol. - 2009. - V. 219. - № 2. -P. 79-87.

27. Camazine S. Self-Organization in Biological Systems / S. Camazine, J.L. Deneubourg, N.R. Franks, J. Sneyd, G. Theraulaz, E. Bonabeau. -Princeton: Princeton Univ. Press, 2003. - P. 525.

28. Child C.M. Axial development in aggregates of dissociated cells from Corymorpha palma / C.M. Child // Physiol. Zool. - 1928. - Vol. 1. -№ 3. - P. 419-461.

29. Collins A.G. Medusozoan phylogeny and character evolution clarified by new large and small subunit rDNA data and an assessment of the utility of phylogenetic mixture models / A.G. Collins, P. Schuchert, A.C. Marques, T. Jankowski, M. Medina, B. Schierwater // Syst. Biol. -2006. - V. 55. - P. 97-115.

30. Collins C. Running with neighbors: coordinating cell migration and cell-cell adhesion. / C. Collins, W. Nelson // Curr. Opin. Cell Biol. -2015. - V. 36. - P. 62-70.

31. Cridge A.G. Convergent occurrence of the developmental hourglass in plant and animal embryogenesis? / A.G. Cridge, P.K. Dearden, L.R. Brownfield / Ann. Bot. - 2016. - V. 117. - № 5. - P. 833-843.

32. Cummings S. G. Head regeneration and polarity reversal in Hydra attenuata can occur in the absence of DNA synthesis / S.G. Cummings, H.R. Bode // Roux's Arch. Dev. Biol. - 1984. - V. 194. - P. 79-86.

33. Dan-Sohkawa M. Reconstruction of bipinnaria larvae from dissociated embryonic cells of the starfish, Asterina pectinifera / M. Dan-Sohkawa, H. Yamanaka, K.J. Watanabe // Embryol. Exp. Morphol. - 1986. -V. 94. - P. 47-60.

34. Darling J.A. Rising starlet: the starlet sea anemone, Nematostella vectensis / J.A. Darling, A.R. Reitzel, P.M. Burton, M.E. Mazza, J.F. Ryan, J.C. Sullivan, J.R. Finnerty // Bioessays. - 2005. - V. 27. - № 2 -P. 211-221.

35. De Robertis E.M. The establishment of Spemann's organizer and patterning of the vertebrate embryo / E.M. De Robertis, J. Larrain, M. Oelgeschlager, O. Wessely // Nat Rev Genet. - 2000. - V. 1. - № 3. -P. 171-181.

36. Dettlaff T.A. A study of the properties, morphogenetic potencies and prospective fate of outer and inner layers of ectodermal and chordamesodermal regions during gastrulation, in various Anuran amphibians / T.A. Dettlaff // J. Embryol. exp. Morph. - 1983. - J. Embryol. exp. Morph. - V. 75. - P. 67-86.

37. DuBuc T.Q. Initiating a regenerative response: cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis / T.Q. DuBuc, N. Traylor-Knowles, M.Q. Martindale // BMC Biol. -2014. - V. 26. - P. 12-24.

38. Duffy D.J. Wnt signaling promotes oral but suppresses aboral structures in Hydractinia metamorphosis and regeneration / D.J. Duffy, G. Plickert, T. Kuenzel, W. Tilmann, U. Frank // Development. - 2010. - V. 137. - № 18. - P. 3057-3066.

39. Dunn C.W. Animal phylogeny and its evolutionary implications. / C.W. Dunn, G. Giribet, G.D. Edgecombe, A. Hejnol // Annual Rev. Ecol. Evol. Syst. - 2014. - V. 45. - P. 371-395.

40. Extavour C.G. Vasa and nanos expression patterns in a sea anemone and the evolution of bilaterian germ cell specification mechanisms / C.G. Extavour, K. Pang, D.Q. Matus, M.Q. Martindale // Evolution and Development. - 2005. - V. 7. - № 3. - P. 201-215.

41. Fagotto F. Regulation of cell adhesion and cell sorting at embryonic boundaries / F. Fagotto // Curr. Top. Dev. Biol. - 2015. - V. 112. -P. 19-64.

42. Finnerty J.R. Origins of bilateral symmetry: Hox and Dpp expression in a sea anemone. / J.R. Finnerty, K. Pang, P. Burton, D. Paulson, M.Q. Martindale // Science. - 2004. - V. 304. - № 5675. - P. 1335-1337.

43. Foty R.A. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior / R.A. Foty, C.M. Pfleger, G. Forgacs, M.S. Steinberg // Development. - 1996. - V. 122. - P. 1611-1620.

44. Freeman G. The role of polarity in the development of the hydrozoan planula larva / G. Freeman // Wilh. Roux's Arch. - 1981. - V. 190. -P. 168-184.

45. Fritzenwanker J.H. Analysis of forkhead and snail expression reveals epithelial-mesenchymal transitions during embryonic and larval development of Nematostella vectensis / J.H. Fritzenwanker, M. Saina, U. Technau // Developmental Biology. - 2004. - V. 275. - P. 389-402.

46. Fritzenwanker J.H. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis / J.H. Fritzenwanker, G. Genikhovich, Y. Kraus, U. Technau // Developmental Biology. - 2007. - V. 310. -P. 264-279.

47. Fritzenwanker J.H. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis (Anthozoa) / J.H. Fritzenwanker, U. Technau // Dev Genes Evol. - 2002. - V. 212. - P. 99-103.

48. Galliot B. Cnidarians as a model system for understanding evolution and regeneration / B. Galliot, V. Schmid // Int. J. Dev Biol. - 2002. -V. 46. - № 1. - P. 39-48.

49. Galliot B. The Hydra model: disclosing an apoptosis-driven generator of Wnt-based regeneration / B. Galliot, S. Chera // Trends Cell Biol. -2010. - V. 20. - № 9. - P. 514-523.

50. Gamba A. Critical behavior and axis defining symmetry breaking in Hydra embryonic development / A. Gamba, M. Nicodemi, J. Soriano, A. Ott // Physical Rev. Letters. - 2012. - V. 108. - № 15. - P. 158103.

51. Genikhovich G. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. / G. Genikhovich, U. Technau // Cold Spring Harb. Protoc. - 2009. - V. 9. -doi: 10.1101/pdb.prot5282.

52. Genikhovich G. Induction of spawning in the starlet sea anemone Nematostella vectensis, in vitro fertilization of gametes, and dejellying

of zygotes / G. Genikhovich, U. Technau // Cold Spring Harb Protoc. -2009. - V. 9. - doi: 10.1101/ pdb prot5281.

53. Gierer A. A theory of biological pattern formation / A. Gierer, H. Meinhardt / Kybernetik. - 1972. - V. 12. - № 1. - P. 30-39.

54. Gierer A. Regeneration of hydra from reaggregated cells / A. Gierer, S. Berking, H. Bode, C.N. David, K. Flick, G. Hansmann, H. Schaller, E. Trenkner / Nat. New Biol. - 1972. - V. 239. - № 91. - P. 98-101.

55. Gierer A. The Hydra model - a model for what? / A. Gierer // Int. J. Dev. Biol. - 2012. - V. 56. - P. 437-445.

56. Gilchrist F. Budding and locomotion in the scyphostomes of Aurelia / F. Gilchrist // Biol. Bull. - 1937. - V. 72. - P. 99-124.

57. Gold D.A. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles / D.A. Gold, D.K. Jacobs / Devel. Genes Evol. - 2013. V. 223. - № 1-2. P. 53-66.

58. Guder C. An ancient Wnt-Dickkopf antagonism in Hydra / C. Guder, S. Pinho, T.G. Nacak, H.A. Schmidt, B. Hobmayer, C. Niehrs, T.W. Holstein // Development. - 2006. - V. 133. - № 5. - P. 901-911.

59. Habas R. Dishevelled and Wnt signaling: is the nucleus the final frontier? / R. Habas, E.B. Dawid // J.Biol. - 2005. - V. 4. - № 1. - P. 2.

60. Hamme J.U. Sponge budding is a spatiotemporal morphological patterning process: Insights from synchrotron radiation-based x-ray microtomography into the asexual reproduction of Tethya wilhelma / J.U. Hamme, J. Herzen, F. Beckmann, M. Nickel // Front Zool. - 2009. - V. 6. - № 19. - doi: 10.1186/1742-9994-6-19.

61. Harding K. Spatially regulated expression of homeotic genes in Drosophila / K. Harding, C. Wedeen, W. McGinnis, M. Levine // Science. - 1985. - V. 229. - № 4719. - P. 1236-1242.

62. Haynes J. Dedifferentiation and redifferentiation of cells in Hydra viridis / J. Haynes, A.L. Burnett // Science. - 1963. - V. 142. - № 3598. - P.1481-1483.

63. Hobmayer B. WNT signalling molecules act in axis formation in the diploblastic metazoan Hydra / B. Hobmayer, F. Rentzsch, K. Kuhn, C.M. Happel, C.C. Laue von, P. Snyder, U. Rothbächer, T.W. Holstein // Nature. - 2000. - V. 407. - № 6801. - P. 186-189.

64. Holstein T.W. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? / T.W. Holstein, E. Hobmayer, U. Technau // Dev. Dyn. - 2003. - V. 226. - № 2. - P. 257-267.

65. Holstein T.W. Gradients and regulatory networks of Wnt signalling in Hydra. Pattern formation / T.W. Holstein // Part I Biological Background. - 2012. - P. 17-25.

66. Holstein T.W. Pattern of epithelial cell cycling in hydra / T.W. Holstein, E. Hobmayer, C.N. David // Dev. Biol. - 1991. - V. 148. -№ 2. - P. 602-611.

67. Holstein T.W. Wnt Signaling in Cnidarians / T.W. Holstein // Methods Mol. Biol. - 2008. - V. 469. - P. 47-54.

68. Hulpiau P. New insights into the evolution of metazoan cadherins / P. Hulpiau h F. van Roy // Mol. Biol. Evol. - 2011. - V. 28. - № 1. -P. 647-657.

69. Issajew W. Studien an organischen Regulationen. Experimentelle Untersuchungen an Hydren / W. Issajew // Roux's Arch. Dev. Biol. -1926. - V. 108. - № 1. - P. 1-67.

70. Itow T. Induction of secondary embryos by intra- and interspecific grafts of center cells under the blastopore in horseshoe crabs / T. Itow, S. Kenmochi, T. Mochizuki // Dev. Growth & Differ. - 1991. - V. 33. -P. 251-258.

71. Kirillova A. Germ layer commitment and axis formation in sea anemone embryonic cell aggregates / A. Kirillova, G. Genikhovich, A. Demilly E. Pukhlyakova, Y. Kraus, U. Technau // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2018. -V 115. -№ 8. - P. 18131818.

72. Kishimoto Y. Hydra regeneration from recombined ectodermal and endodermal tissue. I. Epibolic ectodermal spreading is driven by cell intercalation / Y. Kishimoto, M. Murate, T. Sugiyama // J. Cell Sci. -1996. - V. 109. - P. 763-772.

73. Kraus Y. Gastrulation in the sea anemone Nematostella vectensis occurs by invagination and immigration: an ultrastructural study / Y. Kraus, U. Technau // Dev. Genes Evol. - 2006. - V. 216. - P. 119-132.

74. Kraus Y. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer / Y. Kraus, A. Aman, U. Technau, G. Genikhovich // Nature communications. - 2016. - V. 7. - P. 11694.

75. Kraus Y. The blastoporal organiser of a sea anemone / Y. Kraus, J.H. Fritzenwanker, G. Genikhovich, U. Technau // Curr. Biol. - 2007. -V. 17. - № 20. - P. 874-876.

76. Kraus Y. The embryonic development of the cnidarian Hydractinia echinata / Y. Kraus, H. Flici, K. Hensel, G. Plickert, T. Leitz, U. Frank // Evol. Dev. - 2014. - V. 16. - № 6. - P. 323-338.

77. Kraus Y.A. Morphomechanical programming of morphogenesis in cnidarian embryos / Y. A. Kraus // Int. J. Dev. Biol. - 2006. - V. 50. -№ 3. - P. 267-275.

78. Kraus Y.A. Morphomechanical programming of morphogenesis in cnidarian embryos / Y. A. Kraus // Int. J. Dev. Biol. - 2006. - V. 50. -№ 2-3. - P. 267-275.

79. Kumburegama S. Strabismus-mediated primary archenteron invagination is uncoupled from Wnt/p-catenin dependent endoderm cell

fate specification in Nematostella vectensis (Anthozoa, Cnidaria): Implications for the evolution of gastrulation / S. Kumburegama, N. Wijesena, R. Xu, A.H. Wikramanayake // EvoDevo. - 2011. - V. 2. -№ 1.

80. Kusserow A. Unexpected complexity of the Wnt gene family in a sea anemone / A. Kusserow, K. Pang, C. Sturm, M. Htrouda, J. Lentfer, H.A. Schmidt, U. Technau, A. von Haeseler, B. Hobmayer, M.Q. Martindale, T.W. Holstein // Nature. - 2005. - V. 433. - № 7022. -P. 156-160.

81. Layden M.J. The rise of the starlet sea anemone Nematostella vectensis as a model system to investigate development and regeneration / M.J. Layden // Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. - 2016. - V. 5. - № 4. -P. 408-428.

82. Lecointe A. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps / A. Lecointe, S. Cohen, M. Geze, C. Djediat, A. Meibom, I. Domart-Coulon // Cytotechnology. - 2013. - V. 65. - № 5. - P. 705-724.

83. Lee P.N. A WNT of things to come: evolution of Wnt signaling and polarity in cnidarians / P.N. Lee, K. Pang, D.Q. Matus, M.Q. Martindale // Semin. Cell Dev. Biol. - 2006. - V. 17. - № 2. - P. 157167.

84. Lee P.N. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled / P.N. Lee, S. Kumburegama, H.Q. Marlow, M.Q. Martindale, A.H. Wikramanayake // Dev. Biol. - 2007. - V. 310. - № 1. - P. 169-186.

85. Lengfeld T. Multiple Wnts are involved in Hydra organizer formation and regeneration / T. Lengfeld, H. Watanabe, O. Simakov, D.

Lindgens, L. Gee, L. Law, H.A. Schmidt, S. Ozbek, H. Bode, T.W. Holstein // Dev. Biol. - 2009. - V. 330. - № 1. - P. 186-199.

86. Logan C.Y. Mechanisms of Wnt signaling in development / C.Y. Logan, R. Nusse // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 2004. - V. 20. - P. 781810.

87. Lowell R.D. Regeneration of complete Hydra from isolated epidermal explants / R.D. Lowell, A.L. Burnett // Biol. Bull. - 1969. - V. 13. -№ 137. - P. 312-320.

88. Magie C.R. Cell-cell adhesion in the cnidaria: insights into the evolution of tissue morphogenesis / C.R. Magie, M.Q. Martindale // Biol Bull. - 2008. - V. 214. - № 3. - P. 218-232.

89. Magie C.R. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression / C.R. Magie, M. Daly, M.Q. Martindale // Developmental Biology. - 2007. - V. 305. - P. 483-497.

90. Malacinski G. M. Pattern formation: A primer in developmental biology. / G. M. Malacinski, S. V. Baryant. - New York: Macmillan, 1984. - P. 626

91. Martindale M.Q. Investigating the origins of triploblasty: 'mesodermal' gene expression in a diploblastic animal, the sea anemone Nematostella vectensis (phylum, Cnidaria; class, Anthozoa) / M.Q. Martindale, K. Pang, J.R. Finnerty // Development. - 2004. - V. 131. - № 10. - P. 24632474.

92. Mayorova T. Organizer regions in marine colonial hydrozoans / T. Mayorova, I. Kosevich, N. Dulin, E. Savina, Y. Kraus // Zoology. -2015. - V. 118. - № 2. - P. 89-101.

93. McClay D.R. A micromere induction signal is activated by beta-catenin and acts through notch to initiate specification of secondary mesenchyme cells in the sea urchin embryo / D.R. McClay, R.E.

Peterson, R.C. Range, A.M. Winter-Vann, M.J. Ferkowicz // Development. - 2000. - V. 127. - № 23. - P. 5113-5122.

94. Meinhardt H. Modeling pattern formation in hydra: a route to understanding essential steps in development / H. Meinhardt // Int. J. Dev. Biol. - 2012. - V. 56. - № 6-8. - P. 447-462.

95. Metschnikoff E. Embryologische Studien an Medusen. Ein Beitrag zur Genealogie der Primitiv Organe / Metschnikoff E. - Wien: Alfred Holder, 1886. - P. 159.

96. Mikhailov K.V. The origin of Metazoa: a transition from temporal to spatial cell differentiation / K.V. Mikhailov, A.V. Konstantinova, M.A. Nikitin, P.V. Troshin, L.Yu. Rusin, V.A. Lyubetsky, Yu.V. Panchin, A.P. Mylnikov, L.L. Moroz, S. Kumar, V. V. Aleoshin // BioEssays. -2009. - V. 31. - P. 758-768.

97. Moczek A.P. Developmental plasticity and evolution - quo vadis? // Heredity. - 2015. - V. 115. - № 4. - P. 302-305.

98. Nakamura Y. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer / Y. Nakamura, D.T. Charisios, S. Özbek, T.W. Holstein // PNAS. - 2011. - V. 108. - № 22. - P. 9137-9142.

99. Nelson W.J. Cell-cell junctions: A Subject Collection from Cold Spring Harbor Perspectives in Biology / W.J. Nelson, E. Fuchs. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2010. - P. 443.

100. Nieuwkoop P.D. The formation of the mesoderm in urodelean amphibians. VI. The self-organizing capacity of the induced meso-endoderm / P.D. Nieuwkoop // Roux's Arch. Dev. Biol. - 1992. -V. 201. - P. 18-29.

101. Noda K. Reconstitution of dissociated cells of Hydra / K. Noda // Zool. Mag. - 1971. - V. 80. - P. 27-31.

102. Normandin D. Regeneration of Hydra from the endoderm / D. Normandin // Science. - 1960. - V. 132. - № 3428. - P. 678.

103. Nusse R. Making head or tail of Dickkopf. / R. Nusse // Nature. - 2001. - V. 411. - № 6835. - P. 255-256.

104. Oulhen N. Regeneration in bipinnaria larvae of the bat star Patiria miniata induces rapid and broad new gene expression. / N. Oulhen, A. Heyland, T.J. Carrier, V. Zazueta-Novoa, T. Fresques, J. Laird, T.M. Onorato, D. Janies, G. Wessel // Mech. Dev. - 2016. - V. 142. - P. 1021.

105. Papenfuss E. J. Reunion of pieces of hydra with special reference to the role of the three layers and to the fate of the differentiated parts / E. J. Papenfuss // Biol. Bull. - 1934. - V. 67. - P. 223-243.

106. Park H.D. Cell division during regeneration in Hydra / H.D. Park, A.B. Ortmeyer, D.P. Blankenbaker // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 617-619.

107. Passamaneck Y.J. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis / Y.J. Passamaneck, M.Q. Martindale // BMC Dev. Biol. - 2012. - V. 12.

108. Peiró S. Snail1 transcriptional repressor binds to its own promoter and controls its expression / S. Peiró , M. Escrivá , I. Puig , M.J. Barbera , N. Dave, N. Herranz, M.J. Larriba, M. Takkunen, C. Francí, A. Muñoz, I. Virtanen, J. Baulida, A. García de Herreros // Nucleic Acids Res. -2006. - V. 34. - № 7. - P. 2077-2084.

109. Petersen C.P. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis / C.P. Petersen, P.W. Reddien // Cell. - 2009. - V. 139. - № 6. - P. 10561068.

110. Plickert G. Wnt signaling in hydroid development: Formation of the primary body axis in embryogenesis and its subsequent patterning / G. Plickert, V. Jacoby, U. Frank, W.A. Muller, O. Mokady // Developmental Biology. - 2006. - V. 298. - P. 368-378.

111. Reitzel A.M. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and

two forms of asexual fission / A.M. Reitzel, P.M. Burton, C. Krone, J.R. Finnerty // Invertebr. Biol. - 2007. - V. 126. - P. 99-112.

112. Reitzel A.M. Establishing a model organism: a report from the first annual Nematostella meeting / A.M. Reitzel, J.F. Ryan, A.M. Tarrant // Bioessays. - 2012. - V. 34. - № 2. - P. 158-161.

113. Rentzsch F. Asymmetric expression of the BMP antagonists chordin and gremlin in the sea anemone Nematostella vectensis: implications for the evolution of axial patterning / F. Rentzsch, R. Anton, M. Saina, M. Hammerschmidt, T.W. Holstein, U. Technau // Dev Biol. - 2006. -V. 296. - № 2. - P. 375-387.

114. Richardson M.K. Heterochrony and the phylotypic period / M.K. Richardson // Dev. Biol. - 1995. - V. 172. - № 2. - P. 412-421.

115. Röttinger E. A framework for the establishment of a cnidarian gene regulatory network for "endomesoderm" specification: the inputs of ß-catenin/TCF signaling. / E. Röttinger, P. Dahlin, M.Q. Martindale // PLoS Genet. - 2012. - V. 8. - № 12. - e1003164. doi: 10.1371.

116. Ryan J.R. Pre-Bilaterian Origins of the Hox Cluster and the Hox Code: Evidence from the Sea Anemone, Nematostella vectensis / J.R. Ryan, M.E. Mazza, K. Pang, D.Q. Matus, A.D. Baxevanis, M.Q. Martindale, J.R. Finnerty // PLoS One. - 2007. - V. 2. - № 1.

117. Saina M. BMPs and Chordin regulate patterning of the directive axis in a sea anemone / M. Saina, G. Genikhovich, E. Renfer, U. Technau // PNAS. - 2009. - V. 106. - № 44. - P. 18592-18597.

118. Sato M. Patterning in hydra cell aggregates without the sorting of cells from different axial origins / M. Sato, H. Tashiro, A. Oikawa, Y. Sawada // Dev. Biol. - 1992. - V. 151. - № 1. - P. 111-116.

119. Sato-Maeda M. Quantitative evaluation of tissue-specific cell adhesion at the level of a single cell pair / M. Sato-Maeda, M. Uchida, F. Graner, H. Tashiro // Dev. Biol. - 1994. - V. 162. - P. 77-84.

120. Schmid V. Heat dissociation and maceration of marine Cnidaria / V. Schmid, R. Stidwill, A. Bally, B. Marcum, P. Tardent // Wilh. Roux's Arch. - 1981. - V. 190. - № 3. - P. 143-149. Sci 2015, 16:2844928471.

121. Seipp S. Metamorphosis of Hydractinia echinata (Cnidaria) is caspase-dependent / S. Seipp, K. Wittig, B. Stiening, A. Böttger, T. Leitz // Int. J. Dev. Biol. - 2006. - V. 50. - № 1. - P. 63-70.

122. Slack J.M. The zootype and the phylotypic stage / J.M. Slack, P.W. Holland, C.F. Graham // Nature. - 1993. - V. 361. - № 6412. - P. 490492.

123. Solnica-Krezel L. Gastrulation in zebrafish - all just about adhesion? / L. Solnica-Krezel // Curr. Opin. Genet. Dev. - 2006. - V. 16. - № 4. -P. 433-441.

124. Spemann H. Über induktion von embryonalanlagen durch implantation artfremder organisatoren / H. Spemann, H. Mangold // Wilhelm Roux Arch. Entw. Mech. Org. - 1924. - V. 100. - P. 599-638.

125. Spencer H. On Social Evolution: Selected Writings / H. Spencer. -Chicago: Univ. Chicago Press, 1972. - P. 270.

126. Stearns S.C. The evolutionary links between fixed and variable traits / S.C. Stearns // Acta Palaeontol. Pol. - 1994. - V. 38. - № 3-4. - P. 215232.

127. Steele R. A genomic view of 500 million years of cnidarian evolution / R. E. Steele, C. N. David, U. Technau // Trends in Genetics. - 2011. -V. 27. - № 1. - P. 7-13.

128. Steinberg M. Reconstruction of tissues by dissociated cells / M. Steinberg // Science. - 1963. - V. 141. - № 3579. - P. 401-408.

129. Steinberg M.S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the

emergence of a hierarchy among a population of embryonic cells / M.S. Steinberg // J. Exp. Zool. - 1970. - V. 173. - P. 395-434.

130. Steinmetz P.R. Independent evolution of striated muscles in cnidarians and bilaterians. / P.R. Steinmetz, J.E. Kraus, C. Larroux, J.U. Hammel, A. Amon-Hassenzahl, E. Houliston, G. Wörheide, M. Nickel, B.M. Degnan, U. Technau // Nature. - 2012. - V. 487. - № 7406. - P. 231234.

131. Stumpf M. An organizing region in metamorphosing hydrozoan planula larvae - stimulation of axis formation in both larval and in adult tissue / M. Stumpf, B. Will, K. Wittig, J. Kasper, B. Fischer, J. Schmich, S. Seipp, T. Leitz // Int. J. Dev. Biol. - 2010. - V. 54. - P. 795-802.

132. Sullivan J.C. Conserved and novel Wnt clusters in the basal eumetazoan Nematostella vectensis / J.C. Sullivan, J.F. Ryan, J.C. Mullikin, J.R. Finnerty // Dev. Genes Evol. - 2007. - V. 217. - P. 235239.

133. Takakua Y. Motility of endodermal epithelial cells plays a major role in reorganizing the two epithelial layers in Hydra / Y. Takakua, T. Hariyama, T. Fujisawa // Mech. Dev. - 2005. - V. 122. - № 1. - P. 109122.

134. Takeichi M. Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion / M. Takeichi // Annu. Rev. Biochem. - 1990. - V. 59. -P. 237-252.

135. Tardent P. Regeneration in the Hydrozoa / P. Tardent // Biol. Rev. -1963. - V. 3. - P. 293-333.

136. Technau U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm / U. Technau // Bioessays. - 2001. - V. 23. - № 9. - P. 788794.

137. Technau U. Cell sorting during the regeneration of Hydra from reaggregated cells / U. Technau, T.W. Holstein // Dev Biol. - 1992. -V. 151. - № 1. - P. 117-127.

138. Technau U. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria / U. Technau, R.E. Steele // Development. - 2011. - V. 138. -№ 8. - P. 1447-1458.

139. Technau U. HyBra1, a brachyury homologue, acts during head formation in Hydra / U. Technau, H.R. Bode // Development. - 1999. -V. 126. - P. 999-1010.

140. Technau U. Parameters of self-organization in Hydra aggregates / U. Technau, C. Cramer von Laue, F. Rentzsch, S. Luft, B. Hobmayer, H.R. Bode, T.W. Holstein // PNAS. - 2000. - V. 97. - № 22. - P. 1212712131.

141. Technau U. Recent advances in genomics and transcriptomics of cnidarians / U. Technau, M. Schwaiger // Mar. Genomics. - 2015. -V. 24. - № 2. - P. 131-138.

142. Thorndyke M.C. Molecular approach to echinoderm regeneration / M.C. Thorndyke, W.C. Chen, P.W. Beesley, M. Patruno // Microsc Res. Tech. - 2001. - V. 55. - № 6. - P. 474-485.

143. Torras R. Posterior expression of nanos orthologs during embryonic and larval development of the anthozoan Nematostella vectensis / R. Torras, S. Gonzales-Crespo // Int. J. Dev. Biol. - 2005. - V. 49. -P. 895-899.

144. Trembley A.M. Memoires pour servir a vhistoire d'un genre de polypes d'eau douce; a bras en forme de comes / A.M. Trembley. - Leide: Jean and Herman Verbeek, 1744. - P. 352.

145. Trevino M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis / M. Trevino, D.J. Stefanik, R. Rodriguez, S.

Harmon, P.M. Burton // Dev. Dyn. - 2011. - V. 240. - № 12. - P. 26732679.

146. Turing A.M. The Chemical Basis of Morphogenesis / A.M. Turing // Phil. Trans. R. Soc. Lon. Ser. B, Biological Sciences. - 1952. - V. 237. -№ 641. - P. 37-72.

147. van Roy F. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin / F. van Roy, G. Berx // Cell Mol. Life Sci. - 2008. - V. 65. - P. 3756-3788.

148. Vincan E. Wnt signaling. Volume II: Pathway models / E. Vincan. -N.Y.: Humana Press, 2008. - P. 494.

149. von Baer K.E. Uber Entwickelungsgeschichte der Thiere: Beobachtung und Reflektion / K.E. von Baer. - Köningsberg: Bei den Gebrüdern Bornträger, 1828. - P. 314

150. Waddington C.H. The Strategy of the genes; a discussion of some aspects of theoretical biology / C.H. Waddington. - London: Allen and Unwin, 1957. - P. 262.

151. Watanabe H. Immortality and the base of multicellular life: Lessons from cnidarian stem cells / H. Watanabe, V.T. Hoang, R. Mattner, T.W. Holstein // Cell. Dev. Biol. - 2009. - V. 20. - P. 1114-1125.

152. Weimer B.R. The physiological gradients of hydra. III. Reconstitution of masses of dissociated pieces / B.R. Weimer // Physiol. Zool. - 1934. - V. 7. - № 2. - P. 212-225.

153. Wilson H.V. A new method by which sponges may be artificially reared / H.V. Wilson // Science. - 1907. - V. 25. - № 649. - P. 912-915.

154. Wilson H.V. On some phenomena of coalescence and regeneration in sponges / H.V. Wilson // J. Exp. Zool. - 1907. - V. 5. - № 2. - P. 245258.

155. Wilson H.V. On the behavior of dissociated cells in hydroids, Alcyonaria and Asterias / H.V. Wilson // J. Exp. Zool. - 1911. - V. 11. -P. 281-338.

156. Winklbauer R. Cadherin function during Xenopus gastrulation / R. Winklbauer // Subcell Biochem. - 2012. - V. 60. - P. 301-320.

157. Wodarz A. Mechanisms of Wnt signaling in development / A. Wodarz, R. Nusse // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 1998. - V. 14. - P. 59-88.

158. Yamanaka H. What do dissociated embryonic cells of the starfish, Asterina pectinifera, do to reconstruct bipinnaria larvae? / H. Yamanaka, Y. Tanaka-Ohmura, M.J. Dan-Sohkawa // Embryol Exp Morphol. - 1986. - V. 94. - P. 61-71.

159. Zapata F. Phylogenomic analyses support traditional relationships within Cnidaria / F. Zapata, F.E. Goetz, S.A. Smith, M. Howison, S. Siebert, S.H. Church, S.M. Sanders, C.L. Ames, C.S. McFadden, S.C. France, M. Daly, A.G. Collins, S.H.D. Haddock, C.W. Dunn, P. Cartwright // PLoS One. - 2015. - V. 14. - № 10, e0139068.

160. Zwilling E. Formation of endoderm from ectoderm in Cordylophora / E. Zwilling // Biol. Bull. - 1963. - V. 124. - P. 368-378.

Приложение 1. Таблицы

Что Биохимические

является механизмы

организато действия

тип виды ром организатора эксперимент

Кончик

псевдо-

Mycetozoa D. discoideum плазмодия градиент ц-АМФ трансп.

Porifera E. muelleri оскулум Wnt каскад трансп.

бластопор,

заднии

Hydra sp., кончик

N. vectensis, планулы,

Cnidaria D. pumila гипостом Wnt каскад трансп.

Platy-helminthes Dugesia sp., Planaria sp. голова градиент активности Smed-bcatenin трансп.

Р2 активность POP-1,

Nematoda C. elegans бластомер Wnt каскад дел.

T. tubifex,

A. vittata, 4d и / или 2d

Annelida S. columbiana квадрант MAPK трансп., дел.

I. obsoleta,

C. fornicata, L. stagnalis, 3d и / или 4d ERK1/2 MAPK

Mollusca P. vulgata квадрант каскад дел.

Tachypleus sp., центральные

L. polyphemus клетки не выявлены трансп.

Arthropoda A. labyrinthica кумулюс Dpp-Mad сигнальный каскад трансп.

D. melanogaster передняя зона яИца bicoid, exuperantia, swallow, bicaudal трансп.

Echino- H.pulcherrimus, микромеры,1 т^, smics и цитокин TGFb, ActivinB, LvDelta,

dermata S. mirabilis veg2 Wnt каскад трансп.

Цитоплазма

S. plicata, вегетативног

Chordata S. partia. о полюса Wnt каскад дел., трансп.

губа

B. lanceolatum бластопора не выявлены трансп.

Таблица 1. Описанные в литературе регионы-организаторы и механизмы их действия. трансп - метод трансплантации, дел - метод делеции (удаления фрагмента эмбриона )

вид класс стадия онтогенеза восстановление плана строения источник

Eudendrium carneum полип + Wilson 1911

Pennaria tiarella полип + Wilson 1911

Cordylophora lacustris полип + Beadle, Booth, 1937

Obelia gelatinosa Hydrozoa полип + Beadle, Booth, 1937

Hydra attenuate полип + Gierer et. al., 1972

Podocoryne (Hydractinia) carnea полип + Schmid et al., 1981

медуза + Schmid et al., 1981

Phialidium gregarium эмбрион + Freeman, 1981

Leptogorgia virgulata Anthozoa полип - Wilson 1911

Pocillopora damicornis полип - Lecointe et. al., 2013

полип + Black, Riley, 1985

Chrysaora quinquecirrha Scyphozoa эфира - Black, Riley, 1985

формирующаяся эфира -/+ * Black, Riley, 1985

Таблица 2. Описанные в литературе эксперименты по диссоциации -реагрегации клеток книдарий. *нормальный план строения не восстанавливался, но формировались структуры со щупальцами и ротовыми отверстиями.

Приложение 2. Рисунки

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, показывающее сестринское положение книдарий по отношению билатерально симметричным животным, а также позицию Nematostella vectensis внутри типа [Layden et а1., 2016].

б

А

gast-ula в

Ч

^larula г

Primary 00- polyp '

Д

Рисунок 2. Схематическое изображение развития Nematostella vectensis [Technau, Steele 2011]. А - взрослый полип; Б - яйцеклетка в момент оплодотворения; В - гаструла; Г - планула; Д -первичный полип.

Рисунок 3. Регулятивные способности эмбрионов Nemostella vectensis [Fritzenwanker et al. 2007]. A-E - из каждого бластомера 4х клеточного эмбриона формируется первичный полип; L-M - первичный полип формируется из каждой продольной половины гаструлы; F - K и O- R -первичный полип формируется только из анимальной половины эмбриона, из вегетативной формируется только реснитчатый шар; S -референсный первичный полип. На схеме A - анимальный полюс эмбриона, V - вегетативный полюс.

Рисунок 4. Схематическое изображение кспериментов по диссоциации - реагрегации. А - схема эксперимента по диссоциации гаструл N. vectensis; Б - схема эксперимента по диссоциации - реагрегации оральных половин гаструл; В - схема эксперимента по диссоциации -реагрегации аборальных половин гаструл; Г - схема эксперимента по диссоциации - реагрегации презумптивной эктодермы гаструл; Д -схема эксперимента по диссоциации - реагрегации презумптивной эндодермы гаструл.

mOrange2

Г

m Cherry/brig ht field

Д

В| #

W*

Cj т

;

тОгапде2

Е

mCherry/bright field

_

mCherry/bright field

А

Рисунок 5. Трансгенные линии EF1a::1ifeact-mOrange2 и Snal1A::mCherry(Snal1A~/~). А - экспрессия mOrange2 в гаструле; Б -экспрессия mOrange2 в плануле; В - экспрессия mOrange2 в первичном полипе; Г - эндодермальная экспрессия тОДегсу в гаструле; Д -эндодермальная экспрессия mCherry в плануле; Е - эндодермальная экспрессия тОДе^ в первичном полипе. На изображениях живые образцы.

Рисунок 6. Эксперименты с использованием метода микрохирургии. А -схема совместной диссоциации - реагрегации аборальных половины гаструл линии EF1a::lifeact-mOrange2 и оральных половин гаструл дикого типа; Б - схема совместной диссоциации - реагрегации эндодермальных клеток линии EF1a::lifeact-mOrange2 и эктодермальных клеток гаструл дикого типа; В - схема диссоциации -реагреации эктодермальных клеток гаструл линии SnallA::mCherry(SnallA~/~).

А I

Рисунок 7. Эмбриональные клетки Nematostella после диссоциации. А -кластер из четырех клеток, метод конфокальной микроскопии. Б -отдельные диссоциированные клетки, световая микроскопия.

1ЧПД

лгШ ■ ШГ ' JpS

f., ,

V * § ■ & : V- J

ff'1" f'WTBI t ' S

1 ' ' й

*

24чпд

А

Рисунок 8. Динамика развития агрегатов в первые сутки развития, данные тайм-лэпс съемки на конфокальном микроскопе. А - агрегат через час после диссоциации; Б - агрегат через 12 часов после диссоциации; В -- агрегат через 24 часа после диссоциации. Красной линией выделены границы эпителизованной поверхности агрегата.

Рисунок 9. Филлоподии в зоне неэпителизованного участка агрегата через 5 часов после центрифугирования, данные SEM: (фп -филоподии)

Рис 10. Последовательные стадии развития агрегатов, проанализированные с помощью конфокальной и электронной микроскопии. А, Б — агрегат сразу после центрифугирования без переднезадней полярности или сегрегации на зародышевые листки; В, Г- инициация эпителизации эктодермы к 12 чпд; Д - начало формирования ротового отверстия через 24 чпд; Е - агрегат, разделенный на два зародышевых листка к 24 чпд; Ж - внешний вид агрегата черзе 24 чпд; И - формирование глотки у агрегата через 48 чпд; К - агрегат через 3 дпд, напоминающий нормальную планулу; Л -внешний вид агрегата черзе 3 дпд; М - формирование гипостома у агрегата через 6 дпд; Н- первичный полип с тремя головами и одной ногой; Масштабный отрезок 100 ^т.

Рис 11. Разнообразие первичных полипов и оральных областей у агрегатов. П, С, Т - разнообразие первичных полипов, сформированных из агрегатов; Р- двойная ^Н для орального маркера NvFoxA (красный) и аборального маркера NvFGFa1 (синий). первичный полип с одной орально-аборальной осью. У- Х - разнообразие морфологии оральных полюсов первичных полипов, полученных из агрегатов; Ц - паттерн экспрессии гена NemBra в виде соприкасающихся колец. Данные ^Н. Масштабный отрезок 100 ^т.

1 bra "ЗА рс ■ • 5 » > » т _ 1 wnt! Б wntS В V wnt4 Г fox/! Д » - * % wnt2 Е ,/ш/ ж VI

ПИ 1 % f К • - г л м ж Н 4 § ■1 •ф

2 дпд 1 п • ml ф 1 X » ш *

с э Ю Щ я А' 1 В' ф

тР * J*' Д' г к % Е | * Ж' о J * * П' «

М' с Н' П' Р' / С' 1 У' *

« Ф' . Ф / X' г, »* Ц' LU' » Q^ ч- «Г » н Ю' •1

Рисунок 12. Динамика экспресси генов во время восстановления оральноаборальной полярности агрегатов. foxA, bra, wntl и wnt3 -маркеры орального полюса, fgfAl - аборального полюса, и wnt2 -средней части эмбриона А-Ж агрегаты 30 мин. пд; И-Р агрегаты 1 дпд; С-Ш агрегаты 2 дпд; Щ-В' - агрегаты 3 дпд с одной оральноаборальной осью тела; Г'-Л' агрегаты 3 дпд с несколькими орально-аборальными осями тела; М'-У' - агрегаты 6 дпд с одной оральноаборальной осью тела; Ф'-Ю' - агрегаты 3 дпд с несколькими орально-аборальными осями тела. Метод ISH. Масштабный отрезок 100 цт.

Рисунок 13. Развитие агрегатов, полученных из кдеток ВгаМО эмбрионов. А, б - шарообразное строение агрегатов на 6дпд, световая микроскопия. В -отсутствие паттерна экспресии Ы^Вга на 3пд. Г - паттерн экспресии NvFgfa1 на 3пд

Рисунок 14. Исследование проспективныхпотенций клеток в экспериментах Nematostella по диссоциации-реагрегации. А -

агрегаты, полученные из оральных половинок гаструл, формируют первичный полип; Б агрегаты, полученные из аборальных половинок гаструл, не восстанавливают план строения; Г- диссоциированные клетки эндодермы занимают внутреннее положение в агрегатах.

Рисунок 15. Исследованиеспособности клеток эктодермы к трансдифференцировке в экспериментах по диссоциации-реагрегации. Аагрегаты, полученные из клеток эктодермы, способны формировать первичный полип; Б - экспрессии гена snailA в эндодерме гаструлы; В -отсутствие экспрессии гена ^-паНА в эктодермальных фрагментах; Г -отсутствие экспрессии гена snailA в "эктодермальных" агрегатах сразу после центрифугирования подтверждает отсутствие контаминации эндодермальными клетками в ходе эксперимента. Метод КН. Д-И -развитие агрегатов, полученных из ткани эктодермы эмбрионов линии SnailA::mCherry(SnallA~/~). Ж - первая транскрипция snailA в «эктодермальных» агрегатах через 14 чпд, что свидетельствует о появлении эндодермальных клеток в составе агрегата. К-Н - развитие контрольных агрегатов линии SnailA::mCherry(SnallA"/"). Масштабный отрезок 100 цт.

д phalloidin dapi cadherin-3 dapi

! «Г •

Б Л ' *1 •

Г .%) * , ' * •• ..I/ А'' • • • 4 и г у <$ Т- Л > • 4 - • •• • .1«

в • * • %- \ ^ \ ' • Зу J Vi * s ^—у-

Е общая средний

тип морфолино число площадь размер % области

stdMO 492 258539 525.486 5.26 cdh3MO 291 44230 151.993 0.9

Рисунок 16. Роль Cadherin - 3 в развитии агрегатов. А-В - локазлизация Cadherin - 3. А - рассеянное расположение Cadherin - 3 в отдельной диссоциированной клетке; Б - апикальное расположение Cadherin - 3 в эпителизованных участках в агрегатах 30 мин пд; В - апикальное и базальное расположение Cadherin - 3 в эктодермальных клетках и точечное на апикальных поверхностях эндодермальных клеток в агрегатах 24 чпд; Г-Е Измерение площади агрегатов, полученных из клеток: Г - агрегаты, полученные из гаструл с инъецированным контрольным морфолино (stdMO); Д - агрегаты, полученные из гаструл с инъецированным Cadherin -3 морфолино (cdh3MO); Е - Анализ полученного изображения для агрегатов, полученных из stdMO и cdh3MO эмбрионов по числу агрегатов, общей площади всех агрегатов, среднему размера агрегатов и процентному значению области, занятой агрегатами.

Рисунок 17. Сходства в сегрегации зародышевых листков у агрегатов Nematostella vectensis и гаструл гидроида Dynamena рытИШ. а-поверхность агрегата, 5чпд; б - оптический срез агрегата, 6чпд. в -поверхность гаструлы Dynamena pыmila^; гоптический срез гаструлы Dynamena pыmila