Референс-противорожистая вакцина и ее использование для изучения гуморального иммунитета у трансгенных свиней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Моисеева, Наталья Анатольевна

• Моисеева, Наталья Анатольевна
• кандидат ветеринарных наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Моисеева, Наталья Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биопрепараты для профилактики рожи свиней

1.1.1. Общие сведения о заболевании

1.1.2. Возбудитель рожи свиней Егз^реЬШпх гИшюраЙпае

1.1.3. Вакцины против рожи свиней

1.1.4. Изучение гуморального иммунитета при роже свиней

1.2. Биотехнология сельскохозяйственных животных

1.3. Заключение по обзору литературы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Производственные штаммы микроорганизмов, используемые в работе

2.2. Питательные среды, используемые при промышленном культивировании бактерий

2.3. Определение концентрации живых бактерий рожи свиней

2.3.1. Материалы и реактивы

2.3.2. Подготовка к испытанию

2.3.3. Проведение испытания

2.3.4. Среда высушивания

2.3.5. Процессы и технологическое оборудование

2.4. Технологический контроль

2.4.1. Определение безвредности вакцины

2.4.2. Определение иммуногенной активности противорожистой вакцины

2.4.2.1. Определение иммуногенной активности на белых мышах

2.4.2.2. Определение иммуногенной активности противорожистой вакцины на свиньях

2.4.2.3. Требования к сухому стандартному заражающему штамму №149 возбудителя рожи свиней и порядок работы с ним

2.5. Статистические методы обработки экспериментальных данных

3. Технические и технологические основы для создания референс-вакцины

3.1. Правила безопасности, производственной санитарии, охрана карантинного и ветеринарно-санитарного режимов на предприятиях биологической промышленности

3.1.1. Правила устройства и содержания проиводственных помещений

3.2. Требования к оборудованию, измерительным приборам, средствам автоматизации, сырью и материалам, испольуемым в производстве вакцины

3.3. Технологические параметры и результаты биологического контроля, позволяющие получать стандартную вакцину

3.3.1. Исследования по оптимизации посевной дозы инокулята при глубинном культивировании в реакторах

3.3.2. Оценка результатов промышленного культивирования микроорганизмов штамма ВР-2 рожи свиней

3.3.3. Оценка результатов промышленной технологии изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2

3.3.4. Характеристика готового продукта. Сухая живая вакцина против рожи свиней из штамма Егуз1ре1оШг1х гЬшюраЙиае ВР-2

3.3.5. Изучение стабильности промышленных серий живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:11пх г1ш-эюрайиае ВР-2

3.4. Разработка рекомендаций, характеризующих референс-вакцину против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:1тх ЮпшораЙпае ВР-2

3.5. Изучение гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой рефе-ренс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу81ре1о1:1шх гЬшюраЙиае ВР-2

3.5.1. Сравнительное изучение гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу-81ре1оЙтх йшвюрайцае ВР-2 с помощью метода пробы роста

3.5.2. Сравнительное изучение гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу-з1ре1оЙ1пх гИшюраЙцае ВР-2 с помощью ИФА

3.5.3. Сравнительный анализ гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу-з1ре1о111г1х АшюраЙнае ВР-2, полученных методами пробы

роста и ИФА

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Референс-противорожистая вакцина и ее использование для изучения гуморального иммунитета у трансгенных свиней»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Биологической основой интенсификации и повышения эффективности свиноводства является вакцинопрофилактика и получение новых высокопродуктивных пород свиней за счет современной селекции и создания трансгенных свиней (Л.К.Эрнст, Г.Брем В.В.Устин, 1995; Рахманин П.П. и др. 1996 г.) (46, 129). Вопросами промышленной технологии производства вакцины против одной из самых распространенных болезней свиней - рожи (Е.С.Воронин и др., 1987; В.И.Геведзе и др., 1982; П.С.Рогожин и др., 1986; В.П.Урбан, 1981; И.А.Бакулов, 1998)(1, 15, 16, 96, 118), посвящены работы Луи Пастера, 1882; Т.Леффлера, 1886, Д.Ф.Конева 1904-1908; В.П.Меркулова и др., 1970-1972; О.Б.Дьяконова и др., 1972; Н.Т.Татаринцева, 1975; А.А.Воробьева, 1986; М.Я.Ярцева и др., 1990-1996; Н.Д.Скичко, 1996; А.Н.Панина, Р.В. Душу-ка, 1998; Н.В.Мельника, 1997, 1998 (15, 39, 67798, 107, 131).

Получение трансгенных животных является мощным рычагом селекции XXI века. Наряду с исследовательскими целями преследует решение важных народнохозяйственных задач, среди которых создание новых пород сельскохозяйственных животных, отличающихся высоким уровнем продуктивности, приспособленных к неблагоприятным условиям окружающей среды, устойчивых к стресс-факторам, невосприимчивых к инфекционным заболеваниям, продуцентов биологически активных белков - гормонов и ферментов, используемых в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности (Л.К.Эрнст и др., 19931996 гг.)(128, 129, 130).

Получение трансгенных свиней вызывает особый интерес, если учесть, что органы этих животных являются наиболее перспективными моделями органов донора для трансплантации их человеку (145).

Последние достижения в области генной инженерии вселяют надежду, что может быть создана такая генно-инженерная свинья, которая не будет стимулировать сверхострое отторжение у человеческих реципиентов. (Тоневицкий А.Г. и др., 1996).

Проведение исследований по изучению состояния иммунной системы у трансгенных свиней, вакцинированных противорожистой референс-вакциной, важно еще потому, что возбудитель рожи свиней вызывает заболевание и у человека. А это представляет не только научный, но и практический интерес для животноводства, ветеринарии и трансплантологии.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось создание референс-противорожистой вакцины и использование ее для изучения гуморального иммунитета у трансгенных свиней.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- проанализировать этапы промышленного производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Егу81ре1о1;11пх гИшюраЙиае ВР-2;

- усовершенствовать промышленную технологию производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:11Пх гЫшораЙиае ВР-2;

- разработать рекомендации по требованиям к производству референс-вакцины и создать живую сухую референс-вакцину против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:Ьпх гЫшораЙмае ВР-2;

- изучить стабильность референс-вакцины при хранении;

- изучить гуморальный иммунитет у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егуз1ре1оШпх гИшюраЙпае ВР-2;

- сравнить показатели гуморального иммунитета у свиней, определяемые методом проб роста с таковыми, полученными при использовании ИФА.

Научная новизна. Впервые создана живая сухая референс-вакцина против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1Ьг1х гЫшораЙиае ВР-2. Разработаны рекомендации по техническим и технологическим основам создания референс-вакцины. Определены основные параметры, характеризующие референс-вакцину. Впервые изучен в сравнении уровень гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных референс-вакциной.

Выявлена существенная зависимость показателя гуморального иммунного ответа, полученная методом проб роста с таковыми, определенных в ИФА.

Практическая значимость работы. Создание живой сухой референс-вакцины против рожи свиней из штамма Егу81ре1о1Ьг1х гЫшораЙиае ВР-2 и определенные ее основные параметры делают более стабильным промышленную технологию изготовления противорожистой вакцины. Использование референс-вакцины для изучения гуморального иммунитета повышает объективность оценки состояния иммунной системы у вакцинированных свиней и является дополнительным методом получения информации по трансгенным животным.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биопрепараты для профилактики рожи свиней

1.1.1. Общие сведения о заболевании

Рожа свиней - септическая антропозоонозная инфекционная болезнь, протекающая остро и хронически в форме энзоотических вспышек (7,15, 97, 114, 116). Заболевание известно также под названием эризипелоид Розенбаха, свиная краснуха, эризипеллос, мышиная септицемия, краснуха натуралистов, эритема Бейкера (15).

Болезнь широко распространена во многих странах мира и вызывает большие потери свиней (15, 132). В Европе регистрируется повсеместно, часто встречается в странах Северной и Южной Америки. Заболевание нередко регистрируется в Турции, Индии, Индонезии, КНР, Японии (74). В США рожа свиней впервые установлена в 1885 г., в последние годы заболеваемость свиней рожей низкая, однако отмечается тенденция к ее повышению каждые 4-5 лет (222).

Первые сведения о роже свиней в России относятся к 1883 г. В настоящее время это заболевание распространено в стране повсеместно, его регистрируют в виде спорадических случаев или энзоотических вспышек (7, 79, 94).

1.1.2. Возбудитель рожи свиней Erysipelothrix rhusiopathiae

(E.insidiosa, E.rhusiopathiae suis) впервые был выделен и идентифицирован Р.Кохом (1878), затем описан Л.Пастером и Думасом (1882) во Франции и Леффлером (1881) в Германии (15, 45). E.rhusiopathiae - полиморфные, короткие палочки размером 0,25 ± 0,05 х 1,0 ± 0,5 мкм; располагаются одиночно или цепочками, неподвижных спор и капсул не образуют, хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красками, грамположительные (15, 97). По данным электронно-микроскопических исследований в лизирующихся клетках видны протоспоры (4, 7, 74, 97, 114).

Эризипелотриксы размножаются перешнуровыванием с образованием ге-тероморфных клеток (71) Е.гЬшюраНиае - микроаэрофил. Хорошо растет в аэробных условиях на обычном или полужидком мясопептонном бульоне, среде Хоттингера и некоторых других питательных средах при температуре 37°С и рН 7,2 - 7,6. На МПА через 16-24 ч выращивания имеет вид мельчайших прозрачных росинчатых колоний (Б - форма). В старых культурах колонии имеют сероватый оттенок и шероховатую грубоволокнистую поверхность (Я - форма). На сывороточном агаре наблюдается более пышный рост (4, 7, 16, 60, 94, 101, 114).

Добавление в питательные среды углеводов: глюкозы, фруктозы, галактозы и лактозы обеспечивает максимальный рост эризипелотриксов (113). Оптимальная концентрация глюкозы в среде для их выращивания составляет 0,1% (115). При концентрации глюкозы более чем 1,25%, подавляется рост микроорганизмов. Ионы железа, введенные в среды в виде различных органических и неорганических солей, стимулируют рост бактерий, такое же действие оказывают соли марганца, меди, цинка (115).

В процессе роста бактерии, как правило, потребляют аргинин (112, 164, 166), интенсивно используют гистидин, триптофан, фенилаланин, метионин и лейцин, тогда как аспарагин, глицин, глютаминовую кислоту и аланин поглощают замедленно (166). Различий в метаболизме аминокислот микроорганизмами серологических типов А, В и N не выявлено (112). Отмечено, что все штаммы в процессе роста продуцируют какой-либо пептид, состоящий из аргинина, лизина, треонина, глицина и аспарагиновой кислоты. Продуцируемые пептиды задерживают рост эризипелотриксов. При исследовании путей катаболизма и анаэробной диссимиляции глюкозы Е.гИшюраЙиае установлено, что основным продуктом диссимиляции была молочная кислота и в меньшей степени - этиловый спирт, уксусная и муравьиная кислоты, а также двуокись углерода (195).

В.Гирард и Э.Снелл (18) рекомендуют для выращивания эризипелотриксов питательную среду, включающую кислотный гидролизат казеина,

дрожжевой экстракт, глюкозу, витамины (рибофлавин, тиамин и пантотенат кальция), фосфорнокислые соли натрия и калия, сернокислый магний рН - 7,8 -8,1. Оптимальная температура при культивировании 36°С. Дрожжевой аутолизат, пептон и триптон в составе питательных сред стимулируют рост этих бактерий (164).

Эризипелотриксы образуют сероводород, желатин не разжижают, индола не образуют; ферментируют с образованием кислоты лактозу, глюкозу, левулезу, галактозу, в слабой степени ксилозу, а иногда арабинозу, мальтозу и рамиозу; не ферментируют салицин (4, 97, 101). Весьма устойчивы к внешним воздействиям (7, 397).

Антигенную структуру эризипелотриксов изучали многие исследователи (82, 117, 155, 172, 175, 180, 211). По сообщениям (82, 107) первым на антигенное различие E.rhusiopathiae обратил внимание А.И.Похил в 1939 г., который установил, что все штаммы одинаково агглютинируются сывороткой, полученной при гипериммунизации кроликов одним из штаммов.

Впоследствии П.Уоттс в 1940 г. и Н.Аткинсон в 1941 г. на основании результатов реакции агглютинации (РА), связывания комплемента (РСК) и преципитации (РП) штаммы возбудителя рожи свиней впервые подразделили на две основные серологические группы (А и В). Штаммы, не реагирующие с ти-поспецифическими А- и В-антисыворотками, были отнесены к промежуточной N-rpynne (155).

G.Kucsera (180), G.Kucsera и A.Gimesi 1976 с помощью реакции преципитации в агаровом геле методом двойной диффузии выделили 18 серотипов эризипелотриксов.

К.Hashimoto, V.Yoshida, Y.Sugawara (172) при дифференциации культур эризипелотриксов, выделенных от больных свиней, 49 из них отнесли к сероти-пу А и 44 - к серотипу В. Из миндалин клинически здоровых свиней выделяли культуры серотипов В и N.

G.Kucsera (180), K.Hashimoto et al (172) считают необходимым уточнить серологическую классификацию возбудителя эризипелоида и предлагает обо-

значать серотипы арабскими цифрами вместо букв алфавита, а разницу в антигенной структуре у штаммов, относящихся к одному серотипу, отмечать индексами внутри серотипа. Этого же мнения придерживаются G.Gross и P.Claxton (153), которые обозначают субтипы, выделенные внутри серотипов, как 1а, 16 и т.д.

По данным M.Aagaard (132) всего описано 22 различных серотипа эризи-пелотриксов.

От больных рожей свиней чаще выделяют штаммы эризипелотриксов, относящихся преимущественно к типу А, реже - к типу В и очень редко к типу N (82, 107, 127, 219). По мнению R.L.Wood, R.Harrington (225) острую форму рожи у свиней вызывают серотипы А и В.

В зависимости от среды обитания наблюдается значительная изменчивость морфологических, культуральных и антигенных свойств эризипелотриксов (7, 78).

Н.Т.Татаринцев (107) при исследовании вакцинных, лабораторных, эпизоотических штаммов возбудителя рожи свиней методами перекрестной РА и РП в геле с типоспецифическими сыворотками подтвердил, что штаммы РСА (выделен из вакцины, применяемой в США), АВР-9 (штамм, используемый для изготовления вакцины в скандинавских странах), К-2 (Воронежской НИВС), ВИЭВ (получен в лаборатории микробиологии ВИЭВ), 1-й и 2-й вакцин Конева принадлежат к А-серотипу, а штамм ВР-2 (получен в Румынии) - к N-серотипу. Из 22 лабораторных и свежевыделенных из трупов свиней штаммов, большинство было отнесено к серотипу А и только 2 - к серотипу В.

Л.А.Подлесных, О.Б.Дьяконов (82, 85, 88) провели исследования антигенной структуры, иммунобиологических свойств и типизацию вакцинных и эпизоотических штаммов с использованием РДП в агаровом геле, РА и РГА с типовыми специфическими сыворотками. В результате исследований авторы установили следующее:

- штамм АВР - 9-го серотипа А слабоиммуногенен для свиней;

- штамм К-2 (3-й пассаж) имеет низкий титр в РГА (1:32), не реагирует положительно с А и В - сыворотками и обладает недостаточно выраженными иммуногенными свойствами для свиней;

- штамм «Штауб» имеет низкий титр в РГА (1:16), хотя дает четкие линии преципитации с В-сыворотками, и недостаточно выраженные иммуногенные свойства при проверке на свиньях;

- матрикс рожи свиней Конева имеет высокий титр в РГА - 1:128, что характерно для штаммов типа В, в то же время образует четкие линии преципитации с сыворотками типа А, что свидетельствует о его смешанной антигенной структуре;

- штамм ВР-2 серотипа N не реагирует с А и В типоспецифическими сыворотками в РДП, слабо агглютинирует куриные эритроциты (отрицательная РГА), высокоиммуногенен, что подтверждено при неоднократных проверках на лабораторных животных и свиньях;

- штамм ВР-2 и матрикс Конева не продуцируют растворимых иммунизирующих антигенов и не пригодны для изготовления инактивированных вакцин;

- 10 эпизоотических штаммов отнесены к серотипу В и 12 - к серотипу А.

После переболевания рожей у свиней формируется стойкий иммунитет (7, 94, 97), нередко нестерильной, так как большинство переболевших животных длительное время остаются бактерионосителями (94).

1.1.3. Вакцины против рожи свиней

Эффективность противорожистых биопрепаратов во многом определяется иммунобиологическими и антигенными свойствами вакцинных штаммов, используемых для их изготовления (82).

По сообщениям (77, 97) первые живые вакцины против рожи свиней создали Пастер и Тюлье в 1883 г. путем аттенуации эризипелотриксов при пасса-жировании через кроликов. На основе этого принципа в России П.И. Боровский в 1897 г., а затем Д.Ф.Конев в 1904 и 1908 гг. получили живые вакцины.

Выделенную от голубей вирулентную культуру Д.Ф.Конев ослабил последовательным пассажированием через кроликов и получил матриксы 1-й и 2-й вакцин. Вакцины Конева применялись для специфической профилактики более 30

лет.

П.С.Соломкин в 1940 г. освежил архивный образец 2-го матрикса Конева и после испытаний предложил его для изготовления живой вакцины (77).

Практическое применение вакцин Конева показало ее эффективность в борьбе с рожей свиней, однако короткий срок годности (2 месяца) и осложнения после иммунизации свиней послужили причинами ограниченного использования этого препарата (77).

В связи с этим В.П.Меркулов и А.Б.Энштейн провели работу по усовершенствованию метода изготовления этой вакцины при культивировании бактерий в питательной среде на основе мясного перевара. Для стабилизации культуры в препарате авторы использовали фосфатный буфер гидрата окиси алюминия. Вакцина получила название депонированной. Однако концентрация живых бактерий в вакцине после изготовления резко снижались, у привитых свиней наблюдались осложнения (74, 97).

Т.И.Ефимова (1972) в производственных условиях изготовила вакцийу из матрикса Конева с депонирующим разбавителем, исследование стабильности которой показало, что в течение 12 месяцев отмирает 8,6% микробных клеток.

Для культивирования бактерий 2-го матрикса Конева некоторые авторы испытывали питательную среду на основе ферментативного гидролизата казеина (124, 125, 126). При выращивании культуры в этой среде реакторным способом с перемешиванием (45 об/мин) и без аэрации максимальное накопление живых бактерий рожи через 18 ч роста составило 0,5-2,17 млрд/см3.

В течение 1959-1971 гг. в нашей стране применяли живую ослабленную вакцину Воронежской НИВС из штамма К-2 (третий пассаж) В.Т.Котова и испытывали вакцину из штаммов АВР-9 и «Штауб» (61).

М.Т.Коняев (61) разработал рациональную схему применения живых вакцин против рожи свиней из 2-го матрикса Конева, штаммов К-2 и ВР-2, пре-

дусматривающую иммунизацию свиней в возрасте двух и более месяцев, но не ранее 10-14 дней после отъема их от свиноматок.

А.Штауб в 1939 г. во Франции получил вакцинный штамм серологического типа В, аттенуированный методом культивирования возбудителя рожи свиней при 40°С в обедненной питательной среде и обильном доступе кислорода. Вакцина из этого штамма нашла применение во Франции и Польше. Однако небольшой срок годности этого препарата (10 дней) сдерживал ее широкое использование (74).

При изготовлении живой вакцины в скандинавских странах широко использовали авирулентный штамм АВР-2, полученный при культивировании вирулентного штамма рожи свиней Р-9 на агаре с трипафлавином. Этот штамм принадлежит к серологическому типу А, непатогенен для белых мышей, голубей и свиней.

Штаммы АВР, «Штауб» и РСА по сравнению со штаммами ВР-2 и 2-го матрикса Конева и К-2 недостаточно иммуногенны (35, 61).

В Японии рядом исследователей (198, 199, 200, 203, 207) проведены работы по изысканию живых вакцин против рожи свиней и изучению их иммуно-генности. По данным (198, 199, 207) живая вакцина * из акрифлавин-аттенуированного штамма ЕтЫшораЙцае Koganei 65±015 (серовар 2) обеспечивает перекрестную защиту привитых мышей и свиней после заражения десятью патогенными штаммами эризипелотриксов, относящихся к 4, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 20 и М-серотипам.

Положительные результаты применения живых вакцин против рожи свиней, не уступающие по эффективности парентеральным методам, установлены как при аэрозольной (2, 5, 43, 95, 96, 175, 202), так и при энтеральной иммунизации (2, 26, 27, 28, 66, 91).

Некоторые исследователи предпринимали попытки изготовления и применения живых комплексных препаратов против рожи и чумы свиней (31, 33, 38, 39, 40, 59); рожи и сальмонеллеза (4); рожи, болезни Ауески и чумы (59,

119) и показали, что такие вакцины обеспечивают формирование у привитых животных напряженного противорожистого иммунитета.

Штамм ВР-2 был выделен в 1931 г. в секции диагностики института Пас-тера в Бухаресте из трупа свиньи, павшей от рожи, и постепенно аттенуирован пассажами на различных средах. При этом штамм сохранил небольшую пато-генность для голубей и высокую иммуногенность для свиней (74, 97, 174). На твердых питательных средах растет в виде колоний Б-формы.

Из всех используемых для изготовления вакцин в нашей стране и бывших ГДР, НРБ, Румынии и Чехословакии аттенуированных штаммов эризипелот-риксов штамм ВР-2 имеет преимущество по иммунобиологическим показателям (70, 74).

В нашей стране жидкая вакцина из штамма ВР-2 выпускается длительное время, однако технология ее изготовления несовершенна и не обеспечивает достаточно высокого накопления бактерий в процессе культивирования (менее

о

1 млрд/см). При усовершенствовании условий выращивания вакцинного штамма за счет включения в состав полужидкой питательной среды, на основе перевара Хоттингера, печеночного экстракта и сахарозы удалось несколько увеличить накопление живых микроорганизмов - в среднем до 1,1 млрд/см3 (44).

Двукратная иммунизация свиней вакциной из штамма ВР-2 внутримышечно в дозе 2 х 108 живых микробных клеток обеспечивает невосприимчивость к заражению рожей в течение 6 месяцев (32, 36, 37).

По данным болгарских исследователей (102, 103) у поросят, привитых вакциной из этого штамма, содержащей от 5 до 50 млн живых бактерий, формируется стабильный иммунитет продолжительностью 7 месяцев.

При серийных пассажах через восприимчивых животных (молодых мышей) у штамма повышается вирулентность. Что, вероятно, связано с селекцией высоковирулентных особей. Так, в популяции исходного штамма ВР-2 выраженной вирулентностью обладают 10% клонов, а в популяции многократно пассированного варианта - до 52 %. Многократно пассированный штамм ВР-2

с продуктами метаболизма или с О-антигеном вирулентного штамма № 1329 также изменяет основные биологические свойства в сторону усиления ферментации углеводов и вирулентности.

В целом многолетняя практика производства и применения живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 как в СССР, так и за рубежом показала ее высокую эффективность (20, 32, 36, 70, 75, 76). Однако жидкая вакцина имеет ограниченный срок хранения, неустойчива к внешним воздействиям, в том числе к замораживанию и перегреванию. В процессе хранения жидкой вакцины значительная часть живых бактерий отмирает, в результате чего их количество в прививочной дозе уменьшается. Поэтому она не всегда обеспечивает формирование у привитых животных достаточно напряженного иммунитета (32, 36).

Г.Д.Глуховцев (19) в 1952 г. предложил способ изготовления сухих вакцин против рожи свиней из слабовирулентного штамма ВР-2 (ССВР) и авиру-лентного штамма «Штауб» (АВР). При изготовлении вакцин в качестве питательных сред для выращивания эризипелотриксов использовали среды на основе казеиново-печеночного или мясо-печеночного переваров с добавлением пептона, поваренной соли и двузамещенного фосфорнокислого натрия. Культивирование осуществляли в стеклянной посуде при 36-37°С в течение 36-48 ч. Затем к культуре добавляли 10%-ный раствор желатина и отмытую 2%-ную взвесь гидроокиси алюминия для коагуляции белка. Через 24-48 ч после осаждения культуру смешивали с формалинизированной сывороткой в количестве 40-50% от объема культуры или 40%-ным раствором сахарозы с 2% желатина в таком же количестве. Бактериальную суспензию расфасовывали в ампулы по 68см и высушивали в замороженном состоянии в вакуум-аппарате. Вакцины, изготовленные этим способом, по сравнению с жидкими препаратами, обладали некоторыми преимуществами: увеличенным до 1 года сроком годности, лучшей транспортабельностью и возможностью хранения при температуре ниже 0°С.

Сухую вакцину из слабовирулентного штамма ВР-2 (ССВР) выпускали в СССР биологической промышленностью с 1958 по 1970 г. Однако применение

гидрата окиси алюминия в технологии изготовления этого препарата ухудшало его качество, так как сорбированный антиген при замораживании в процессе изготовления вакцины резко изменяет свою дисперсность в результате агрегации частиц, быстро выпадающих в осадок (36).

В этой связи некоторыми исследованиями (32, 36) предпринимались попытки усовершенствовать технологию изготовления сухой живой вакцины из штамма ВР-2. При этом культуру вакцинного штамма эризипелотриксов выращивали в бульоне Хоттингера реакторным способом 36-40 ч. Затем осажденную путем центрифугирования бактериальную массу суспендировали в сахаро-зо-желатиновой защитной среде с 0,1% агар-агара или обезжиренном молоке, расфасовывали в ампулы по 2-4 см и подвергали лиофильной сушке. Количество иммунизирующих доз определяли из расчета содержания 200 млн живых микробных клеток в прививной дозе для свиней. Опытные серии препарата, изготовленные в промышленных условиях, при испытании на свиньях и белых мышах, были безвредными и иммуногенными, а средняя эффективная доза, предохраняющая от гибели 50% вакцинированных белых мышей, составила 23190 микробных клеток. Указанная технология вследствие низкого накопления бактерий в процессе выращивания (в среднем не более 1 млрд/см3) и значительного их отмирания при замораживании-высушивании не нашла практического использования в промышленном производстве.

По данным (108, 109) для культивирования штамма ВР-2 был разработан состав питательной среды на основе ферментативного гидролизата казеина, включающей глюкозу (0,5%), дрожжевой аутолизат (5%) и печеночный гидро-лизат (10%). Выращивание эризипелотриксов осуществляли в лабораторных ферментерах в течение 22 ч при непрерывной аэрации и без нее. Авторы показали, что количество жизнеспособных клеток было выше в культурах, подвергавшихся аэрации.

Рядом исследователей осуществлены работы по стабилизации штамма ВР-2 при высушивании (102, 104, 108, 121, 122) и регидратации эризипелотриксов из высушенного состояния (68, 99, 102). С положителными результатами в

качестве защитных сред использовали МПБ, 20%-ную сыворотку крови крупного рогатого скота, молочно-лактозо-сахарозную среду, обезжиренное молоко (99), сухой сывороточный альбумин в количестве 2,5 - 3,0% к культуре (102, 104), фибринозный гидролизат и желатозу (в соотношении 2,5 - 3,0 : 1,5 - 2,0) - 4 - 5% от объема вакцины (121, 122), гидролизат казеина с добавлением сахарозы, тиомочевины и агар-агара (109).

Для разведения высушенных культур эризипелотриксов испытывали МПБ, 5%-ный раствор пептона, обезжиренное молоко, 20%-ную сыворотку крови крупного рогатого скота, глюкозо-пептонный раствор (99), разбавитель, состоящий из 40% 4-процентной гидроокиси алюминия, 20% глицерина, 0,05% агар-агара, 1% поваренной соли и дистиллированной воды (68), мясопептонный растворитель из МПБ и физиологического раствора соответственно в соотношении 1:9 (102).

По данным И.Стоева и соавт. (102) сывороточный альбумин не оказывает влияния на антигенные свойства сухой вакцины из штамма ВР-2 и обладает большим защитным эффектом. Однако применение сывороточного альбумина требует технологического решения проблемы стерилизации, так как его нельзя подвергать тепловой обработке (122).

Натуральные продукты (сыворотка крови животных, молоко, мясные экстракты), используемые в качестве стабилизаторов и регидратантов, обладают рядом таких существенных недостатков, как антигенная активность, опасность контаминации культуры, отсутствие адъювантного действия (122, 206).

В настоящее время для активной специфической профилактики рожи свинеи в нашей стране осуществляется промышленное производство 3 вакцин, из них 2 живые (из штамма ВР-2 и депонированная из матрикса Конева) и 1 инактивированная - концентрированная гидроокисьалюминиевая формолвак-цина(7, 15,28).

Депонированная вакцина представляет собой жидкую культуру 2-го матрикса Конева, адсорбированную на фосфатном буферном растворе; вакцина из штамма ВР-2 - нативная живая культура слабовирулентного штамма; инакти-

вированная вакцина - из культур специально отобранных штаммов возбудителя рожи свиней серологического типа В, осажденных гидроокисью алюминия и инактивированных формалином.

Согласно НТД по изготовлению и контролю жидкой живой вакцины из штамма ВР-2 производственное выращивание эризипелотриксов осуществляется в реакторах с использованием питательной среды на основе перевара Хот-тингера с добавлением 0,3% поваренной соли, 0,5% двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1% однозамещенного фосфорнокислого калия (допускается добавление 2,5-5,0% печеночного экстракта). Продолжительность культивирования 24 ч при 35-36°С и перемешивании культуры в течение 1-2 мин через каждые 2-3 ч. Выращенная культура с концентрацией в 1 см не менее 500 млн живых бактерий используется в качестве вакцины. Срок хранения препарата 6 месяцев при температуре 5-10°С, однако он не всегда в пределах данного срока обеспечивает создание у привитых животных достаточно напряженного иммунитета. Жидкая вакцина нестандартна и неустойчива к внешним воздействиям.

Депонированная вакцина из 2-го матрикса Конева в производственных условиях изготавливается при культивировании бактерий рожи свиней в питательной среде на основе гидролизата Хоттингера, содержащей следующие компоненты: 0,5% химически чистого хлористого натрия; 0,1-0,15% агар-агара; 0,5% двузамещенного фосфорнокислого натрия; 1% пищевого желатина; 0,3% сахарозы. Культуру матрикса Конева выращивают в реакторе 20-24ч при периодическом перемешивании. После выращивания в культуру добавляют 4%-ный гидрат окиси алюминия (40% к объему культуры). Срок годности вакцины 10 месяцев. После применения этой вакцины у животных нередко наблюдается тяжелая поствакцинальная реакция.

За рубежом применяют живые противорожистые вакцины из штаммов АВР-9 (США, Швеция, Австрия, Италия, Норвегия), «Штауб» (Голландия, Бельгия), РСА, 31 (США), С7 (Канада), в Дании - Кондо вакцина и другие, а также инактивированные препараты (74, 107). Новая стандартная противоро-жистая вакцина ШЗ изготовлена в Германии (186).

В бывших социалистических странах преимущественно применялась вакцина из штамма ВР-2 и в меньшей степени вакцины из штаммов «Штауб» и АВР-9. Коммерческие живые вакцины, выпускаемые в Чехословакии (фирма «Хемапол»), в Германии («Дессау») и в Болгарии, представляют собой лиофи-лизированные культуры в ампулах, стандартизированные по количеству доз (3, 103). Отмечаются высокие иммуногенные свойства и слабая реактогеность вакцины из штамма ВР-2. Однако она имеет короткий срок годности и нестабильна при хранении.

По данным (102, 103, 104, 105) в бывшей НРБ для выращивания эризипе-лотриксов при изготовлении сухой вакцины из штамма ВР-2 используют МПБ с 10%-ной трипсинизированной сывороткой крови лошади. Продолжительность культивирования 24-48 ч при 37°С. Полученную культуру смешивают с защитной средой и подвергают лиофилизации. Одна доза вакцины содержит от 4 до 40 млн, а в некоторых случаях и до 400 млн живых бактерий. Однако, как правило, технология изготовления коммерческих препаратов, выпускаемых за рубежом, не расшифровывается.

В нашей стране созданы современные прогрессивные технологии изготовления бактериальных вакцин, применяемых в ветеринарной практике, на основе управляемого по значимым физико-химическим параметрам роста периодического глубинного культивирования микроорганизмов в ферментерах с использованием питательных сред из пищевого и непищевого сырья, эффективных средств стабилизации и регидратации сухих биопрепаратов. Изучена динамика, показатели роста эризипелотриксов - штамм ВР-2, в процессе периодического выращивания с позиций биологической активности и физиологического состояния культур, а также стабильности их биологических свойств. Полученные данные дополняют существующие представления о закономерностях процесса периодического культивирования микроорганизмов и служат основой для оптимизации условий выращивания бактерий в технологии изготовления бактериальных препаратов.

Разработаны управляемые по еН, рН, рОг, концентрации глюкозы процессы периодического глубинного культивирования бактерий рожи свиней в ферментерах. Установлены высокие воспроизводимость и повторяемость процессов. Производительность управляемого культивирования микроорганизмов по выходу бактериальной массы в 3,1 -7,2 раза выше, чем при их выращивании по традиционной технологии.

Разработаны экспресс-тесты определения стабильности биологической активности сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2: соответственно «30 мин. при 50°С» и «30 мин. при 60°С» и показана эффективность их использования для контроля стабильности этих препаратов.

Обоснована возможность создания эффективных стабилизаторов биологической активности сухих живых вакцин. Разработана защитная среда для вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2, которая позволила повысить стабильность сухих препаратов против рожи свиней более чем в 10 раз по сравнению с вакцинами, изготовленными по традиционным технологиям. Разработан эффективный растворитель для сухих живых вакцин против рожи свиней из штамма ВР-2.

Дана оценка вакцин против рожи свиней, изготовленных по разработанным технологиям, в сравнении с соответствующими коммерческими препаратами, изготовленными по традиционным технологиям. Показаны стабильность их биологических свойств и высокая иммуногенная активность.

На основании полученных материалов исследований по оптимизации условий культивирования, стабилизации культур микроорганизмов из высушенного состояния разработаны новые высокоэффекивные технологии изготовления сухих живых вакцин против рожи свиней из штамма ВР-2. Предложена технология изготовления растворителя для сухих вакцин против рожи свиней из штамма ВР-2. (67, 98,131).

Разработан и испытан с положительными результатами новый состав питательной среды с улучшенными ростовыми свойствами для глубинного пе-

риодического культивирования штамма Егуз1ре1о1;1шх гЬшюраЙиае ВР-2 при промышленном производстве живой сухой вакцины против рожи свиней.

Для активной профилактики рожи свиней наша биопромышленность производит живые (жидкую и сухую) вакцины из штамма ВР-2, депонированного из матрикса Конева, а также инактивированные вакцины - концентрированную гидроокисьалюминиевую формоловую и эмульгированную (по заявкам хозяйств).

В последние годы идет наращивание производства сухой живой вакцины из штамма ВР-2. Этот препарат, выпускаемый во флаконах на Щелковском биокомбинате, сохраняет в атмосфере азота жизнеспособность 90-100% клеток в пределах одного года (срок годности). Вакцина безвредна для белых мышей и свиней. Может применяться для внутримышечной или подкожной (доза 200 млн клеток) и пероральной иммунизации (2 млрд клеток) На ряде биопредприятий освоено производство сухой вакцины из этого же штамма в ампулах под вакуумом. Сухой препарат после двукратного введения обеспечивает формирование напряженного иммунитета в пределах 5-6 месяцев при соблюдении условий, препятствующих нормальной иммунобиологической перестройке организма (применение антибиотиков или других химиотерапевтических препаратов, несбалансированное кормление, особенно по белковым компонентам).

1.1.4. Изучение гуморального иммунитета при роже свиней

Для определения уровня антител в сыворотках крови при изучении напряженности иммунитета у свиней против рожи используют пробу роста (ПР, РА, РНГА и РТГА (58, 165, 167, 179). Однако не все перечисленные серологические реакции дают четкую зависимость между титром противорожистых антител и иммунной защитой. Так, по данным (58, 140, 167, 179), четкой корреляции между титром агглютининов и устойчивостью к заражению свиней рожей не найдено, а более чувствительной и достоверно отражающей иммунный статус является проба роста. При попытке оценить эффективность живой вакцины по результатам теста на пассивные защитные антитела мышей, зависимости

между процентом выживаемости мышей и высотой титров агглютининов не выявлено (208). Разработаны количественные методы контроля активности сыворотки против рожи свиней (29).

Существующий метод индикации специфических антител к роже в сыворотках крови больных и переболевших животных - реакция пробы роста, характеризуется рядом существенных недостатков: длительностью постановки реакции (24-48 ч) трудоемкостью, малой специфичностью и при серологической диагностике не применяется (48, 51, 52, 53).

Наиболее перспективным методом, применяемым для изучения гуморального иммунитета диагностики заболеваний различной этиологии является ИФА, который позволяет выявить и количественно оценить специфические антитела.

Метод, получивший название «Иммуноферментный анализ», первоначально был разработан для гистохимических исследований. В настоящее время он широко используется для определения мест локализации вирусных антигенов как в световой, так и в электронной микроскопии (12, 71, 92, 93, 137, 162, 181,205,208).

Иммуноферментный анализ, как способ количественного определения концентраций антигенов и антител в биологических жидкостях, был введен в лабораторную и клиническую практику в начале 70-х годов независимо друг от друга тремя группами исследователей (139, 159, 160, 161), которые объединили методику иммобилизации белков на поверхности твердой фазы с методами конъюгации антител и ферментов. Е. Engvall и P.Perlmann (159) предложили для гетерогенного (твердофазного) ИФА название ELISA, которое прочно утвердилось в литературе.

В процессе разработки твердофазных иммуноферментных реакций создано много методов, которые разделяются на конкурентные и неконкурентные. Схемы различных вариантов ИФА для определения антител приведены в таблице 1.

Определение антител методами твердофазного ИФА

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Моисеева, Наталья Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Проанализированы и определены теоретические, научно-технологические и технические основы, строгое выполнение которых, дает возможность получить референс-вакцину живую сухую против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:1тх гЬшюраЙиае ВР-2, которые заключаются в: - в высококвалифицированных, подготовленных специалистах;

- в устройстве производственных помещениях, отвечающих «Правилам безопасности, производственной санитарии, охранно-карантинного и ветеринар-но-санитарного режимов на предприятиях биологической промышленности;

- в наличии технических средств, оборудования, измерительных приборов, средств автоматизации технологических процессов, отвечающих высоким требованиям;

- в обеспечении промышленного производства сырьем и материалами, отвечающими предъявляемым требованиям и ГОСТам;

- в методическом и методологическом обеспечении специалистов;

- в наличии утвержденных нормативно-технологических документов;

- в срочном учете и соблюдении технологических и технических параметров производства;

- в подборе, поддержании и хранении производственного штамма обладающего высокой специфической эффективностью, широким иммунологическим спектром, создающим длительный и напряженный иммунитет у вакцинированных животных высокогарантированной безвредности;

- в создании технико-технологических и биологических условий для получения вакцины, высокогарантировано отвечающей требованиям утвержденных ТУ;

- в длительном сохранении необходимого качества вакцины.

2. Усовершенствован технологический этап получения инокулята и опре5 делена оптимальная концентрация (0,05 - 0,15 млрд/см ) живых микроорганизмов в посевном материале, используемом при промышленном глубинном культивировании на новой питательной среде. Дополнения и изменения вошли в инструкцию по промышленному изготовлению живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2.

3. Изготовлена живая сухая референс-вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2, содержащая 4+1 млрд/см живых микроорганизмов, сохраняющая 80-100% их количества в течение 1 года хранения и отвечающая всем требованиям ТУ 08064-19-37-95.

4. Изучен гуморальный иммунный ответ в сравнении у трансгенных и не-трансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной из штамма ВР-2. Установлено, что у трансгенных свиней показатель гуморального иммунитета был выше, чем у нетрансгенных.

5. Гуморальный иммунный ответ у трансгенных и нетрансгенных свиней изучали в сравнении двумя методами: проб роста и ИФА. Установлена высокая зависимость между показателями, полученными этими методами, коэффициент корреляции равен 0,87, р=0,05.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Моисеева, Наталья Анатольевна, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Бакулов И.А. Новые проблемы эпизоотологии.//Международная научно-практическая конференция, посвященная 40-летию ВНИИВВиМ/ТПокров, 1998,с.135-138.

2. Бартнинкас И., Каминскас В., Мартусявичене А. Изучение эффективности аэрозольной и пероральной иммунизации ассоциированными вакцинами (из местных культур коли, ревертантов сальмонелл, матрикса Конева и из штамма ВР-2 рожи свиней) с последующим обезвреживанием и дезодорацией помещений.//Тр.Лит.вет.акад. и Лит.НИИ ветеринарии//1987, вып. 18, с.27-33.

3. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения биомембран при охлаждении. // Киев, Наукова Дума, 1982, 400с.

4. Билетова Н.В., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. Возбудитель рожи свиней.//Справочная микробиология.//М., 1980, с.40-44.

5. Богданов В.М., Рогожин Н.С., Авакян Б.Г., Абдулаев У.Л., Шевченко Ю.Н. Актуальные проблемы ветеринарной науки и практи-ки.//Тез.докл.науч.-практ.конф., 26-27 марта 1987//Самарканд, с.6-7.

6. Богатырев А.Н., Эрнст Л.К. Генная инженерия сельскохозяйственных животных - мощный рычаг селекции XXI века.// «Генноинженерные сельскохозяйственные животные» - Сб.науч.трудов - выпуск I // М., 1995, с.З-17.

7. Рожко Г.К. Рожа.//Справочник по болезням свиней. Под ред. А.И.Собко, И.Н.Гладенко // Киев, 1981, с.63-67.

8. Бойко A.A., Хорьков И.А. Перспективы использования антивидовых иммуноглобулинов, меченых пероксидазой, в ветеринарии и животноводст-ве.//Вест.с/х науки - 1987, №9, с.96-100.

9. Борисенкова А.Н., Лебедева А.И., Гаврилова B.C., Шестаков Н.П., Кузь-менко В.В., Куликов Д.К., Аблокулов И.С. Производственные испытания инактивированной сорбированной вакцины ВНИВИП против пастерелле-за птиц.//Система мероприятий по обеспечению эпизоотического благополучия и эффективности птицеводческих хозяйств промышленного ти-па.//Тез.док.-Иркутск, 1986, с.51-52.

Ю.Брем Г., Эрнст JI.K., Андропов J1.A., Васильева Э.Г., Акольников В.Е., Королева И.Л. Трансгенные свиньи (MT-lhgrf), оценка качества туш и химического мяса при убое животных.// «Генноинженерные сельскохозяйственные животные» Сб.науч.трудов - выпуск I // М., 1995, с.41-48.

П.Брем Г., Эрнст Л.К., Васильева Э.Г., Акольников В.Е. Оценка роста и развития первого поколения трансгенных свиней (MT-lhgrf), в процессе он-тогенеза//«Генноинженерные сельскохозяйственные животные» Сб. на-уч.трудов - выпуск I // М., 1995, с.26-34.

12.Васильев A.B., Непоклонова И.В. Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций.//Ветеринария,- 1982, №8, с.63-65.

13.Венгеров Ю.Ю., Буларгина Т.В., Куш A.A. и др. Современные методы иммуноферментного анализа для диагностики вирусных инфек-ций.//Биотехнология. -1987, т.З, №3, с.291-295.

14.Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я. Иммуноферментный анализ. // Ветеринария,-1983, №9, с.68-70.

15.Воронин Е.С., Романова М.В. Рожа свиней: профилактика и меры борь-бы./Юбзорная информация. - М., 1987, с.45.

16.Геведзе В.И., Андросик H.H., Ленькова В.А. Рожа. // Профилактика болезней свиней в комплексах. - Минск, 1982, с.30-34.

17.Гельцов Л.П., Сковородин E.H., Устин В.В. Сравнительная морфология органов воспроизведения трансгенных (MT-lhgrf) и контрольных свиней//

«Генноинженерные сельскохозяйственные животные» Сб.науч.трудов -выпуск I // М., 1995, с.62-64.

18.Гирард Б., Спем Э. Рост. Биохимические факторы. Методы общей бактериологии/Под ред. Герхардта Ф. пер с англ. - М., Мир, 1983, с. 198-277.

19.Глуховцев Г.Д. Способ изготовления сухих вакцин против рожи у свиней. A.c. 125874 СССР, Кл. 30 h,g, заявл. 07.02.52; опубл. в 1969, Бюлл. №3, с.2

20.Глуховцев Г.Д., Дьяконов О.Б., Подлесных JI.A., Лукьянченко A.B. Проверка иммуногенных свойств вакцинных штаммов рожи свиней.//Труды государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов - Т.ХИ, М„ 1964, с.212-218.

21.Головкина Г.П., Каменева Е.М., Спевак М.В., Гримонина Л.Ф. Ферменто-лизаты биомассы микроорганизмов - высокоэффективная белковая основа производственных и диагностических питательных сред в биотехнологии ветеринарных препаратов .//Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биохимических препаратов. - Тез.докл. 3-й Всесоюз. конф. 21-23 октября 1987. -М., 1987, с.107.

22.Гусев A.A., Панин А.Н. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных полимеразной цепной реак-ции.//Владимир, 1998.

23.Девришов Д.А. Иммунофлуоресцентная диагностика вирусных респираторных инфекций телят.//Ветеринария.-1985, №3, с.67-68.

24.Дзантиев Б.Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа.//Бюл. ВИЭВ, - 1985, вып.58, с.10-22.

25.Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа.//ЖВХО, 1982, т.27, №4, с.442-449.

26. Душук Р.В, Подлесных Л.А., Зубец H.A., Исаченко И.В., Юсов E.H. Перо-ральная иммунизация свиней против рожи. // Ветеринария. - 1982, №4, с.26-27.

27. Душук P.B, Подлесных JI.А., Зубец H.A., Глебов А.Е., Мамчиц Ф.Н. Про-

9

изводственное испытание пероральной иммунизации свиней против рожи свиней.//Актуальные вопросы эпизоотологии. - Тез.докл. Всесоюз. науч. конф. 8-10 июля 1983 г. - Казань, 1983, с.117-118.

28.Душук Р.В, Подлесных Л.А., Дьконов О.Б., Зубец H.A., Звозчик В.В., Ба-ратюха В.В., Колесников А.Я. Специфическая профилактика рожи сви-ней.//Ветеринария. —1989, №3, с.33-35.

29.Душук Р.В, Подлесных Л.А., Горбунова И.В., Козырев Ю.А. Количественный метод контроля активности сыворотки против рожи свиней.// «Биопрепараты, методы их стандартизации и контроля.» - сборник научных трудов - М., 1990, с.63-70.

30. Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А., Доценко В.В., Бондаренко В.Е. Контроль качества производственных серий сухой ассоциированной вакцины против рожи и чумы свиней.// Труды ВГНКИ «Совершенствование методов изготовления и контроля диагностических ветеринарных препаратов» -труды 26, М., 1978.

31.Дьяконов О.Б., Агеева Л.С., Подлесных Л.А., Фисенко О.Ф., Юдина И.С. Иммунобиологические свойства сухой ассоциированной вакцины против чумы и рожи при проверке на свиньях.//Труды Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов МСХ СССР. - т.ХХ, М„ 1974, с. 167-172.

32.Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Сухая концентрированная противорожи-стая вакцина ГНКИ из штамма ВР-2.// Труды Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов МСХ СССР. - t.XVIII, М., 1972, с.231-236.

33. Дьяконов О.Б, Агеева Л.С. Изготовление сухой ассоциированной вакцины против чумы и рожи свиней.//Труды Государственного научно-

контрольного института ветеринарных препаратов. - т.XVI, М., 1969, с.236-241.

34. Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Изучение биологических свойств депонированной вакцины против рожи свиней в процессе ее хранения./АГруды Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов. -т.XII, М., 1964, с.218-225.

35.Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Изготовление и проверка иммуногенных свойств эмульгированных вакцин против рожи свиней на свиньях и лабораторных животных.// Труды ВГНКИ - т.ХШ, М, 1968, с.207-212.

36.Дьконов О.Б., Подлесных Л.А., Доценко В.В., Бондаренко В.Е. Разработка промышленной технологии и метода контроля сухой концентрированной вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2.//Тр.института / Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов. -1978, т.27, с.21-25.

37.Дьконов О.Б., Подлесных Л.А., Фисенко О.Ф., Юдина И.С. Иммунобиологические свойства сухой концентрированной противо-рожистой вакцины из штамма ВР-2.// Научно-практическая конф. Всесоюзного научно-контрольного института ветпрепаратов. Тезисы докладов. -М., 1972, с.93-95.

38.Дьконов О.Б., Агеева Л.С., Подлесных Л.А., Фисенко О.Ф., Юдина И.С. Изучение иммунобиологических свойств сухой ассоциированной вакцины против чумы и рожи свиней в сравнительном аспекте с моновакцинами. Научно-практическая конф. Всесоюзного научно-контрольного института ветпрепаратов. Тезисы докладов. -М., 1972, с.95-97.

39. Дьяконов О.Б., Шаповал Н.И. Итоги производственного испытания сухой ассоциированной вакцины против чумы и рожи свиней и сухой концентрированной противорожистой вакцины из штамма ВР-2.// Научно-

практическая коиф. Всесоюзного научно-контрольного института ветпре-паратов. Тезисы докладов. -М., 1972, с.97-99.

40.Дьяконов О.Б., Подлесных JI.A., Доценко В.В. Иммуногенная активность производственных серий сухой ассоциированной вакцины против рожи и чумы свиней.//Труды института. Всесоюзный Государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов. - 1980, т.29-30, с.244-246.

41.Ениколонов Т.Н., Захарченко В.И., Гришук М.А. и др. Получение трансгенных кроликов, содержащих и экспрессирующих ген соматропина чело-века.//Доклады АН СССР - 1988, №5, с.1246-1249.

42.Ефимова Т.И., Сроки выживания возбудителя рожи свиней в сухой вакцине из матрикса Конева.// Научно-практическая конф. Всесоюзного научно-контрольного института ветпрепаратов. Тезисы докладов. - М., 1972, с.99-100.

43.Изотова H.A., Бурцев В.И., Кушнир А.Т., Бондаренко И.М. Жизнеспособность бактерий рожи свиней в аэрозоле.//Ветеринария. - 1975, №6, с.55-57

44.Зайцева Г.И., Чудинова А.Д. Исследования по культивированию вакцинного штамма рожи свиней ВР-2 в ферментерах.Юкспресс-информация института. Всесоюзный научно-исследовательский институт биологической промышленности. - 1978, №5, с.99-101.

45.Карышева А.Ф., Карышев C.B. Рожа.//Инфекционные болезни животных / Под ред. Р.Шишмаревой. - Кишинев, 1989, с.422-434.

46.Рахманин П.П., Самуйленко А.Я., Ломакина Т.А. Основные направления развития агробиологической промышленности России.//Курская биофабрика -100 лет. - Курск, 1996, с.285-299.

47.Кленовицкий П.М., Завада А.Н., Живалев И.К., Некрасов A.A. Ядрышко-образующие районы у трансгенных свиней (MT-1/hgrf).// «Генноинженер-ные сельскохозяйственные животные» - Сборник трудов - выпуск 1, М., 1995, с.64-68.

48.Клюкина В.И., Бойко A.A., Ярцев М.Я., Шишов В.П., Блехерман Б.Е. Сравнительная оценка методов получения антигенов бактерий рожи свиней для ИФА.//Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов. Тезисы докладов 3 Всесоюзной конференции - Щелково, 1987, с.211-212.

49.Клюкина В.И., Бойко A.A., Простяков А.Н. Получение иммунно-пероксидазных конъюгатов к IgG свиньи. //Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. - М., 1986, №8, с.5-6.

50.Клюкина В.И., Синицин В.А., Стерчук А.П., Бойко A.A., Собко А.И. Методические рекомендации по применению метода ИФА для выявления ко-ронавируса ТГЭС свиней и специфических антител.// Москва, 1987.

51 .Клюкина В.И., Бойко A.A., Ярцев М.Я., Шишов В.П. Индикация антител к роже свиней методом ИФА.//Материалы Всесоюзной конференции эпиз. эпидемиология, средства диагностики терапии и спец. профилактики инф.болезней, общих для человека и животных. - Львов, 1988, с.140-141.

52.Клюкина В.И., Ярцев М.Я., Шишов В.П, Блехерман Б.Е., Самуйленко А.Я. Иммуноферментный метод в диагностике рожи свиней. //Биохимия с/х животных и продовольственная программа. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. - Киев, 1989, с.41.

53.Клюкина В.И., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И. Перспективы использования мультиантигенного варианта ИФА для диагностики инфекционных болезней свиней. // Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарии и медицине. Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции. - Нижний Новгород, 1990, с.69-70.

54.Клюкина В.И., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И. Оценка качества противо-рожистой сыворотки методом ИФА.//Биотехнология и биофизика микробных клеток. Тезисы Всесоюзной конференции. - Алма-Ата, 1991, с. 106.

55.Клюкина В.И. Сравнительная оценка методов выделения иммуноглобулинов из сыворотки свиней. // Научные основы техн. пром. пр-ва ветер, биопрепаратов. Тезисы докладов 2-й Всесоюзной конференции ВНИТИБП. -Щелково, 1981,с.154-155.

56.Клюкина В.И., Бойко A.A., Простяков А.П. Получение моноспецифических антисывороток к IgG и IgM свиньи. // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. - М., №10, 1984, с.6-7.

57.Клюкина В.И., Бойко A.A., Простяков А.П. Удаление липидных веществ из сыворотки крови свиней. // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. -М., 1985, №1, с.6-7.

58.Коваленко Я.Р., Сидоров М.А., Татаринцев НТ. Антитела сывороток крови и напряженность иммунитета против рожи у свиней. // Докл. ВАСХ-НИЛ. - 1970, №8, с.25.

59.Конопаткин A.A. Материалы многолетних исследований комплексной иммунизации свиней и ее эффективность. // Сб. статей института / Азерб. сельскохозяйственный институт им. С.Агамалиоглы. - 1984, с.84-104.

60.Ковалев Г.К. Некоторые вопросы биологии Erysipelothrix rhusiopathiae // Ж. Микробиологии. - 1982, №3, с.11-18.

61.Коняеев М.Т. Зависимость эффективности использования противорожи-стых вакцин от их иммуногенности и схем применения. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции 24-25 октября 1978,-М„ 1978, с.80.

62.Козакова Л.В., Булла И. Цитогенетический анализ трансгенного хряка (МТ-ШдгТ) и его потомства. // «Генноинженерные сельскохозяйственные животные». Сборник трудов. - выпуск 1, М., 1995, с.68-73.

63.Колоскова Л.С., Душук Р.В., Подлесных Л.А., Козырев Ю.А. Сравнительная оценка иммуногенности противорожистых вакцин. // Биопрепараты, методы их стандартизации и контроля. Сборник научных трудов. - М-, 1990, с.70-77.

64.Кэрсак Э. Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретация результатов. //Бюл.ВОЗ. - 1985, №4, с.118-139.

65.Лапшин С.А., Эрнст Л.К., Мотяев В.И. Особенности жирнокислотного состава тканей трансгенных свиней. // «Генноинженерные сельскохозяйственные животные». Сборник научных трудов - выпуск 1, М., 1995, с.58-62

66.Летецкий В.А., Геведзе В.И. Иммунобиологические показатели при энте-ральной иммунизации свиней против рожи. // Межвед.сб./Белорусский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии. -1984, вып.22, с.17-21.

67.Мельник Н.В. Разработка, усовершенствование и оптимизация промышленных технологий производства диагностикумов и противобактерийных вакцин.//Докторская диссертация, М., 1997.

68.Меркулов В.П., Энштейн А.Б. Сухая вакцина против рожи свиней из мат-рикса Конева с депонирующим разбавителем. // Сб. работ по вопросам производства и применения биологических препаратов. - 1969. №3, с.4-6.

69.Мирошничеснко О.Н., Захарченко В.И., Прокофьев М.И. и др. Получение трансгенных кроликов с геном ас РНК против ЕА - области аденовируса А5//Доклады ВАСХНИЛ. - 1983, №5, с.31-32.

70.Мотовски А., Йорданов С. Някои актуали въпроси относко червенката по свинете. // Ветеринарна сбирка. - 1985, №6, с. 19-21.

71.Науменков В.И. Применение иммунопероксидазного метода для индикации вирусных антигенов в культуре клеток. // Ветеринария. - 1984, №7, с.70-71.

72.Науменко П.А., Владимиров B.JL, Фридберг Р.В., Школьник Г.С. Биохимические показатели крови органов свиней.// «Генноинженерные сельскохозяйственные животные». Сборник научных трудов. - выпуск 1, М., 1995, с.48-54.

73.Ленкоффа Г., Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ. // М., Мир, 1988. С.446.

74.Никифорова Н.М., Дьяконов О.В., Подлесных Л.А. Рожа свиней. // Ветеринарные препараты. / Под ред. Осидзе Д.Ф. - М., 1981, с.266-274.

75.Никифорова Н.М., Дьяконов О.Б. Подлесных Л.А. Изготовление сухой сепарированной вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 и проверка ее иммуногенных свойств на свиньях.// Труды ВГНКИ - t.XIII, М., 1968, с.218-222.

76.Никифорова Н.М., Дьяконов О.В., Лукьянченко A.B. Достижения ветеринарной науки и практики в борьбе с рожей свиней и пастереллезом сельскохозяйственных животных. // Труды Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов. - t.XIV, М., 1987, с.186-196.

77.Никифорова Н.М. Современные методы активной профилактики пасте-реллеза птиц. // Труды Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов, - т. 10, М., 1962, с. 192-200.

78.Никаноров Б.А. Рожа свиней. // Краевая эпизоотология Нечерноземной зоны РСФСР/ Под ред. Урбана В.П., Таршиса М.Г. - М., 1980, с.95-105.

79.Вышелесский С.Н., Андреев П.Н. Рожа. // Избранные труды. - М., 1977, с.431.

80.Новиков Б.В., Балышева В.И, Дмитренко В.В., Чурбанова Г.Н., Федоров Д.Г., Жестеров В.И., Вишняков И.Ф., Полтавцева P.A., Эрнст JI.K. Имму-нореактивность свиней, трансгенных по гену соматропного гормона. // ВНИИВВиМ, «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных». - Покров, 1998, с. 190-191. Панин АН

81г^ушук Р.В. Рожистая инфекция. // Ветеринарная газета, 1998.

82.Подлесных JI.A., Дьяконов О.Б. Изучение некоторых маркеров вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя рожи свиней. // Труды института Всесоюзный Государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов. - т.20, 1974, с. 179-183.

83. Петров Р.В., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины. М, Мед-наука, 1988, с.288.

84.Плотникова A.B., Зелкова Н.Г. Трансгенные свиньи с геном MT-1/hgrf и перспективы их использования в селекции. // «Генноинженерные сельскохозяйственные животные». Сборник трудов - выпуск 1, М., 1995, с.73-85.

85.Подлесных JI.A., Дьяконов О.Б. Изучение некоторых маркеров вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя рожи свиней. // Труды Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов МСХ СССР. -т.ХХ, М., 1974, с.179-184.

86.Подлесных JI.A., Дьяконов О.Б., Душук Р.В., Никифорова Н.М., Зубец H.A., Доценко В.В., Бондаренко В.Е. Сухая живая вакцина против рожи свиней. //Ветеринария. - 1985, №3, с.31-33.

87.Подлесных JI.A., Исаченко И.В., Доценко В.В., Бондаренко Н.В. Стандартизация биопрепаратов против рожи свиней. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции 19-21 ноября 1981, - М, 1981, с.72.

88.Подлесных Л.А. Изучение иммунобиологических свойств некоторых штаммов возбудителя рожи свиней. // Труды ВГНКИ «Совершенствование технологии изготовления и контроля ветеринарных препаратов за период 1967-1977 гг. - т.24, с.201-206.

89.Прокофьев М.И. Достижения использования эмбриологии в животновод-тве. // Международный сельскохозяйственный журнал. - 1987, №1, с.43-46

90.Прокофьев М.И., Лагутина И.С., Эрнст Л.К. Результаты исследований по

созреванию и оплодотворению ..... коров вне организма. // Материалы

конференции «Проблемы и перспективы биотехнологии». - Братислава, 1989, с.60-61.

91.Прудников С.И. Влияние концентрированного аэрозоля вакцины бактерий рожи на развитие иммунитета у свиней. // Зональн. Научно-производственная конференция научных и практических работников Урала и Сибири по инф. и незараз, болезням свиней. Тезисы докладов. -Омск, 1974, с.40-44.

92.Реутова Е.Г. Иммуноферментный метод диагностики вирусных заболеваний. //Ветеринария. - 1980, №7, с.25-27.

93.Реутова Е.Г., Чевелев С.Ф., Архипов Н.И. Иммуноферментный метод в вирусологических исследованиях (обзор литературы). // Ветеринария. -1976, №3, с.53-55.

94.Рогожин П.С. Рожа. // Инфекционные и инвационные болезни свиней в Узбекистане. / Отв.ред. Иргашев И.Х., 1985, с.44-51.

95.Рогожин П.С., Богданов В.М., Авакян Б.Г. Аэрозольная иммунизация подсвинков против рожи жидкой вакциной из штамма ВР-2. // Профилактика инфекционных болезней животных в Узбекистане. / Отв. ред. Иргашев И.Х. - Ташкент, 1984, с.65-69.

96.Рогожин П.С., Богданов В.М., Авакян Б.Г. Аэрозольная иммунизация свиней против рожи свиней депонированной вакциной. // Труды института / Узб. научно-исследовательский вет.институт. - 1986, Т.38, с.52-55.

97.Регузов B.C. Эризипелотриксы. // Ветеринарная микробиология / Под ред. Козловского Е.В., Емельяненко П.А. - М., 1982, с. 198-203.

98.Скичко Н.Д., Мельник Н.В., Зенов Н.И., Тройнин A.C., Алкеева О.С., Каськов A.B. Усовершенствование технологии производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов.- 1996, с. 105.

99.Сидоров М.А., Джубандыкова М.С. Реактивация лиофилизированных культур возбудителя рожи свиней. //Ветеринария. - 1974, №2, с.46-47.

100. Сидоров М.А., Тарасенок Н.И. Вирулентность и иммуногенность вакцинного штамма ВР-2 рожи свиней. // Бюлл. института / Всесоюз. научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии. - 1981, выпуск 42, с.72-74.

101. Смирнова Н.И. Возбудитель рожи. // Ветеринарная микробиология. -Минск, 1979, с.144-146.

102. Стоев И., Върбанов М. Метод за получивание на лиофилизирана ави-рулентна ваксине VR-2 против червенка по свинете: A.C. 22589 НРБ, 2 (51) С12К 5/00. //заявл. 22.01.75, опубликовано 20.04.77, с.5.

103. Стоев И., Христова X., Йотов М. Опити за стандартизиране на ваксина червенна - VR-2 в зависимост от концентрацията на бактериите. // Научни трудове./Съюз на научните работници в България. - Клон Враца, 1982, т.6, с.601-609.

W _

104. Стоев И., Йотов М., Божилов С., Христова X., Тодорова Р. Проучвания върху иммуногенните качества на ваксина против червенна по свинете -VR-2, лиофилизирана с рулични поддържащи среды. // Научни трудове,

т.4, 2-й Международной конф. по проблемите и профилактиката на про-мышленото свиневъдство. Научн.докл. -Враца, 1975, с.233-240.

105. Стоев И., Лилов И. Изгитване иммуногенноста на червенковия штамм ВР-2 культивирован върху различии хронители среди.//Научни трудове / НИИ иммунопрофил.болезней свиней. - Враца, 1974, т.З, с.117-123.

106. Тарасенок Н.И. Изменчивость возбудителя рожи свиней. // Докл. ВАСХНИЛ. - 1984, №10, с.39-40.

107. Татаринцев Н.Т., Биологические свойства вакцинных штаммов рожи свиней. // Труды института / Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии. - 1971, т.29, с. 144-149.

108. Тазетдинова Р.А., Котылев О.А., Никитина В.А. Эффективность питательной среды из ферментативного гидролизата казеина для культивирования вакцинного штамма ВР-2 возбудителя рожи свиней. // Туды института. / Казанский ветеринарный институт им. Н.Э.Баумана. - 1982. С.4-8.

109. Тазетдинова Р.А., Котылев О.А., Обоснование эффективности технологии лиофилизации вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 для аэрозольного применения. // Груды института. / Казанский ветеринарный институт им. Н.Э.Баумана. - 1982. С.3-4.

110. Тарасенок Н.И. Изменчивость свойств вакцинного штамма ВР-2 рожи свиней. // Ветеринария. - 1974, №2, с.50-51.

111. Тарасишин Л.А. Иммуноферментный анализ и его модификации в исследовании вирусных антигенов. // Микробиологический журнал. - 1986, т.48, №4, с.99-104.

112. Телишевская Л.Я., Трусова Л.И. Особенности обмена веществ возбудителя рожи свиней. // Труды института / Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов. - 1980, т.29-30, с.247-252.

113. Телишевская Л.Я., Трусова Л.И. Значение углеводов для роста Listeria monocytogenes и Erysipelothrix insidiosa. // Труды института / Всесоюзный

государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов. - 1974, т.20, с.251-254.

114. Томеску В., Гиврилэ Д. Рожа свиней // Зоонозы. - М., 1982, с.109-113.

115. Трусова Л.И., Телишевская Л.Я., Потребность Erysipelothrix insidiosa в некоторых минеральных компонентах. // Труды института / Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветпрепаратов. - 1974, т.20, с.247-250.

116. Третьяков А.Д. Мероприятия по профилактике и ликвидации инфекционных болезней животных. //Ветеринарное законодательсво. -М., 1981, с. 75-199.

117. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Свемникова Л.П. Влияние условий культивирования на синтез бруцеллатина. // Антибиотики и медицинская биотехнология. - 1985, выпуск.30, №10, с.754- 757.

118. Урбан В.П. Практикум по эпизоотологии.//1981, с.188-190.

119. Хасанов Ч.Г. Аэрозольная вакцинация свиней против чумы, болезни Ауески и рожи. // Труды института. / Казанский ветеринарный институт. -1983, с.66-69.

120. Харитоненков И.Г., Христова М.Л. Использование иммуноферментных методов в вирусологии. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1985, №6, с.3-15.

121. Христова X., Нинов Н.В., Диловска X. Защитная среда за лиофилизи-ране на жива ваксина против червенка по свинете - VR-2. // Вет. Мед. науки. - 1984, т.21. №7/8, с.57-61.

122. Христова Х.В., Нинов Н.В., Диловская Х.Г. Защитная среда за лиофи-лизиране на жива вакцина против червенки по свинете VR-2: А.С.36960 НРБ, 3(51). Кл. AGIK 39/20. //Заявлено 14.11.83, опубликовано 15.03.85. Бюлл.№3, с.4.

123. Шихов И.Я., Эрнст JI.K., Некрасов A.A., Кущ A.A., Семеняченко В.П., Васильев И.Н., Гращук М.А. Получение трансгенных свиней. // «Генно-инженерные сельскохозяйственные животные». Сборник трудов. - выпуск 1, М., 1995, с.85-93.

124. Шишов В.П., Никаноров Б.А., Передереев Н.И., Сощик Г.Г., Филиппова Г.И. Питательная среда для выращивания бактерий рожи: A.C. 497335ССР, МКИ3С12И 1/06. // Заявлено 03.06.74., опубликовано 30.12.75, Бюлл. №48, с.2.

125. Шишов В.П., Никаноров Б.А., Передереев Н.И., Вахрушева В.И. Испытание жидкой питательной среды для культивирования бактерий рожи в реакторах. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. / Тезисы докладов 2-й Всесоюзной конференции 19-21 ноября 1981,- М., 1981, с. 132-134.

126. Шишов В.П., Никаноров Б.А., Передереев Н.И. Культивирование мат-рикса II вакцины Конева в реакторах. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. / Тезисы докладов 2-й Всесоюзной конференции 19-21 ноября 1981,- М., 1981, с. 65-66.

127. Шур И.В., Будко М.П. Рожа свиней. // Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства мяса и мясных продуктов./ Под ред. Будко М.П., Костенко Ю.Т. - М., 1983. С.155-158.

128. Эрнст JI.K., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. //М., «Колос», 1995, с.191.

129. Эрнст JI.K., Брем Г., Устин В.В. Зоотехническая и физиолого-биохимическая оценка трансгенных свиней с геном рилизинг фактора со-матропного гормона. // «Генноиженерные сельскохозяйственные животные». Сборник научных трудов. - выпуск 1, М., 1995, с. 17-26.

130. Эрнст JI.К., Голубев А.К., Макарова З.Н., Дорожилов А.Е., Кузьмина Т.И., Царенко Р.Г., Шнур А.И., Федотов Г.П. Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной in vito яйцеклетке коровы. // Вестник сельскохозяйственных наук. - 1983, №7, 1995, с.30-37.

131. Ярцев М.Я., Шишов В.П., Доценко В.В., Евдокименко Н.И. Усовершенствование некоторых стадий при изготовлении сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2. // «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» -1996, с.112.

132. Aagaard М. Rodsygeinfektioner hos svin // Dansk Vet. Tidsskr. - 1982, vol. 65, №1, p.2-8.

133. Alen W.K., Raison E.A., Surgical and non-surgical egg transfu in horses. -J. Riprod Fert., 1975, suppl, 23, p.525-530.

134. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. A microplate method of enzyme linked immunosorbent assay and its application to malaria. // Bull. Wld. Hlth. Org.- 1974, v.51, p.209-211.

135. Ansari A.A., Hattikudur N.S., Joshi S.R., Medeira M.A. ELLISA solid phase: Stability binding characteristics. // J. Immunol. Meth., v.84, №1-2, p.l 17-124.

136. Anderson G.B., Behboodi E., Pacheco T.V., Cultured inner cell masses from in vitro derived lovine blastocysts. Theriogendogy, 1992, 37,177, Abstr.

137. Avrameas S. Immunoenzyme technigues: enzymes as markers for the localization of antigens and antibodies. // Int.rev.cyt. - 1970, v.21, p.439-485.

138. Avrameas S. Enzyme immonoassays and related technigues: development and limitations. // Curr. Top. Microbiol, and Immunol. - 1983, v. 104, p.93-99.

139. Avrameas S., Guilbert B. Dosage enzyme-immunologique de proteines a l'aide d'immunoadsorbant et d'antigenes marques aux enzymes. // C.R. Acard. Sci. (Paris). - 1971, v.273, p.2705-2707.

140. Binder J.F., Mat bois H. Zur Bestimmung der Wertigheit von rotlanf-hyperimmunseren von Folerder und Rinfern. // Wiener Tierarztliehe Monat sschridt. - 1985., Bd.72, №1, s.1-7.

141. Boorsma D.M., Streefkerk J.G. Periodate or glutaral - dehyde for preparing peroxidase conjugate? // J. Immunol. Meth. - 1979, v.30, p.245-255.

142. Boland M.P., Use of the rallit oviduct as a sereening tool for the viability of mammalian eggs. // The riogenology. - 1984, v.21, p.126-127.

143. Bolton V.N., Oacles P.J., Johnson M.H., The relationship letveen cleavage, DNA replication and expression in the mouse 2-cell embryo. // J.Embryol. exp. morph. - 1984, v.79, p.139-163.

144. Brachett B.G., Bousguet., Boice M.L., Donaiving W.J., Evans J.V., Pressel M.A. Normul development do lloving in vitro dertilization in the cow. // Biol. Reprod. - 1982, v.27, p. 147-158.

145. Brem G. Transgenic animals. // In. Biotecnology, VCH, in press. - 1992, p.745-832.

146. Brem G., Kronsslich H. Szilvassy eineiiger kinderunillinge durch Embryo -Microchirurgie. //Bert. Munch. TurarzH. Wshr, 1983, v.96, p.153-157.

147. Brem G., Brenig B., Goodman H.M. et al. Production of transgenis mice, rabbits and pig by microinjection into pronuclie. // Zuckthyg., 1985, v.20, p.251-252/

148. Bullock S.L., Walls K.W. Evaluation of parame - ters of the enzyme-linked immunospecific assay. //J.Infect. Dis. - 1977, v.136, suppl., p.279-286.

149. Choudary J.B., Gier H.T.< Marion G.B. Cyclic changes in bovine vesicular follicles. //J.Anim.Sci., 1968, v.27, p.468-478.

150. Church R.B., Schaufele F.J., Meckling K. Embryo manipulation and gene transfer in livestock. // Can. J. Anim. Sei. - 1985, v.65, p.527-538.

151. Chupin O., Combarnous V., Procureur R. Different of LN on FSH - induced superovulation in tivo breds of cattle. // Theriogenology - 1985, v.23, p. 184187.

152. Cheng W.T.K., Moor R.M., Polge C. In vitro fertilization of pig and sheep oocytes matured in vivo in vitro. // Theriogenology - 1986, v.25,p. 146-150.

153. Crosa G., Glakton F. Serological classification of Australian strains of Ery-sipelotrhrix rhusiopathiae isolated from pege, sheep, turkeys and man. // Australian Vet. J. - 1979, v.55, №2, p.77-81.

154. Davis D.L., Day B.N. Cleanige and blastocyst formation by pig egg in vitro.// J. Anim. Sci. - 1978, v.46, p.1043-1047.

155. Dedie F. Die Souerlosiishen Antigene von Erysipelothrix rhusiopathiae. // Mon. Fur. Vet. Med. - 1949, B.l, №4, s.7-10.

156. Elsden R.P., Nelson L.D., Seidel G.E. Jr. Superovulating cous with follicle stimulating hormone and pnegnant mares serum gonadotropin. // Theriogenology-1978, v.9, p. 17-26.

157. Elsden R.P., Hasler G.F., Seidel G.E. In. Nonsurgical recovery of lovine eggs. // Theriogenology - 1976, v.6, p.523-532.

158. End L.A., Kornegay E.T., Huntington J., Wellman T. Effects of incubation temperature and bicarbonate on naturation of pig oocytes in vitro. // J.Reprod. Fert. - 1986, v.76, №2, p.67-662.

159. Engvall E., Jonsson K., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes. // Biochem. Biophys. Acta. -1971, v.251, p.427-434.

160. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. // Immunochem. - 1971, v.8, p.871-874.

161. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay. III. Quantitative of specific antibodies by enzyme-labelled antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes. // J. Immunol. - 1972, v.109, p.129-135.

162. Farr A.G., Nakane P.K. Immunohistochemistry with enzyme-labelled antibodies: a brief review. // J. Immunol. Meth. - 1981, v.47, №2, p.129-144.

163. Feigner P. A new technique of heterogenous enzyme-linked immunosorbent assay, stick-ELISA. I. Description of the technique. // Zbl. Bact. I., Abt. Orig. A. - 1978, Bd240, H.l, s.112-117.

164. Feist H., Flocsman K.D.,Eilr W. Ernige Untersuchungen sun. Nabrstoffben-darf der Rotlaufbacterien. - 1976, v.30, №1, s.49-57.

165. Fool G.M., Counter F.T. Flosk Immunisation. // Biul. Inst. Web Fujaw. -1969, v.13, №1, f.11-13.

166. Fogany I., Fapp L. Studies on the metabolist of Erysipelothrix rhusiopa-thiae.// Acta Vet. Acad. Sei Hund. - 1963, v.13, №1, f.1-9.

167. Frans F. Biolodical freezing and cryfixation. // J. Microsc. Gr. Brit. - 1977, v.lll, №1, f.3-16.

168. Gordon J.W., Ruddle F.H. ONA - mediated genetic transformation of mouse emryos and bone marrow. // A. Review. Gene. - 1985, v.33, p. 121-136.

169. Gray K.R., Bondioli K.R., Betts C.L. The commercial aplication of embryo spliting in beet cattle. // Thenogenology. - Í991, v.35, p.37-44.

170. Harper K.M., Brackett B.G. Bovine blastoiyts development after in vitro maturution in a defined medium with epidermal growth factor and low concentration it gonadotropins. //Biol. Reprod. - 1992, v.46, p.210-215.

171. Hanada A., Fnya V., Suzuku T. Proceedings of the 78-th dlecting of the Japanese Soociety of Zootechnical Seieme. // 1986, №1, v.36, p. 18.

172. Hashimoto K., Yoshida Y., Sugawara Y., Erysipelothrix insidiosa isolated from swin. // Fich and Birds in Japen. Nat. Inst. Anim. Health (Tokyo). - 1974, v.24,p.l 13-120.

173. Hendry R.m., Herrmann J.E. Immobilization of antibodies on nylon for use in enzyme-linked immunoassay. // J.Immunol. Meth. - 1980, v.35, №3-4, p.285-296.

174. Jsopescu J., Gheorgiu J. Donnes sur le vaccin anti-rouget roumain, prepare a rec la souche VR-2. // Archiva Vet. - 1965, v.l, №1, f.37-53.

175. Kaden V., Heller., Dabberke W. Aerogene immunisirung von Schwesnen gagen schuainepest und rotlauf in einer tierimmunis ierungschleuse. // Tirzucht. -1985, Bd.39, №10, s.449-452.

176. Kato K., Hamaguchi Y., Okava S. et al. Use of rabbit antibody IgG-loaded silicone pieces for sandwich immunoassay of macromolecular antigens. // J.Biochem. - 1977, v.81, p.1557.

177. Katska L. Comparison of two method for recowery of ouerian oocyties from slaughter cattle. //Anin. Reprod. Sci. - 1998, v.7, p.461-463.

178. Kiehm D.J., Roulean A., Vonderhyden B., Anmstrong D.T. In vitro dertili-zation of rat oocytes following ryopreservation. // Theriogenology - 1987, v.27, №1, p.242-247.

179. Kucsera G. Kiserletek a serterarbakeellenanjagok kimatatasara aj serologial probavoil. // Magyar all atarvosok Lapja. - 1960, v. 15, №12, p.452-454.

180. Kucsera G., Gimesi A. Studies on Erysipelothrix rhusiopathiae carriership pig herds. // Acta Vet. Acard. Sci. Hung. - 1976, v.26, №2, f. 149-156.

181. Kurstak E. The immunoperoxidase technigue: localization of viral antigens in cells. // Methods in virology; Ed. Maramorosch K., Koprowski H., N.Y., London: Academic Press. - 1971, p.423-444.

182. Leibo S.P., Rail W.F. Snerease in production of pregnancies by bisection of bovine embryos. // Theriogenology - 1987, v.27, №1, p.245-250.

183. Lutterback A., Koll R.A., Brem G. In vitro-maturation of lovine oocytes in coculture wiht granulosa cells and their subseguent fertilization and development. // Zuchthygienc. - 1987, v. 22, №4, p. 145-150.

184. Moor R.M. Regylation of the meictic Cycle in oocytes of Douestio mam-mols. // Annals New York Academy of Science. - 1988, part V., p.248-258.

185. Moor R.M., Warnes G.M. Regylation of oocyte maturation in mammals "Control of ovulation". // Cox. Wyman. Ltd. - 1978, p.159-176.

186. Moos M. Experimentelle Erfahrung beider Frstellung lines neuen nationellen Rotlacfstsndardimpfstoffs Rf.3 // Dentsche Veterinärmedizinische Gesell-schoft. Fachguppl "Fischrrankheiten". München. - 1987, s. 137-146.

187. Motlik J., Fulka J., Flechon J.E. Changes in intercellular coupling between pig oocytes and cumulus cells during maturation in vivo and in vitro. // J. Re-prod. and Fert. - 1986, 76 (1), 31-37.

188. Newcomb R., Cheristie W.B., Rawson L.E.A. Birth of calves after in vivo fertilization of oocytes removed from follicules and matured in vitro. // Vet. Ree.- 1978, v. 102, p.461-462.

189. Newcomb R., Rawson L.E.A. Investigation of physiological factors affecting non-surgical transfer. // Theriogenology - 1980, v. 13, p.41-49.

190. Notarianni E., Laurie S., Moor R.M., Evans M.J. Maintenance and differentiation in culture of pluripotential embryonnic cell lines from pig blastocysts. // J.Reprod. Fert. - 1990, Suppl 41, 51-56.

191. Oguri N., Tsutsumi Y. Non-surgical egg transfer in mares. // J.Reprod. Fertil. - 1974, v.41, p.313-320.

192. Plante L., King W.A. Effect of time to first cleavage on hatoching rate of bovine embryo in vitro. Theriogenology - 1992, v.37, p.274., Abstr.

193. Pursei V.J. et al. Genetic engineering of liverstock. // Sei., 1989, v.244, p.1281-1289.

194. Schärpe L.S., Cooreman W.M., Blomme W.J., Laekeman G.M. Quantitative enzyme immunoassay: current statue. // Clin. Chem. - 1976, v.22, №6, p.733-738.

195. Robertson D.C., McCullough W.G. Glucose catabolisn of Erysipelothrix rhysiopatiae. //3. of Bacteriology. - 1968, v.95, №6, p.2112-2116.

196. Rozeik C., Schulz H.B. The competitive antigen spot test (CAST). A.rapid and simple means of quantitatively screening antisera. // J. Immunol. Meth. -1986, v.91, №1, p.91-97.

197. Sarkar M., Mandal C. Immunobilization of antibodies on a new solid phase for use in ELISA. // // J. Immunol. Meth. - 1985, v.83, №1, p.55-60.

198. Sawada T., Takahashi T., Seto K. Immunogenicity of different fractions from broth culture of Erysipelothrix rhusiopathiae in mice and swine. // Jpn. J. Vet. Sci. - 1987, v.49, №1, f. 151-154.

199. Sawada T., Takahashi T. Cross protection of mice and swine given live-organism vaccine against challenge exposure witch strains of Erysipelothrix rhusiopatiae representing ten serotypes. // Am. J. Vet. Res. - 1987, v.48, №1, f. 81-84.

200. Sawada T., Muramatsu M., Seto K. Estimation of protective immunity of pigs inoculated with swine erysipelas live vaccine by passive mouse protection test. // Jpn.J.Vet.Sci. - 1982, v.44, №4, p.565-570.

201. Scuurs A.H.W.M., Van Weemen B.K. Enzymeimmunoassay. // Clin. Chim. Acta.- 1977, v.81,p.l-40.

202. Schals V. Aerogene immunisirurg gegen rotlauf in anlagen der industrima-sien Tierproduktion. //Mh. Veter. Med. - 1972, Bd.27, №21, s.818-820.

203. Seto K., Nishimura Y., Fujiki M., Asechi H., Susuki K. Studies on acrifla-vine-fast attenuated Erysipelothrix insidiosa. // Jpn.J.Vet.Sci. - 1971, v.33, №4, f.161-171.

204. Sirard M.A., Lambert R.D. In vitro Fertilization of bovine follicular oocytes obtained by laparoscopy. - Biol.Reprod. - 1985, v.33, p.487-494.

205. Storch H. Die Immunenznenzymtechnik. // Zschr.inn.Med. - 1972, Bd.27, s.589-594.

206. Scakmay G. Liofilizalt bacterium es virustorssek Fyujtemenye. // Madyar allatorv. Lapia. - 1964, v. 19, №5, f. 197-202.

207. Takahashi T., Tarabei M., Sawada T., Seto K. Crpss protection in mice and swine with live erysipelas vaccine to challenge exposure with strains of Ery-sipelothrix rhusiopat hiae of various serotyoes. // Am.J.Vet.Ret. -1984, v.45, №10, f.2115-2118.

208. Taylor C.R. Immunoperoxidase techniques. // Arch. Pathol, and Labor. Med. - 1978, v. 102, №3, p.113-121.

209. Oliver D.C., Sander H.A., Hogg R.D. Hellmann J.W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. // J.Immunol.Meth. - 1981, v.42, p. 195-200.

210. Thibault C., Gerard M., Menezo V. Acquisition pari'ovo cyte de lapine et de veon du factew de decondensation du spermatozoide fécondant. // MPGF. Ann. Biol. Anim. Biochem. Biophys. - 1975, v.15, p.705-715.

211. Traub E. Immunisierung gegen. Schweinerrotlauf mit Konsentrierten Ad-sorbatimostoffen. //Monuthefte fiir Vet.Med. - 1947, Bd.2, rg, s. 165-167.

212. Soom A., Van Vlaendderen J., Mahmoudzadeh A.R., Drluker H., de Kruif A. Comparison rate in vitro dertilized bovine embryous related to the interval from insemination to first cleavage. // 1992, Butterworth-Helnemann. -p.905-918.

213. Van Weemen D.K. ELISA: highlights of the present state of the art. // J.Virol.Meth. - 1985, v.10, №4, p.371-378.

214. Van Weemen D.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. //FEBS Lett. - 1971, v.15, p.232-236.

215. Valette L. Immunisation du pore contre le rouget. // Rec.Med.Veter. - 1976, v.152, №3, f.213-218.

216. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. Enzyme immunoassays in dianostic medicine. Theory and practice. // Bull. World. Health Organ. - 1976, v.53, №1, p.55-65.

217. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. The enzyme-linked immunosorbent as. say (ELISA). A guide with abstracts of microplate applications., London, -

1979, p.128.

218. Wang W.L., Jing H.S., Lu K.H., Görden J., Polge C. The affect of gas phase on the in vitro development of bovine embryos derived from in vitro maturation and fertilization of ovarian oocytes. // Theriogenology - 1992, v.37, p.320, Abstr.

219. Wellmann G., Heuner F. Bedertung von serologischen Untersuchungen in der Schweinerotlaufforschund. // Zentralblatt fiir Bacteriologie Parasitenvunde, Inpectionscrankheiten und Jnjgiene. - 1957, 170, 1/5, 91.

220. Wilkie T.M., Brinster R.L., Palmiter R.D. Germline and somatic mosaicism in transgenic mice. // Devi. Biol. - 118, 9-18.

221. Willadsen S.M., Godke R.A. A.simple procedure for the production of in-dentical sheep twins. // The veterinary Record. - 1984, v.l 14, p.240-243.

222. Wood R.L. Swine esysipelas - a review of prevalence and research. // J.of the Amer. Vet. Med. Ass. - 1984, v. 184, №8, f.944-949.

223. Wright J.H. Commerciae freezing of bovine embryos in strous. // . Theriogenology- 1985, v.23, p. 17-29.

224. Yadav H.C., Leslie K.E., Wolton J.S. A study of methods for bisecing rabbit embryos. -. Theriogenology - 1985, v.23, p.237.

225. Yang X. Embryo cloning by nuclear transfer in cattle rabbit. // Int. Emb. Trans. Soc. Nensletter. - 1991, 9(r), p.10-22.