Развитие системы контроля «картофельной болезни хлеба» на различных этапах технологии переработки зерна тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.01, кандидат наук Яицких Артем Валерьевич

• Яицких Артем Валерьевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Яицких Артем Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Микробиота зерна и зернопродуктов, её состав, характеристики и классификация

2. Видовой состав возбудителей «картофельной болезни хлеба»

3. Влияние зараженности зерна возбудителями «картофельной болезни хлеба» на здоровье человека

4. Морфологические особенности бактерий - возбудителей «картофельной болезни хлеба»

5. Ферментативная активность В. subtШs

6. Критические точки загрязнения зерна и зернопродуктов «картофельной болезнью хлеба»

7. Методы контроля и выявления «картофельной болезни хлеба»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Сырье и материалы

2. Методы исследований

2.1. Методы исследования свойств сырья

2.2. Методика подбора проб зерна

2.3. Определение количества спорообразующих бактерий и их амилазной активности

2.4. Моделирование условий влажности, оптимальных для развития спорообразующих бактерий в зерновой массе

2.5. Моделирование температурных режимов, оптимальных для развития спорообразующих бактерий в зерновой массе

2.6. Статистическая обработка данных

3. Результаты исследования и их анализ

3.1. Подбор штаммов бактерий - продуцентов а-амилазы

3.2. Выбор условий для определения активности бактериальной а-амилазы вискозиметрическим методом

3.3. Выбор оптимального субстрата для определения разжижающей активности бактериальной а-амилазы вискозиметрическим методом

3.4. Уточнение времени образования а-амилазы при росте B.subtШs в пробирках

с картофельным крахмалом

4. Разработка одноэтапного и двухэтапного методов контроля активности а-амилазы спорообразующих бактерий

4.1. Одноэтапный метод

4.2. Двухэтапный метод

4.2.1. Уточнение условий синтеза а-амилазы спорообразующими бактериями в накопительных культурах

4.2.2. Разработка требований к средам для выращивания спорообразующих бактерий и синтеза ими а-амилазы

4.2.3. Влияние температуры на образование бактериальной а-амилазы

4.2.4. Влияние времени инкубации на образование бактериальной а-амилазы в накопительной культуре

4.2.5. Влияние уровней заражения зерна пшеницы спорообразующими бактериями на величину числа падения

4.2.6. Подготовка водного смыва спорообразующих бактерий с зерна и его пастеризация

5. Определение количественной зависимости между показателями вискозиметрического метода и органолептического проявления «картофельной болезни хлеба»

5.1. Подбор ряда проб зерна с разными уровнями зараженности спорообразующими бактериями и контроль показателей развития «картофельной болезни хлеба»

5.2. Разработка двухэтапного вискозиметрического метода определения зараженности зерна пшеницы спорообразующими бактериями на жидких средах

5.3. Прогнозирование возникновения «картофельной болезни» в хлебе из проб зерна с разными уровнями зараженности спорообразующими бактериями

6. Вискозиметрический метод определения зараженности зерна возбудителями «картофельной болезни хлеба» на хлебном субстрате

6.1. Разработка условий инокуляции хлебного субстрата смывами с зерна и определение объема экстракта хлеба, необходимого для выявления зараженности

6.2. Выявление особенностей хлебного субстрата в накопительных культурах и влияние его массы на величину разжижающей активности

6.3. Разработка условий инкубирования срезов хлеба

7. Установление зависимости между величиной разжижающей активности а-амилазы спорообразующих бактерий с зерна и содержания спорообразующих бактерий с интенсивностью проявления «картофельной болезни хлеба»

7.1. Первая группа проб

7.2. Вторая группа проб

7.3. Расчет обобщенных индикаторных показателей «картофельной болезни хлеба» по двум группам проб

8. Разработка норм вискозиметрического показателя разжижающей активности

8.1. Нормативы вискозиметрического показателя активности бактериальной а-

амилазы в зерне (РА), исключающие заболевание хлеба «картофельной болезнью»

8.2. Нормативы разжижающей активности бактериальной а-амилазы как показателя пораженности зернопродуктов возбудителями «картофельной болезни хлеба»

8.3 Нормативы разжижающей активности бактериальной а-амилазы как показателя пораженности хлеба возбудителями «картофельной болезни»

9 Апробация метода

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список принятых сокращений

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Развитие системы контроля «картофельной болезни хлеба» на различных этапах технологии переработки зерна»

ВВЕДЕНИЕ

Во всем мире зерно и продукты его переработки являются основным источником питания для человека и кормом для сельскохозяйственных животных. В зерне сконцентрированы различные питательные вещества, и потому оно является благоприятным субстратом для развития различных микроорганизмов. Только один грамм зерновой массы содержит от нескольких сотен до нескольких тысяч микроорганизмов. В связи с этим микробиологическое загрязнения зерна является одним из главных факторов, определяющих безопасность питания, а следовательно, и здоровье населения. Развитие микроорганизмов является одной из возможных причин уменьшения сроков хранения, снижения качества зерна пшеницы и других зерновых культур. В зависимости от условий хранения зерновой массы изменения в численном и видовом составе ее микробиоты могут носить различный характер [23, 61].

В последние годы все чаще встречается в хлебе «картофельная болезнь хлеба» (КБХ), которая представляет серьезную проблему для хлебопеков и мукомолов в России. Распространение КБХ является следствием комплекса проблем, в том числе, связанных с ухудшением микробиологического состояния зерна и муки, применением новых видов сырья и пищевых добавок, расширением ассортимента вырабатываемых хлебобулочных изделий функциональных и диетических, и рядом других факторов [29, 74, 92].

Распространению КБХ способствует расширение сети малых предприятий по производству муки и хлебобулочных изделий, у которых стремление к уменьшению технологических затрат приводит к сокращению технологических операций по очистке зерна, помещений, емкостей и оборудования, сокращению периода брожения полуфабрикатов и соответственно понижению кислотности теста. Все эти факторы способствуют резкому увеличению вероятности заболевания. Например, в производстве хлеба с высоким содержанием отрубей для диетического питания при уменьшении кислотности теста вероятность заболевания резко возрастает [44, 75, 88].

При этом случаи выявления очагов поражения хлеба «картофельной болезнью» отмечаются не только в южных районах, но и в северных районах России и в весеннее-летний период, и в зимнее время.

С каждым годом возрастают потребности промышленности в ферментных препаратах микроорганизмов и расширяются области их биотехнологического применения [131,147]. Одно из ведущих мест в производстве занимают амилолитические ферменты [125], наиболее распространенными из которых являются а-амилаза, которая также синтезируется и спорообразующими бактериями рода Bacillus.

Кроме того, увеличилось применение в сельском хозяйстве пестицидов на основе чистых культур бактерий рода Bacillus особенно B. Subtilis.

Перечисленные факторы в будущем могут отразиться на обсемененности зерна, появлению бактерий с новыми качественными свойствами и более частому возникновению «картофельной болезни хлеба». Поэтому к числу специфических гигиенических факторов риска для зерна пшеницы и вырабатываемых из него продуктов могут быть отнесены эти бактерии - возбудители КБХ.

Вследствие этого перед нами стоит важнейшая задача разработки и осуществления объективной, достоверной и своевременной оценки микробиологической зараженности зерна и зернового сырья, и прежде всего, возбудителями КБХ [5].

В настоящее время существуют методы определения КБХ, которые можно разделить на микробиологические, технологические и биохимические [9, 11, 65]. Однако использование существующих методов контроля или затруднительно в производственных условиях, занимает много времени, или не обеспечивает точной оценки зараженности зерна или муки возбудителями, а также основываются на субъективной органолептической оценке проявлений «картофельной болезни» в хлебе.

Поэтому задача поиска альтернативного метода по определению зараженности зерна и зернопродуктов возбудителями КБХ, который бы обладал нормируемым, количественным показателем, с возможностью определения его на

современном отечественном оборудовании, обеспечивающий объективность, достоверность и сокращение времени анализа, является актуальной.

Целью настоящей работы является создание системы оценки и прогнозирования зараженности зерна и зернопродуктов возбудителями «картофельной болезни» по всей технологической цепи производства «от зерна до хлеба» с применением нового инструментального метода и нового показателя, обеспечивающих не только качественную, но и количественную объективную и достоверную оценку на основе выявления закономерностей взаимосвязи ферментативной активности спорообразующих бактерий Bacillus subtilis с проявлениями «картофельной болезни».

В связи с вышеизложенным в настоящей работе определены основные задачи:

1. Выявить микробиологические и биохимические изменения в хлебе в процессе развития «картофельной болезни».

2. Исследовать возможность применения вискозиметрического метода для определения активности бактериальной а-амилазы.

3. Установить закономерности влияния ферментативной активности Bacillus subtilis на качество выпеченного хлеба.

4. Создать инструментальный метод оценки поражения зерна и зернопродуктов возбудителями «картофельной болезни хлеба» - по амилолитической активности бактериальной а-амилазы.

5. Разработать новый показатель для определения разжижающей активности (РА) популяции спорообразующих бактерий (СБ), присутствующих в пробе зернопродукта и ухудшающих его качество.

6. Разработать нормы РА для определения уровня зараженности зерна и зернопродуктов с целью контроля и прогнозирования заболевания хлеба «картофельной болезнью».

Научная новизна. Выявлены основные закономерности - динамика развития спорообразующих бактерий и синтеза ими а-амилазы, позволившие сократить общую продолжительность анализа определения КБХ.

Определена связь биохимических и микробиологических процессов, протекающих при развитии возбудителей КБХ в субстрате, позволившая заменить субъективную органолептическую оценку КБХ (с применением пробных лабораторных выпечек) на объективную инструментальную оценку величины разжижающей активности а-амилазы, накопленной СБ при развитии на субстрате.

Установлена зависимость времени обнаружения разжижающей активности а-амилазы в хранящемся хлебе, от содержания спорообразующих бактерий в зерне или зернопродуктах, и их физиологической активности.

Впервые доказана возможность применения разжижающей активности для определения зараженности зерна и зернопродуктов КБХ.

Впервые разработан приборный метод, позволяющий определять «картофельную болезнь хлеба» на самых ранних этапах работы с зерном - при приемке, хранении, перемещении зерна, в том числе, в помольной партии.

Практическая значимость работы. Разработан новый метод определения «картофельной болезни хлеба», который обеспечивает объективность и достоверность результатов оценки и позволяет сократить продолжительность выявления зараженности продукта КБХ.

Создан новый показатель - разжижающая активность бактериальной а-амилазы, который позволяет оценить уровень зараженности зерна и зернопродуктов возбудителями КБХ, тем самым провести не только качественную, но и количественную оценку зараженности с целью прогнозирования заболевания готового хлеба.

Разработаны нормы нового показателя - разжижающей активности (РА) для количественной оценки зараженности зерна, муки и хлеба с целью контроля, прогнозирования и управления производства безопасной продукции.

Разработаны и утверждены следующие стандарты организации:

- СТО 00932169.104-2013 «Ускоренный метод определения количества спор мезофильных бактерий рода Bacillus - возбудителей картофельной болезни хлеба - в зерне, зернопродуктах и хлебе»;

- СТО 00932169.101-2013 «Зерновые культуры. Вискозиметрический метод определения зараженности зерна возбудителями картофельной болезни хлеба»;

- СТО 00932169.103-2013 «Зернопродукты. Вискозиметрический метод определения зараженности муки и хлеба картофельной болезнью»;

- СТО 00932169.105-2016 «Зернопродукты. Вискозиметрический метод определения «картофельной болезни хлеба».

На разработанный способ получено 3 патента:

«Способ определения «картофельной» болезни хлеба» патент № 2519107;

«Способ определения зараженности зерна спорообразующими бактериями -возбудителями «картофельной» болезни хлеба» патент № 2548713;

«Способ определения «картофельной болезни хлеба» в зернопродуктах без пробной лабораторной выпечки», патент № 2641011.

Научные положения, выносимые на защиту:

- научное обоснование возможности определения КБХ по амилолитической активности СБ, до проявления органолептических признаков развития заболевания;

- критерии идентификации зараженности возбудителями КБХ зерна и зернопродуктов, базирующиеся на объективном приборном методе контроля, с использованием нового показателя РА;

- технологическое решение по применению прибора типа ПЧП для определения зараженности и прогнозирования дальнейшего развития КБХ в зерне и зернопродуктах;

- экспериментальные и теоретические данные по нормам РА и связи их с зараженностью и проявлением КБХ в хлебе.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов проведенных исследований базируется на строгих доказательствах и использовании апробированных математических методов. Полученные расчетные соотношения подвергнуты тщательной экспериментальной проверке. Выявленные

теоретические положения непосредственно согласуются с общепризнанными результатами в других областях науки и техники.

Все научные положения, выводы и рекомендации, изложенные в диссертации, обоснованы и подтверждены экспериментальными исследованиями и материалами, которые полностью соответствуют данным протоколов опытов.

Основные результаты выполненных исследований были представлены на 5-й Конференции молодых ученых и специалистов Россельхозакадемии «Современные методы направленного изменения свойств сельскохозяйственного сырья для производства продуктов здорового питания» (Москва, 2011г.); на 14-м конгрессе ICC «Научно-технические инновации для здоровых злаков и масел» (Пекин, 2012г.); на 7-ой Конференции молодых ученых и специалистов Россельхозакадемии (Москва, 2013г.); на 2-й международной научной конференции Министерства образования и науки РФ «Качество и экологическая безопасность пищевых продуктов и производств» (Тверь, 2014г.); на международной научно-практической конференции «Современные аспекты научно-технологического обеспечения переработки сельскохозяйственного сырья и отходов» (Астана, 2014г.); на конференции, посвященный 70-летию со дня основания Санкт-Петербургского филиала ФГАНУ НИИ хлебопекарной промышленности «Усиление конкурентного потенциала пищевых предприятий путем развития эффективных биотехнологий» (Санкт-Петербург 2016г.), и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных работы, в том числе 8 в журналах, рекомендованных ВАК РФ; получено 3 патента опубликованные в БИПМ №16 2014 г, № 11, 2015 г, № 35, 2017 г.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включающих введение, 8 глав экспериментального и аналитического материала, заключение, список сокращений, список литературы из 151 наименований, в том числе 59 - на иностранных языках. Содержит 22 рисунков, 56 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Микробиота зерна и зернопродуктов, её состав, характеристики и

классификация.

Зерновые массы, как и другие виды продуктов растительного происхождения, не подвергавшиеся специальным приемам стерилизации, чрезвычайно насыщены микроорганизмами. Так, при исследовании любой зерновой массы в 1 г ее обнаруживается от нескольких десятков тысяч до сотен тысяч или даже миллионов различных представителей микробиологического мира.

Основным субстратом, из которого растения получают свою микробиоту, является почва. При учете микроорганизмов населяющих почву обнаруживают в

7 9

1 г ее от 10 до 10 КОЕ различных представителей микробиоты [25]. Колебания количества микроорганизмов в пределах этих больших величин зависят от вида почвы, ее структуры, плодородия и других причин.

Установлено, что на участках почвы, окружающих корни растений, в ризосфере микроорганизмов во много раз больше, чем на участках, удаленных от корней (таблица 1) [81].

Таблица 1 - Количество микроорганизмов на засеянных овсом и пшеницей участках [81].

Вид зерновой культуры Глубина отбора пробы почвы, см Количество микроорганизмов, тыс./ 1 г почвы

в ризосфере на участках, удаленных от корней

Овес 0-25 300000 1500

30-60 240000 500

Пшеница 0-25 150000 1800

30-60 280000 700

Повышенное содержание микроорганизмов в ризосфере растений объясняется тем, что для них в зоне корня создаются благоприятные условия в

виде питательной среды. Так, растения выделяют через корни органические соединения (сахара и кислоты), также корни сбрасывают отмершие клетки эпидермиса, отмирают корневые волоски и отдельные участки корней. Все эти органические вещества представляют собой богатую питательную среду и способствуют развитию микроорганизмов.

Часть микроорганизмов почвы (некоторые бактерии и грибы) из ризосферы постепенно переходят на наземные органы растений — стебли и листья и развивается на них. Одни из таких микроорганизмов питаются продуктами жизнедеятельности растений, выделяемыми ими на поверхность своих тканей, а другие - проникают во внутренние части растения. Первые не приносят вреда растениям и за свое существование на поверхности их органов получили название эпифитных; вторые, развиваясь, вызывают определенные заболевания растений, угнетают или губят их совсем, т.е. являются типичными паразитами [83].

Видовой состав эпифитной микрофлоры сельскохозяйственных растений довольно однообразен и состоит почти исключительно из не спорообразующих бактерий, а бациллы составляют лишь небольшой процент бактериального эпифитного населения. Ограниченность видового состава эпифитов объясняется тем, что лишь немногие микроорганизмы обладают способностью активно размножаться, не паразитируя, в условиях весьма скудного количества питательных веществ, выделяемых растением на поверхности его тканей в процессе жизнедеятельности [24].

После появления на растении плодов и семян эпифиты расселяются и на их поверхности, причем интенсивность накопления микроорганизмов на зерновках и семенах связана и со степенью их изоляции от окружающих условий. Так, например, семена бобовых, заключенные в плотный двухстворчатый боб, бывают значительно менее населены микроорганизмами, чем оболочки боба или зерновки злаковых.

Ко времени созревания урожая почва зоны корня обогащается актиномицетами и бациллами (В. mycoides, В. subtШs, В. mesentericus), что связано

с их более мощной ферментативной системой, способной разлагать отмирающую корневую систему.

Кроме эпифитной и паразитной микрофлоры надземной части растений на зерно в процессе роста и развития вместе с пылью и брызгами дождя попадает часть микроорганизмов почвы, а в процессе уборки и при обмолоте зерно еще больше загрязняется микроорганизмами [24, 79].

Количество пыли и микробов, задерживающихся на зерне, зависит отчасти от условий обмолота и уборки, но в большей степени от морфологических признаков зерна. Зерно злаковых больше заселено микроорганизмами, чем семена некоторых масличных и бобовых, имеющих ровную, гладкую поверхность. Скоплению пыли и микроорганизмов способствуют такие морфологические особенности зерна и семян, как наличие шероховатой поверхности, бородки, бороздки и т. п. [42].

Вследствие этого в составе микрофлоры каждой зерновой массы обязательно находят такие группы микроорганизмов, как различные бактерии и плесневые грибы, во многих образцах находят актиномицеты и родственные им организмы, а также дрожжи.

По образу жизни, а следовательно и по воздействию на зерновую массу встречающиеся в ней микроорганизмы можно разделить на три группы: сапрофитные, фитопатогенные и патогенные для животных или человека.

Подавляющую часть микробов в зерновой массе составляют сапрофиты, т. е. метатрофные микроорганизмы, нуждающиеся в различных органических соединениях. К этой группе относятся эпифитная микробиота, а также микроорганизмы, способные при известных условиях питаться органическими веществами зерна и в процессе питания частично или полностью разрушать зерно, изменяя его физические свойства и химический состав [24, 81].

В отдельных партиях зерна обнаруживают фитопатогенные микроорганизмы, вызывающие заболевания у растения и его отдельных органов.

Еще реже в зерновую массу попадают микроорганизмы патогенные для животных или человека. Однако возможность их присутствия в зерновых массах должна учитываться в практике работы с зерном.

Грибов на поверхности растений и на зерне немного, один грамм доброкачественного зерна содержит несколько тысяч грибов. В грибной флоре свежеубранного зерна обычно присутствуют такие виды как Altemaria, Cladosporium, Helminthosporium, Ascochyta. Penicillium и Aspergillus, которые обнаруживаются в небольших количествах. Встречаются дрожжи и актиномицеты. При хранении значительно изменяется состав грибной флоры. Доминирующими компонентами становятся пеницилловые и аспергилловые грибы (получившие название «плесени хранения»), а типичные представители свежеубранного зерна — «полевые плесени» — сохраняются в небольшом количестве [9, 81].

Почти во всякой доброкачественной зерновой массе и всегда в свежеубранном зерне, не подвергавшемся порче, численное превосходство имеют бактерии, а среди них бактерии из рода Pseudomonas, активно размножающиеся на поверхности растений. Особенно часто встречается Ps. herbicola. Преобладание этой бактерии на зерне служит показателем его высоких качеств. При всевозможных пороках этот микроорганизм вытесняется другими.

Из бактерий на зерне встречаются микрококки, молочнокислые бактерии, масляно-кислые бактерии. Всего на растениях обнаруживаются до 50 видов бактерий.

На зерно вместе с пылью попадают бациллы, которые на растениях сохраняются в пассивном состоянии не размножаясь. В единичных экземплярах бациллы всегда присутствуют в свежеубранном или хранящемся зерне. Численность их сильно возрастает в партиях сильно запыленных или подвергавшегося самосогреванию зерна. Их негативное воздействие на зерно и зернопродукты выражается в появлении «картофельной болезни хлеба», которая представляет проблему для мукомольных и хлебопекарных предприятий и опасность для здоровья человека.

2. Видовой состав возбудителей «картофельной болезни хлеба»

Для предприятий мукомольно-крупяной и хлебопекарной отраслей промышленности существенный интерес представляет своевременное определение в зерне, а затем и в зернопродуктах спорообразующих бактерий, для предотвращения «тягучей» или «картофельной болезни хлеба».

Первое научное исследование, доказавшее микробиологическую природу возбудителя «картофельной болезни хлеба», относится к 1885 г. и принадлежит Лорану (Laurent, 1885), который из слизи больного хлеба выделил организм, описанный им под названием Bacillus panificans.

В 1889 г. Кратчер и Немилович выделили из слизи зараженного хлеба типичную «картофельную палочку» (Bac. mesentericus) [57].

Возбудителями заболевания являются термотолерантные спорообразующие бактерии, относимые ранее к группам «сенной палочки» и «картофельной палочки». В первую очередь это Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus. По новой классификации типовым видом рода Bacillus признан только вид В. subtilis («сенная палочка»). Существование В. mesentericus («картофельная палочка») как отдельного вида исключается, он рассматривается как вариант вида (E.subtilis asp. mesentericus). Некоторые исследователи относят к возбудителям также В. mycoides, В. cereus, В. licheniformis, В. pumilis, В. polymyxa и другие виды, однако их роль в этом заболевании хлеба менее значима [71, 136, 141, 146]. Лишь часть изолятов перечисленных видов способны вызывать «картофельную болезнь хлеба»; их доля колеблется от 32 до 67% [57, 129, 142, 144]. Эта способность определяется индивидуальными различиями в физиологической активности, термоустойчивости и кислотоустойчивости спорообразующих бактерий [145].

Немецкими специалистами было определено видовое соотношение спорообразующих бактерий в белом хлебе, пораженном «картофельной болезнью». Количество бацилл достигало 1 млн. КОЕ/г после двух суток хранения в провокационных условиях. Популяция бацилл, выделенная из хлеба, состояла на 70% из В. subtilis, 24% В. Licheniformis, 2% В. Pumilis, и 2% В. Cereus. [137]

В работе итальянских исследователей 61 изолят Bacillus sр. был выделен из пораженного хлеба и охарактеризован по фенотипическим и генетическим признакам. Помимо В. subtilis, В. licheniformis, В. cereus были идентифицированы В. сШшй и B. firmus. Все изоляты обладали амилазной активностью, но лишь 32,4% из них были способны вызывать «картофельную болезнь хлеба» после пастеризации при 96 °С в течение 10 мин [130].

По данным P.M. Рахимберлиной (1980) этиологическим фактором в возникновении «картофельной болезни хлеба» в условиях Казахстана является комплекс трех видов спорообразующих аэробов: В. subtilis, В. polymyxa и В. cereus, т.е. их ассоциация [71].

По всей технологической цепочке «от поля до хлеба» наблюдалось нарастание частоты обнаружения этих видов. Если в почве В. subtilis, В. polymyxa и В. cereus составляли 12, 19 и 13% от общего количества спорообразующих аэробов, то в зерне - 11, 18 и 21%, в пораженном хлебе - 22, 30 и 22% [71].

Мирзоева обнаружила, что в муке из зерна европейского происхождения В. subtilis и В. mesentericus составляли основную часть спорообразующих бактерий (75-95%) [57].

При этом большинство из перечисленных видов относятся к типичным почвенным микроорганизмам и участвуют в распаде органического вещества почвы на его поздней стадии, вследствие чего присутствие этих видов на зерне свидетельствует о загрязнении зерна в процессе уборки и/или хранении и нарушении технологии переработки [67, 127].

3. Влияние зараженности зерна возбудителями «картофельной болезни

хлеба» на здоровье человека

Потребление продуктов, зараженных спорообразующими бактериями которые вызывают «картофельную болезнь хлеба», представляют особую опасность для здоровья населения, поскольку спорообразующие бактерии, попадая в организм человека, способны вызывать очень серьезные нарушения

функционирования иммунной системы, желудочно-кишечного тракта, печени, органов дыхания нервной системы [30, 57].

Даже если спорообразующие бактерии не вызывают «картофельной болезни хлеба», все же их наличие в готовых изделиях не желательно [3, 6, 87]. Так, В. А. Мирзоева в своих работах неоднократно подчеркивает существенную роль Bacillus subtilis в порче молочных продуктов, кондитерских изделий, сахарных сиропов, консервов, зерновых, хлебных и других продуктов [57]. Ее мнение разделяли также С.П. Аскалонов, А. И. Ильченко, которые обращали внимание на то, что эти бактерии могут обсеменять различные пищевые продукты (хлеб, мясо и др.), вызывая нередко их порчу [78].

О выделении из кондитерских изделий, пищевых дрожжей, консервов, хлебобулочных изделий и даже алкогольных напитков бактерии группы «картофельной палочки» сообщают Л.Ю. Медвинская, Р.М. Рахимберлина [71, 85]. Они отмечают, что при этом даже большие количества этих бактерий иногда могут не менять ни вкуса, ни запаха, ни цвета указанных пищевых продуктов.

Ряд авторов обращает внимание на встречаемость в пищевых продуктах токсигенных культур этой группы, наличие у них факторов патогенности. Однако, вследствие недооценки возможной роли бацилл в патологии человека и животных, большинство авторов не исследовали токсичность выделенных культур [26].

B. subtilis относится к микроорганизмам, вырабатывающим протеолитические ферменты, которые расщепляют белок до конечных продуктов, поэтому называется «микробом гниения». Попав в организм, «картофельная палочка» наносит ущерб тканям. У погибших подопытных мышей происходило увеличение печени, лимфоузлов. Украинские ученые, изучая эту болезнь, обнаруживали связанные с нею раковые опухоли, гемолиз, судороги, нервный паралич [82]. Вышеописанные изменения у животных сходны с теми, которые зарегистрированы у погибших от токсикоинфекций людей [2, 68].

Большая часть известных нам сведений касается условно патогенного микроорганизма B. cereus, который относится, наряду с В. subtilis, к возбудителям

«картофельной болезни хлеба» [11, 71, 130]. По данным египетских исследователей В. сereus была обнаружена в 26,4 % проб хлеба и хлебобулочных изделий, причем в 12% случаев содержание бактерий превышало 400 КОЕ/г [56, 128].

Эти микроорганизмы вызывают два типа пищевых отравлений микробной этиологии (гастроэнтеритов). Первый тип отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч.), характерны изнуряющие диарея и рвота. Инфекционные поражения этого типа можно считать токсикозами, связанными с действием метаболитов, накапливающихся в пищевых продуктах. Второй тип отравлений характеризует более продолжительный инкубационный период (около 17 ч.), схваткообразные боли в животе, диарея [27, 148, 149].

Заболевания являются результатом интоксикации организма, вызванной ростом бактерий в пище (рвота) или в желудочно-кишечном тракте (диарея). Они обусловлены двумя разными токсинами. При диарейном типе это -высокомолекулярный белок, при рвотном типе - низкомолекулярный термостабильный пептид (цереулит).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яицких Артем Валерьевич, 2019 год

- ♦

♦ ♦

V—

В

IO 20 ЗО 40 SO 60 70 SO ЭО lOO

РА зерна,%

V = о OOllx2 - Э.0318Х - ■ U.7Z31 ♦

♦

♦ ♦

: ♦ i i ---^

С

O IO 20 ЗО 40 50 60 70 SO ВО lOO

РА зерна,%

Рисунок 13. Графики зависимости интенсивности «картофельной болезни хлеба» (А, В) и численности СБ в зерне (С) от РА.

*

♦ Ф^ч. ♦

1

; V = 0,3 174х Н г - 9,0572х '= 0,9391 + 85,553

:

|

4

;

1

А

8 10 КОЕ зе рна

12

14

16

18

1

\

; V

V = -12,8 К2 31п{х) ■+■ 50,! = 0,8348 ¡61

;

; ♦

; ♦ ♦

1

1

В

КОЕ туки

♦

у = 1,3722х2 + ( 22,98х -1- 0,7952 1,8859

6

Кое зе рна

С

Рисунок 14 - График зависимости «картофельной болезни хлеба» (А,В) и разжижающей активности (С) от количества СБ в зерне и муке

7.2. Вторая группа проб Следующая группа состояла из 7 проб зерна, заспоренных в лабораторных условиях штаммами В. subtШs - наиболее активными продуцентами а-амилазы. В ней также определяли РА бактериальной а-амилазы, содержанием СБ в смывах зерна, а также интенсивность развития «картофельной болезни» в хлебе, время проявления признаков заболевания и ИП (таблица 45).

Таблица 45 - Основные индикаторные показатели, связанные с развитием «картофельной» болезни хлеба (2-я группа проб)

Зерно Мука Хлеб

№ пробы СБ максимальная интенсивность запаха, баллы

СБ, К0Е/г-103 РА, % К0Е/г-103 переход в муку, % появления запаха, ч ИП

1 0,16 0 0,02 12,5 90 0,5 0,6

2 0,58 20 0,10 14,0 72 2,5 3,5

3 1,6 46 0,30 18,7 48 4 8,3

4 2,5 59 0,36 14,4 48 4 8,3

5 3,5 72 0,55 15,7 36 4 11,1

6 5,2 74 0,70 13,5 36 3 8,3

7 9,9 84 1,50 15,2 24 5 20,8

Аналогично 1-й группе, во 2-й группе проб была установлена тесная линейная связь КБХ со всеми исследованными показателями, в большинстве случаев значимая на уровнях 0,01 и 0,05 (таблица 46). Наименьшие коэффициенты линейной корреляции наблюдались у микробиологических показателей, таких как содержание СБ в зерне и муке.

Зависимость КБХ от содержания СБ в зерне и муке более полно описывалась с помощью регрессионных уравнений, в которых количество СБ было представлено в логарифмическом виде (рисунок 15). В этом случае коэффициенты детерминации составляли 0,981 и 0,994, что характеризует нелинейный характер связи КБХ с количеством СБ в зерне.

Таблица 46 - Коэффициенты линейной корреляции (Пирсона) основных индикаторных показателей, характеризующих развитие «картофельной болезни хлеба» (2-я группа проб)

РА зерна КОЕ зерна КОЕ муки КБХ ИП

РА зерна 1 0,792 0,674 -0,988** 0,836*

КОЕ зерна 0,792 1 0,841* -0,794 0,919**

КОЕ муки 0,674 0,841* 1 -0,682 0,895*

КБХ -0,988** -0,794 -0,682 1 -0,870*

ИП 0,836* 0,919** 0,895* -0,870* 1

* корреляция значима на уровне 0,05 ** корреляция значима на уровне 0,01

Наибольший интерес представляло подтверждение степени информативности показателя разжижающей активности а-амилазы, т.е. установление с помощью регрессионного анализа характера и степени связи РА со временем появления «картофельной болезни хлеба» и ее интенсивности (ИП) и зараженностью зерна СБ (рисунок 16).

А

;

\

у

\ Н2 = С ),9815

♦

:

:

О 2 4 6 8 10 12

КОЕ зерна

Рисунок 15 - Графики зависимости интенсивности КБХ, ч от содержания СБ в

зерне

Рисунок 16 -Графики зависимости органолептических показателей развития КБХ и численности СБ от РА бактериальной а-амилазы.

Была выявлена тесная, полиномная (А), и экспоненциальная (С и D) зависимости индикаторных показателей от величины РА (Я2 = 0,9080 - 0,9815). Рассчитанные по этим уравнениям ожидаемые величины индикаторных показателей в целом неплохо согласуются с эмпирическими величинами во 2-й группе проб. Однако, использование этих уравнений для 1-й группы проб не дали ожидаемых значений индикаторных показателей.

Сопоставляя значения индикаторных показателей, связанных с развитием КБХ в обеих группах проб, можно отметить, что «картофельная болезнь хлеба» проявлялась в сопоставимые промежутки времени во 2-й группе проб при значительно меньших значениях РА и СБ в зерне, чем в 1-й группе проб.

7.3. Расчет обобщенных индикаторных показателей «картофельной болезни

хлеба» по двум группам проб

Еще раз остановимся на особенностях рассматриваемых проб.

1-я группа - это пробы, в которых зерно было поражено СБ вследствие неблагоприятных природных процессов. Спорообразующие бактерии тесно аффелированы с оболочками зерна и даже могут частично проникать внутрь их. Природные популяции СБ в этих пробах состоят из организмов с различной амилолитической активностью; при оценке по 5-бальной шкале на агаре с крахмалом средний уровень активности штаммов с проб зерна составлял 2,0-2,5 балла.

2-я группа - пробы, поверхностно заспоренные несколькими штаммами В. subtШs - наиболее сильных продуцентов а-амилазы. Уровень их активности максимален и составляет 5 баллов. Бактерии находятся на поверхности оболочек зерна и связаны с ними только сорбционными взаимодействиями.

Как мы рассматривали ранее, в обеих группах проб, отличающихся характером заражения зерна СБ, была установлена тесная связь между развитием КБХ (время, ИП), РА бактериальной а-амилазы и содержанием СБ, что было показано с помощью корреляционного и регрессионного анализа.

Однако количественные характеристики индикаторных показателей по группам заметно отличались. Для их наглядного сопоставления индикаторные показатели были рассчитаны для одинаковых временных интервалов проявления КБХ: 24, 36, 48, 72 и 90 часов. Была проведена дополнительная обработка экспериментальных результатов (таблица 47).

Таблица 47 - Средние значения индикаторных показателей, определяющих время появления и интенсивность КБХ в разных группах проб

Время появления КБХ, ч 1-я группа (10 проб) 2-я группа (7 проб)

Зерно Мука ИП хлеба Зерно Мука ИП хлеба

СБ, КОЕ/г-103 РА, % СБ, К0Е/г-103 СБ, К0Е/г-103 РА, % СБ, К0Е/г-103

90 0,12 5 0,10 0,6 0,16 0 0,02 0,6

72 1,40 32 0,13 1,5 0,58 20 0,10 3,5

48 2,90 66 0,80 2,6 2,1 53 0,33 8,3

36 6,50 91 1,5 8,3 4,4 73 0,63 9,7

24 13,40 93 5,4 19,8 9,9 84 1,50 20,8

Анализ данных этой таблицы убедительно показал, что сопоставимые величины скорости (часы) и интенсивности развития «картофельной болезни хлеба» (ИП) во 2-й группе проб наблюдались при более низких исходных уровнях РА и количества СБ. В дальнейшем, по мере хранения хлеба во 2-й группе проб происходила компенсация исходных величин индикаторных показателей за счет повышенной ферментной активности штаммов спорообразующих бактерий.

Доказательством большей вредности спорообразующих бактерий в этой группе проб является значительное (в большинстве случаев) превышение удельных величин РА бактериальной а-амилазы и ИП хлеба, рассчитанных на 1 тыс. спорообразующих бактерий, присутствующих в зерне и муке (таблица 48). Так, при порче хлеба через 72 ч, удельные величины РА и ИП в 1-й группе проб составили 23% и 2.2 соответственно, тогда как во 2-й группе они достигли 35% и 6,0.

Таблица 48 - Сопоставление удельных значений РА и ИП хлеба, рассчитанных на 1 тыс. спорообразующих бактерий, в 1-й и 2-й группах проб

Время РА в зерне, % ИП хлеба ИП хлеба

появления 1-я 2-я 1-я 2-я 1-я 2-я

КБХ, ч группа группа группа группа группа группа

72 23 35 1,1 6,0 11,5 35,0

48 23 25 0,9 4,0 3,3 25,0

36 14 16 1,3 2,2 5,5 15,4

24 7 9 1,5 2,1 3,7 13,9

* В расчете на спорообразующие бактерии зерна ** В расчете на спорообразующие бактерии муки

8. Разработка норм вискозиметрического показателя разжижающей

активности

8.1. Нормативы вискозиметрического показателя активности бактериальной а-амилазы в зерне (РА), исключающие заболевание хлеба «картофельной

болезнью».

Исходя из теоретической вероятности преобладания в популяции СБ в зерне активных продуцентов а-амилазы, при разработке проекта нормативов вискозиметрического показателя РА мы считали необходимым ориентироваться на этот крайний случай, т.е. на данные по 2-й группе проб.

Итак, исходя из полученных результатов, предлагаются следующие нормативы для РА и содержания СБ в зерне, прогнозирующие заболевание хлеба «картофельной болезнью» через определенные сроки его хранения в условиях, оговоренных Инструкцией №1100/2451-98-115.

Во избежание развития в хлебе «картофельной болезни» при хранении его в течение указанных в таблице сроков, величина РА а-амилазы в партиях пшеницы, предназначенных для выработки хлебопекарной муки, не должна превышать значений приведенных в таблице 49.

Таблица 49 - Нормативы РА бактериальной а-амилазы и содержания СБ в зерне определяющих поражение хлеба «картофельной болезнью» в определенные сроки хранения

Время заболевания хлеба «картофельной болезнью», ч РА, %, не более СБ, К0Е/г-103, не более ИП

90 5 0,14 0,6

72 20 0,58 3,5

48 43 1,4 9,1

36 67 3,2 11,7

24 80 8,9 22,9

С учетом неравномерного распределения спорообразующих бактерий в зерне и возможного вторичного загрязнения муки спорообразующими бактериями при ее выработке на мукомольных заводах рекомендуется использовать партии зерна с РА не более 43%.

8.2. Нормативы разжижающей активности бактериальной а-амилазы как показателя пораженности зернопродуктов возбудителями «картофельной болезни

хлеба»

Величина РА может колебаться в пределах от 0 до 95-97%, она имеет сильную зависимость от количества спорообразующих бактерий - возбудителей «картофельной болезни хлеба», находящихся в массе продукта, и от их ферментной активности.

Во избежание развития в хлебе «картофельной болезни» при хранении в течение указанных в таблице 50 сроков, величина разжижающей активности а-амилазы в партиях зернопродуктов (смесей), предназначенных для производства хлебобулочной продукции, не должна превышать нижеприведенных значений.

Таблица 50 - Нормативы РА бактериальной а-амилазы для зернопродуктов определяющие поражение хлеба «картофельной болезнью» в определенные сроки хранения

РА зернопродукта, %, не более Время заболевания хлеба «картофельной болезнью», ч

11 90-60

30 48

50 36

70 24

С учетом неравномерного распределения спорообразующих бактерий в зернопродуктах (смесях) рекомендуется использовать партии на хлебопекарные цели с РА не более 30%.

8.3 Нормативы разжижающей активности бактериальной а-амилазы как показателя пораженности хлеба возбудителями «картофельной болезни»

На основе приборного вискозиметрического метода разработана оценка поражения хлеба «картофельной болезнью» по разжижающей активности бактериальной а-амилазы спорообразующих бактерий.

В таблице 51 приведены нормативы разжижающей активности (РА) а-амилазы спорообразующих бактерий, соответствующие органолептическим признакам «картофельной болезни хлеба» с интенсивностью 0,5 и 1,0 балл.

При вискозиметрическом методе началом развития картофельной болезни считается РА свыше 20%, при этом органолептические признаки болезни еще отсутствуют.

Из данных таблицы видно, что хлеб, с органолептически выявленными признаками заболевания через 24 ч, может быть обнаружен вискозиметрическим методом через 16ч хранения, а с выявлением через 36ч - обнаруживается вискозиметрически через 24 ч.

Таблица 51 - Нормативы РА бактериальной а-амилазы для хлеба

определяющие поражение его «картофельной болезнью»

Время обнаружения картофельной болезни в хлебе, ч Длительность хранения хлеба, ч

по органолеп- тической оценке по РА 16 24 36

Органолепти-ческая оценка КБХ, баллы РА, % Органолеп-тическая оценка КБХ, баллы РА, % Органолеп-тическая оценка КБХ, баллы РА, %

48 36 н.о. 0-10 н.о. 0-10 н.о. свыше 20

36 24 н.о. 0-10 н.о. свыше 20 0,5 31-60

24 16 н.о. свыше 20 0,5 31-60 0,5-1,0 61-90

9 Апробация метода

Для апробации метода проверены 8 проб зерна пшеницы с разной зараженностью. В пробах зерна определяли содержание СБ, РА а-амилазы, эти показатели проверяли в зерне до и после очистки, данные представлены в таблице 52 и 53. Очистку зерна проводили на ситовом сепараторе ЗЛС с набор из двух сит карманного с размером ячеек 5 мм, и подсевного с размером 1,7х20 мм.

С помощью нормативов вискозиметрического показателя активности бактериальной а-амилазы в зерне (РА), исключающие заболевание хлеба картофельной болезнью были выделены:

- пробы зараженные, пробы с РА > 43

- пробы с выявленной зараженностью, пробы с РА в промежутке 20-42

- пробы чистые, пробы с РА < 20

Таблица 52. Показатели КБХ в исходном зерне.

№ Инструментальные показатели Микробиология

пробы число падения, с разжижающая активность, % К0Е/г-103

1 192 24 2,8

2 126 62 7,5

3 159 47 10

4 222 6 1,5

5 247 0 0,2

6 207 15 0,1

7 194 23 0,9

8 215 10 4,5

Таблица 53. Показатели КБХ в очищенном зерне.

№ пробы Инструментальные показатели Микробиология

число падения, с разжижающая активность, % КОЕ/г-103

1 204 20 2,1

2 133 59 4,1

3 161 45 9

4 222 12 0,6

5 252 0 0,1

6 231 7 0,2

7 203 21 0,6

8 217 15 1,5

В представленных пробах имелось 2 зараженные пробы, 2 выявленные и 4 чистые пробы. После очистки зерна микробиологическая нагрузка во всех представленных пробах имела тенденцию к уменьшению. Учитывая, что развития КБХ зависит от количества СБ то и РА в пробах при определении в очищенном зерна пшеницы немного уменьшилось.

Анализируя данные представленные в таблицах можно подтвердить и то, что на развитие КБХ имеет прямое воздействие не только количество СБ присутствующих в проверяемой пробе, но и их ферментативная активность, так проба №8 имела достаточно сильную микробиологическую нагрузку но при этом отличалась по РА от пробы №7 с меньшем количеством СБ (рисунки 17 и 18).

120

100

80

60

< 40

20

I РА

I КОЕ

Предел РА для чистых проб

•Предел РА для зараженных проб

№ пробы

Рисунок 17 Разжижающая активность и микробиология исходного зерна.

Рисунок 18. Разжижающая активность и микробиология зерна после очистки.

В полученной нами муке, из очищенных проб зерна, проверяли микробилогический показатель - количество СБ бактерий, и их амилолилтическую активность - разжижающую активность. Данные приведены в таблице 54.

Таблица 54. Показатели КБХ в муке.

№ пробы Инструментальные показатели Микробиология КОЕ/г-103

Число падения, с Разжижающая активность, %

1 214 20 1,6

2 125 66 2,3

3 143 55 8

4 193 28 1,3

5 223 16 0,5

6 209 19 0,7

7 136 61 1,3

8 226 10 1,1

С помощью нормативов разжижающей активности бактериальной а-амилазы как показателя пораженности зернопродукта (муки) возбудителями «картофельной болезни хлеба» были определены следующие пробы:

- пробы зараженные, пробы с РА > 30

- пробы с выявленной зараженностью, пробы с РА в промежутке 11-30

- пробы чистые, пробы с РА < 11

При анализе микробиологических показателей выяснилось, что при помоле всех 8 проб зерна, несколько проб были загрязнены СБ с предыдущих помолов, что привело к дополнительной нагрузке и увеличению проб с выявленной зараженностью КБХ. Одна из сильно зараженных проб зерна была отправлена на помол перед слабо зараженными пробами, и даже очистка оборудования после помола не дала полную микробиологическую чистоту мельницы, что в дальнейшем отразилось на пробах №4, №5, №6, №7. Самое сильное заражение произошло в пробе №7, она после помола перешла по своим показателям в разряд зараженных проб (рисунок 19).

90

12345678

№ пробы

Рисунок 19. Разжижающая активность и микробиология муки первого сорта.

Пробы №4, №5, №6, №7 увеличили не только количество СБ но и РА в них возросла. Таким образом, из 4 чистых и 2 выявленных проб в зерне, в муке, после заражения при помоле получилось - 1 чистая, 4 выявленные и 3 зараженные пробы КБХ.

Зараженность остальных проб (не загрязненных при помоле) несколько снизилось по своим микробилогическим показателям. РА в муке практически не изменилась, по этому показателю пробы муки не отличались от зерна.

Изменение микробиологических биохимических и органолептических показателей порчи КБХ изучали на формовом хлебе, полученном методом пробных лабораторных выпечек.

В соответствии с принятой методикой в хлебе определяли содержание СБ, разжижающую активность бактериальной а-амилазы, а также развитие КБХ по интенсивности специфического запаха, липкости и цвету мякиша, наличию очагов, которые оценивали органолептически (таблица 55).

Таблица 55. Показатели развития КБХ в хлебе.

№ пробы Органолептика, баллы 36 часов РА, % 24 часа РА, % 36 часов Микробиология К0Е/г-103 36 часов

1 0 11 25 2400

2 2 27 62 12300

3 1 23 60 13600

4 0 0 10 3500

5 0 0 17 450

6 0 11 13 1000

7 1 6 48 8800

8 0 0 29 2800

С помощью нормативов разжижающей активности бактериальной а-амилазы как показателя поражения хлеба картофельной болезнью были определены следующие пробы:

- пробы зараженные, пробы с РА > 31

- пробы с выявленной зараженностью, пробы с РА в промежутке 20-30

- пробы чистые, пробы с РА < 20

В выпеченном хлебе из зараженных проб муки, КБХ была обнаружена органолептически через 36 часов хранения в провокационных условиях, а также с помощью общего показателя РА, что совпадает с нормативами для хлеба, как показателя поражения его заболеванием (рисунок 20).

2 изначально зараженные и 1 сильно обсемененная при помоле пробы имели ярко выраженную зараженность КБХ. Из приведенных данных видно сильную разжижающую активность и выявленные органолептические признаки развития КБХ в хранившемся хлебе.

Выпеченные хлеба после проверки разделились на 3 чистых, 2 с выявленной КБХ и 3 зараженные КБХ в соответствии с СанПиН 2.3.2. 1078-01.

Определение микробиологии в хлебе имела зависимость от проявления КБХ и РА. В хлебе с выявленным заражением количество микроорганизмов было на порядок больше чем в хлебах без проявления КБХ.

70

1 2 1 а ь ь / а № пробы

Рисунок 20. Разжижающая активность в хлебе через 24 и 36 часов инкубации

В результате получены данные по изменению зараженности КБХ зерна после очистки, по переходу СБ при помоле из зерна в муку, а также зараженности хлеба при его выпекании. Уточнены граничные значения РА и содержания СБ в зерне муке и хлебе, соответствующие органолептической оценке болезни хлеба (таблица 56).

Исходные уровни заражения 8 проб зерна СБ были разнообразны пробы были представленны как с низким, так и с сильным заражением бактериями, нагрузка СБ колебалась от 0,1 до 10 КОЕ/г-10 Их величина в указанных пределах влияла на скорость и интенсивность развития КБХ в хлебе. Также анализ ряда проб показал, что не только от количества СБ но и от их ферментативной активности зависит проявление РА в пробах.

Таблица 56. Общие данные по зерну исходному, зерну после очистки, муке и

выпеченному хлебу

№ пробы Зерно Зерно после очистки Мука Пробная лабораторная выпечка

РА, % КОЕ/г-103 РА, % КОЕ/г-103 РА, % КОЕ/г-103 Запах, баллы 36 часов РА, % 24 часа РА, % 36 часов К0Е/г-103 36 часов

1 24 2,8 20 2,1 20 1,6 0 11 25 2400

2 62 7,5 59 4,1 66 2,3 2 27 62 12300

3 47 10 45 9 55 8 1 23 60 13600

4 6 1,5 12 0,6 28 1,3 0 0 10 3500

5 0 0,2 0 0,1 16 0,5 0 0 17 450

6 15 0,1 7 0,2 19 0,7 0 11 13 1000

7 23 0,9 21 0,6 61 1,3 1 6 48 8800

8 10 4,5 15 1,5 10 1,1 0 0 29 2800

Микробиологические показатели имели тенденцию к уменьшению на каждом этапе переработки зерна (после очистки и помола) но при этом выявление зараженности и развития КБХ происходило соответственно нормативам РА разработанных для СТО. При помоле всех 8 проб зерна, несколько проб были загрязнены СБ с предыдущих помолов, что привело к дополнительной нагрузке и увеличению проб с выявленной зараженностью КБХ (рисунок 21).

Сравнительные испытания 3 разработанных методов выявления КБХ для зерна, продуктов его переработки и хлеба на основании общего показателя РА показали, что прослеживаемость заражения проверяемого продукта возможна еще до его получения, то есть с зерна (рисунок 22).

Рисунок 21. Микробиологическое изменение в процессе очистки и помола

зерна пшеницы.

Рисунок 22. Изменение разжижающей активности в процессе очистки, помола зерна пшеницы и выпечке хлеба из полученной муки первого сорта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Приведено научное и практическое обоснование применения вискозиметрического метода по выявлению возбудителей «картофельной болезни хлеба» в зерне и зернопродуктах, обеспечивающего своевременное, приборное определение возможности возникновения «картофельной болезни хлеба». Одноэтапный метод оценки активности бактериальной а-амилазы при инкубировании в пробирках для ЧП не целесообразен для применения, так как при использовании картофельного крахмала и популяции СБ, не обладающих индуцированной а-амилазой, требуется до 40 ч для синтеза а-амилазы и проявления разжижающей способности.

2. Выявлены динамика и закономерности развития СБ и синтеза ими а-амилазы на хлебном субстрате, позволившие сократить общую продолжительность анализа, в жидких накопительных культурах синтез бактериальной а-амилазы не связан с количеством и ферментативной активностью СБ и не обеспечивает достоверную оценку зараженности зернопродуктов КБХ.

3. Определена связь биохимических и микробиологических процессов, протекающих при развитии возбудителей КБХ на хлебном субстрате, что позволило заменить субъективную органолептическую оценку КБХ в пробных лабораторных выпечках на объективную инструментальную оценку величины РА а-амилазы, накопленной СБ при развитии на хлебном субстрате.

4. Разработан новый приборный вискозиметрический метод по выявлению зараженности «картофельной болезнью хлеба» зерна и продуктов его переработки.

5. Разработан новый показатель определения зараженности зерна и зернопродуктов КБХ - разжижающая активность (РА), и доказана его зависимость как от содержания спорообразующих бактерий, так и от их физиологической активности.

6. Разработаны нормы РА для количественной оценки зараженности зерна, муки и хлеба с целью контроля, прогнозирования и управления производства безопасной продукции, и утверждены 3 стандарта организации на новые вискозиметрические методы по определению зараженности зерна, продуктов его переработки и хлеба «картофельной болезни хлеба».

Список принятых сокращений

КМАФАнМ (общее микробное число) - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. КБХ - «картофельная» болезнь хлеба; СБ - спорообразующие бактерии - возбудители КБХ; ЧП - число падения, с; НК - накопительная культура; МПА - мясопептонный агар; СА - сусло агара;

ОВВ - относительная влажность воздуха ИП - индекс порчи; СТО - стандарт организации; ПЧП - прибор для определения ЧП;

РА - разжижающая активность бактериальной а-амилазы, %; КОЕ/г - количество микроорганизмов (колониеобразующих единиц).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авдиюк, Е.В. Очистка а-амилаз Aspergillus flavus var. oryzae и Bacillus subtilis и их свойства / E. В. Авдиюк, Л.Д. Варбанец, Л.А, Сафронова, Е.С. Харкевич // Biotechnologia Acta - 2012. - №5. - 91-99 с.

2. Акопян, Л.А. Распространенность штаммов бактерий вида B. cereus / Л.А. Акопян, Э.Г. Африкян // Журн. эксп. и клин. медицины. - №5. - 1967. - Р.22.

3. Аскалонов, С.Л. Пищевые заболевания, вызываемые спорообразующими аэробными бактериями Bac. Mesantericus и Bac. Cereus / С.Л. Аскалонов, А.И. Ильченко // Вопросы питания. - Киев: Госмедиздат УССР, 1962. - С.226-229.

4. Ауэрман, А.Я. Технология хлебопекарного производства. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984.

5. Афанасьева, О.А. Микробиологический контроль хлебопекарного производства / О.А. Афанасьева. - М.: Пищевая промышленность, 1976. -С. 113

6. Афанасьева, О.В. Микробиология хлебопекарного производства [Текст] / О.В. Афанасьева; С.-Петерб. фил. Гос. НИИ хлебопекар. пром-ти (СПб Ф ГОСНИИХП), - СПб.: Береста, 2003. -221с.

7. Бакулов, И.А. Токсикоинфекции и токсикозы. Вопросы профилактики заболеваний / И.А. Бакулов, А.М. Смирнов, Д.А. Васильев // Ульяновск, УГСХА, 2004. - С.64 - 66.

8. Берковски, Э.И. За круглым столом - о качестве хлеба в Киргизии // Хлебопродукты. - 1991. - №8. - С. 23-29.

9. Билай, В.И. Основы общей микологии. - М: Вища школа, 1974. - 395

с.

10. Богатырева, Т.Г. Значение хлебопекарных дрожжей в технологии и микробиологическом заражении хлеба / Т.Г. Богатырева, И. Г. Белявская // Хлебопродукты. - 2012. - №2. - С. 56-59.

11. Богатырева, Т.Г. Современные методы диагностики болезней хлеба // Хлебопродукты. - 2008. - №2. - С.50-51; №3. - С.50-52.

12. Богатырева, Т. Г. Современные методы диагностики болезней хлеба // Хлебопродукты. - 2008. - №3. - С.50-52.

13. Витавская, А.В. Биологическая защита хлеба от картофельной болезни хлеба / А.В. Витавская, Г.Н. Дудикова, К.А. Тулемисова. - Алматы, 1998. - С. 432.

14. Галич, И. П. Амилазы микроорганизмов. — К.: Наук. думка, 1987. —

192 с.

15. Головачева, Р.С. Современная классификация термофильных бацилл // Сб. Современные представления о термофилии микроорганизмов. - М.: Наука, 1973. - С.52-62.

16. ГОСТ 27669-88 Мука пшеничная хлебопекарная. Метод пробной лабораторной выпечки хлеба.

17. ГОСТ 27676-88 Зерно и продукты его переработки. Метод определения числа падения.

18. Демчук, А.П., Ройтер И.М. Методы выявления и предупреждения «картофельной» болезни хлеба. - М.: ЦНИИТЭИ Пищепром, 1970. - 41 с.

19. Джей, Дж. М. Современная пищевая микробиология [Текст] / Дж.М. Джей, М.Дж. Лёсснер, Д. А. Гольден; пер. 7-го англ. изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знания. - 2011. - 86 с.

20. Доерфель, К. Статистика в аналитической химии. - М.: Мир, 1969. -

247 с.

21. Доспехов, Б. А. методика полевого опыта с основами статистической обработки результатов исследований. - Изд. Пятое, доп. и перер. - М.: Агропромиздат. - 1985. - 352 с.

22. Дудикова, Г. Проблемы картофельной болезни хлеба в Казахстане // Хлебопродукты. - 2001. - №11. - С. 23-26.

23. Егоров, В.В. Практикум по микробиологии / В.В. Егоров. - М.: Издво МГУ, 1986. - С. 35-42.

24. Емцев, В. Т. Микробиология : учебник для вузов / В. Т. Емцев, Е. Н. Мишустин. - 5-е изд., перераб. и доп. - М. : Дрофа, 2005. - 445 с.

25. Заварзин, Г.А. Лекции по природоведческой биологии. // Г.А. Заварзин - НАУКА, 2003. - С. 345.

26. Заварзин, Г.А. Фенотипическая систематика бактерий: Пространство логических возможностей. -М.: Наука, 1974. - С.56.

27. Затула, Д.Г. Влияние метаболитов споровых сапрофитных бактерий на организм человека / Д.Г. Затула, С.Р. Резник // - Киев: «Наукова Думка», 1973. - С. 10-12.

28. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба / Поландова Р.Д., Богатырева Т.Г., Сидорова О.Ф. и др. - М.: Минсельхозпрод РФ, 1998. - 31 с. (№1100/2451-98-115).

29. Инструкция по предупреждению «картофельной» болезни хлеба на хлебопекарных предприятиях: ГосНИИХП. - М., 2012. - 32 с.

30. Калдыркаев, А.И. Изучение вирулентности бактерий вида Bacillus сегеш / А.И. Калдыркаев, М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, Г.Ф. Архипова // Материалы международной научно-практической конференции. -Ульяновск. - 2009. - С. 114-116.

31. Клевакин, В.М. Санитарная микробиология пищевых продуктов / В.М. Клевакин, В.В. Карцев. - Л.: Медицина - 1986. - С.704

32. Козьмина, Н.П. Биохимия зерна и продуктов его переработки. - М.: Колос, 1976. - 375 с.

33. Костров, Е.И. Борьба с потерями зерна путем снижения его зараженности. Элеваторная промышленность / Е.И. Костров, С.М. Кондратьева, Т.В. Шленская // Экспресс-информация. - М.: ЦНИИТЭИ хлебопродуктов. -1986. - С. 15-18.

34. Кретович, В.Л. Биохимия зерна и хлеба. - М.: Издательство академии наук СССР, 1958. - 173 с.

35. Кретович, В.Л. Биохимия растений: Учебник для биол. Факультетов. -М.: Высш. школа, 1980. - 445 с.

36. Кретович, В.Л. Техническая биохимия. - М.: Высшая школа, 1973. -

456с.

37. Лакин, Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа. - 1980. - 293 с.

38. Логинова, Л.Г. Амилаза // Сб. Современные представления о термофилии микроорганизмов. - М.: Наука, 1973. - С. 151-164.

39. Логинова, Л.Г., Егорова Л.А., Цаплина И.А. Рост и развитие аэробных бацилл // Сб. Современные представления о термофилии микроорганизмов. - М.: Наука, 1973. - С.63-70.

40. Львова, Л.С. Вискозиметрический метод определения зараженности зерна возбудителями «картофельной болезни» хлеба / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Хлебопродукты. - 2014. - №2. - С. 55-57.

41. Львова, Л.С. Вискозиметрический метод определения «картофельной болезни» в муке и хлебе / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Хлебопродукты. - 2013. -№12. - С. 52-55.

42. Львова, Л.С. Заболеет хлеб или нет / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Зерно. - 2013. - №11. - С. 158-159.

43. Львова, Л.С. Источники загрязнения зерна спорообразующими бактериями - возбудителями «картофельной» болезни хлеба / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Хлебопродукты. - 2013. - №9. - С. 57-59.

44. Львова, Л.С. Контаминация муки возбудителями картофельной болезни / Л.С. Львова, А.В. Яицких // Кондитерское и хлебопекарное производство. - 2014. - №11-12. - С. 58-61.

45. Львова, Л.С., Яицких А.В. Откуда в хлебе картофельная палочка // Зерно. - 2013. - №8. - С. 187-190.

46. Львова, Л.С. Приборный вискозиметрический метод определения картофельной болезни в хлебе / Л.С. Львова, Е.П. Мелешкина, А.В. Яицких // Современные аспекты научно-технологического обеспечения переработки сельскохозяйственного сырья и отходов: Сб. докладов международной научно-практической конференции. - г.Астана. 2014. - 299 стр.

47. Маркина, Л. Пищевая Безопасность зернового хлеба / Л. Маркина, Г. Н. Панкратов, Е. Шкапов // Хлебопродукты. - 2001. - №9. - С. 29-30.

48. Мартыненко, Н.С. Определение прибором «структурометр 1» физико-механических свойств формирующегося при выпечке мякиша сдобных булочных изделий / Н.С. Мартыненко, А.С. Романов, В.Ю. Богер, М.А. Беккер // Техника и технология пищевых производств - 2010. - №2.

49. Мачихина, Л.И., Алексеева Л.В., Львова Л.С. Научные основы продовольственной безопасности зерна (хранение и переработка). - М.: ДеЛи принт, 2007. - 382 с.

50. Медведев, П.В., Степанов А.С., Федотов В.А. Оценка уровня зараженности зерна пшеницы различных природно-географических зон Оренбургской области возбудителями картофельной болезни хлеба // Вестник ОГУ, № 2 (108) - Оренбург, 2010. - С. 114-118.

51. Мелешкина, Е. П. Связь числа падения со свойствами углеводно-амилазного комплекса муки // Хлебопродукты. - 2005. - № 9. - С. 28 - 32.

52. Мелешкина, Е. П. ЧП, Автолитическая активность и амилограф // Хлебопродукты. - 2005. - № 10. - С. 24 - 25

53. Методы и приборы для определения качества заготовляемого и поставляемого в переработку зерна. Сборник ВНИИЗ /А. И. Мартьянова, Т. И. Очеретенко, А. И. Рыжова, И. Э. Жупахина, Г. Е. Гришина, Т. А. Леонова, Е. П. Мелешкина и др. / М., ВНИИЗ, 1992. - 132 с.

54. Микробиологическая порча пищевых продуктов. - Под ред. К.де В.Блекберн.- СПб.: Издательство «Профессия». - 2008 г . - 784 с.

55. Микробиологический контроль на хлебопекарных предприятиях / соек: Г.1 . Юсупова, О.А.Сидорова, О Л. Тарутина, Р.Д. Поландока, О.В. Афанасьева. - М.: ГОСНИИХП, Московская типография №2. - 2008 г. - 334 с.

56. Минаева, Л.П. Возбудители картофельной болезни хлеба: выделение, идентификация методом ПЦР [Текст] / Л.П. Минаева // «Кондитерское и хлебопекарное производство». -№ 5.-2009 г.-С. 40-42.

57. Мирзоева, А.В. Бактерии группы сенной и картофельной палочек. -М.: Изд-во АН СССР, 1959. - 175 с.

58. Мишустин, Е.М., Трисвятский Л.А. Микробы и зерно. - М.: Изд-во АН СССР, 1963. - 292 с.

59. Мишустин, Е.М. Термофильные микроорганизмы в природе и практике. М. - Л.: Изд-во АН СССР, 1950. - 391 с.

60. Никитина, Е. В. Изучение кукурузного крахмала ферментированного амилазой Bacillus. / Е. В. Никитина, С. В. Захарова, Ф. К. Алимова, Ю. А. Морозова - 2011 г. - 150-152 с.

61. Омельченко, В.Д. Зерна, поврежденные и испорченные микроорганизмами и самосогреванием как критерий санитарно-гигиенического состояния пшеницы и кукурузы / В.Д. Омельченко Автореф. дисс. канд. техн. наук. -М., - 1991. - С. 1-9.

62. Омельченко, В.Д. Микробиологическая характеристика поврежденных и испорченных зерен в кукурузе и пшенице / В.Д. Омельченко, Л.С. Львова, З.К. Быстрякова и др. // Труды ВНИИЗ. - 1992. - Вып. 118. - С.166-128.

63. Пельц, О.В. Гигиеническая оценка контаминации муки возбудителями картофельной болезни / О.В. Пельц, Е.Я. Долгушина, Н.Н. Аксенова и др. // Медицина в Кузбасе, спецвыпуск. - 2003, №5. - С.74-75.

64. Першин, Г.Н. Влияние бактерицидных и химиотерапевтических веществ на бактериальные ферменты. - М.: Медгиз. - 1952. - 228 с.

65. Поландова, Р.Д. Зависимость «картофельной болезни» хлеба от протеолитической активности бактерий Bacillus subtilis / Р.Д. Поландова, А.В. Бердутина, О.А. Сидорова, О.Н. Трубникова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - №11. - С. 38-40.

66. Правила организации и ведения технологического процесса па хлебопекарных предприятиях / утв. директором ГосНИИХП: ввод, в действие с 12.07.1999. М.: ГОСНИИХП.- 1999 г.- 126 с.

67. Практикум по микробиологии. - Под ред. проф. А.И. Нетрусова, Высшее профессиональное образование. - Москва: Естественные пауки. - 2005 г. -584 С.

68. Прокопова, Л.Л. Вас. сегеш как возможные возбудители пищевых токсикоинфекций. - Автореф. канд. дис. - Киев, 1971.

69. Пумпянский, А.Я. Картофельная болезнь хлеба и ее предотвращение [Текст] / А.Я. Пумпянский. - Москва; Пищепромиздат. - 1955 г. - 44 с.

70. Пучкова, Л.И. Технология хлеба / Л.И. Пучкова, Р.Д. Поландова, И.В. Матвеева - СПб.: ГИОРД, 2005. - С. 35.

71. Рахимберлина, Р.М. Роль споровых аэробов в этиологии «картофельной» болезни хлеба // Автореф. дис. канд. биол. наук. - Алма-Ата, 1980. - 20 с.

72. Романов, А.С. Экспертиза хлеба и хлебобулочных изделий. Качество и безопасность / А.С. Романов, Н.И. Давыденко, Л.Н. Шатнюк и др. // Сибирское университетское издательство. - Новосибирск. - 2005.

73. СанПин 2.3.2. 1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. -М.: Минздрав России, 2002. - 164с.

74. Сборник современных технологий хлебобулочных изделий. - Под общ, ред. чл.-корр. РАСХН, д.э.н., проф. А.П. Косована. - Москва. - РАСХН. -2008 г. 268 с.

75. Сборник технологических инструкций для производства хлеба и хлебобулочных Изделий: [сборник]. - М.: прейскурантиздат, 1989. - 494 с.

76. Семенюк, Г. Микрофлора // Хранение зерна и зерновых продуктов. Пер. с англ. -М.: ИЛ, 1956. - С.82-148.

77. Скурихин, И.М., Тутельян В.А. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. - М.: Медицина. - 1988. - 342 с.

78. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Васильевская // Киев: Наукова Думка, 1982. - С.117-120.

79. Теппер, Е. 3. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е. 3. Теппер, В, К. Шилыпткова. Г. И, Переверзева; Под ред. В. К. Шильниковой. — 5-е изд.. перераб. и доп. — М.: Дрофа, 2004. — 256с.

80. Технологические рекомендации по улучшению качества хлебобулочных изделий из муки с пониженными хлебопекарными свойствами [Текст]: М.: Изд-во ООО «Вторая типография».-20101.-98 с.

81. Трисвятский, Л.А. Хранение зерна. - М: Агропромиздат, 1986. - 352 с.

82. Уметова, Г.Б., Витавская А.В. За «круглым столом» - о качестве хлеба в Киргизии // Хлебопродукты. - 1991. - №8. - С. 23-29.

83. Федоров, М.В. Микробиология. - М: Сельхозгиз, 1955. - 437 с.

84. Фениксова, Р.В. Биохимические основы получения и применения ферментных препаратов. Уч. пособие «Техническая биохимия». - М.: Высшая школа, 1973. - С.375-453.

85. Феоктистова, Н.А. Бактерии вида Bacillus Mesantericus - возбудителей пищевых отравлений / Н.А Феоктистова, М.А. Юдина, Д.А. Васильев, И.Р. Хусаинова // Молодежь и наука XXI века: Материалы III международной научно-практической конференции молодых ученых. - Ульяновск, 2010. - С.78-82.

86. Феоктистова, Н.А. Оценка качества пшеничной муки на наличие возбудителей картофельной болезни хлеба / Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин, и др. // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: материалы IV международной научно-практической конференции. -2012. - Т.1. - С.320-326.

87. Юдина, М.А. Роль бактерий вида Bacillus mesantericus в контаминации объектов санитарного надзора / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.а. Васильев и др. // Аграрная наука - сельскому хозяйству: материалы VI международной научно-практической конференции. - Барнаул, 2011. - Т.3. -С.353-355.

88. Юсупов, Р.Х. Картофельная болезнь хлеба и способы её предупреждения / Р.Х. Юсупов, Б.А. Матвеев и др. // Материалы XLII научно-технической конференции ЧГАУ. - М., 2003. - С. 374.

89. Яковленко, В.А. Технохимический контроль производства в отрасли хлебопродуктов // Учебник и учебное пособие для вузов. «Колос» - М., 1975. -С. 382.

90. Яковлев, В.И. Технологии микробиологического синтеза // Учебник и учебное пособие для вузов. - Л., Химия, 1987. - С. 272.

91. Яковлева Н.П. Фитопатология. Программированное обучение // «Колос» - М., 1992. - С. 384.

92. Якубке, Х. Д. Хлеб. Аминокислоты, пептиды, белки / Х. Д. Якубке, Ешкайт Х. // Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. - С. 456.

93. Al-Quadan, F., Hazem A., Rasha N. Characteristics of a novel, highly acid-and thermo stable amylase from thermophilic Bacillus strain HUTBS62 under different environmental conditions // Ann. Microbiol. — 2011. — V. 61, N 4. — P. 887-892.

94. Annamalai, N., Thavasi R., Vijayalakshmi S., Balasubramanian T. Extraction, purification and characterization of thermostable, alkaline tolerant a-amylase from Bacillus cereus // Ind. J. Microbiol. — 2011. — V. 51, N 4. — P. 424-429.

95. Asgher, M., Asad M. J., Rahman S. U., Legge R. L. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing // J. Food Engin. — 2007. — V. 79. — P. 950-955.

96. Bailey, C. P. Bacillus'Bacillus spore contamination associated with commercial bread manufacture/ Bailey, C. P., A. von Holy // Food Microbiol. - 1993. V 10. -P. 287— 294.

97. Burcik, E. Ueber die Beziehungen zwischen Hydratur und Wachstum bei Bacterien und Hefen //Arch. Mikrobiol. - 1951. - V.15. - S.203-235.

98. Chen, M. L., and H. Y, Tsen. 2002. Discrimination of Bacillus cereus and Bacillus thuringiemiswith 16S rRNA and gyragyra gene based PCR primers and sequencing of their annealing sites. J. Appl. Microbiol. V 92. - P. 912-919.

99. Coleman, G., Elliot W.H. Studies on a-amylase formation by Bacillus subtilis // Biochem. J. - 1962. - V.83. - P.256.

100. Collins. A characterisation of Bacillus isolates from ropy bread, bakery equipment and raw materials / Collins, N. F., L. A. M. Kirshner, and A. von Holy. // S. Afr. J. Sci. - 1991. - V 87. -P. 62-66.

101. Condon, S., A. Influence of the incubation temperature after heat treatment upon the estimated heat resistance values of spores of Bacillus subtilis. / Condon, S., A. Palop, J. Raso, F. J. Sala. // Lett. Appl. Bacteriol.— 1996. 22:149 - v 152.

102. Coppola, S., O. Pepe, and G. Mauriello. 1998. Effect of leavening microflora orxpizza dough properties. J. Appl. Microbiol. V 85. - P. 891-897.

103. Corsetti, A., M. Gobbetti, and E. Smacchi. 1996. Antibacterial activity of sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory substance from Lactobacillus saw/ranczscoLactobacillus sanfrancisco C57. Food Microbiol. V 13. -P. 447-456.

104. Cranum, P.E. Bacillus cereus. In: Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. - Washington, DC: Am. Soc. Microbiol., 1997. - P.327-336.

105. De Bellis P., Valerio F. et al. Natural contamination of semolina by Bacillus spp. Spores and inhibition of rope spoilage in bread // 1st MoniQA International Conference. Book of Abstracts. - Rome, Italy. - P.67.

106. De Souza P. M., Magalhaes P. O. Application of microbial a-amylase in industry: A review // Braz. J. Microbiol. — 2010. — V. 41, N 4. — P. 850-861.

107. Fisher, E. A. A study of rope in bread / Fisher, E. A., and P. Halton. // Cereal Chem. - 1928. - V5. -P. 192-208.

108. Fukumoto, J., Yamamoto, T. & Tsuru, D. Proc. int. Symp. Enzyme Chemistry, Tokyo and Kyoto. 1957. - P. 366.

109. Ghorbel, R. E., Maktouf S., Massoud E. B. et al. New thermostable amylase from Bacillus cohnii US147 with a broad pH applicability // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2009. — V. 157. — P. 50-60.

110. Gordon, R.E., Smith N.R. Aerobic sporeforming bacteria capable of growth at high temperatures // J. Bact. - 1949. - V.58. - P.327-341.

111. Gordon, R. E. The genus Bacillus. // In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio), 1973. - V.1. - P.71-88.

112. Gregersen, T. 1978. Rapid method for distinction of Gram negative from Gram positive bacteria. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V5. - P. 123-127.

113. Griffiths, M. Strategies to control the outgrowth of spores of psychrotrophic Bacillus spp. in dairy products / M. Griffiths, J.D. Phillips // Milchwissenschaft. - 1990. - №10.

114. Hagihara, B. Annu. Rep. sci. Works Fac. Sci. 1954. Osaka Univ. 235.