Развитие подходов импульсного электронного парамагнитного резонанса для структурных исследований биомолекул и их комплексов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Крумкачёва Олеся Анатольевна

• Крумкачёва Олеся Анатольевна
• доктор наук
• 2023

Оглавление диссертации доктор наук Крумкачёва Олеся Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи работы

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Вклад автора

Степень достоверности и апробация результатов

Благодарности

ГЛАВА 1. МЕТОДОЛОГИЯ ИМПУЛЬСНОЙ ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ СПИНОВЫХ МЕТОК НА ОСНОВЕ ТРИАРИЛМЕТИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ

Конформационная подвижность триарилметильных спиновых меток в структурных исследованиях ДНК

Подходы к исследованию нуклеиновых кислот методами дипольной ЭПР спектроскопии при физиологической температуре

Электронная спиновая релаксация триарилметильных меток при комнатной температуре

Подход к исследованию структурной организации надмолекулярных белково-нуклеиновых комплексов

Глава 2. ПОДХОДЫ ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КОМПЛЕКСОВ РИБОСОМ ЧЕЛОВЕКА

Конформационная динамика мРНК в процессе элонгации трансляции по данным ЭПР

Взаимодействие РНК с 40S субъединицей рибосомы вблизи входа в мРНК-канал по данным ЭПР

Две альтернативные конформации мРНК в декодирующем участке 80S рибосомы человека на стадиях элонгации и терминации трансляции по данным ЭПР

Развитие ЭПР подходов для изучения комплексов с участием длинных РНК

Глава 3. НОВЫЕ ПОДХОДЫ В СВЕТОИНДУЦИРОВАННОЙ ИМПУЛЬСНОЙ ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ

Фотовозбужденное гиперполяризованное триплетное состояние фуллерена как спиновая метка нового типа

Оптимизация чувствительности в импульсных ЭПР-экспериментах с фотометками

Подходы ЭПР для исследования комплексов фотосенсибилизаторов с альбумином

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Развитие подходов импульсного электронного парамагнитного резонанса для структурных исследований биомолекул и их комплексов»

Актуальность темы исследования

Исследование структуры и функций биомолекул и их комплексов является актуальным направлением в современной науке, поскольку тесно связано с решением важнейшей задачи биофизики, молекулярной и структурной биологии -установлению принципов работы различных компонент клетки и организма на молекулярном уровне. Кроме того, такие исследования необычайно актуальны с точки зрения медицины и фармакологии, так как позволяют проследить механизмы возникновения различных заболеваний на уровне отдельных белков, молекул нуклеиновых кислот или низкомолекулярных соединений и разработать средства для их терапии. За последние два десятилетия спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) стала важным инструментом в структурной биологии, дополняющим методы более высокого разрешения, такие как рентгеновская кристаллография, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР).[1] В большинстве случаев биополимеры не имеют собственных парамагнитных центров, поэтому для проведения ЭПР исследований требуется вводить спиновые метки с ненулевым спином электрона в заданные положения биомолекулы (Рис. 1). Два (или более) парамагнитных центра в исследуемом объекте взаимодействуют посредством диполь-дипольного взаимодействия, величина которого зависит от расстояния между метками. В случае, когда метки расположены на расстоянии 1.5-10 нм (в некоторых случаях до 16 нм), величину диполь-дипольного взаимодействия между электронными спинами можно определить методами импульсной ЭПР спектроскопии. Данные методы применимы для широкого круга биополимеров.

Ключевой особенностью импульсной дипольной ЭПР спектроскопии является возможность получать не только информацию о среднем расстоянии между парамагнитными центрами, но и точное распределение по расстояниям. Благодаря этому становится возможным исследовать системы с неоднородным

конформационным ансамблем и отслеживать структурные переходы, возникающие при изменении условий среды или при образовании комплексов.

Рис. 1 Принципы импульсной дипольной ЭПР спектроскопии. (а) Введение спиновых меток в биополимер. (б) Спин-гамильтониан дипольного взаимодействия, красным выделена зависимость от расстояния между метками. (в) Последовательность импульсного двойного электрон-электронного резонанса (ДЭЭР). (г) Типичный спектр эхо-детектированного ЭПР нитроксильной метки с указанием позиций накачки и детектирования. (д) Типичная временная зависимость ДЭЭР и (е) получаемое распределение по расстояниям между спиновыми метками.

Методология спектроскопии ЭПР в приложении к биополимерам сегодня

продолжает активно развиваться. Можно выделить два глобальных тренда в

области ЭПР и его приложений, которым сегодня уделяется особое внимание. Во-

первых, это исследования, направленные на преодоление существующих

ограничений метода, таких как относительно низкая чувствительность и

необходимость проводить исследования при низких температурах. Второе

направление — это применение ЭПР для исследования сложных

многокомпонентных биологических комплексов, где важно отслеживать

6

структурные перестройки как отдельных частей, так и всего ансамбля в целом. В частности, ЭПР спектроскопия имеет большой потенциал в области исследования структурной организации рибосомных комплексов и белково-нуклеиновых комплексов, участвующих в репарации ДНК. Конформационные изменения молекул РНК играют ключевую роль в биологических процессах, регулируя функционирование, например, трансляционного комплекса рибосомы, ответственного за синтез белков в клетках. Глубокое понимание принципов работы таких макромолекулярных структур необходимо для ответа на многие фундаментальные вопросы современной биофизики и молекулярной биологии, а также может способствовать созданию новых лекарств и диагностике заболеваний.

Степень разработанности темы исследования

Свойства спиновых меток, применяемых в дипольной ЭПР спектроскопии, являются критически важными, так как они определяют возможные ограничения в чувствительности метода и диапазон измеряемых расстояний. Традиционно в качестве спиновых меток для таких исследований использовались нитроксильные радикалы ^=1/2) (Рис. 2). Данные метки отличаются небольшой стоимостью, высокой устойчивостью к восстановлению и наличием широкого набора методов для их селективного введения в биополимеры. Перечисленные важные преимущества делают нитроксильные радикалы широко используемыми в дипольной ЭПР спектроскопии. Однако их применение также сопряжено с определенными недостатками, которые могут налагать серьезные ограничения на использование метода ЭПР в исследованиях биомолекул.

Одним из критических ограничений является минимально допустимая концентрация спиновых меток, и, соответственно, исследуемых объектов, составляющая примерно 0.05-0.1 мМ. Многие важные биологические объекты и их комплексы, например, такие, как рибосомы, плохо растворяются в данных концентрациях. Помимо этого, важным параметром спиновых меток является время фазовой памяти (Тт), которое определяет диапазон расстояний, доступных

для измерения импульсным ЭПР. В связи с этим импульсные ЭПР эксперименты с использованием стандартных нитроксильных меток в большинстве случаев проводятся при температуре менее 80 К, где время фазовой памяти максимально. При повышении температуры значение Тт сокращается, что связано, в том числе, с активацией движений метильных групп нитроксильного радикала.

Рис. 2 Структуры различных спиновых меток и их эхо-детектируемые спектры ЭПР в Q-диапазоне в замороженных растворах.

Для того, чтобы повысить чувствительность дипольной ЭПР спектроскопии

и преодолеть существующие ограничения, ЭПР-лаборатории всего мира, ведут

8

поиски новых спиновых меток. "Идеальная" спиновая метка для дипольной ЭПР спектроскопии должна отвечать следующим основным критериям: интенсивный наблюдаемый сигнал ЭПР, длительное время электронной фазовой спин-спиновой релаксации вплоть до физиологических температур, и высокая стабильность к восстановлению в клеточной среде. В течение последних лет было предложено несколько новых спиновых меток и способов их оптимизации с целью расширения возможностей применения дипольной ЭПР спектроскопии.

Наиболее существенные улучшения чувствительности дипольной ЭПР спектроскопии за последнее время были получены в результате создания и развития спиновых меток на основе триарилметильных (ТАМ) радикалов (Рис. 2). Триарилметильные метки характеризуются микросекундным временем фазовой памяти в широком диапазоне температур, обладают узким и интенсивным ЭПР спектром и демонстрируют высокую химическую устойчивость в клеточных условиях. Эти характеристики делают триарилметильные радикалы весьма перспективными в качестве спиновых меток для анализа структуры биологических систем в условиях, близких к физиологическим.

Первая успешная демонстрация использования ТАМ радикалов как спиновых меток для белков была осуществлена в 2012 году профессором Джеком Фридом (Jack H. Freed) из Корнельского университета (Cornell University) в США. [2] Измерения проводились для белка лизоцима, который был иммобилизован путём ковалентного связывания с твёрдой поверхностью. Из-за короткого времени электронной фазовой памяти исследование было ограничено температурой 277 K (4°С) и короткими расстояниями - до 2 нм. На момент начала исследований, описанных в данной диссертации, других примеров применения триарилметильных меток, включая их использование для анализа нуклеиновых кислот, в научной литературе не было. Также отсутствовали примеры проведения подобных экспериментов при температуре выше 277 K.

Изучение структурной организации и динамики сложных надмолекулярных комплексов, образованных нуклеиновыми кислотами и белками, в частности,

рибосом человека, является фундаментальной задачей современных наук о живом. Рибосомы - специальные органоиды, обеспечивающие заключительный этап реализации генетической информации - синтез белка в клетке (трансляцию). Для изучения структурной организации комплексов, моделирующих различные состояния рибосом высших организмов в процессе трансляции, в последние годы активно применяют методы рентгеноструктурного анализа (РСА) и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), что позволило расшифровать структуры этих комплексов с атомным разрешением . [3-6] Однако данные методы имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, многие комплексы трудно или даже невозможно получить в кристаллическом виде, что делает невозможным их изучение с помощью рентгеноструктурного анализа. Также ни один из вышеупомянутых методов не пригоден для расшифровки структур легко диссоциирующих (лабильных) комплексов.

Современные подходы, используемые для анализа данных крио-ЭМ, в случае систем с большим конформационным и композиционным разнообразием, к которым относятся комплексы рибосом, - несовершенны. [7] Анализ таких образцов требует классификации изображений частиц на структурно однородные подмножества, а итоговый результат в значительной степени зависит от выбранного для классификации подхода и от заданного количества классов. Как результат, в итоговой архитектуре может быть утеряна информация о конформационной динамике исследуемого объекта, так же как о наличии легко диссоциирующих (лабильных) комплексов или элементов, обладающих повышенной подвижностью. Однако эти отсутствующие данные могут быть важны для описания механизмов сборки комплексов, а их учет открывает возможности для обнаружения новых функционально значимых факторов. Для исследования сложных биологических комплексов в настоящее время развиваются гибридные (или комплексные) подходы, которые предполагают объединение данных крио-ЭМ с дополнительной информацией о конформационной динамике ансамбля, полученной комплементарными методами. [8]

Как уже отмечалось, дипольная ЭПР спектроскопия применима для исследования сложных многокомпонентных комплексов, и, что особенно важно, позволяет получать полную функцию распределения по расстояниям для всего ансамбля. Учитывая это, данный метод обладает большим потенциалом касательно исследования комплексов рибосом и может предоставить новую функционально важную информацию, дополняющую данные крио-ЭМ. Несмотря на это, ЭПР-спектроскопия пока не получила широкого применения для измерения межспиновых расстояний в сложных надмолекулярных комплексах биополимеров. Спин-меченые производные транспортной РНК (тРНК) и аналогов матричной РНК (мРНК) были использованы лишь в единичных ранних работах по изучению комплексов бактериальных рибосом. В частности, с использованием спин-меченого производного тРНК наблюдали конформационные изменения в молекуле тРНК, вызванные её связыванием с рибосомой,[9] а спин-меченую полиуридиловую кислоту применяли в качестве аналога мРНК для изучения стехиометрии рибосомного комплекса, образующегося с её участием. [10]

Принципиально новым направлением в области ЭПР является идея использования в качестве спиновой метки долгоживущей фотовозбужденной молекулы (например, порфирина или фуллерена). В основном состоянии эти молекулы диамагнитны и обладают нулевым спином S=0. Под воздействием лазерного импульса фотометка способна эффективно переключаться в возбужденное триплетное состояние со спином S=1, которое можно зарегистрировать методом ЭПР. Если рядом с триплетной молекулой находится парамагнитный партнер, например, нитроксильный радикал со спином S=1/2, то между двумя метками возникает диполь-дипольное взаимодействие, величина которого зависит от расстояния между метками, и которое может быть измерено методами ЭПР. Преимущество в использовании фотоиндуцированных триплетных молекул по сравнению со стандартными нитроксильными спиновыми метками заключается в многократном увеличении интенсивности регистрируемого ЭПР сигнала. Это реализуется благодаря тому, что в сформированной под действием

света триплетной молекуле наблюдается неравновесная поляризация электронных уровней, для которой разница заселённостей в 10-100 раз превышает разность в случае равновесной (Больцмановской) заселенности уровней в нитроксильном радикале.

Первая работа, продемонстрировавшая возможности дипольной ЭПР спектроскопии с использованием фотоиндуцированного триплетного состояния в применении к пептиду в замороженном растворе, была выполнена в 2014 г. с использованием молекулы порфирина в качестве фотометки. [11] Однако эта молекула не является оптимальной для таких экспериментов из-за достаточно широкого спектра ЭПР (~80 мТл) (Рис. 2). В результате в этих экспериментах интенсивность наблюдаемого сигнала ЭПР была сравнима с интенсивностью нитроксильного радикала. Поскольку типичная спектральная ширина возбуждения в импульсных экспериментах ЭПР составляет ~2 мТл (~50 МГц), эффективным было бы использовать триплетную молекулу с более узким спектром, чтобы возбуждать больше спинов и наблюдать более интенсивный сигнал. Не менее важным является тот факт, что скорость электронной спиновой релаксации триплета порфирина не позволяет проводить дипольные эксперименты ЭПР при физиологических температурах.

Оба недостатка могут быть успешно устранены с помощью другого типа фотовозбужденных триплетов - фуллеренов. Фуллерены имеют гораздо более узкий спектр ЭПР по сравнению с порфиринами ~20 мТл. Это позволяет более эффективно возбуждать триплеты и значительно увеличить отношение сигнал/шум. Кроме того, известно, что спектры ЭПР фотовозбужденных фуллеренов детектируются вплоть до комнатной температуры, и проведение экспериментов дипольного ЭПР в условиях, близких к нативным, является потенциально возможным.

Применение фотовозбужденных триплетных состояний в качестве спиновых меток в ЭПР-спектроскопии открывает новые перспективы в изучении структуры биологических комплексов с фотоактивными молекулами. Это включает в себя

системы, используемые в фотодинамической терапии, где изучение закономерностей связывания фотолигандов с биомакромолекулами является ключевым этапом в разработке новых лекарственных и диагностических препаратов. Несмотря на высокий потенциал данного подхода, до сих пор методы импульсной ЭПР спектроскопии не применялись для таких систем, что делает данное направление весьма перспективным для дальнейшего исследования.

Цели и задачи работы

Цель работы - разработка новых подходов импульсной ЭПР спектроскопии для преодоления существующих ограничений метода и расширения его возможностей в структурных исследованиях биополимеров, а также применение ЭПР для изучения структурной организации сложных биологических надмолекулярных комплексов.

Задачами работы являлись:

• Разработка методологии импульсной ЭПР спектроскопии для спиновых меток нового типа на основе триарилметильных радикалов, в том числе для проведения экспериментов при комнатных температурах.

• Разработка подходов импульсного ЭПР для установления структурной организации надмолекулярных белково-нуклеиновых структур с использованием спиновых меток разной природы, на примере комплекса, участвующего в репарации ДНК.

• Разработка подходов импульсной ЭПР спектроскопии для исследования структуры природных РНК и комплексов рибосом человека. Применение новых подходов для установления конформационной динамики матричных РНК в составе различных комплексов рибосом человека.

• Исследование гиперполяризованного триплетного состояния фуллерена в качестве перспективной спиновой метки нового типа для дипольных ЭПР измерений, включая эксперименты при низких концентрациях.

• Разработка комплексного подхода на основе методов ЭПР с участием фотовозбужденных триплетных состояний для исследования структурных и функциональных свойств белковых комплексов, перспективных в фотодинамической терапии рака.

Научная новизна работы

На примере широкого ряда дуплексов ДНК, спин-меченных триарилметильными и нитроксильными радикалами, впервые установлена зависимость формы распределения по расстояниям между метками от типа спинового центра и структуры линкера. На основании полученных данных определена оптимальная стратегия для введения спиновых меток в дуплексы ДНК с использованием триарилметильных радикалов.

Впервые реализованы эксперименты по измерению нанометровых расстояний в биополимерах при физиологической температуре с использованием триарилметильных меток и импульсной ЭПР-спектроскопии, что было недостижимо для используемых ранее других типов спиновых меток. Предложены эффективные и простые процедуры иммобилизации ДНК для проведения дипольных ЭПР измерений при комнатных температурах.

Впервые предложен и реализован новый подход, позволяющий проводить дипольные измерения при 300 К (27°С) в ортогональной спиновой паре, состоящей из триарилметильного и нитроксильного радикалов. Новизна данного подхода определяется использованием нитроксильной спиновой метки не для наблюдения, что широко распространено в импульсном ЭПР при низких температурах, а в качестве быстро-релаксирующего спина при 300 К.

Проведено масштабное исследование электронной спиновой релаксации триарилметильных радикалов при 300 К в зависимости от структуры радикала и свойств растворителя. Впервые установлен механизм электронной фазовой релаксации триарилметильных радикалов в высоких магнитных полях (выше 350

мТл) и определены оптимальные параметры для проведения дипольных ЭПР измерений с их участием.

Разработан новый подход к исследованию стохастических ориентационных движений молекул на наносекундной шкале методом ЭПР с использованием триарилметильных спиновых зондов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить исследования в широком диапазоне температур, включая комнатную, что ранее было невозможно с использованием стандартных нитроксильных зондов.

Предложен оригинальный подход к исследованию структурной организации белково-нуклеиновых комплексов, в основе которого лежит идея ортогональных (спектроскопически различных) спиновых меток, где триарилметильные центры селективно вводятся в ДНК, а нитроксильные - в белок. Предложенный подход впервые успешно реализован на примере детального исследования конформационных изменений ДНК, вызванных введением локального повреждения и образованием комплекса с апурин-апиримидиновой эндонуклеазой 1. Впервые продемонстрировано, что данные ЭПР могут быть использованы для отслеживания расщепления ДНК эндонуклеазой.

Впервые предложен подход ЭПР спектроскопии для определения конформационной динамики матричных РНК в составе комплексов рибосом человека. Данный подход применен для исследования структурной организации мРНК на стадиях элонгации и терминации трансляции. Получен ряд важных результатов, дополняющих атомарные модели рибосомных комплексов. Впервые напрямую зарегистрирован и подробно исследован лабильный комплекс олигонуклеотидов с 40S рибосомой, формирующийся вне мРНК-связывающего канала.

Впервые предложено использовать в качестве спиновой метки фотовозбужденный фуллерен. Показаны преимущества фотовозбужденного фуллерена в дипольных ЭПР экспериментах по сравнению с недавно предложенной порфириновой меткой и стандартной нитроксильной меткой.

Проведено количественное сравнение чувствительности различных методов дипольного ЭПР для фуллереновых меток. Впервые экспериментально продемонстрирована возможность проведения дипольных ЭПР измерений с рекордно низкой концентрацией спиновых меток 100 нМ (объем 10 мкл). На сегодняшний день это наилучший результат среди всех опубликованных данных.

Разработан интегральный подход, сочетающий применение различных методов импульсной и стационарной ЭПР-спектроскопии, для определения и описания функциональных характеристик различных сайтов связывания фотосенсибилизаторов с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА). Применимость и информативность предложенного подхода продемонстрирована на примере исследования комплексов ЧСА с двумя модельными агентами для фотодинамической терапии. Установлена зависимость функциональных свойств комплексов фотолигандов от их локализации на молекуле белка внутри белков.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты, полученные соискателем, вносят значительный вклад в развитие новейших физико-химических методов исследования структуры и функций биомолекул. В работе удалось решить ряд важных проблем в области импульсной ЭПР спектроскопии и значительно расширить область применения данного метода в структурной биологии, в том числе для исследования сложных надмолекулярных комплексов.

Разработанные подходы для проведения дипольных ЭПР-экспериментов при физиологических температурах открывают новые горизонты в структурных исследованиях биомолекул, делая возможным проведение исследований, которые ранее были недоступны импульсному ЭПР. Такие исследования включают в себя изучение конформационных изменений биополимеров при физиологической температуре, индуцированных различными внешними факторами, такими как вариация температуры или воздействие фотооблучения.

Методы иммобилизации ДНК при комнатных температурах, представленные в данной работе и обеспечивающие условия для импульсных ЭПР измерений, отличаются высокой гибкостью и универсальностью. Их можно адаптировать для разнообразных биологических исследований, связанных с нуклеиновыми кислотами. Эти методы способствуют дальнейшему развитию в области исследования структуры и динамики биосистем на нанометровом масштабе в естественных условиях. В частности, предложенная процедура иммобилизации ДНК с использованием ионообменного сорбента Nucleosil®DMA, недавно была применена профессором Т. Признером (Prof. Dr. Thomas F. Prisner) из Университета Гёте во Франкфурте (Goethe University Frankfurt). Эта методика позволила провести уникальные исследования быстрой внутренней динамики двойной спирали ДНК с использованием метода ЭПР. [12]

Предложенный в исследовании метод анализа стохастических ориентационных движений на наносекундном масштабе с применением триарилметильных зондов может быть востребован для описания процессов, протекающих в биологических объектах при низких температурах. В частности, этот подход может быть использован для изучения механизмов, которые лежат в основе криоконсервации, и способствовать разработке более эффективных методов хранения биологических образцов, в том числе вакцин.

Предложенный подход к изучению белково-нуклеиновых комплексов с использованием импульсной дипольной ЭПР-спектроскопии и ортогональных спиновых меток на основе триарилметильных и нитроксильных радикалов обладает широким спектром применения. Он может быть адаптирован для детального анализа разнообразных комплексов, играющих ключевую роль в процессах репарации, репликации и транскрипции ДНК, что открывает новые перспективы в понимании этих фундаментальных биологических процессов.

Результаты исследования рибосомных комплексов человека значительно обогащают и дополняют данные, ранее полученные с использованием криоэлектронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии. Эти научные

достижения способствуют углублению понимания молекулярных механизмов трансляции у млекопитающих. В долгосрочной перспективе новые знания могут стать основой для разработки терапии заболеваний, связанных с нарушениями в работе рибосом, а также для разработки новых антибиотиков (цитотоксических агентов), селективно действующих на клетки млекопитающих, простейших или бактерий.

Предложенная стратегия применения фуллереновых меток является важным шагом в направлении снижения необходимой для исследования концентрации спин-меченых биомолекул в ЭПР-спектроскопии. Это открывает новые возможности для изучения систем, работа с которыми ранее была ограничена из-за высоких требований к концентрации образцов. В перспективе это имеет особое значение для дипольных ЭПР исследований в клетках, где невозможно использовать большие концентрации исследуемых объектов. До сих пор применение ЭПР для структурных исследований в клетках было сильно ограничено из-за быстрого восстановления стабильных спиновых меток до диамагнитного состояния во внутриклеточной среде. Использование фотоиндуцированных спиновых меток позволяет принципиально решить эту проблему. Изначально такие метки являются диамагнитными, и их переход в парамагнитное триплетное состояние происходит непосредственно перед запуском импульсной ЭПР последовательности. Этот подход может стать ключевым для проведения более сложных и точных структурных ЭПР исследований на клеточном уровне.

Предложенный метод комплексного исследования взаимодействия фотоактивных молекул с человеческим сывороточным альбумином открывает новые возможности для детального изучения процесса взаимодействия фотосенсибилизаторов с белками в организме человека. Такой подход может стать инструментом в проектировании новых агентов для фотодинамической терапии, что, в свою очередь, может способствовать повышению эффективности этого метода лечения. При этом область применения данного метода не ограничивается

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Крумкачёва Олеся Анатольевна, 2023 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Schiemann O. et al. Benchmark Test and Guidelines for DEER/PELDOR Experiments on Nitroxide-Labeled Biomolecules // J. Am. Chem. Soc. American Chemical Society, 2021. Vol. 143, № 43. P. 17875-17890.

2. Borbat P. et al. Pulsed ESR dipolar spectroscopy for distance measurements in immobilized spin labeled proteins in liquid solution // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134, № 24. P. 9950-9952.

3. Llacer J.L. et al. Conformational Differences between Open and Closed States of the Eukaryotic Translation Initiation Complex // Mol. Cell. 2015. Vol. 59, № 3. P. 399412.

4. Simonetti A. et al. eIF3 Peripheral Subunits Rearrangement after mRNA Binding and Start-Codon Recognition // Mol. Cell. 2016. Vol. 63, № 2. P. 206-217.

5. Brown A. et al. Structural basis for stop codon recognition in eukaryotes // Nature. 2015. Vol. 524, № 7566. P. 493-496.

6. Lomakin I.B., Steitz T.A. The initiation of mammalian protein synthesis and mRNA scanning mechanism: 7462 // Nature. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 500, № 7462. P. 307-311.

7. Lyumkis D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis // J. Biol. Chem. 2019. Vol. 294, № 13. P. 5181-5197.

8. Banerjee A., Bhakta S., Sengupta J. Integrative approaches in cryogenic electron microscopy: Recent advances in structural biology and future perspectives // iScience. 2021. Vol. 24, № 2. P. 102044.

9. Rodriguez A. et al. Interaction of 70 S ribosomes from Escherichia coli with spinlabeled N-Cbz-Phe-tRNAPhe. An electron paramagnetic resonance study. // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, № 17. P. 8116-8120.

10. Damerau W. et al. Probing of mRNA binding sites involved in interactions with rat liver ribosomes using poly(U) spin labeled at the ribose moiety // Biomed. Biochim. Acta. 1986. Vol. 45, № 6. P. 727-736.

11. Albertini M. et al. Porphyrin Triplet State as a Potential Spin Label for Nanometer Distance Measurements by PELDOR Spectroscopy // J. Am. Chem. Soc. 2014. Vol. 136, № 18. P. 6582-6585.

12. Granz M. et al. Dynamics of Nucleic Acids at Room Temperature Revealed by Pulsed EPR Spectroscopy // Angew. Chem. Int. Ed. 2018. Vol. 57, № 33. P. 1054010543.

13. Milov A.D., Salikhov K.M., Shchirov M.D. Application of the double resonance method to electron spin echo in a study of the spatial distribution of paramagnetic centers in solids // Sov. Phys. Solid State. 1981. Vol. 23. P. 565-569.

14. Kulik L. V. et al. Electron dipole-dipole interaction in ESEEM of nitroxide biradicals // Chem. Phys. Lett. 2001. Vol. 343, № 3-4. P. 315-324.

15. Garbuio L. et al. Orthogonal spin labeling and Gd(III)-nitroxide distance measurements on bacteriophage T4-lysozyme // J. Phys. Chem. B. 2013. Vol. 117, № 11. P. 3145-3153.

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

Owenius R., Eaton G.R., Eaton S.S. Frequency (250 MHz to 9.2 GHz) and viscosity dependence of electron spin relaxation of triarylmethyl radicals at room temperature // J. Magn. Reson. 2005. Vol. 172, № 1. P. 168-175. Kanazhevskaya L.Yu. et al. Conformational Dynamics of Abasic DNA upon Interactions with AP Endonuclease 1 Revealed by Stopped-Flow Fluorescence Analysis // Biochemistry. 2012. Vol. 51, № 6. P. 1306-1321. Wilson D.M. et al. Incision Activity of Human Apurinic Endonuclease (Ape) at Abasic Site Analogs in DNA // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, № 27. P. 1600216007.

Kutuzov M.M. et al. Interaction of poly(ADP-ribose) polymerase 1 with apurinic/apyrimidinic sites within clustered DNA damage // Biochem. Mosc. 2011. Vol. 76, № 1. P. 147-156.

Erzberger J.P., Wilson D.M. The role of Mg2+ and specific amino acid residues in the catalytic reaction of the major human abasic endonuclease: new insights from EDTA-resistant incision of acyclic abasic site analogs and site-directed mutagenesis // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 290, № 2. P. 447-457.

Schermerhorn K.M., Delaney S. Transient-State Kinetics of Apurinic/Apyrimidinic (AP) Endonuclease 1 Acting on an Authentic AP Site and Commonly Used Substrate Analogs: The Effect of Diverse Metal Ions and Base Mismatches // Biochemistry. 2013. Vol. 52, № 43. P. 7669-7677.

Maher R.L., Bloom L.B. Pre-steady-state Kinetic Characterization of the AP Endonuclease Activity of Human AP Endonuclease 1 // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282, № 42. P. 30577-30585.

Kuznetsova A.A. et al. Substrate specificity of human apurinic/apyrimidinic

endonuclease APE1 in the nucleotide incision repair pathway // Nucleic Acids Res.

Oxford University Press, 2018. Vol. 46, № 21. P. 11454-11465.

Budkevich T. V. et al. Regulation of the mammalian elongation cycle by subunit

rolling: a eukaryotic-specific ribosome rearrangement // Cell. 2014. Vol. 158, № 1. P.

121-131.

Svidritskiy E. et al. Structures of yeast 80S ribosome-tRNA complexes in the rotated and non-rotated conformations // Struct. Lond. Engl. 1993. 2014. Vol. 22, № 8. P. 1210-1218.

Rabl J. et al. Crystal Structure of the Eukaryotic 40 S Ribosomal Subunit in Complex with Initiation Factor 1 // Science. 2011. Vol. 331, № 6018. P. 730-736. Ben-Shem A. et al. The Structure of the Eukaryotic Ribosome at 3.0 Ä Resolution // Science. 2011. Vol. 334, № 6062. P. 1524-1529.

Takyar S., Hickerson R.P., Noller H.F. mRNA Helicase Activity of the Ribosome // Cell. Elsevier, 2005. Vol. 120, № 1. P. 49-58.

Hinnebusch A.G. The Scanning Mechanism of Eukaryotic Translation Initiation // Annu. Rev. Biochem. 2014. Vol. 83, № 1. P. 779-812.

Pisareva V.P. et al. Translation initiation on mammalian mRNAs with structured 5'-UTRs requires DExH-box protein DHX29 // Cell. 2008. Vol. 135, № 7. P. 12371250.

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

Graifer D., Karpova G. Photoactivatable RNA derivatives as tools for studying the structural and functional organization of complex cellular ribonucleoprotein machineries // RSC Adv. The Royal Society of Chemistry, 2013. Vol. 3, № 9. P. 2858-2872.

Graifer D. et al. Variable and conserved elements of human ribosomes surrounding the mRNA at the decoding and upstream sites // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № 11. P. 3282-3293.

Demeshkina N. et al. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA codons at the human ribosomal A, P, and E sites: A crosslinking study with mRNA analogs carrying an aryl azide group at either the uracil or the guanine residue // RNA. 2000. Vol. 6, № 12. P. 1727-1736.

Demeshkina N. et al. Positioning of mRNA codons with respect to 18S rRNA at the P and E sites of human ribosome // Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Struct. Expr. 2003. Vol. 1627, № 1. P. 39-46.

Schilling-Bartetzko S. et al. Apparent association constants of tRNAs for the ribosomal A, P, and E sites. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, № 7. P. 4693-4702. Sharifulin D.E. et al. Molecular contacts of ribose-phosphate backbone of mRNA with human ribosome // Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Regul. Mech. 2015. Vol. 1849, № 8. P. 930-939.

Graifer D. et al. 2'-OH of mRNA are critical for the binding of its codons at the 40S ribosomal P site but not at the mRNA entry site // FEBS Lett. 2012. Vol. 586, № 20. P. 3731-3736.

Sharifulin D.E. et al. Exploring accessibility of structural elements of the mammalian 40S ribosomal mRNA entry channel at various steps of translation initiation // Biochim. Biophys. Acta BBA - Proteins Proteomics. 2016. Vol. 1864, № 10. P. 1328-1338.

Sharifulin D.E. et al. Molecular contacts of ribose-phosphate backbone of mRNA with human ribosome // Biochim. Biophys. Acta BBA - Gene Regul. Mech. 2015. Vol. 1849, № 8. P. 930-939.

Molotkov M.V. et al. mRNA 3' of the A Site Bound Codon is Located Close to Protein S3 on the Human 80S Ribosome // RNA Biol. 2006. Vol. 3, № 3. P. 122-129. Graifer D. Variable and conserved elements of human ribosomes surrounding the mRNA at the decoding and upstream sites // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № 11. P. 3282-3293.

Budkevich T. V. et al. Regulation of the Mammalian Elongation Cycle by Subunit Rolling: A Eukaryotic-Specific Ribosome Rearrangement // Cell. 2014. Vol. 158, № 1. P. 121-131.

Schmidt C. et al. The cryo-EM structure of a ribosome-Ski2-Ski3-Ski8 helicase complex // Science. 2016. Vol. 354, № 6318. P. 1431-1433.

Grosheva A.S. et al. Recognition but no repair of abasic site in single-stranded DNA by human ribosomal uS3 protein residing within intact 40S subunit // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 7. P. 3833-3843.

45. Raleigh D.P. Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules. Gerald D. Fasman // Q. Rev. Biol. 1997. Vol. 72, № 1. P. 70-70.

46. Anger A.M. et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome // Nature. 2013. Vol. 497, № 7447. P. 80-85.

47. Petry S., Weixlbaumer A., Ramakrishnan V. The termination of translation // Curr. Opin. Struct. Biol. 2008. Vol. 18, № 1. P. 70-77.

48. Muhs M. et al. Cryo-EM of Ribosomal 80S Complexes with Termination Factors Reveals the Translocated Cricket Paralysis Virus IRES // Mol. Cell. 2015. Vol. 57, № 3. P. 422-432.

49. Taylor D. et al. Cryo-EM structure of the mammalian eukaryotic release factor eRF1-eRF3-associated termination complex // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Vol. 109, № 45. P. 18413-18418.

50. Preis A. et al. Cryoelectron Microscopic Structures of Eukaryotic Translation Termination Complexes Containing eRF1-eRF3 or eRF1-ABCE1 // Cell Rep. 2014. Vol. 8, № 1. P. 59-65.

51. Shao S. et al. Decoding Mammalian Ribosome-mRNA States by Translational GTPase Complexes // Cell. 2016. Vol. 167, № 5. P. 1229-1240.e15.

52. Matheisl S. et al. Structure of a human translation termination complex // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № 18. P. 8615-8626.

53. Song H. et al. The Crystal Structure of Human Eukaryotic Release Factor eRF1— Mechanism of Stop Codon Recognition and Peptidyl-tRNA Hydrolysis // Cell. 2000. Vol. 100, № 3. P. 311-321.

54. Bulygin K.N. et al. Chemical footprinting reveals conformational changes of 18S and 28S rRNAs at different steps of translation termination on the human ribosome // RNA. 2016. Vol. 22, № 2. P. 278-289.

55. Bhaskar V. et al. Dynamics of uS19 C-Terminal Tail during the Translation Elongation Cycle in Human Ribosomes // Cell Rep. 2020. Vol. 31, № 1. P. 107473.

56. Bertran A. et al. Light-induced pulsed dipolar EPR spectroscopy for distance and orientation analysis // Methods in Enzymology. Elsevier, 2022. Vol. 666. P. 171-231.

57. Hintze C. et al. Laser-Induced Magnetic Dipole Spectroscopy // J. Phys. Chem. Lett. American Chemical Society, 2016. Vol. 7, № 12. P. 2204-2209.

58. Bakry R. et al. Medicinal applications of fullerenes // Int. J. Nanomedicine. 2007. Vol. 2, № 4. P. 639-649.

59. Yamakoshi Y. et al. Active Oxygen Species Generated from Photoexcited Fullerene (C 60 ) as Potential Medicines: O 2 - • versus 1 O 2 // J. Am. Chem. Soc. 2003. Vol. 125, № 42. P. 12803-12809.

60. Di Giosia M. et al. Proteins as supramolecular hosts for C 60 : a true solution of C 60 in water // Nanoscale. 2018. Vol. 10, № 21. P. 9908-9916.

61. Wu H. et al. Solubilization of pristine fullerene by the unfolding mechanism of bovine serum albumin for cytotoxic application // Chem. Commun. 2011. Vol. 47, № 38. P. 10659.

62. Leonis G. et al. A Comprehensive Computational Study of the Interaction between Human Serum Albumin and Fullerenes // J. Phys. Chem. B. 2015. Vol. 119, № 48. P. 14971-14985.

63. Benyamini H. et al. Interaction of C 60 -Fullerene and Carboxyfullerene with Proteins: Docking and Binding Site Alignment // Bioconjug. Chem. 2006. Vol. 17, № 2. P. 378-386.

64. Gieldon A. et al. Rapid insight into C60 influence on biological functions of proteins // Struct. Chem. 2017. Vol. 28, № 6. P. 1775-1788.

65. Belgorodsky B. et al. Formation and Characterization of Stable Human Serum Albumin-Tris-malonic Acid [C 60 ]Fullerene Complex // Bioconjug. Chem. 2005. Vol. 16, № 5. P. 1058-1062.