Разработка технологии молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Алексеев, Яков Игоревич

• Алексеев, Яков Игоревич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Алексеев, Яков Игоревич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Генетически модифицированные организмы (определение, проблемы

использования)

1.2. Основные цели создания ГМ линий сельскохозяйственных растений

1.3. Классификация ГМО

1.4. Законодательство в сфере оборота и анализа ГМ продукции. Обзор линий ГМО, 15 разрешенных к применению в продуктах питания и кормах на территории Российской Федерации

1.5. Основные методы обнаружения ГМО

1.5.1. Физико-химические методы анализа (хроматография, спектрофотомтрия, 20 спектрофлюорометрия и др.)

1.5.2. Иммуноферментный анализ

1.5.3. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

1.6. Типы ПЦР анализа образцов на наличие ГМО

1.7. Схема анализа ГМО методом ПЦР-РВ в России

1.8. Современное состояние использования ПЦР-РВ в диагностике ГМО

1.9. Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР

1.10. Другие методы определения ГМО, основанные на анализе ДНК

1.11. Диагностические системы для выявления ГМО

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Конструирование, синтез и очистка праймеров и зондов для ПЦР-РВ

2.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

2.3. Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот

2.4. Биологический материал (стандарты, опытные образцы)

2.5. Определение процентного содержания чужеродной ДНК относительно геномной ДНК 43 растений

2.6. Методика приготовления калибровочных растворов на примере сои линии GTS 40-3-2 44 и кукурузы линии MON 810

2.7. Статистическая обработка результатов исследования

2.8. Получение плазмиды для внутреннего положительного контроля (клонирование)

Глава 3. Результаты исследований

3.1 Разработка метода и набора реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и 48 пищевых продуктов

3.2 Разработка скрининговых методов выявления трансформационных 56 событий

3.2.1 Разработка праймеров и зондов для обнаружения трансформационных событий 56 методом ПЦР в реальном времени

3.2.2. Выявление последовательностей генов устойчивости к фосфинотрицину - bar, pat и 65 глифосату - epsps

3.2.3. Выявление растительной ДНК и ДНК сои

3.2.4. Разработка наборов реагентов для скринингового обнаружения промоторов 35S 78 CaMV, Р-FMV и терминатора NOS

3.2.5. Разработка набора реагентов для скринингового обнаружения генов bar, pat и epsps 82 методом ПЦР в реальном времени

3.3. Разработка набора реагентов для обнаружения вируса мозаики цветной капусты и 85 промотора CaMV 35S методом ПЦР в реальном времени

3.4. Разработка набора реагентов для выявления ГМ рапса методом ПЦР в реальном 88 времени

3.5. Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК ГМ сои лини 98 GTS 40-3-2, устойчивой к глифосату методом ПЦР в реальном времени

3.6. Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК ГМ кукурузы 103 линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку

3.7. Пример исследования продуктов питания на содержание в них ДНК ГМО

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение №1. Протокол выделения ДНК разработанным набором реагентов

Список сокращений и условных обозначений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы, степень ее разработанности. Одной из важнейших задач современной биотехнологии является повышение эффективности и безопасности производства основных сельскохозяйственных культур. Одним из эффективных способов увеличения урожайности сельскохозяйственных растений является придание традиционным растениям новых свойств (устойчивость к вредителям, к средствам защиты) с помощью тенной инженерии. При этом необходимо глубокое изучение и исключение возможных негативных воздействий от введенных в растение генетических изменений на человека и экологию. Современное законодательство Российской Федерации регламентирует использование генетически модифицированных организмов: в продуктах питания и кормах могут быть использованы только прошедшие государственную регистрацию линии сельскохозяйственных культур, для которых доказана их безопсность для человека и экологии (Тутельян В.А., 2007, Соколов М.С., 2011). При этом, если количество ДНК генетически модифицированного растения в продукте питания превышает 0,9%, соответствующее указание должно содержаться на этикетке данного продукта. Для обеспечения эффективного контроля за наличием и количественным содержанием ДНК, разрешенных, а в случае невыявления разрешенных, но выявления трансфорационного(ых) события(й) - запрещенных, к использванию в продуктах питания и кормах генетически модифицированных растений необходима разработка технологии анализа нуклеиновых кислот. Эффективным методом анализа нуклеиновых кислот является полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ), обладающая высокими эффективностью, аналитической чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью и повторяемостью результата. Метод является быстрым, автматизируемым и стандартизуемым и позволяет получать как качественный, так и количественный результат. Кроме того, метод ПЦР-РВ позволяет детектировать несколько ДНК мишеней одновременно, что существенно снижает стоимость исследования.

Цель работы - разработка и внедрение технологии молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки.

Задачи работы

1. Разработать метод и набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов.

2. Разработать наборы реагентов для скринингового обнаружения ДНК ГМ линий методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.

3. Разработать набор реагентов для одновременного обнаружения вируса мозаики цветной капусты и промотора CaMV 35S методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.

4. Разработать набор реагентов для выявления ДНК ГМ рапса методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.

5. Разработать набор реагентов для количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-32 методом ПЦР в реальном времени.

6. Разработать набор реагентов для количественного обнаружения ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна выполненных исследований

Впервые разработаны наборы реагентов с уникальными системами праймеров и зондов, подобранными на основе анализа данных международной базы генетических данных GenBank. Изучены и подтверждены их высокие аналитические характеристики.

Впервые разработаны наборы реагентов для скринингового обнаружения ГМО, для выявления ГМ рапса, а также наборы реагентов для количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 и ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном времени.

Впервые разработана технология молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных растений и продуктов их переработки, реализующая все стадии исследования - выделение нуклеиновых кислот из из растительного сырья и пищевых продуктов на магнитных частицах, скрининг разрешенных для использования на территории Российской Федерации ГМО, идентификация линий и их количественный анализ. Теоретическая и практическая значимость полученных результатов Разработанные в работе наборы реагентов позволяют выявлять все линии ГМ растений, разрешенные для использования в продуктах питания и кормах на территрии Российской Федерации. Разработаная технология молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки используются испытательными лабораториями Роспотребнадзора, Россельхознадзора, Ростеста, государственными научно-исследовательскими и образовательными учреждениями и частными компаниями как на территории Российской Федерации, так и за рубежом (Украина, Белорусь, Казахстан, Узбекистан, Таджикистан). Использование разработанных наборов реагентов для количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 и ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном времени регламентируется постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.11.2007 №80 «О надзоре за

оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО» и методическими указаниями МУК 4.2.2304 -07.

Методология и методы исследований. Методология работы планировалась для достижения поставленной цели. Исследования проводились современными стандартными и вновь разработанными методами. В работе использовались стандартные, референсные образцы, а также молекулярно-генетические методы. Достоверность и обоснованность результатов и выводов работы подтверждается использованием статистических методов.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод и набор реагентов на магнитных частицах для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов обеспечивает прохождение последующей ПЦР в реальном времени с эффективностью не хуже 85%.

2. Пентаплексный набор реагентов, позволяющий выявлять в анализируемых образцах растительного происхождения одновременно ДНК растений (по гену NADH-дегидрогиназы растений), ДНК ГМ растений по промоторам 35S CaMV и P-FMV, терминатору NOS, имеющий внутренний положительный контроль для исключения ложноотрицательных результатов исследования. Эффективности пяти реакций, находятся в диапазоне 88 - 93,5%, специфичность на исследованной выборке образцов составляет 100%, аналитическая чувствительность находится в пределах 10 копий ДНК мишени в мл. Разработанный набор реагентов позволяет выявлять 22 из 24 разрешенных для применения на территории Российской Федерации линий ГМ растений.

3. Тетраплексный набор реагентов, позволяющий проводить скрининг и выявлять в анализируемых образцах растительного происхождения три основных специфичных для ГМ растений гена: bar и pat, обеспечивающих устойчивость к фосфинотрицину, и гена epsps, придающего устойчивость к глифосату (Раундап), имеющий внутренний положительный контроль для исключения ложноотрицательных результатов исследования. Эффективности четырех реакций находятся в диапазоне 92,4 - 95,3%. Набор обладает 100% специфичностью на исследованной выборке образцов, а также высокой аналитической чувствительностью, находящейся в пределах 10 копий ДНК мишени в мл. Набор реагентов позволяет выявлять 12 из 24 разрешенных для применения на территории Российской Федерации линий ГМ растений.

4. Набор реагентов для одновременного обнаружения вируса мозаики цветной капусты и промотора CaМV 35S методом мультиплексной ПЦР в реальном времени. Эффекитвность работы набора реагентов 91%. Специфичность набора реагентов на

исследованной выборке образцов - 100%. Аналитическая чувствительность набора реагентов составляет 1*10 копий ДНК в мл по фрагментам промотора 35S CaMV и ДНК вируса мозаики цветной капусты. Набор реагентов позволяет исключить ложноположительные результаты исследования при анализе генетически модифицированных растений, за счёт попадания в них ДНК вируса мозайки цветной капусты.

5. Набор реагентов, позволяющий выявлять ДНК рапса и обнаруживать чужеродные гены pat, epspsp и терминатор NOS, присутствующие в большинстве коммерчески используемых линий ГМ рапса методом ПЦР в реальном времени. Эффекитвность работы набора реагентов 91%. Специфичность набора реагентов на исследованной выборке образцов -

3 „

100%. Аналитическая чувствительность набора реагентов составляет 2*10 копий определяемых ДНК мишенией в мл.

6. Набор реагентов для количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 методом ПЦР в реальном времени позволяет определять количество ДНК ГМ сои линии GTS 40-3-2 с чувствительностью 0,1% стандарта IRMM GTS40-3-2 и диапазоном количественных измерений (0,1-10) масс % ГМО.

7. Набор реагентов для количественного обнаружения ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном времени позволяет определять количество ДНК ГМ кукурузы линии MON 810 с чувствительностью 0,5 % стандарта IRMM MON810 и диапазоном количественных измерений (0,5-10) масс % ГМО.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на семинарах и годовых отчетах лаборатории анализа генетически модифицированных растений ФГБНУ ВНИИСБ. Материалы диссертации докладывались на 1 st Global Conference on GMO Analysis Villa Erba, Italy 24-27 June, 2008, XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 10 апреля 2013 г., XVI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 14 апреля 2016 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Алексеев, Я.И. 35S промотор вируса норичника (P-FMV) - новая мишень для анализа на содержание генетически модифицированных организмов / Я.И. Алексеев, Т.В. Хотяинцева,

С.В. Боровская, О.С. Колобова, Д.А. Варламов, П.Н. Харченко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии.- 2011.- Вып. 6.- С. 156-161.

2. Алексеев, Я.И. Обнаружение генетически модифицированного рапса методом мультиплексной полимеразной цепной реакции / Я.И. Алексеев, С.В. Боровская, О.С. Колобова, Д.А. Варламов, П.Н. Харченко, О.И. Пашкевич // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2013.- № 4.- С. 33-37.

3. Моисеева, М.В. Разработка наборов реагентов для выявления ДНК генетически модифицированной кукурузы линий 5307 и М0№9034 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени / М.В. Моисеева, Е.Ю. Букина, Я.И. Алексеев, Е.В. Беленович, О.В. Кузубова, Д.А. Варламов, Е.С. Мазурин, П.Н. Харченко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии.- 2015.- Вып. 6.- С. 108-116.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 128 страницах, содержит 33 рисунка и 31 таблицу. Библиографический указатель литературы включает 107 источников, из них 89 зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю Журавлевой Е.В., а также сотрудникам ФГБНУ ВНИИСБ и компании ООО «Синтол» Варламову Д.А., Боровской С.В., Минаковой Н.Ю., Моисеевой М.В. за помощь и взаимопонимание при выполнении и оформлении работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект №14.579.21.0012 от 05 июня 2014 г., ГО RFMEFI57914X0012).

Работа выполнена с использованием дорогостоящего научного оборудования ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ ВНИИСБ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетически модифицированные организмы (определение, проблемы использования)

Под термином «Генетически модифицированные организмы» (генно-инженерно-модифицированные организмы) понимаются организм или несколько организмов, любое неклеточное, одноклеточное образование, способное к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и содержащие генно-инженерный материал, в т.ч. гены, их фрагменты или комбинации генов .

Генетически модифицированные организмы (ГМО) подразделяют на генетически модифицированные микроорганизмы, генетически модифицированные животные и генетически модифицированные растения.

Для придания новых свойств ГМО в геном исходного организма встраивают гены, их фрагменты или комбинации генов. Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном.

На рисунке 1 представлено изображение генно-инженерной последовательности ДНК (генетическая конструкция), вводимой в геном организма и содержащей регуляторные последовательности (промотор и терминатор) и маркерный ген. Факт трансформационного события, то есть включения генетической конструкции в состав генома хозяина, определяет линию ГМ растения.

ДНК хозяина Промотор ГЕН Терминатор Маркер ДНК хозяина

Генетическая конструкция

Трансформационное событие

Рис.1 Схема генетической конструкции.

Наиболее распространенными генами, встраиваемыми при создании ГМ растений, являются гены устойчивости к гербицидам на основе глюфосината аммония (epsps, pat/bar) и гены устойчивости к насекомым cry (зерновой точильщик, колорадский жук и пр.). Наиболее

распространенными регуляторными последовательностями являются промоторы (35S CaMV, NOS, P-FMV и терминаторы NOS, 35S CaMV, E9, osc).

Создание ГМ растений позволяет повысить продуктивность сельскохозяйственного производства и улучшить питательную ценность продуктов питания, а также оказывает опосредованные положительные эффекты, такие как снижение объемов распыляемых пестицидов, увеличение доходов ферм, повышение стабильности урожая и безопасности продуктов питания, что особенно актуально для развивающихся стран. («Modern food biotechnology, human health and development: an evidence-based study» FOOD SAFETY DEPARTMENT* WORLD HEALTH ORGANIZATION, as of 1 June 2005, Department of Food Safety, Zoonoses and Foodborne Diseases).

Однако, многие из этих аргументов подвергаются сомнению и критике учеными и общественностью, поскольку при проверке заявленные эффекты часто не подтверждаются. В настоящее время сложились несколько основных направлений создания и использования ГМ-культур, каждое из которых имеет как свои потенциальные преимущества, так и риски связанные с их использованием (Иван Игнатьев, 2007).

Начиная с 1996 г., когда на рынок вышли первые генетически модифицированные растения (Roundup Ready - RR-соя, имеющая устойчивость к гербициду «Раундап» и «Bollgard», Bt-хлопчатник, устойчивый к табачной листовертке (tobacco budworm) и хлопковой совке (bollworm)) разработки компании Монсанто (США), (что существенно сокращало потребности в пестицидах) они были посажены на общей площади в 1,7 млн. га.

После 19-летнего периода последовательного ежегодного роста с 1996 по 2014 год, общая площадь генетически модифицированных растений достигла максимума в 181,5 млн. га, а в 2015 году снизилась до 179,7 млн Га в 28 странах, т.е. на 1% между 2014 и 2015 годами. Годовые колебания в гектарах ГМ культур (как увеличение, так и уменьшение) зависят от нескольких факторов. В 2015 году основным фактором, приводящим к сокращению площадей под ГМ культурами в некоторых странах, было снижение общих посевов сельскохозяйственных культур. Например, для кукурузы уменьшение составило 4%, а для хлопка - 5%, что было обусловлено низкими ценами, при этом некоторые фермеры перешли от кукурузы, хлопка и рапса к более легко управляемой культуре, такой как ГМ соя, а также к другим менее требовательным культурам таким как подсолнечник и сорго. (James Clive, 2015).

США по-прежнему лидируют среди других стран с 70,9 млн га посевов ГМ растений (39% от общемирового), на втором месте Бразилия - 44,2 млн га, на третьем Аргентина - 24,5 млн га, на четвертом месте Индия - 11,6 млн га, на пятом Канада - 11,0 млн га. Всего ГМ-культуры выращиваются в 28 странах мира. (James Clive, 2015).

В 2015 году такие черты, как устойчивость к насекомым и к гербицидам реализовывались по отдельности в четырех основных сельскохозяйственных культурах: кукурузе, сое, хлопке и рапсе. (James Clive, 2015).

К настоящему моменту в мире известно 406 ГМ линий растений (34 линий сои, 148 кукурузы, 42 рапса, 58 хлопка, 47 картофеля, 3 сахарной свеклы, 11 томатов, 42 риса, а также ГМ подсолнечник, папайя, лен, люцерна, гвоздика, слива, роза, табак и др.).

1.2. Основные цели создания ГМ линий сельскохозяйственных растений

Повышение устойчивости растения к насекомым

Бактериальный Bt-токсин используется в сельском хозяйстве как эффективный инсектицид. Широко распространено использование бактериальной суспензии Bacillus thuringiensis для борьбы с насекомыми. Перенесённый в геном растения бактериальный ген cry Bt-токсина придает растению устойчивость против ряда насекомых-вредителей (CryI и CryIIB токсичны для отряда Чешуекрылых (Lepidoptera); CryIIA - для Чешуекрылых и Двукрылых (Diptera); CryIII - для Жескокрылых (Coleoptera); и четыре вида CryIV белков - для Двукрылых).

Самым распространённым растением, в геном которого встраивают ген Bt-токсина является кукуруза. Устойчивость к насекомым возникает, благодаря введенным в геном кукурузы генов Cry2Ab2, CrylA.105 и Ecry3.lAb (это синтетическая форма генов Cry3A и CrylAb бактерий Bacillus thuringiensis). Эти гены отвечают за синтез эндотоксинов, которые специфически связываются с рецепторами клеток кишечного эпителия насекомых, что приводит к нарушению осмотического равновесия и лизису клеток (Kumar P.A. et al 1996). Примерами ГМ линий кукурузы, устойчивым к насекомым являются 5307, MON89O34 и MON81O.

В настоящее время промышленно выращивают около тридцати сельскохозяйственных Bt-культур (кукуруза, хлопчатник, картофель, рапс, брокколи, арахис, табак и т.д.). По оценке Агентства по защите окружающей среды США (US EPA), только использование Bt-зерновых

культур в США приводит к ежегодному сокращению применения синтетических инсектицидов на площади примерно 3 млн. га. Увеличивается использование Bt-культур во всем мире. (Викторов А.Г., 2008).

Повышение устойчивости растения к действию гербицидов

Ген 5-енолпируват-шикимат-З-фосфатсинтазы (epsps) из бактерии Agrobacterium tumefaciens, введенный в геном растения, придает ему повышенную устойчивость к глифосату (соя GTS 40-3-2, соя MON 89788, кукуруза NK 603, кукуруза MON 88017, сахарная свекла H7-1).

Ген фосфинотрицин-Ы-ацетилтрансферазы (PAT) из бактерии Streptomyces viridochromogenes обеспечивает трансгенным растениям повышенную устойчивость к гербициду глюфозинат аммония. (соя A2704-12, соя A5547-127, соя SYNTOH2, кукуруза Bt11, кукуруза T25).

Повышение устойчивости растения к возбудителям заболеваий

В 1986 году П. Абель впервые получил устойчивую к вирусу табачной мозаики форму табака путём переноса в геном растения гена этого вируса, кодирующего белок оболочки (coat protein - CP) (косупрессия). C тех пор это подход был успешно применен на многих растениях.

Растение начинает производить вирусный белок до того, как вирус в него проникнет, что стимулирует включение защитных механизмов, которые блокируют размножение вируса, в случае его проникновения в растение.

Впервые эту стратегию использовали для спасения индустрии по выращиванию папайи. Распространение вируса кольцевой пятнистости папайи (Papaya ringspot virus (PRSV)) является ограничивающим фактором в производстве папайи во всем мире. В 1992 году PRSV был обнаружен в районе Пуна на острове Гавайи, где выращивалось около 95% папайи Гавайев. В течение двух лет, PRSV быстро распространился, в результате чего индустрия оказалась на грани полного уничтожения. К 1995 году были разработаны первые ГМ сорта папаи «Rainbow» и «SunUp». (Gonsalves, D. 2004) не подверженые заражению этим вирусом, которые выращиваются до сих пор.

Изменение композиции жиров и жирных кислот

Примером могут служить генетически модифицированные линии рапса 23-18-17 и 23198, которые были получены с целью улучшить состав жирных кислот семян. Введение в геном

рапса гена тиоестеразы (UcFatB2) из калифорнийского лавра позволило изменить состав жирных кислот и привело к накоплению в составе масла рапса до 45% ценной 12-членной жирной кислоты - лаурата. Это позволило использовать линии 23-18-17 и 23-198 как замену других масел с высоким содержанием лаурата, например, пальмового. Масла с высоким содержанием лаурата служат ценным пищевым продуктом, а также используются в промышленности для производства моющих средств (http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/gmf-agm/appro/ofb-096-100-a-eng.php).

Изменение ростовых качеств и урожайности

Примерами могут служить соя MON87712 с усиленным ростом и репродуктивным развитием (содержит ген bbx32 Arabidopsis thaliana, кодирующий белок, регулирующий суточные физиологические процессы растения) и эвкалипт Н421, который содержит ген cell Arabidopsis thaliana, кодирующий белок, способствующий быстрому росту.

Изменение качества продукта

Томат FLAVR SAVR™ содержит ген pq, подавляющий продукцию фермента, ответственного за расщепление пектиновых молекул в клеточной стенке, что приводит к задержке размягчения плодов; роза WKS82/130-4-9 содержит ген bp40 Viola wittrockiana катализирующий синтез синего пигмента антоциана дельфинидина и его производных

Устойчивость к абиотическому стрессу (климатическим и погодным условиям)

Примером может служить соя MON87460, которая содержит ген cspB Bacillus subtilis, поддерживающий нормальные клеточные функции в условиях засухи.

Стекерные линии - обладают одновременно несколькими ГМ признаками

Примерами служат кукуруза 3272 х Btll х MIR604 х TC1507 х 5307 х GA21 - сочетание признаков устойчивости к гербицидам, устойчивости к насекомым, изменения качества продукта и кукуруза 5307 х MIR604 х Btll х TC1507 х GA21 х MIR162 GA21 - сочетание признаков устойчивости к гербицидам и устойчивости к насекомым.

1.3. Классификация ГМО

ГМО могут быть классифицированы на основе происхождения трансгена. ГМО подразделяют на ГМО первого поколения, в которых экспрессия гена, определяющего желаемый признак, находится под контролем универсального промотора (например, вируса мозаики цветной капусты, cauliflower mosaic virus, CaMV P35S) и терминатора T35S. Большинство коммерческих ГМО принадлежит к этому типу. ГМО второго поколения (stacked) были получены либо путем скрещивания ГМО первой генерации между собой, либо путем внедрения второй трансгенной конструкции в уже существующий ГМО (на стадии полевых испытаний). ГМО третьего поколения (near-intragenic) содержат трансген, в котором кодирующая желаемый признак генетическая последовательность хозяйского происхождения, и лишь регуляторные последовательности являются чужеродными. В связи с тем, что чужеродные последовательности в ГМО этого поколения существенно уменьшены, обнаружение таких ГМО значительно сложнее (находятся на стадии разработок).

1.4. Законодательство в сфере оборота и анализа ГМ продукции. Обзор линий ГМО разрешенных к применению в продуктах питания и кормах на территории Российской Федерации

1973 год принято считать годом возникновения генной инженерии постольку, поскольку именно в это время американский биохимик П.Берг впервые использовал технологию рекомбинантной ДНК. Одновременно с проведением такого рода исследований стал обсуждаться вопрос и о возможных рисках, сопровождающих применение данной технологии. Поэтому потребовалось формирование правовой основы использования этой технологии, прежде всего, на национальном уровне. И уже в 1976 году Конгресс США одобрил разработанные Комитетом по технологии рекомбинированной ДНК Национального института здоровья США Руководящие принципы проведения исследований с рекомбинантными ДНК (Кузин, 2013).

Пищевая продукция из ГМО подлежит обязательной оценке на безопасность, государственной регистрации и последующему контролю за оборотом. К 2017 г 24 линий ГМ растений имеют действующие разрешения на ввоз в Россию и использование в пищевой промышленности (см. таблицу 1), однако выращивать ГМ-культуры можно только на опытных участках.

Пищевые продукты, полученные из ГМО, прошедшие медикобиологическую оценку и не отличающиеся по изученным свойствам от своих аналогов, полученных традиционными методами, являются безопасными для здоровья человека, разрешены для реализации населению и для использования в пищевой промышленности без ограничений в соответствии с письмом «о совершенствовании надзора за пищевыми продуктами, содержащими ГМО и ГММ Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 20 августа 2008 года N 01/9044-8-32».

Пищевая продукция подлежит обязательному этикетированию при содержании компонентов ГМО более 0,9 %. Содержание в пищевых продуктах 0,9% и менее компонентов, полученных с применением ГМО, является случайной или технически неустранимой примесью (СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»).

В Российской Федерации действует законодательная и нормативно-методическая база, необходимая для эффективного осуществления государственного надзора и производственного контроля за пищевой продукцией, произведенной из ГМО растительного происхождения. Кроме того в субъектах Российской Федерации располагаются Центры гигиены и эпидемиологии оснащенные лабораторным оборудованием для проведения исследований методом ПЦР в реальном времени, так как метод ПЦР-РВ является рекомендованным для выявления ГМО (ГОСТ Р 53244-2008, ГОСТ Р 56058-2014, МУК 4.2.2304-07, МУК 4.2.3309-15).

По состоянию на апрель 2017 г., на территории Российской Федерации для использования в продуктах питания, пищевом сырье и кормах для животных разрешены 24 вида линий ГМ растений: 8 линий сои, 12 линий кукурузы, 1 линия риса, 1 линия сахарной свеклы, 2 линии картофеля (http ://fp.crc.ru/gosregfr/ реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию (Таблица 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алексеев, Яков Игоревич, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеев, Я.И. ПЦР диагностика в современной агробиотехнологии / Я.И. Алексеев // Проблемы агробиотехнологии; под ред. член-корр. РАСХН Харченко П.Н. - М.: Росинформагротех. - 2012. - С. 200-226.

2. Биологическая безопасность: современные методические подходы к оценке качества пищевой, фармакологической и сельскохозяйственной продукции/ С.Е. Дромашко и др. -Минск: Беларуская навука, - 2015. - С. 218.

3. Викторов, А.Г. Влияние ВГрастений на почвенную биоту и плейотропный эффект дельта"эндотоксин кодирующих генов/ А.Г. Викторов // Физиология растений. -2008. -Т. 55. -С. 823-833.

4. ГОСТ Р 53244-2008 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов».

5. ГОСТ Р 56058-2014 «Корма и кормовые добавки. Методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения».

6. Игнатьев, И. Генетически модифицированные организмы и обеспечение биологической безопасности: учебное пособие/ И. Игнатьев, И. Тромбицкий, А. Лозан. Кишинев: Экоспектр-Бендеры. - 2007. -С. 60.

7. Кузин, А. А. Регулирование оборота генно-модифицированных организмов (ГМО) нормами российского права/А.А. Кузин //Социально-политические науки. - 2013. -Выпуск 1. -С. 64-70.

8. Маниатис. Т, Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование/ Т. Маниатис, Э. Фрич,Дж. Сэмбрук. - М.: Мир, 1984.- 480 с.

9. Методические указания МУК 4.2.2304-07 «Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения».

10. Методические указания МУК 4.2.3309-15 «Методы идентификации и количественного определения новых линий ГМО 2-го поколения в пищевых продуктах»

11. МУК 4.2.1913-04 Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания

12. МУ 2.3.2.1917-04 «Пищевые продукты и пищевые добавки. Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги»

13. О совершенствовании надзора за пищевыми продуктами, содержащими ГМО и ГММ Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ПИСЬМО от 20 августа 2008 года N 01/9044-8-32.

14. Патрушев, М.В. Генетически модифицированные источники: характеристика некоторых ГМ- линий, их детекция / М.В. Патрушев, М.В. Возняк // Партнеры и конкуренты. -2004. - № 10. - С. 19-26.

15. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

16. Соколов, М.С.Экологическая оценка Bt-растений-неотъемлемое условие их безопасного производства / M.C. Соколов, А.И Марченко А // М.:Росин-формагротех. - 2011. -C.129.

17. Сорокина, Е.Ю. Методы аналитического контроля пищевой продукции, произведенной из генноинженерно-модифицированных растений/Е.Ю. Сорокина// Вопросы питания. - 2013. - № 3. - С. 53-60.

18. Тутельян В.А.(ред.) Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности и контроль/М.: Издательство РАМН, 2007. - С. 444.

19. Akritidis, P. Identification of unknown genetically modified material admixed in conventional cotton seed and development of an event-specific detection method/ P. Akritidis, K. Pasentsis, A.S. Tsaftaris, P.V. Mylona, A.N. Polidoros// Electronic Journal of Biotechnology. - 2008. - Vol. 11, no. 2. - P. 76-83.

20. Angers-Loustau, A. JRC GMO-Matrix: a web application to support Genetically Modified Organisms detection strategies/ A. Angers-Loustau, M. Petrillo, L. Bonfini, F. Gatto, R. Sabrina, A. Patak, J. Kreysa// BMC Bioinformatics 15:6592(2014). 2014; 15(1): 417

21. Anklam, E. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms (GMO's) in agricultural crops and plant-derived food products/ E. Anklam, F.Gadani , P. Heinze, H. Pijnenburg, G. Van den Eede// Eur. Food Res. Technol. - 2002. - Vol. 21 - P. 3-26.

22. Arumuganathan, K. Nuclear content of some important plant species / K. Arumuganathan, ED. Earle // Plant Mol. Biol. Rep. - 1991. Vol. 9. no. 3. - P. 208-218.

23. Bahrdt, C. Validation of a newly developed hexaplex real-time PCR assay for screening for presence of GMOs in food, feed and seed/ C.Bahrdt, A.Krech, A.Wurz, D. Wulff // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2011. Vol. 396. - P. 2103-2112.

24. Barbau-Piednoir, E. Inter-laboratory Testing of GMO Detection by Combinatory SYBR Green PCR Screening (CoSYPS)/ E. Barbau-Piednoir, P. Stragier, N. Roosens, M. Mazzara, C. Savini,

G. Van den Eede, M.Van den Bulcke // Food Analytical Methods. - 2014. -Vol. 7, - P. 1719-1728.

25. Beckie, H. GM canola: The Canadian Experience/H. J Beckie, K N. Harker, A. Legere, M. J Morrison, G. Seguin-Swartz, K. C Falk //Farm Policy Jornal. - 2011, Vol. 8. № 1.

26. Bhat, S. Single molecule detection in nanofluidic digital array enables accurate measurement of DNA copy number/ S. Bhat, J. Herrmann, P. Armishaw, P. Corbisier, K.R. Emslie // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2009. - Vol. 394, no. 2. - P. 457-467.

27. Boom, R. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / R. Boom, C.J. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M. Wertheim-van Dillen, J. van der Noordaa // J. Clin. Microbiol. -1990. - Vol. 28. - P. 495-503.

28. Buermans, H.P.J. Next generation sequencing technology: advances and applications/

H.P.J. Buermans, J.T. den Dunnen // Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 2014, Vol. 1842, no. 10, P. 1932-1941.

29. Burns, M.J. The applicability of digital PCR for the assessment of detection limits in GMO analysis/ M.J. Burns, A.M . Burrell, C.A. Foy // European Food Research and Technology. - 2010. -Vol. 231, no. 3. - P. 353-362.

30. Chen, L. Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assays for seven genetically modified maize events and their application in practical samples analysis/L. Chen, J. Guo, Q. Wang, G. Kai, L. Yang // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2011. - Vol. 59, no. 11, - P. 5914-5918.

31. Chen, X. Endpoint visual detection of three genetically modified rice events by loopmediated isothermal amplification/ X. Chen, X. Wang, N. Jin, Y. Zhou, S. Huang, Q. Miao, Q. Zhu, J. Xu // International Journal of Molecular Sciences. - 2012. - Vol. 13, no. 11. - P. 14421-14433.

32. Cheng, Y. Loop-mediated isothermal amplification for the event-specific detection of wheat B73-6-1/Y. Cheng, M. Zhang, K. Hu, F. Sun, R. Tao, X. Gao, F. Luan // Food Analytical Methods. - 2014. - Vol. 7, no. 2. - P. 500-505.

33. Corbisier, P. Absolute quantification of genetically modified M0N810 maize (Zea mays L.) by digital polymerase chain reaction/ P. Corbisier, S. Bhat, L. Partis, V.R.D. Xie, Emslie. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. -P. 2143-2150.

34. Cottenet, G. Development and validation of a multiplex real-time PCR method to simultaneously detect 47 targets for the identification of genetically modified organisms/G. Cottenet, C.Blancpain, V. Sonnard, P.F.Chuah // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2013. - Vol. 405, no. 21. - P. 6831-6844.

35. Chaouachi, M. Molecular identification of four genetically modified maize (Bt11, Bt176, Mon810 and T25) by duplex quantitative real-time PCRFood / M.Chaouachi, M.S. Zellama, N. Nabi, A.B. Hafsa, K. Said // Analytical Methods. - 2014. - Vol. 7, no. 1. - P. 224-233.

36. Demeke, T. Multiplex qualitative PCR assay for identification of genetically modified canola events and real-time event-specific PCR assay for quantification of the GT73 canola event/ T. Demeke, I. Ratnayaka // J. Food Control. - 2008. - Vol. 19. - P. 893-897.

37. Di, H. Rapid detection of genetically modified ingredients in soybean products by real-time loopmediated isothermal amplification/ H. Di, L. Shi, H. Shen, H. Yan, H.Meng, L. Li1, M. J. Alam, S. Yamasaki, L. Ye // Journal of Food and Nutrition Research. - 2014. Vol. 2, no. 7. - P. 363368.

38. Dorries, H.-H., Development of a qualitative, multiplex realtime PCR kit for screening of genetically modified organisms (GMOs)/ H.-H. Dorries, I. Remus, Gronewald A., Gronewald C., Berghof-Jager K. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 20432054.

39. Dobnik, D. NAIMA as a solution for future GMO diagnostics challenges/D. Dobnik, D. Morisset, K. Gruden // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 22292233.

40. Droplet digital PCR versus multiplex real-time PCR method for the detection and quantification of DNA from the four transgenic soy traits MON87769, MON87708, MON87705 and FG72, and lectin / R. Koppel, T. Bucher, A. Frei, H.U. Waiblinger // European Food Research and Technology. - 2015. - Vol. 241, no. 4. - P. 521-527.

41. Novak, P.K. GMOtrack: generator of cost-effective GMO testing strategies/ P.K. Novak, K. Gruden, D. Morisset , N. Lavrac, D. Stebih, A. Rotter, J. Zel // Journal of AOAC International. -2009. -Vol. 92, no. 6. - P. 1739-1746.

42. Gonsalves, D. Transgenic papaya in Hawaii and beyond / D. Gonsalves // AgBioForum, 2004 Vol. 7, P. 36-40.

43. Guan, X. Visual and rapid detection of two genetically modified soybean events using loopmediated isothermal amplification method/X.Guan X., J. Guo , P. Shen, L. Yang, D. Zhang// Food Analytical Methods. - 2010. - Vol. 3, no. 4. - P. 313-320.

44. Fantozzi, A. Innovative application of fluorescent microsphere based assay for multiple GMO detection/ A. Fantozzi, M. Ermolli, M. Marini, B. Balla, M. Querci, G. Van den Eede // Food Analytical Methods. - 2008. - Vol. 1, no. 1. - P. 10-17.

45. Fraiture, M.A., Herman P., Taverniers I., De Loose M., Deforce D., and Roosens N.H. An innovative and integrated approach based on DNA walking to identify unauthorized GMOs/ M.A. Fraiture, P. Herman, I. Taverniers, M. De Loose, D. Deforce, N.H. Roosens // Food Chemistry. -

2014. - Vol. 147. - P. 60-69.

46. Fraiture, M.A. Validation of a sensitive DNA walking strategy to characterise unauthorized GMOs using model food matrices mimicking common rice products/ M.A. Fraiture, P. Herman, I. Taverniers, M. De Loose, F. Van Nieuwerburgh, D. Deforce, N.H. Roosens // Food Chemistry. -

2015. - Vol. 173. - P. 1259-1265.

47. Fraiture, M.A. Integrated DNA walking system to characterize a broad spectrum of GMOs in food feedmatrices/ M.A. Fraiture, P. Herman, L. Lefevre, I. Taverniers, M. De Loose, D. Deforce, N. H Roosens // BMC Biotechnology. - 2015. - Vol. 15, article 76.

48. Fukuta, S. Real-time loopmediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms/S. Fukuta, Y. Mizukami, A. Ishida et al.// European Food Research and Technology. - 2004. - Vol. 218, no. 5. -P. 496-500.

49. Heide, B.R. Determination of eight genetically modified maize events by quantitative, multiplex PCR and fluorescence capillary gel electrophoresis/ B. R. Heide, S.M. Dramtorp, K. Rudi, E. Heir, A.L. Holck// European Food Research and Technolog. -2008. - Vol. 227, no. 4. - P. 11251137.

50. Heide, B.R. Detection of eight GMO maize events by qualitative, multiplex PCR and fluorescence capillary gel electrophoresis/ B.R. Heide, E. Heir, A. Holck // European Food Research and Technology. - 2008. - Vol. 227, no. 2. - P. 527-535.

51. Higuchi, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences/ R. Higuchi, G. Dollinger, P.S. Walsh, R. Griffith // Biotechnology. - 1992. - Vol. 10. - P. 413-417.

52. Higuchi, R. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions/ R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger R. Watson // Biotechnology. - 1993. - Vol. 11. - P. 1026-1030.

53. Holland, P.M. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'- 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase/ P.M. Holland, R.D. Abramson, R. Watson, D.H. Gelfand // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 7276-7280.

54. Holst-Jensen, A. PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs)/A. Holst-Jensen, S.B. Ranning, A. L0vseth, K.G. Berdal // Anal Bioanal Chem. -2003. - Vol. 375. - P. 985-993.

55. Huang, X. Rapid visual detection of phytase gene in genetically modified maize using loopmediated isothermal amplification method/ X. Huang, L. Chen, J. Xu, H.-F. Ji, S.Zhu, H. Chen // Food Chemistry. - 2014. - Vol. 156. - P. 184-189.

56. Huber, I. Development and validation of duplex, triplex, and pentaplex real-time PCR screening assays for the detection of genetically modified organisms in food and feed/ I. Huber, A. Block, D. Sebah, F. Debode, D. Morisset, L. Grohmann, G. Berben, D. Stebih, M. Milavec, J. Zel, U. Busch // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2013, Vol. 61, no. 43, P. 10293-10301.

57. Clive, J. 20th Anniversary (1996 to 2015) of the Global Commercialization of Biotech Crops and Biotech Crop Highlights in 2015 / J. Clive // GM Crops: 2015. ISAAA Brief No. 51. ISAAA

58. Kawata, M. Dispersal and persistence of genetically modified oilseed rape around Japanese harbors/ M. Kawata, K. Murakami, T. Ishikawa // Environ Sci Pollut Res Int. - 2009. - Vol. 16. - P. no 2.

59. Kiddle, G. GMO detection using a bioluminescent real time reporter (BART) of loop mediated isothermal amplification (LAMP) suitable for field use/ G. Kiddle, P. Hardinge, N. Buttigieg, O. Gandelman, C. Pereira, C. J McElgunn, M. Rizzoli, R. Jackson, N. Appleton, C. Moore, L. C Tisi, J. AH Murray // BMC Biotechnology. - 2012. - Vol. 12, article 15.

60. Koppel, R. A. H.-U. Two quantitative multiplex real-time PCR systems for the efficient GMO screening of food products/ R. A. Koppel, A. Sendic, H.-U. Waiblinger // European Food Research and Technology. - 2014. - Vol. 239, no. 4. - P. 653-659.

61. Koppel, R. Droplet digital PCR versus multiplex real-time PCR method for the detection and quantification of DNA from the four transgenic soy traits MON87769, MON87708, MON87705 and FG72, and lectin/R. Koppel, T. Bucher, A .Frei, H.U. Waiblinger // European Food Research and Technology. - 2015. - Vol. 241, no. 4. - P. 521-527.

62. Koppel, R. Rapid establishment of droplet digital PCR for quantitative GMO analysis/ R. Koppel, T. Bucher // European Food Research and Technology. - 2015. - Vol. 241, no. 3. - P. 427439.

63. Kumar, P.A. The Insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis/P.A. Kumar, V.S. Malik, R. P. Sharma // Adv. Appl. Microbiol. -1996. Vol. 42. - P. 1-43.

64. Lee, D. Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA sequences / D.Lee D, M. La Mura, T.R. Allnutt, W. Powell // BMC Biotechnology, 2009, Vol. 9, article 7.

65. Leoni, C. Genome walking in eukaryotes / C. Leoni, M. Volpicella, F. De Leo, R. Gallerani, L.R. Ceci // FEBS Journal. - 2011. - Vol. 278, no. 21. - P. 3953-3977.

66. Liang, C. Detecting authorized and unauthorized genetically modified organisms containing vip3A by real-time PCR and next-generation sequencing / C. Liang, J.P van Dijk, IMJ Scholtens, M. Staats, T.W. Prins, MM. Voorhuijzen, A.M. da Silva, A.C. Arisi, J.T. den Dunnen, E.J. Kok // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2014. - Vol. 406, no. 11. - P. 2603-2611.

67. Liu, M. Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated isothermal amplification / M. Liu, Y. Luo, R. Tao // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. - 2009. - Vol. 73, no. 11. - P. 2365-2369.

68. Li, Q. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid detection of cry1Ab gene in transgenic rice (Oryza sativa L.) /Q. Li, J. Fang, X. Liu et al. // European Food Research and Technology. - 2013. - Vol. 236, no. - P. 589-598.

69. Milavec, M. GMO quantification: valuable experience and insights for the future / Milavec M., Dobnik D., Yang L., Zhang D., Gruden K., and Zel J. //Analytical and Bioanalytical Chemistry. -2014. - Vol. 406, no. 26. - P. 6485-6497.

70. «Modern food biotechnology, human health and development: an evidence-based study» FOOD SAFETY DEPARTMENT WORLD HEALTH ORGANIZATION, as of 1 June 2005, Department of Food Safety, Zoonoses and Foodborne Diseases.

71. Morisset, D. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR / D. Morisset, D. Stebih, M. Milavec, K. Gruden, J. Zel // PLoS ONE, 2013, Vol. 8, no. 5, Article ID e62583.

72. Murray, M.G. Rapid isolation of hih molecular weight plants DNA / M.G. Murray, W.F. Thompson // Nuclear Acids Research. - 1980. - Vol. 8. - P. 4321-4325.

73. Nakaya, H.I. Concepts on microarray design for genome and transcriptome analyses/ H.I. Nakaya, E.M. Reis, S. Verjovski-Almeida // Nucleic Acids Hybridization Modern Applications, Springer, Dordrecht. The Netherlands. - 2007 - P. 265- 307.

74. Park, S.-B. Multiplex PCR system to track authorized and unauthorized genetically modified soybean events in food and feed / S.-B. Park, H.-Y. Kim, J.-U. Kim//Food Control. - 2015. -Vol. 54. - P. 47- 52.

75. Pla, A. New multiplexing tools for reliable GMO detection in Genetically Modified and Non-Genetically Modified Food Supply Chains: Co-Existence and Traceability / A. Pla, V. Nadal, C. Baeten, C. Bahrdt, G. Berben, Y. Bertheau, A. Coll, J. P. van Dijk, D. Dobnik, J. A. Fernandez Pierna, K. Gruden, S. Hamels, A. Holck, A. Holst-Jensen, E. Janssen, E. J. Kok, J. L. La Paz, V. Laval, S. Leimanis, A. Malcevschi, N. Marmiroli, D. Morisset, T. W. Prins, J. Remacle, G. Ujhelyi, D. Wulff // Wiley, Oxford,UK, 2013, P. 333-366.

76. Poms, R.E. Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat /R.E. Poms, J.Glossl, H. Foissy // European Food Research and Technology. - 2001. - Vol. 213. - P. 361-365.

77. Querci, M. Real-time PCR-based ready-to-use multi-target analytical system for GMO detection /M. Querci, N. Foti, A. Bogni, L. Kluga, H. Broll, G. van den Eede //Food Analytical Methods. - 2009. - Vol. 2. - P. 325-336.

78. Randhawa, G.J. Loop-mediated isothermal amplification: rapid visual and real-time methods for detection of genetically modified crops /G.J. Randhawa, M. Singh, D. Morisset, P. Sood P., J. Zel // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2013. - Vol. 61, no. 47. - P. 11338-11346.

79. Ranjan R., Patro S., Kumari S., Kumar D., Dey N., Maiti I.B. // Anal. Bioanal. Chem. -2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 2103-12.

80. Raymond, P. Detection and identification of multiple genetically modified events using DNA insert fingerprinting / P.Raymond, L. Gendron, M. Khalf, S. Paul, K.L. Dibley, S. Bhat , V.R. Xie, L. Partis, M.E. Moreau, C. Dollard, M.J. Coté, S. Laberge, K.R. Emslie. //Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 2091-2102.

81. Rosa, S.F. Development and Applicability of a Ready-to-Use PCR System for GMO Screening / S.F. Rosa, F. Gatto, A. Angers-Loustau, M. Petrillo, J. Kreysa, M. Querci // Food Chemistry 2016. - Vol. 201. - P. 210-219.

82. Ruttink, T. Molecular toolbox for the identification of unknown genetically modified organisms/T. Ruttink, R. Demeyer, E. van Gulck, B. Van Droogenbroeck, M. Querci, I. Taverniers, M. De Loose // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 2073-2089.

83. Samac, D.A. A comparison of constitutive promoters for expression of transgenes in alfalfa (Medicago sativa) / D.A.Samac, M. Tesfaye, M. Dornbusch, P. Saruul, S.J. Temple. // Transgenic Res. - 2004. - Vol. 13 , no. 4. - P. 349-361.

84. Samson, M.C. Multiplex real-time PCR assays for simultaneous detection of maize M0N810 and GA21 in food samples/ M.C Samson, M.Gulli, N. Marmiroli // Food Control. - 2013. -Vol. 30, no. 2. - P. 518-525.

85. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors/ F.Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

86. Scholtens, I. Practical experiences with an extended screening strategy for genetically modified organisms (GMOs) in real-life samples/I. Scholtens, E. Laurensse, B. Molenaar, Zaaijer S., H. Gaballo, P. Boleij, E. Kok // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2013. -Vol. 61, no. 38. - P.9097-9109.

87. Shao, N. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms/ N. Shao, S.M. Jiang, M. Zhang, J. Wang, S.J. Guo, Y. Li, H.W. Jiang, C.X. Liu, D.B. Zhang, L.T. Yang, S C. Tao // Analytical Chemistry. M. 2014. - Vol. 86, no. 2. - P. 1269-1276.

88. Spalinskas, R. Efficient retrieval of recombinant sequences ofGMplants by Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter-based bidirectional LT- RADE/ R. Spalinskas, M. Van den Bulcke, A. Milcamps // European Food Research and Technology. - 2013. - Vol. 237, no. 6. - P. 1025-1031.

89. Song, Q. Analysis of geneticallymodified organisms by pyrosequencing on a portable photodiode-based bioluminescence sequencer/ Q. Song, G. Wei, G. Zhou // Food Chemistry, -2014. -Vol. 154. - P. 78-83.

90. Van den Bulcke, M. .A theoretical introduction to ''Combinatory SYBR Green qPCR Screening", a matrix-based approach for the detection of materials derived from genetically modified plants/ M. Van den Bulcke, A. Lievens, E. Barbau-Piednoir, G. MbongoloMbella, N. Roosens, M. Sneyers, A.L. Casi //Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 21132123.

91. Vega, E.D. Characterization and study of transgenic cultivars by capillary and microchip electrophoresis/ E.D. Vega, M.L. Marina //International Journal of Molecular Sciences. - 2014. - Vol. 15, no. 12. - P. 23851-23877.

92. Von Gotz, F. See what you eat—broad GMO screening with microarrays/F. Von Gotz//Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 1961-1967.

93. Willems, S. Statistical framework for detection of genetically modified organisms based on Next Generation Sequencing/ S. Willems, M.A. Fraiture, D. Deforce, S.C. De Keersmaecker, M. De Loose, T. Ruttink, P. Herman, F. Van Nieuwerburgh, N. Roosens//Food Chemistry. - 2016. - Vol. 192. - P. 788-798.

94. Wang, W.X. Event-specific qualitative and quantitative detection of transgenic rice Kefeng-6 by characterization of the transgene flanking sequence/ W.X. Wang, T.H. Zhu, F.X. Lai, Q. Fu //European Food Research and Technology. - 2011. - Vol. 232, no. 2. -P. 297-305.

95. Wang, C. GMO detection in food and feed through screening by visual loop-mediated isothermal amplification assays/ C. Wang, R. Li, S. Quan, P. Shen, D. Zhang, J. Shi, L. Yang//Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2015. - Vol. 407, no. 16. - P. 4829-4834.

96. Wahler, D. Nextgeneration sequencing as a tool for detailed molecular characterization of genomic insertions and flanking regions in genetically modified plants: a pilot study using a rice event unauthorised in the EU/ D. Wahler , L. Schauser,J. Bendiek., L. Grohmann //Food Analytical Methods. - 2013. - Vol. 6, no. 6. - P. 1718-1727.

97. Waiblinger, H.-U. A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants/ H.-U.Waiblinger, L. Grohmann, J. Mankertz, D. Engelbert., K. Pietsch // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2010. - Vol. 396, no. 6. - P. 2065-2072.

98. Waiblinger, H.-U. Validation and collaborative study of a P35S and T-nos duplex real-time PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products/ H.-U Waiblinger,. B. Ernst, A. Anderson, K. Pietsch //European Food Research and Technology. - 2008. - Vol. 226, no. 5. - P. 1221-1228.

99. Weng, H. Novel reference gene, High-mobility-group protein I/Y, used in qualitative and real-time quantative polymerase chain reaction detection on transgenic rapeseed cultivar/ H. Weng, L. Yang, Z. Liu Z, J. Ding, A. Pan, D. Zhang //J. AOAC Int. - 2005. - Vol. 88, no. 2.

100. Wu, H. Highly sensitive pyrosequencing based on the capture of free adenosine 5 phosphosulfate with adenosine triphosphate sulfurylase/ H. Wu, W. Wu, Z. Chen, W. Wang, G. Zhou, T. Kajiyama, H. Kambara//Analytical Chemistry. - 2011. - Vol. 83, no. 9. - P. 3600-3605.

101. Xu, JLoop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of genetically modified maize T25/ J. Xu, Q. Zheng, L. Yu, R. Liu, X. Zhao,G. Wang,Q. Wang, J. Cao//Food Science & Nutrition. - 2013. - Vol. 1, no. 6. - P. 432-438.

102. Yang, L. Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5-transgene integration sequence/ L. Yang ,S. Xu , A. Pan, C. Yin, K. Zhang, Z. Wang, Z. Zhou, D. Zhang// Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2005. - Vol. 53, no. 24. - P. 9312-9318.

103. Yang, L. Characterization of GM events by insert knowledge adapted re-sequencing approaches/ L.Yang, C. Wang, A. Holst-Jensen, D. Morisset, Y. Lin, D. Zhang// Scientific Reports. -2013. - Vol. 3. - article 2839.

104. Wu, Y. Development of a general method for detection and quantification of the P35S promoter based on assessment of existing methods/Y. Wu, Y. Wang, J Li, W. Li, L. Zhang,Y. Li, X. Li, J. Li, L. Zhu G. Wu.//Scientific Reports4. - 2014. - Article number:7358.

Wu Y1, Wang Y2, Li J1, Li W1, Zhang L3, Li Y1, Li X1, Li J1, Zhu L1, Wu G1.

105. Zahradnik, C. Detection of the 35S promoter in transgenic maize via various isothermal amplification techniques: a practical approach/ C. Zahradnik, C. Kolm, R. Martzy, RL Mach, R.

Krska, A.H. Farnleitner, K. Brunner //Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2014. - Vol. 406, no. 27. - P. 6835-6842.

106. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications/Zipper H. , Brunner H., Bernhagen J., Vitzthum F. // Nucleic Acids Research. - 2004. - Vol. 32. - P. 12.: e103.

107. Zhang, M. One simple DNA extraction device and its combination withmodified visual loop-mediated isothermal amplification for rapid on-field detection of genetically modified organisms/ M. Zhang, Y. Liu, L. Chen, S. Quan, S. Jiang , D. Zhang, L. Yang //Analytical Chemistry. - 2013. -Vol. 85, no. 1. - P. 75-82.