Разработка технологии лекарственных форм на основе арники облиственной (Arnica foliosa Nutt.) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат наук Михеева, Наталья Сергеевна

• Михеева, Наталья Сергеевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Михеева, Наталья Сергеевна

Глава 1. Обзор литературы.....................................................................11

1.1 Ботаническая характеристика, химический состав арники облиственной {Arnica foliosa Nutt. Семейства Сложноцветные - Asteraceae), применение в народной и научной традиционной медицине.............................................11

1.2 Номенклатура лекарственных средств на основе арники...........................15

1.3Современные аспекты технологии получения сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья........................................................18

1.4 Технологические особенности получения суппозиториев..........................22

1.5 Крем - как рациональная мягкая лекарственная форма............................27

Выводы к главе 1.................................................................................36

Глава 2. Материалы и методы исследования...............................................38

2.1 Материалы исследования..................................................................38

2.1.1 Арники облиственной экстракт сухой................................................38

2.1.2 Вспомогательные вещества............................................................39

2.1.3 Определение фенольных соединений методом ВЭЖХ...........................42

2.1.4 Определение фенольных соединений методом спектрофотометрии..........43

2.2 Методы исследований....................................................................45

2.2.1 Методы оценки подлинности субстанции, суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС..................................................................45

2.2.2 Количественное определение суммы фенольных соединений в субстанции и лекарственных формах - в пересчете на лютеолин-7-глюкозид...........................................................................................60

2.2.3 Технологические характеристики активного вещества.....................76

2.2.4 Методы определения физико-химических, технологических и биофармацевтических свойств суппозиториев, содержащих АОЭС.......................79

2.2.5 Методы определения физико-химических, структурно-механических свойств 1,5% крема, содержащего АОЭС............................................................82

2.3 Статистические методы..................................................................84

Заключение к главе 2............................................................................84

Глава 3. Технология получения лекарственных форм, созданных на основе АОЭС...............................................................................................86

3.1 Технология получения суппозиториев на основе АОЭС...........................86

3.2 Технология получения крема 1,5% на основе АОЭС.................................98

Выводы к главе 3..............................................................................................109

Глава 4. Доклиническое изучение безопасности лекарственных форм, созданных на основе АОЭС.................................................................................110

4.1 Микробиологическое изучение субстанции, суппозиториев ректальных и

крема 1,5% созданных на основе АОЭС.................................................110

4.1.1 Результаты бактериостатической и фунгистатической активности субстанции, суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС.........112

4.2 Изучение стабильности суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС в процессе хранения..................................................................114

4.3 Токсикологическое изучение суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС....................................................................................119

4.3.1 Результаты экспериментального токсикологического изучения суппозиториев ректальных на основе АОЭС.............................................122

4.3.2 Результаты токсикологического изучения крема 1,5% на основе АОЭС.............................................................................................125

4.3.3 Результаты изучения аллергизирующего действия крема 1,5% на основе АОЭС.............................................................................................127

4.3.4 Результаты изучения противовоспалительных и репаративных свойств

крема 1,5% на основе АОЭС.................................................................128

Выводы к главе 4...............................................................................131

Общие выводы..................................................................................132

Список сокращений и условных обозначений...........................................133

Список литературы............................................................................134

Приложения.....................................................................................148

Актуальность темы: В соответствии с Федеральной целевой программой «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 г.» создание эффективных и безопасных лекарственных средств отечественного производства является актуальной задачей современной фармацевтической науки [84].

Как известно, номенклатура современных лекарственных средств, разрешенных к медицинскому применению в Российской Федерации представлена препаратами синтетического и природного происхождения, при этом в некоторых фармакологических группах доля препаратов на основе лекарственного растительного сырья составляет около 40%. Фитопрепараты выгодно отличаются от синтетических лекарственных средств мягким щадящим действием на организм в сочетании с минимальными токсико-аллергическими проявлениями [55, 62, 78].

Для достижения терапевтической эффективности и безопасности при разработке лекарственных препаратов особое значение имеет обоснование выбора лекарственной формы. Использование мягких лекарственных форм для наружного применения (мази, линименты, кремы, гели) позволяет обеспечивать максимальную концентрацию лекарственных веществ непосредственно в очаге поражения, например, в месте нарушения целостности кожи, воспаления слизистой оболочки, нагноении, пролежнях, ожогах [117].

Востребованной лекарственной формой являются суппозитории, в которых выгодно сочетаются достоинства пероральных и инъекционных лекарственных средств. Применение суппозиториев позволяет решить вопрос проблемы боли и вкуса, связанные с назначением лекарственных средств для парентерального введения и приема внутрь, а так же возможность применения лекарственного препарата при нарушении акта глотания, тошноте и рвоте, возможность

использования в бессознательном состоянии [1, 80]. Кроме того, поступление большей части активной субстанции из суппозиториев происходит непосредственно в большой круг кровообращения, чем объясняется высокая скорость всасывания БАВ.

В настоящее время при создании фитопрепаратов в качестве субстанций чаще всего используются сухие экстракты из растительного лекарственного сырья. К числу таких субстанций относится арники облиственной экстракт сухой, полученный из травы арники облиственной, ранее разработанный в ФГБНУ ВИЛАР и отвечающий требованиям нормативного документа.

Учитывая, что в номенклатуре лекарственных средств, зарегистрированных в Российской Федерации, созданных на основе растения рода Арника (Arnica L.), присутствуют только гомеопатические лекарственные препараты, разработка лекарственных средств на основе сухого экстракта арники, обладающих противовоспалительным, ранозаживляющим и кровоостанавливающим действием является своевременной и актуальной задачей и перспективным направлением современной фармацевтической науки.

Цель и задачи исследования:

Целью настоящего исследования является проведение комплексных исследований по разработке состава, технологии получения и стандартизации суппозиториев ректальных и крема 1,5%, созданных на основе арники облиственной экстракта сухого.

Для достижения поставленной цели в задачи исследования входило:

- теоретически и экспериментально обосновать и разработать оптимальный состав и технологию получения суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого с использованием рациональных основ;

- разработать критерии подлинности и установить нормы содержания действующих веществ в разрабатываемых лекарственных формах с целью их стандартизации;

- исследовать кинетику высвобождения действующих веществ из суппозиториев ректальных и изучить реологические свойства крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого;

- изучить стабильность суппозиториев ректальных и крема 1,5% в процессе хранения и установить их срок годности;

- изучить безопасность разработанных лекарственных форм (суппозиториев и крема).

- провести исследования по изучению противовоспалительной и ранозаживляющей активности крема 1,5%

- на основании полученных результатов разработать и оформить проект фармакопейной статьи (ФС) и опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство суппозиториев; технические условия (ТУ) и технологическую инструкцию (ТИ) на крем 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

Научная новизна

На основании технологических, аналитических и биофармацевтических исследований впервые разработан состав суппозиториев ректальных и крема 1,5%, созданных на основе арники облиственной экстракта сухого для лечения воспалительных заболеваний различной этиологии.

Подобран состав и соотношение вспомогательных компонентов, обеспечивающих биодоступность БАВ и стабильность лекарственных форм в процессе хранения. Изучены параметры биодоступности суппозиториев ректальных, позволяющие выбрать их оптимальный состав, а так же структурно-механические и реологические свойства крема 1,5%, способствующие прогнозированию его стабильности при длительном хранении.

В рамках гармонизации методов контроля качества сухого экстракта, суппозиториев ректальных и крема 1,5% разработаны унифицированные и валидированные методики количественного анализа суммы фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7- глюкозид методом спектрофотометрии.

Разработаны рациональные технологические схемы производства для суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

Практическая значимость работы

На основании, проведенных исследований разработаны аналитические методики (подлинность и количественное определение) биологически активных веществ, содержащихся в арнике облиственной экстракте сухом и в лекарственных формах. Разработаны рациональный состав и технология получения суппозиториев ректальных и крема 1,5%.

На основании полученных результатов, разработаны и оформлены: - проект фармакопейной статьи (ФС) и опытно-промышленный регламент (ОПР 04868244-03-2014) на производство суппозиториев;

- технологическая инструкция и технические условия на крем 1,5% (ТУ 9373-122-04868244- 2014).

Методы исследования

В работе использованы физико-химические, технологические, структурно-механические, биофармацевтические и микробиологические методы.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения, где выполнялась диссертация

Диссертационная работа выполнена в отделе фармацевтической технологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и

ароматических растений» в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований ФГБНУ ВИЛАР по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации на 2011 - 2015 годы».

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и задач, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, обобщению полученных данных и их статистической обработке.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.01 - технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта специальности.

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты исследования по обоснованию составов и технологий получения лекарственных форм суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого для лечения заболеваний различной воспалительной этиологии;

- результаты изучения подлинности и нормы содержания действующих веществ в суппозиториях ректальных и креме 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого;

- результаты исследования кинетики высвобождения действующих веществ из суппозиториев ректальных;

- результаты изучения структурно-механических и реологических свойств крема 1,5%;

- результаты изучения стабильности суппозиториев ректальных и крема для обоснования сроков их годности;

- результаты доклинических исследований разработанных лекарственных форм.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии лекарственных форм на основе арники облиственной (Arnica foliosa Nutt.)»

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на XXI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2014 г. II научно-практической конференции с международным участием «От растения к препарату: традиции и современность», Москва, ФГБНУ ВИЛАР, 23-24 апреля 2014 г. II научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века», Москва, 11-12 декабря 2014 г.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликованы 12 научных работ, в том числе 6 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК, 4 тезисов докладов, 2 статьи в сборнике научных трудов ФГБНУ ВИЛАР.

Объем и структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух экспериментальных глав, заключения, общих выводов, библиографии и приложений. Библиография включает 140 источников литературы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 23 рисунка.

1Л Ботаническая характеристика, химический состав арники облиственной (Arnica foliosa Nutt. Семейства Сложноцветные - Asteraceae), применение в народной и научной традиционной медицине

Род арника в мировой флоре насчитывает 32 вида. На территории России и стран СНГ произрастает восемь видов: арника горная {Arnica Montana L.), арника уналашкинская {Arnica imalaschcensis Less.), арника сахалинская {Arnica sachalinensis A.Gray), арника Лессинга {Arnica lessingei L.Green), арника Шамиссо {Arnica chamissonis Less.), арника облиственная {Arnica foliosa Nutt.) и др. [113].

В Западной Европе арника — как лекарственное растение, известна еще в раннем Средневековье. Расцвет применения вытяжек из арники в медицине приходится на XVIII в., когда ее назначали внутрь и наружно при самых различных заболеваниях.

В России в медицинской практике разрешены к использованию три вида арники — арника горная {Arnica Montana L.), арника Шамиссо {Arnica chamissonis Less.) и арника облиственная {Arnica foliosa Nutt.) [113].

Все три вида арники содержат комплекс биологически активных веществ, представляющих различные классы химических соединений - флавоноиды (кверцетин, кемпферол, лютеолин, апигенин, изорамнетин, изокверцетин, сколимозид, цинарозид, изокверцитрин, космосиин, астрагалин и др.), эфирное масло с сесквитерпеновыми лактонами (арнифолин, геленалин, 11-а, 13-дигидрогеленалин, арниколиды А-Е и др.), тритерпеноиды - (арнидиол, фарадиол и их смесь - арницин), полисахариды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты (кофейная, хлорогеновая, феруловая и др.), непредельные фитостерины, оксикумарины (скополетин, умбеллиферон), каротиноиды. В основном был изучен химический состав цветков арники, поскольку в медицинской практике

они применяются чаще, чем остальные части растения [33, 45, 64, 72—73, 132— 134, 139-140].

По литературным данным установлено, что противовоспалительное, противомикробное действие - и эффект ингибирования агрегации тромбоцитов, обусловлены наличием эфирного масла в цветках арники, в состав которого входят сесквитерпеновые лактоны - геленалин и 11-я,13-дигидрогеленалин. Арнифолин обладает миотропным действием (усиливает сократительную деятельность матки). Подобным действием обладают и азотсодержащие основания - холин и бетаин [33, 70]. Тритерпенодные соединения, содержащиеся в сырье, проявляют местнораздражающее действие, что в свою очередь способствуют рассасыванию кровоизлияний, а цинарин, флавоноиды и полиацетилены оказывают желчегонное действие [49, 64]. Фенольные соединения арники также обладают противовоспалительным и капилляроукрепляющим действием [101]. Противовоспалительной активностью обладают и каротиноиды. Полисахариды арники оказывают иммуностимулирующее действие. Аминокислоты обладают антиаритмической активностью [22, 85, 135].

В настоящее время препараты из арники широко используются в гомеопатии во многих странах мира, в том числе и в России. Например, в Германии и Польше препараты на её основе применяются при лечении гипертонии, стенокардии, бронхиальной астмы, истерии, ревматизма, хронического ларингита, сухого плеврита и др. [34].

Арника горная, произрастающая в Европе входит в фармакопеи (ГГФ, ФФ, ГФИ, ГФСШ), где ее используют как целое растение, так и отдельно - соцветия, подземную и надземные части [89].

В сборнике фармакопейных статей по гомеопатии Российской Федерации имеется статья на настойку гомеопатическую матричную из арники горной, которую получают из высушенных корневищ с корнями растения и используют для приготовления гомеопатических лекарственных средств [97].

Высушенные цветки арники горной являются официнальным лекарственным растительным сырьем во многих странах Западной Европы, США,

Мексике, ряде стран Южной Америки, Турции, Индии и Японии, а также в России. Листья арники горной являются официнальным видом сырья в Венесуэле.

Корневища и корни арники - как лекарственное сырье, входили в 1-Ш издание отечественной фармакопеи. Препараты, полученные из нее обладают возбуждающим действием на функцию сердечно-сосудистой системы, увеличивают коронарный кровоток, расширяют коронарные сосуды при различных патологических состояниях, атеросклерозе, миокардитах и сердечных ангиоспазмах, увеличивают амплитуду сердечных сокращений, например: «Пумпан», капли гомеопатические и таблетки подъязычные гомеопатические, производства Рихард Биттнер АГ, Австрия.

Настойка из цветков арники горной входит в фармакопеи Франции IX издания, Швейцарии VI издания, а также в Европейскую фармакопею. В России качество настойки арники регламентируется ФС-42-2061-83. Ее применяли внутрь в качестве кровоостанавливающего средства в акушерской и гинекологической практике при недостаточной инволюции матки в послеродовом периоде и воспалительных заболеваниях мочеполовой системы, при внутренних кровотечениях, а также в стоматологической практике — как противовоспалительное и кровоостанавливающее средство [33, 52, 70, 114].

Наружно настойку .и настой цветков арники использовали в виде компрессов и примочек при ранах, болях в мышцах, при лечении гнойничковых заболеваний кожи, язвах, ожогах, для рассасывания гематом при ушибах [33, 70, 107].

Таким образом, в практической медицине препараты арники применяли как кровоостанавливающее, противовоспалительное, общеукрепляющее,

желчегонное, гипотензивное и гипохолестеринемическое средство [27, 107].

В народной медицине препараты арники применяли внутрь как жаропонижающее средство, а также наружно при кожных высыпаниях, ревматизме, подагре, переломах и мышечных болях [92].

В Российской Федерации официнальным видом сырья являются только цветки растения рода арника, а лекарственными препаратами - настойка из

цветков арники, а также настойка матричная гомеопатическая арники горной, что существенно ограничивает возможности применения растений рода арника [29, 74, 85]. Кроме того, арника горная является дикорастущим, редким, исчезающим видом, занесенным в Красную Книгу [32, 46, 65]. В настоящее время наиболее распространенным видом являются арника облиственная и арника Шамиссо, которые ведены в культуру. Возделывание указанных видов арники оказалось вполне возможным, причем наиболее предпочтительным выбран вид арники облиственной, в связи с более крупными цветочными корзинками, что делает ее сбор менее трудоемким [51, 74]. В связи с этим, для дальнейших исследований с целью создания лекарственных препаратов была выбрана трава арники облиственной [76].

1.2 Номенклатура лекарственных средств на основе арники

Номенклатура препаратов на основе растения рода арника — представлена в основном гомеопатическими лекарственными средствами, в большинстве своем зарубежных производителей. В таблице 1 представлены препараты, содержащие в качестве одного из активных компонентов арнику [27].

Таблица 1 - Номенклатура препаратов, содержащих в качестве одного из активных компонентов арнику и их лекарственные формы

Название препарата Лекарственная форма Показания к применению Производитель

Арника ДН Мазь для наружного применения гомеопатическая 20 г, 30 г Применяется при ушибах мягких тканей и подкожных гематомах ООО «Доктор Н», Россия

Арника - ГФ Мазь для наружного применения гомеопатическая 15 г, 25 г; Масло для наружного применения гомеопатическое 15 мл, 25 мл Травмы мягких тканей (ушибы, гематомы) без нарушения целостности кожных покровов ООО «Гомеопатическая фармация», Россия

Арника Мазь для наружного применения, гомеопатическая 25 г, 30 г Ушибы мягких тканей (для ускорения рассасывания гематом) ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика», Россия

Арника-Хеель Капли гомеопатические 30мл, 100 мл Острые или хронические локализованные или генерализованные воспалительные процессы «Биологише Хайльмиттель Хеель ГмбХ», Германия

Арника- Сальбе-Хеель С Мазь для наружного применения гомеопатическая 50 г Раны, воспаления, ушибы, вывихи, переломы, гематомы, фурункулы, ревматизм, миалгия вследствие мышечного переутомления «Биологише Хайльмиттель Хеель ГмбХ», Германия

Таблица 1 окончание

Название препарата Лекарственная форма Показания к применению Производитель

Арника Эскулюс Суппозитории ректальные гомеопатические №6 Геморрой (неосложненные формы) ООО «Доктор Н», Россия

Пум пан Капли гомеопатические 20 мл, 50 мл, 100 мл; таблетки подъязычные гомеопатические №12 В комплексном лечении ишемической болезни сердца, артериальной гииертензии, хронической сердечной недостаточности 1-11 стадии, нейроциркуляторная дистония «Рихард Биттнер АГ», Австрия

Траумель С Капли гомеопатические для приема внутрь по 30 мл; мазь для наружного применения гомеопатическая 30 г, 50 г, 100 г; раствор для внутримышечного и околосуставного введения гомеопатический по 2,2 мл; таблетки для рассасывания гомеопатические №50 В комплексной терапии воспалительных заболеваний различных органов и тканей, особенно опорно-двигательного аппарата (в том числе тендовагшшт, бурсит, стилоидит, эпикондилит, периатрит) и посттравматических состояний (вывих, растяжение связок, сухожилий и мышц; отек мягких тканей после операции и травмы) «Биологише Хайльмиттель Хеель ГмбХ», Германия

Цель Т Мазь для наружного применения гомеопатическая 30 г, 50 г, 100 г; Раствор для внутримышечного введения гомеопатический по 2,2 мл; таблетки для рассасывания гомеопатические №50 Артрозы, в том числе гонартрозы, спондилоартроз; плечелопаточный периартрит. «Биологише Хайльмиттель Хеель ГмбХ», Германия

В последние годы в ФГБНУ ВИЛАР проводились научно-исследовательские работы по введению в культуру растения арника облиственная с целью расширения ее сырьевой базы, и создания на ее основе новых фитопрепаратов [48, 51]. Наиболее перспективной в этой области явилось получение арники облиственной экстракта сухого, содержащего сумму биологически активных веществ, позволяющих его стандартизировать.

Одной из тенденций современной фармацевтической технологии является

«

разработка способов получения сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья, используемых в качестве замены традиционных настоев и отваров, спиртовых настоек и жидких экстрактов, главными недостатками которых являются неполное извлечение биологически активных веществ, их нестабильность при хранении, неточное дозирование при медицинском применении этих лекарственных форм [53].

В связи с этим, является актуальной проблема разработки лекарственных препаратов на основе сухих экстрактов, полученных из лекарственного растительного сырья [54, 56-57, 108, 129, 136].

Благодаря использованию технологических процессов, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ из растительного сырья, удается получать экстракты, содержащие сумму биологически активных веществ в концентрированном виде.

Сухие экстракты представляют собой гигроскопичный, комкующийся аморфный порошок. Контроль качества сухих экстрактов проводят согласно ОФС, ГФ XI и XII изданий и частным фармакопейным статьям. Стандартизацию проводят по показателям: описание, внешний вид, потеря массы при высушивании, количественное определение действующих веществ, подлинность.

Сроки хранения сухих экстрактов составляют более двух лет, что выгодно отличает их от жидких и густых экстрактов [30, 39, 91]. В настоящее время ассортимент сухих экстрактов и лекарственных средств на их основе постоянно расширяется [27—28].

Перспективным направлением в разработке сухих экстрактов является совершенствование существующих технологий, усовершенствование отдельных

стадий, отработка оптимальных условий технологического процесса, влияющих на рациональное и экономичное использование лекарственного растительного сырья и создание новых технологий [40-41].

Основными стадиями технологического процесса при производстве сухих экстрактов являются: твердофазная экстракция, очистка от балластных веществ и сушка, которые обеспечивают скорость и полноту извлечения биологически активных веществ из растительного сырья.

Начальной стадией получения растительных экстрактов является твердофазная экстракция, в которой преобладают диффузионные процессы. Полнота экстрагирования зависит от типа экстрагента, степени измельченности, температуры, скорости перемешивания, соотношения сырья и экстрагента, продолжительности экстракции [42, 96].

К экстрагентам предъявляется ряд требований: они должны быть индифферентны по отношению к извлекаемым веществам, препятствовать развитию микроорганизмов, иметь относительную низкую стоимость и обеспечивать максимальный выход БАВ; не должны быть токсичными.

Сырьем для получения арники облиственной экстракта сухого (АОЭС) является высушенная трава арники облиственной {Arnica foliosa Nutt.) сем. Asteraceae, которая ранее не использовалась для получения сухих экстрактов.

Технологическая схема получения сухого экстракта из арники облиственной, разработанная в ФГБНУ ВИЛАР, предусматривала стадии твердофазной экстракции сырья 40% этиловым спиртом, последующее концентрирование извлечений, очистку сгущенного экстракта и сушку водного остатка в вакууме при температуре 60±2°С.

По методу избирательного извлечения травы арники облиственной, путем фракционирования на отдельные группы веществ, исследован и установлен состав природных соединений сухого экстракта. Показано, что арники облиственной экстракт сухой содержит 30-35 % фенольных соединений: (флавоноидные гликозиды: лютеолин-7-глюкозид, апигенин-7-О-глюкозид, кверцетин-3-глюкозид; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, кофейная,

феруловая); примерно 3-5 % липофильных веществ (пигменты, липиды, смолы, сесквитерпеновые лактоны ряда геленалина и кумарины: скополетин, умбеллиферон); 20-25 % углеводов (полисахариды и простые сахара: фруктоза, сахароза и глюкоза); 20-25 % азотсодержащих соединений (белки, аминокислоты: аспарагиновая и глютаминовая и гистидин, цистин) [5, 22].

Экспериментальные исследования, проведенные в лаборатории экспериментальной и клинической фармакологии ФГБНУ ВИЛАР показали, что АОЭС в экспериментах на животных при введении его в желудок или внутривенно оказывает кровоостанавливающее действие, ранозаживляющий и противовоспалительный эффект на слизистые оболочки прямой кишки, проявляет гастропротективное и гиполипидемическое действие. Кроме того, АОЭС стимулирует интенсивность желчеотделения. Изучение биологической активности АОЭС с применением специфических биотест систем по НАДФН-оксидазному тесту показало наличие у него иммуномодулирующей активности [13]. В опытах ш vitro показано, что АОЭС обладает бактериостатической и фунгистатической активностью в отношении патогенных бактерий и грибов.

В лаборатории лекарственной токсикологии установлено, что при однократном внутрибрюшинном и внутрижелудочном способах введении лабораторным животным АОЭС является малотоксичным веществом. Препарат в условиях длительного введения в желудок крысам не нарушал морфологический состав периферической крови, не оказывал кардиотоксического действия, проявлял диуретический и седативный эффект. При патогистологическом исследовании АОЭС обладал умеренным дозозависимым раздражающим действием на ЖКТ крыс, проявлял гепато- и нефротоксичность, нарушал реологию крови, вызывая сгущение плазмы и сладж-реакцию эритроцитов. АОС не обладал аллергизирующим, иммунотоксическим и гонадотоксическим действием [20-21].

Учитывая, что арники облиственной экстракт сухой при резорбтивном действии в экспериментах на животных, проявлял токсическое действие на печень, почки, раздражал слизистую желудочно-кишечного тракта, нарушал реологию

крови, обладая гиперкоагулирующим эффектом, целесообразно было разработать лекарственные формы на основе АОЭС для местного и наружного применения.

Таким образом, на основе арники облиственной экстракта сухого, разработаны мягкие лекарственные формы в виде суппозиториев ректальных и крема 1,5%, предназначенных для местного и наружного консервативного лечения воспалительных заболеваний различного генеза [19, 61, 75, 80].

Среди лекарственных форм как местного, так и резорбтивного действия значительное место принадлежит суппозиториям, назначению которых в медицинской практике в последнее время придают большое значение. Их применение позволяет пролонгировать лечебный эффект в очаге воспаления и улучшить биодоступность лекарственного вещества.

Лекарственные средства в виде суппозиториев применяются не во всех странах мира. Ограничения возможности транспортировки и условий их хранения возникают в регионах с жарким климатом. Кроме того, на широкое медицинское применение суппозиториев влияют традиционные и сложившиеся терапевтические подходы в различных странах. Номенклатура суппозиториев в каждой из европейских стран (Франция, Испания, Италия, Германия) составляет более 100 наименований. В России - суппозитории являются традиционной и достаточно широко используемой лекарственной формой. Рынок суппозиториев занимает 1,2% всего фармацевтического рынка России в упаковках. Рынок суппозиториев почти полностью представлен розничными продажами (97,5%). В основном превалируют ректальные суппозитории: они обеспечивают 75% продаж в упаковках. На долю вагинальных суппозиториев приходится 19%, и 6% — на суппозитории, которые могут применяться как ректально, так и вагинально, при этом суппозитории, обладающие обезболивающим и противовоспалительным действием занимают 3-е место по продажам [47].

В настоящее время существует множество классификаций суппозиториев: по пути введения, технологии производства, так же по другим признакам [55]. Обобщенная классификация суппозиториев приведена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Классификация суппозиториев

Медицинское применение препаратов в лекарственной форме суппозитории позволяет снизить уровень аллергических реакций, пролонгировать лечебный эффект и в некоторых случаях снизить дозу лекарственного средства [58]. Традиционно суппозитории используются в проктологии (лечение геморроя и анальных трещин), гинекологии (инфекционно-воспалительные заболевания урогенитальной сферы), урология (лечение простатитов), а также при острых и хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях, в качестве болеутоляющих, жаропонижающих и противовоспалительных средств, в случаях, когда невозможен пероральный прием лекарственного препарата из-за его раздражающего действия на слизистую желудка. Важную роль суппозитории играют в педиатрической и гериатрической практике, когда возникают проблемы с усвоением и доставкой лекарственных веществ при приеме внутрь [47, 98].

В педиатрической практике суппозитории используются достаточно широко, они составляют около 20% всех применяемых в педиатрии лекарственных форм. Большой интерес представляют суппозитории, содержащие анальгетические, жаропонижающие и спазмолитические лекарственные вещества. В состав суппозиториев могут входить БАВ различных фармакологических групп: гормоны, витамины, антибиотики, сульфаниламиды, седативные, противоаллергические, диуретические, слабительные и др. Суппозитории успешно применяют в детской анестезиологии с целью преднаркозной подготовки. Суппозитории для детей изготавливают, как правило, на основе масла какао и твердого жира Типа А. Допускается добавление в них ланолина безводного, декстрина, целлюлозы и меда [9].

Суппозитории ректальные — идеальная лекарственная форма для детей первого года жизни, а также для детей склонных к аллергическим реакциям на красители, ароматизаторы и др. Использование суппозиториев целесообразно в ситуациях, когда необходимо пролонгирование терапевтического эффекта, например применение антипиретика в вечернее время. Суппозитории довольно часто назначаются для лечения многих хронических заболеваний, которые в основном возникают в пожилом возрасте. Учитывая, что в России насчитывается около 40 млн. пенсионеров, то проблема лекарственного обеспечения, в том числе такими лекарственными формами как суппозитории, вполне актуальна [109].

С развитием гомеопатии стали широко применяться суппозитории гомеопатические. Они состоят из гомеопатических лекарственных средств, равномерно распределенных в основе. В нормативных документах на суппозитории определенного состава должны быть указаны - состав разведения взятых для изготовления гомеопатических лекарственных средств и их концентрация, общая масса 1 суппозитория, которая для детей должна быть около 1,0 г, для взрослых - около 2,0 г. Все применяемые основы в производстве суппозиториев, должны быть разрешены для применения в гомеопатии. В этой связи в качестве основ рекомендованы: масло какао, гидрогенизированные жиры

(Твердый жир Типов Л и В) и основа «Суппорин М». В суппозитории гомеопатические не вводят стабилизаторы [52].

Одним из критериев оценки качества суппозиториев является биологическая доступность лекарственных веществ в составе этой лекарственной формы. Методы исследования in vitro позволяют судить о биологической доступности лекарственного вещества по его количеству, высвободившемуся из лекарственной формы. В большинстве случаев установлена корреляция между скоростью растворения и скоростью всасывания лекарственных веществ [125].

Эффективность действия суппозиториев в значительной степени зависит от основы и вспомогательных веществ, входящих в их состав, которые обеспечивают биологическую активность и стабильность лекарственной формы. Основы, используемые при производстве суппозиториев, подразделяются на липофильные, гидрофильные и дифильные [2- 3].

В качестве липофильных основ применяют масло какао с парафином и гидрогенизированными жирами, растительные и животные гидрогенизированные жиры, твердые жиры или триглицериды, ланоль, сплавы гидрогенизированных жиров с воском, твердым парафином, эмульгатором и другие основы, разрешенные для медицинского применения.

В качестве гидрофильных основ используют желатино-глицериновые гели, сплавы полиэтиленоксидов с различными молекулярными массами и другие основы, разрешенные для медицинского применения.

В качестве дифильных основ используют липофильные и гидрофильные основы с добавлением поверхностно-активных веществ и эмульгаторов, а также сложные эфиры высших жирных кислот типа витепсол, лазупол, суппорин М и другие, разрешенные к медицинскому применению [71].

В зависимости от состояния основного действующего вещества (растворимое или нерастворимое в основе) суппозитории могут быть гомогенными или гетерогенными (суспензионными).

При выборе оптимального варианта технологии суппозиториев необходимо учитывать:

- характер кристаллов лекарственных веществ;

- способность действующих веществ растворяться в липидах, в воде очищенной и различных средах (спирт, глицерин, этанольно-водная глицериновая смесь и др.);

- состав основы и ее природа, основные физико-химические свойства (температуры плавления и затвердевания, вязкость, возможность смешиваться с водой и другими средами);

- свойствами вспомогательных веществ (растворяющая, диспергирующая, эмульгирующая способность, антимикробные);

- наличие поверхностно-активных веществ (ПАВ), которые, как правило, увеличивают скорость всасывания лекарственных веществ [58, 80].

При соблюдении оптимальной технологии важной функцией суппозиторной основы является обеспечение скорости доставки активного вещества в организм. Поэтому для увеличения всасывания активного вещества из суппозиториев необходимо использовать основы отвечающие следующим основным требованиям:

- агрегативная устойчивость эмульсионной системы в. расплаве в процессе производства, при разливании в формы и ее охлаждении;

- время полной деформации суппозиторной основы, не более 15 минут;

- время растворения, не более 60 минут [30].

В настоящее время на фармацевтическом рынке представлен широкий ассортимент лекарственных препаратов в виде мягких лекарственных форм, обладающих ранозаживляющей, кровоостанавливающей и

противовоспалительной активностью, которые применяются местно в комплексной терапии кожных заболеваний [6, 68 - 69, 137]. Наиболее широким спросом пользуются мягкие лекарственные формы, созданные на основе лекарственного растительного сырья, преимуществом которых является хорошая переносимость, отсутствие аллергических реакций, возможность длительного назначения пациентам всех возрастных категорий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Михеева, Наталья Сергеевна, 2015 год

_ исп

S.-50-b-

ст

где

S исп - площадь пика лютеолин-7-глюкозида в испытуемом растворе; S ст. — площадь пика PCO лютеолин-7-глюкозида; а - масса PCO лютеолин-7-глюкозида в граммах; b - масса препарата в граммах;

W - потеря в массе при высушивании препарата в %; Результаты проведенных исследований приведены в таблице 8.

№ Серия Содержание в %

1 010113 0,123

2 020113 0,126

3 030113 0,129

4 040113 0,120

5 050113 0,120

Установлено, что содержание лютеолин-7-глюкозида в суппозиториях с АОЭС колеблется в пределах от 0,120 до 0,131%.

Методика валидирована. Подтверждены ее специфичность, пригодность хроматографической системы:

- время удерживания пика лютеолин-7-глюкозида на хроматограммах испытуемого раствора совпадает со временем удерживания соответствующего пика на хроматограммах раствора стандартного образца лютеолин-7-глюкозида с точностью до 0,1 %;

- выбранные условия хроматографирования позволяют разделить пики лютеолин-7-глюкозида (коэффициент разделения 1,5) и сопутствующих веществ, отделив их от системного пика;

- компоненты «плацебо» и возможно образующиеся примеси на хроматограммах испытуемых растворов не мешают определению количественного содержания.

Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 6,3%.

п f Р Т(Р, Х% S2 S Sx АХср АХ Ё Е%

(%) f) %

5 4 95 2,78 0,123 7,70-10-6 2,77-10"3 1,24-10"3 3,4-10"3 7,7-10'3 2,8 6,3

Количественное определение содержания лютеолин-7-глюкозида в креме 1,5%, содержащем АОЭС, напрямую невозможно из-за мешающего определению пика, расположенного непосредственно около такового, принадлежащего анализируемому веществу (рис. 5).

Поэтому количественная оценка была произведена по следующей формуле: „ (^с,-^—)-«-25-100

где

S исп - площадь пика лютеолин-7-глюкозида в испытуемом растворе;

S «плацебо» - площадь пика «плацебо»;

S ст. - площадь пика PCO лютеолин-7-глюкозида;

а - масса PCO лютеолин-7-глюкозида в граммах;

b - масса препарата в граммах;

W - потеря в массе при высушивании препарата в %;

Установлено, что содержание лютеолин-7-глюкозида в креме 1,5% с АОЭС составляет около 0,045 %.

Таким образом, установлено, что АОЭС, суппозитории ректальные и крем 1,5% содержат фенольные соединения, основным компонентом суммы которых является лютеолин-7-глюкозид, что делает перспективной для оценки качества сквозную стандартизацию АОЭС, суппозиториев и крема 1,5% по этому веществу. К сожалению, метод ВЭЖХ не пригоден для количественной оценки

содержания этого вещества в креме 1,5 % из-за присутствия пика сопутствующих веществ, мешающего определению.

Также следует отметить, что ВЭЖХ методика оценки качества АОЭС по содержанию лютеолин-7 глюкозида не предполагает полную количественную характеристику БАВ, и не учитывает содержание других веществ фенольного характера.

Поэтому для экспресс анализа и для включения в НД нами использован спектрофотометрический метод анализа определения суммы фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид.

2.2.2 Количественное определение суммы фенольных соединений в субстанции и лекарственных формах в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид

Для оценки содержания суммы фенольных соединений предложена унифицированная методика, позволяющая проводить сквозной анализ, как в сухом экстракте, так и лекарственных формах.

Методика количественного определения фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид методом спектрофотометрии валидирована по следующим критериям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность, робастность.

Специфичность - способность однозначно оценивать анализируемое вещество в присутствии других компонентов, которые могут присутствовать в образце. Это могут быть примеси, продукты разложения, вспомогательные вещества и т. д.

Правильность - характеризует степень соответствия между известным истинным значением или справочной величиной и значением, полученным по данной методике.

Прецизионность — аналитической методики выражает степень близости (или степень разброса) результатов для серии измерений, выполненных по данной методике на различных пробах одного и того же однородного образца. Прецизионность может рассматриваться на трех уровнях: сходимость, внутрилабораторная прецизионность и воспроизводимость.

Сходимость характеризует прецизионность методики при ее выполнении в одних и тех же условиях (в частности, одним и тем же аналитиком или группой аналитиков) в течение небольшого промежутка времени.

Внутрилабораторная прецизионность - характеризует влияние внутрилабораторных вариаций: различные дни, различные аналитики, различное оборудование и т. д.

Воспроизводимость - характеризует прецизионность в межлабораторном эксперименте (совместные исследования, обычно применяемые для стандартизации метода).

Линейность — способность методики (в пределах диапазона применения) получать результаты испытаний, прямо пропорциональные концентрации (количеству) анализируемого вещества в образце.

Робастность — способность аналитической методики не подвергаться влиянию малых, задаваемых (контролируемых) аналитиком изменений в условиях выполнения методики. Робастность является показателем надежности методики при ее использовании в указанных условиях.

1. Разработка методики количественного определения суммы фенольных соединений в АОЭС

На основании полученных результатов по качественному и количественному составу фенольных веществ в исследуемых объектах, целесообразна оценка их качества по содержанию фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид (рис. 8)

он

о

Рисунок 8- Лютеолин-7-глюкозид

Как известно, реакция комплексообразования с хлоридом алюминия является селективной для фенольных соединений и дает батохромный сдвиг спектра в длинноволновую область, что позволяет отделить фенолы от большой группы сопутствующих веществ.

Спектры поглощения полученных комплексов снимали на саморегистрирующем спектрофотометре Helios в интервале длин волн от 350 до 460 нм.

Установлено, что продукт взаимодействия АОЭС с раствором алюминия хлорида имеет спектральную кривую идентичную с раствором лютеолин-7-глюкозида в условиях методики при длине волны 400±3 нм, как видно из рис. 9 их максимумы поглощения совпадают. Это определило выбор данной длины волны в качестве аналитической.

Scan Graph

0 4949----------,.,_„---—------------

401 0,0 403

350 360 3S0 400 420 440 «50 48Э 5С:

Wave engiH'W)

Рисунок 9 - Спектры поглощения комплексов лютеолин-7-глюкозида и фенольных соединений АОЭС (2) с алюминия хлоридом

2. Методика количественного определения суммы фенольных соединений, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид в АОЭС и лекарственных формах А) АОЭС

Около 0,15 г (точная навеска) сухого экстракта (содержащего сумму фенольных соединений в количестве 8,26%) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 30 мл воды и взбалтывают, затем доводят раствор 95% спиртом этиловым до метки и перемешивают (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 25 мл помещают по 1 мл раствора А, прибавляют по 3 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и выдерживают в течение 40 мин. Измеряют оптическую плотность при длине волны 400 нм в

кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм, в качестве раствора сравнения используют следующий раствор: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают по 1 мл раствора А экстракта и 0,5 мл уксусной кислоты разведенной. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора PCO лютеолин-7-глюкозида, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы фенольных соединений (X) в экстракте в пересчете на лютеолин-7-глюкозид вычисляют по формуле:

D-mPCO-25-b25-100-P-100 ~i)PCO-50-m-l-25-100.(100-H0

Или

D-25-25-100-/M00

Где:

D — оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса навески сухого экстракта взятая для анализа;

Dpco- оптическая плотность PCO лютеолин-7-глюкозида;

Мрсо- навеска PCO лютеолин-7-глюкозида в г;

Р- чистота PCO лютеолин-7-глюкозида.

W- потеря в массе при высушивании сухого экстракта

Е- удельный показатель поглощения PCO лютеолин-7-глюкозида с раствором алюминия хлорида, равный 401. Б) Суппозитории с АОЭС

Один суппозиторий помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и помещают на кипящую водяную баню и нагревают до расплавления основы. К полученной массе прибавляют 20 мл спирта этилового 95 %, помещают в ультразвуковую баню и выдерживают при температуре 50°С в течение 15 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры и доводят тем же растворителем до

метки, затем помещают в морозильную камеру выдерживают до застывания основы и фильтруют через фильтр «синяя лента» (раствор А).

Содержание суммы фенольных соединений в одном суппозитории в пересчете на лютеолин-7-глюкозид вычисляют по формуле:

D — оптическая плотность испытуемого раствора;

Е - удельный показатель поглощения PCO лютеолин-7-глюкозида с раствором алюминия хлорида, равный 401.

В) Крем с АОЭС

Около 3,0 г (точная навеска) крема помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и помещают на кипящую водяную баню и нагревают до расплавления основы. К полученной массе прибавляют 20 мл спирта этилового 95 %, помещают в ультразвуковую баню и выдерживают при температуре 50°С в течение 15 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры и доводят растворителем тем же до метки, затем помещают в морозильную камеру выдерживают до застывания основы и фильтруют через фильтр «синяя лента» (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5 мл раствора А, прибавляют 3 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и выдерживают в течение 40 мин. Измеряют оптическую плотность при длине волны 380 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5 мл раствора А и 0,5 мл уксусной кислоты разведенной.

Содержание суммы фенольных соединений в % в пересчете на лютеолин-7-гликозид вычисляют с помощью формулы:

Х =

Р-25-25'1000

-юо.ы

Лет

где:

Х =

D-25*25*100

где:

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса навески крема, взятая для анализа;

Е - удельный показатель поглощения PCO лютеолин-7-глюкозида с раствором алюминия хлорида, равный 401.

Результаты определения представлены на рис. 10-13 и в таблице 10.

Scan Graph

0,3

402,5 0,316

02

>

er m 3

01

/' I

350 360 370

380 390 400 410 WaveJength(nm)

420 430 440 450

Рисунок 10 - Спектр комплекса лютеолин-7-глюкозида с алюминия хлоридом

Scan Graph

Рисунок 11 - Спектр комплекса фенольных соединений, содержащихся в экстракте, с алюминия хлоридом

Sean Graph

шн

I

<

075

>

er

m

' ч й m a

3os,o 1 m

/

/

0 50

0 25 ' - - - • - - - - ......

375 3SG 390 400 410 420 433 ¿40 450

«Vsveîençthinr)

Рисунок 12 - Спектр комплекса фенольных соединений, содержащихся в извлечении из суппозиториев, с алюминия хлоридом

Sean GrapN

ЗЭ7.0,0,539

375 332 Ш 400 410 420 <30

Рисунок 13 - Спектр комплекса фенольных соединений, содержащихся в извлечении из крема, с алюминия хлоридом

Таблица 10 - Результаты количественного определения суммы фенольных соединений, в пересчете на лютеолин-7-глюкозид

Наименование образца Содержание

АОЭС 8,26 %

Суппозитории с АОЭС 3,29 мг/суппозиторий (0,16%)

Крем 1,5% с АОЭС 0,12%

Валидация методики проведена на образце АОЭС, полученные данные в силу унификации полностью применимы для подтверждения правильности, сходимости, воспроизводимости и специфичности методик количественной оценки в лекарственных формах.

Правильность

Проверка методики на модельных смесях лютеолин-7-глюкозида (ФС 42-017506). Модельные смеси готовили трёх концентраций с содержанием лютеолин-7-глюкозида в % к исходной концентрации 80, 100, 120. Исходная концентрация лютеолин-7-глюкозида составляла 0,4 мг в 25 мл. Определение проводилось в трёх повторностях для каждой концентрации. Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Процент восстановления

№ п/п Реальное значение Экспериментально найденное значение

измеряемой Абсолютная % восстановления

величины в величина мг

модельной смеси

в мг

1. 0,32

1.1. 0,323 100,9

1.2. 0,319 99,57

1.3. 0,316 98,77

среднее 99,75

2. 0,4

2.1. 0,394 98,49

2.2. 0,402 100,43

2.3. 0,408 101,99

среднее 0,401 100,3

3. 0,48

3.1. 0,485 101,02

3.2. 0,475 98,9

3.3. 0,401 100,29

среднее 99,74

Средний % восстановления для 3-х концентраций в трёх повторностях 99,93

Сходимость

Испытания проводили в разные дни с использованием спектрофотометра Helios одним и тем же специалистом на 1 образце АОЭС в 6-ти повторностях с содержанием суммы фенольных соединений, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид 8,3% . Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12 - Вычисление коэффициента критерия «t» Стъюдента

Дата испытания Арники облиственной экстракт сухой

№ Результаты определений Стандартное отклонение (S) Коэффициент вариации % (CV%) Критерий «t» Стьюдента

1-ый день t экс. t таб.

1 8,2

2 8,3

3 8,4

4 8,3

5 8,4

6 8,2

Среднее 8,3 0,0894 1,08

2-ой день

1 8,3

2 8,3

3 8,4

4 8,4

5 8,2

6 8,2

Среднее 8,3 0,0894 1,07 0 2,57

В оспроизвод имость

Определение проводили на одном образце АОЭС в 6-ти повторностях в 2-х лабораториях. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13 - Результаты определения воспроизводимости

Лаборатория АОЭС, с содержанием суммы фенольных соединений, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид 8,3%

№ Результаты определений Стандартное отклонение (S) Коэффициент вариации % (CV%) Критерий «t» Стьюдента

t экс. tTa6.

1 1 8,15

2 8,35

3 8,30

4 8,40

5 8,20

6 8,44

Среднее 8,31 0,113 1,36

2

1 8,25

2 8,15

3 8,35

4 8,40

5 8,45

6 8,44

Среднее 8,34 0,118 1,41 0,5 2,57

Специфичность

Спектры поглощения окрашенных комплексов фенольных соединений с алюминия хлоридом АОЭС, извлечения из суппозиториев и крема в интервале длин волн от 350 до 460 нм имеют спектральную кривую идентичную спектральной кривой комплекса лютеолин-7-глюкозида с раствором алюминия хлорида и максимумы поглощения при длине волны 400±3 нм.

Опыты с добавками. Испытание проводили на 1-ом образце АОЭС в 3-х концентрациях с добавками PCO лютеолин-7-глюкозида. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14 — Результаты опытов с добавками

Содержание Добавлено Должно Найдено Ошибка

суммы лютеолин-7- быть суммы Абсолютная Относитель

фенольных глюкозида в мг фенольных в мг ная

соединении в мг соединений в%

в навеске в мг

в мг

12,0 0,3 12,3 12.1 -0,2 -1,63

12,0 0,4 12,4 12,5 +0,1 +0,81

12,0 0,5 12,5 12,4 -0,1 -0,80

Относительная ошибка опытов с добавками находится в пределах случайной ошибки методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки при определении суммы фенольных соединений АОЭС, и о специфичности данной методики.

Линейность и диапазон

Линейность определяли на пяти концентрациях PCO лютеолин-7-глюкозида. 0,02 г (точная навеска) PCO лютеолин-7-глюкозида (ФС 42-0175-06), высушенного до постоянной массы при температуре 100 - 105°С, помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл прибавляют 20 мл 70 % спирта этилового и доводят объем раствора тем же спиртом до метки (раствор А). 1 мл раствора А

помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят тем же растворителем до метки (раствор PCO).

В пять мерных колб вместимостью 25 мл помещают по 1; 2; 3; 4; 5 мл раствор стандартного образца, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и выдерживают в течение 40 мин. Измеряют оптическую плотность при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм, в качестве раствора сравнения используют следующий раствор: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают по 1 мл раствора А экстракта и 0,5 мл уксусной кислоты разведенной. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Результаты приведены в таблице 15 и на рис. 14 в виде графика.

Таблица 15 — Результаты определения зависимости оптической плотности от концентрации стандартного образца

Оптическая плотность(О) Концентрация лютеолин-7-глюкозида в мг % Коэффициент корреляции у=Ь*х+а

b а

0,132 0,32 0,999 0,398 0,003

0,260 0,64

0,380 0,96

0,510 1,28

0,644 1,60

График линейности (у=Ь*х+а) У=0,398*Х+0,003

Рисунок 14 - График зависимости оптической плотности от концентрации лютеолин-7-глюкозида

Аналитическая область метод % в конечном объеме. Критерии валидации представлены в таблице 16.

Таблица 16 - Критерии валидации

№ п/п Параметры Критерий приемлемости Экспериментальные

валидации данные

1. Правильность Процент восстановления 99,93

98,0-102%

2. Сходимость Коэффициент 1,08%; 1,07%

Вариации »2%

3. Воспроизводимость 1 .Коэффициент 1-ая лаборатория:

Вариации » 2% 1.1,36

2.Критерий «1» 2-ая лаборатория:

Стьюдента < табличного 1.1,41

2,57 2.0,5

4. Специфичность 1 .Совпадение спектров 1 .Доказана

поглощения идентичность спектров

2. Относительная поглощения

ошибка опытов с окрашенных

добавками должна комплексов препарата

находиться в пределах и СО.

случайной ошибки 2,Относительная

методики,что ошибка опытов с

свидетельствует об добавками находится в

отсутствии пределах случайной

систематической ошибки методики, что

ошибки. свидетельствует об

отсутствии

систематической

ошибки.

5. Линейность и диапазон Коэффициент 0,999

корреляции >0,98

Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения фенольных соединений в АОЭС, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид спектрофотометрическим методом представлены в таблице 17.

Таблица 17 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений методом спектрофотометрии в пересчете на лютеолин - 7- глюкозид.

Название п { Р (%) Т(Р,0 Х% Б2 Б АХср АХ Ё% Е %

АОЭС 5 4 95 2,78 8,26 1,25-10"2 0,112 0,0500 0,139 0,311 1,7 3,76

Суппозитории с АОЭС 5 4 95 2,78 0,16 9,20-Ю-6 0,003 0,0013 3,77-10"3 8,43-10"3 2,35 5,26

Крем с АОЭС 5 4 95 2,78 0,12 2,30-10"6 1,52-10"3 6,78-10"4 1,88-10"3 4,21-Ю"3 1,56 3,49

Относительная погрешность отдельной варианты в предложенной методике в АОЭС не превышает 3,76%, в суппозиториях — 5,26%, в креме с АОЭС — 3,49%.

Таким образом, полученные результаты подтверждают достоверность методики анализа количественного определения суммы фенольных соединений в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид в АОЭС, суппозиториях и креме по параметрам: правильность, прецизионность, сходимость, воспроизводимость, линейность и диапазон, специфичность, аналитическая область, что позволяет использовать её при сквозной стандартизации от экстракта к лекарственным формам и при разработке нормативной документации.

2.2.3 Технологические характеристики активного вещества

Определение насыпной массы, сыпучести, угла естественного откоса,

влажности, растворимости арники облиственной экстракта сухого

Насыпную массу определяли в цилиндре с определенным диаметром отверстия. Цилиндр ставили на лист пергаментной бумаги на ровную поверхность, засыпали предварительно взвешенную навеску и легко постукивали по стенке цилиндра до постоянного объема. Опыт повторяли три раза.

Насыпную массу рассчитывали по формуле:

т з

т = , где: ш — насыпная масса порошка, г/см ;

шСр -средняя масса навески, г;

V - объем цилиндра, мл

Определение сыпучести проводили на приборе ВП-12А (Мариупольский завод технологического оборудования).

Сыпучесть определяли по скорости истечения навески порошка из воронки со строго заданными геометрическими параметрами.

20,0 г порошка АОЭС засыпали в воронку прибора для определения сыпучести при закрытой заслонке. После 20 с утряски открывали заслонку и фиксировали время истечения материала из воронки. Использовали прибор, как в режиме вибрации, так и без него. Опыт повторяли три раза.

Сыпучесть рассчитывали по формуле:

V с I

где: Ус - сыпучесть, г/с;

I - время истечения, с;

ш - масса навески, г

Угол естественного откоса. Опыты проводили на вибрационном устройстве ВП-12А. Свободно насыпанный исследуемый материал образовывал конус, угол откоса которого измеряли с помощью визирной линейки и шкалы. Опыт повторяли три раза.

Определение влажности. Изучали гравиметрическим методом по разнице масс до и после сушки точной навески около 10,0 г в сушильном шкафу при температуре 100±5° до постоянной массы. Результаты представлены в таблице 18.

Таблица 18 - Технологические показатели качества АОЭС

Показатели Значения

Насыпная масса г/см :

При свободном падении 0,59 г/см3

При уплотнении 0,85 г/см3

Сыпучесть г/с 1,93 г/с

Угол естественного откоса, град. 35°

Влажность % 4,95%

Согласно полученным данным - арники облиственной экстракт сухой гигроскопичный порошок с низкой сыпучестью, со временем комкуется и отсыревает. Экстракт необходимо хранить в хорошо укупоренной таре.

Изучение растворимости АОЭС. Проводили по методике ГФ XII, (ОФС 42-004907 «Растворимость»).

Были использованы следующие растворители: вода очищенная, полиэтштенгликоль-400, 1,2-пропиленгликоль, димексид, а также смесь растворителей: ПЭГ— 400 (полиэтиленгликоль-400) + вода в соотношении 1:3; 1,2—

пропиленгликоль + вода в соотношении 1:3. Результаты опытов представлены в таблице 19.

Таблица 19 - Степень растворимости АОЭС в различных растворителях

Растворитель Температура °С Растворимость

Вода очищенная 20 МР

Вода очищенная 60 МР

ПЭГ- 400 20 ПР

1,2— Пропиленгликоль 20 МР

ПЭГ-400 +вода (1:3) 20 Р

1,2— Пропиленгликоль+вода (1:3) 20 Р

Димексид 20 ПР

Обозначения: МР - мало растворим; ПР - плохо растворим; Р - хорошо растворим

Как видно из данных, - представленных в таблице 19, АОЭС хорошо растворим в системе растворителей: ПЭГ-^ЮО+вода в соотношении 1:3 и 1,2— Пропиленгликоль+ вода в соотношении 1:3. Полученные растворы устойчивы, не выпадают в осадок в течение длительного времени. При растворении АОЭС все крупные частицы (более 10 мкм в диаметре) растворяются, система стремится к монодисперсности, что является предпосылкой равномерного распределения экстракта при изготовлении лекарственной формы.

2.2.4 Методы определения физико-химических, технологических и биофармацевтических свойств суппозиториев, содержащих в АОЭС

Описание. Суппозитории однородные, светло-коричневого цвета, в форме торпеды, с очень слабым своеобразным запахом; на продольном срезе допускается наличие воздушного стержня или воронкообразного углубления.

Средняя масса. 2,0 г ± 5% (1,9-2,1 г). Определяется взвешиванием 20 суппозиториев с точностью до 0,01 г. Отклонение в массе суппозиториев не должно превышать ±5% от средней массы. Только два суппозитория могут иметь отклонение ±7,5% от средней массы.

Температура плавления. Норма от 31-37°С. Испытания проводят в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.1 с. 16, метод 2 б, на образце из 10 суппозиториев, которая не должна превышать 37° С.

Время полной деформации. Должно быть не более 15 минут.

Определение времени полной деформации проводят в стеклянном приборе, состоящем из открытой с обеих сторон трубки с капиллярным переходом, стеклянного штока и металлического стержня массой 7,5 г и диаметром 2 мм. Трубку с короткого конца закрывают пробкой и заполняют водой температуры 37°С. Перед началом определения прибор помещают в сосуд с циркулирующей водой при температуре (37±1)°С. Суппозиторий, предварительно выдержанный на льду в течение 15 минут, вводят в трубку и закрепляют с помощью штока, затем тотчас на суппозитории устанавливают металлический стержень и включают секундомер. Замеряют время от введения суппозитория в трубку до появления стержня внизу сужения трубки. Это время принимают за время полной деформации суппозитория.

Определение pH водной вытяжки.

Значение pH водной вытяжки суппозиториев определяли потенциометрически на pH - метре «Mettler Toledo» S 80-К в соответствии с требованиями ГФ XII, вып. 1.

Кислотное число.

Кислотным числом называют количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных кислот, содержащихся в 1 исследуемого вещества. Испытания проводят в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, на образце из 10 суппозиториев.

Йодное число.

Йодным числом называют количество граммов йода, связываемое 100 г исследуемого вещества. Проводят в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.1.

Высвобождение активного вещества из суппозиториев.

Определение скорости высвобождения АОЭС из основ различной природы, а также изучение факторов, влияющих на этот процесс, проводили методом диализа через полупроницаемую мембрану (по Крувчинскому) с помощью которого можно получить информацию о скорости и полноте высвобождения лекарственного вещества.

Методика: прибор, используемый для диализа, состоит из наружного стеклянного сосуда - химического стакана вместимостью 500 мл и внутреннего сосуда без дна — диализной трубки. Дном цилиндра служит полупроницаемая мембрана, в качестве которой используют нелакированную целлофановую пленку (ГОСТ 7730-89 - пленка целлюлозная. Технические условия) с общей площадью контакта 20 см , толщиной 0,25 мм. На внутреннюю поверхность мембраны помещают суппозиторий массой 2,0 г (точная навеска), который неподвижно

закрепляют на конце диализной трубки резинкой - обхваткой. Диализную трубку вносим в химический стакан с диализной средой (объем 25 мл) и погружаем на глубину не более 2 мм. Диффузия АОЭС протекает через целлофановую мембрану при температуре 37°С ± 0,5°С в термостате. Отбор проб диализата проводится через заданные промежутки времени - 30, 45, 60, 120 мин. по 5 мл пипеткой с обязательным восполнением диализной среды. Длительность эксперимента по изучению высвобождения АОЭС из суппозитория составляет 2 ч. Опыт проводится с 5-кратным повторением. При изучении высвобождения в качестве диализной среды используется вода очищенная.

Количество высвободившейся АОЭС в пробах диализата определяли спектрофотометрическим методом с помощью прибора СФ-46 при длине волны 368 нм, в кюветах с толщиной слоя 10 мм и вычисляли по формуле:

Di • mst- Vk-2

_

Dst -шн-.Уа5

где:

Х-количество высвободившейся АОЭС, %; Di — оптическая плотность образца; Dst- оптическая плотность стандарта PCO АОЭС; mst- навеска образца PCO;

шн - навеска образца (содержание АОЭС в навеске, г);

Va— объём аликвоты;

Vk— объём диализной среды.

2.2.5 Методы определения физико-химических, структурно-механических

свойств крема 1,5%, содержащего АОЭС

Определение pH 1,5 % раствора крема. Значение pH 1,5 % водного извлечения крема определяли потенциометрически на pH - метре «Mettler Toledo» S 80-К в соответствии с требованиями ГФ XII, вып. 1.

Определение коллоидной стабильности.

Коллоидную стабильность определяли в соответствии с ГОСТ-29189-91 «Кремы косметические, правила приемки, отбора проб». Методы испытаний». Метод предназначен для характеристики агрегативной устойчивости эмульсионных кремов и основан на определении количества отделившейся жировой или водной фазы при центрифугировании образца в течение 5 мин. при 6000 об/мин в лабораторной центрифуге ОП-8УХЛ. Систему считали устойчивой, если после проведения испытаний не наблюдалось выделения масляной или водной фазы.

Определение термостабильности.

Термостабильность определяли в соответствии с ГОСТ 29189-91. Метод основан на определении количества отделившейся масляной или водной фазы при термостатировании в течение 24 ч. при температуре 40^-2° С. Для оценки термостабильности использовали данные визуальных определений. Визуально препарат считался стабильным, если при проведении испытаний не наблюдали расслоения фаз. Термостабильность систем также исследовали в условиях резко меняющейся температуры (ГОСТ 29189-91). Для этого образец препарата термостатировали в течение 7 сут. при 40-42° С, а затем выдерживали 7 сут. в холодильнике при температуре 10-12° С и 3 сут. при комнатной температуре (20° С). Препарат считался термостабильным если не наблюдалось выделения масляной или водной фазы.

Реологические свойства крема.

Измерение реологических показателей крема проводили на ротационном вискозиметре «Реотест—2»типа ЯУ (Германия), действие которого основано на использовании вязкого трения, возникающего в слое жидкости, протекающей в кольцевом зазоре между двумя коаксиальными равномерно вращающимися цилиндрами. Ротационные вискозиметры применимы для непрерывного измерения вязкости среды, что позволяет их использовать в системах контроля и управления производственными процессами. При варьировании скорости ротора (таким образом, при изменении градиента скоростей) можно исследовать текучесть и неньютоновских жидкостей, к которым относится крем. Каждый из анализируемых образцов крема (около 20 г) помещали в измерительный стакан. Для каждого образца проводили 3 измерения, с интервалом в 30 мин. при температуре 20°С. Скорость вращения цилиндра вначале последовательно увеличивали, используя 12 скоростей вращения, а после достижения максимальной для данного прибора величины касательного напряжения, также последовательно уменьшали.

По полученным результатам рассчитывали касательное напряжение сдвига и эффективную вязкость и строили реограммы течения исследуемого крема [63, 95].

Касательное напряжение сдвига (т) вычисляли по формуле,

где Ъ - цилиндровая постоянная, равная 5,6 Па; а - показания измерительного прибора.

Эффективную вязкость вычисляли по формуле:

где г|- эффективная вязкость, Па • с;

т- напряжение сдвига, Па;

у— градиент скорости сдвигового течения, с"1.

Результаты представлены в главе 3.

2.2 Статистические методы

Математические методы статистической обработки и анализа экспериментальных данных были проведены в соответствии с ГФ XI изд.2 и методом вариационной статистики с применением «t» - критерия Стьюдента. Все экспериментальные данные, представленные в работе являются результатом не менее пяти определений.

Заключение к главе 2

- в качестве объектов исследования и дальнейшей разработки состава и технологии получения суппозиториев ректальных и крема 1,5%, использовали арники облиственной экстракт сухой, выделенный из травы арники облиственной {Arnica foliosa Nutt., семейства Сложноцветные - Asíeraceae);

- подбор вспомогательных веществ в состав разрабатываемых лекарственных форм осуществляли с учетом физико-химических свойств АОЭС и исходя из задач технологии получения суппозиториев и крема;

- для идентификации фенольных соединений в субстанции и лекарственных формах использовали метод ВЭЖХ;

- количественное определение суммы фенольных соединений в АОЭС и в лекарственных формах, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид проводили спектрофотометрическим методом, который подтверждает достоверность предложенного метода анализа по параметрам: правильность; прецизионность; сходимость; воспроизводимость; линейность и диапазон; специфичность; аналитическая область, что позволяет использовать её при сквозной

стандартизации от экстракта к лекарственным формам и при разработке нормативной документации;

- для характеристики технологических свойств АОЭС использовали методы определения насыпной массы, сыпучести, угла естественного откоса, влажности и растворимости;

- качестве вспомогательных веществ для суппозиториев и крема 1,5% на основе АОЭС, выбраны наиболее широко применяемые и хорошо изученные основы: твердый жир тип А, твин-80, воск эмульсионный, спен-60, эмуксол, вазелин;

- изучение процесса высвобождения АОЭС из суппозиториев оценивали методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану по методу Крувчинского;

- измерение эффективной вязкости крема 1,5% в широком диапазоне значений при разных скоростях сдвига и температуры проводили с помощью ротационного вискозиметра «Реотест-2»;

- математические методы статистической обработки и анализа экспериментальных данных были проведены в соответствии с требованиями ГФ XI изд. 2 и методом вариационной статистики с применением «Ь> - критерия Стьюдента.

ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ,

СОЗДАННЫХ НА ОСНОВЕ АОЭС

3.1 Технология получения суппозиториев ректальных на основе АОЭС

Актуальным являются разработка суппозиториев на основе лекарственного растительного сырья и в частности на основе АОЭС, обладающего противовоспалительными, кровоостанавлявающими, ранозаживляющими и рассасывающими гематомы свойствами. В связи, с этим суппозитории на его основе могут широко использоваться в медицинской практике для лечения воспалительных заболеваний различного генеза.

Суппозитории являются рациональной лекарственной формой, в которой выгодно сочетаются достоинства пероральных и инъекционных лекарственных средств, связанных с отсутствием проблемы боли и вкуса, снижением уровня аллергических и токсических реакций, повышением биодоступности и фармакологической активности лекарственного средства. Эффективность суппозиториев в значительной степени зависит от входящих в них вспомогательных веществ, которые обеспечивают биологическую активность и стабильность лекарственной формы препарата [1, 75].

Важными критериями при создании суппозиториев, отвечающих требованиям ГФ XI изд., вып. 2, являются равномерное распределение БАВ и вспомогательных веществ в основах, и высвобождение активной субстанции из основ. В связи с этим при оценке качества суппозиториев учитывались параметры, позволяющие выбрать их оптимальный состав.

К этим параметрам относятся: скорость высвобождения лекарственного вещества из суппозиториев, рН, время полной деформации, стабильность и микробиологическая чистота в процессе хранения.

В лаборатории экспериментальной и клинической фармакологии ФГБНУ ВИЛАР экспериментально установлена эффективная доза АОЭС - 10 мг/кг, вызывающая гиперкоагуляционный эффект при внутривенном введении кроликам. Это послужило основанием для разработки лекарственной формы препарата в виде суппозиториев ректальных, содержащих 50 мг активного вещества (АОЭС). Рекомендуемая суточная терапевтическая доза 100 мг (2 суппозитория в сутки).

Определяющим фактором, влияющим на всасывание лекарственных веществ, является их растворимость и распределение в носителе. Установлено, что АОЭС полностью растворяется в 1,2-Пропиленгликоле, предварительно в измельченном виде (результаты исследований представлены в разделе 2.2.1). Введение в основу 1,2-Пропиленгликоля обеспечивает время полной деформации [7, 80,111].

При разработке суппозиториев, исследования должны быть направлены на установление зависимости между биодоступностью препарата и физико-химическими параметрами вспомогательных веществ.

Основные факторы, влияющие на эффективность разрабатываемой лекарственной формы представлены на рис.15.

Знание свойств лекарственных и вспомогательных веществ (наполнители, адсорбционные, вещества, диспергирующие вещества, антиоксиданты, консерванты)

закономерности и механизмы образования дисперсных систем

Эффективная <«_ лекарственная форма

Оценки

высвобождения и биодоступности ЛВ

Всестороннее изучение новых вспомогательных веществ

Рисунок 15 - Основные факторы, влияющие на эффективность разрабатываемой лекарственной формы

При выборе наиболее рациональной основы, исходили из преимуществ липофильных основ.

В таблице 20 представлен состав основ, используемых в технологии экспериментальных образцов суппозиториев ректальных с АОЭС.

По данным составам получены суппозитории массой от 1,9 до 2,1 г.

Таблица 20 — Составы основ экспериментальных образцов суппозиториев (г)

№ Наименование ингредиента Экспериментальные образцы

1 2 3 4 5 6 7

1 ПЭГ 400:1500 9,2 - - - - - -

2 Витепсол \V-35 - 13,7 - - - - -

3 Твердый жир (Тип А) 15,2 10,4 10,9

4 Суппорин М - - - - - - 13,7

5 Моноглицериды - 1,4 - - - -

6 1,2- Пропиленгликоль 5,0 5,0 2,5 5,0 5,0 5,0 5,0

7 Твин 80 0,8 0,8 0,4 0,8 0,8 - 0,8