Разработка технологии фиксации изолированных клеток при субретинальной трансплантации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.07, кандидат наук Миргородская, Светлана Александровна

• Миргородская, Светлана Александровна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Миргородская, Светлана Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Перспективы генной терапии и доставка генного материала при патологии органа зрения

1.2 Применение постоянного магнитного поля в офтальмологии

1.3 Перспективы применения магнитных технологий с целью фиксации клеточного материала

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Исследование безопасности и эффективности технологии насыщения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293 магнитными частицами, и оценка их взаимодействия с магнитным имплантатом в эксперименте in vitro

2.1.1. Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами

2.1.2. Оценка прочностных, токсикологических, цитотоксических и ростстимулирующих свойств магнитного имплантата

2.1.3. Исследование локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза

2.1.4. Оценка эффективности взаимодействия внутриклеточных

магнитных частиц и магнитного имплантата

2/2. Исследование эффективности метода субретинального

введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293,

меченных магнитными частицами в эксперименте in vivo

2.2.1. Группы исследования и методы послеоперационного

контроля

2.2.2. Методы морфологического исследования глазного яблока экспериментальных животных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты разработки технологии введения магнитных частиц в эмбриональные стволовые клетки почки человека линии НЕК-293

3.1.1. Метод культивирования клеток и насыщения магнитными частицами

3.1.2. Результаты оценки пролиферативной активности и жизнеспособности стволовых клеток, меченных магнитными частицами

3.2. Результаты разработки оригинального магнитного имплантата

для эписклеральной фиксации

3.2.1. Общая характеристика разработанного магнитного имплантата

3.2.2. Результаты оценки прочностных, токсикологических, цитотоксических, цитостатических и ростстимулирующих свойств магнитных имплантатов на культурах клеток

3.2.3. Результаты исследования локального инвазивного воздействия полимерного эластичного магнитного имплантата на структуры глаза

3.2.4. Результаты оценки эффективности взаимодействия внутриклеточных магнитных частиц и магнитного имплантата

3.3. Результаты разработки хирургического способа и устройства для локального субретинального введения клеток линии НЕК-293,

содержащих магнитные частицы

3.3.1. Разработанное устройство для субретинального введения

эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных

магнитными частицами

3.3.2. Техника операции на глазах животных

3.4. Результаты экспериментального исследования in vivo эффективности способа субретинального введения эмбриональных стволовых клеток линии НЕК-293, меченных магнитными частицами

3.4.1. Результаты клинических наблюдений за

экспериментальными животными

3.4.2. Результаты морфологического исследования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВМД возрастная макулярная дегенерация

ГКС ганглионарные клетки сетчатки

ДР диабетическая ретинопатия

ДЗН диск зрительного нерва

КТ компьютерная томография

ММСК мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

МП магнитное поле

МРТ магнитно-резонансная томография

МТТ реагент - 3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2Н-

тетразолия бромид

ПМП постоянное магнитное поле

ПР пигментный ретинит

ПЭМИ полимерный эластичный магнитный имплантат

ПЭС пигментный эпителий сетчатки

ЦНС центральная нервная система

AAV adeno-associated viral factor (рекомбинантный адено-ассоциированный вирусный фактор)

ADV adenoviral factor (аденовирусный фактор)

BDNF brain-derived neurotrophic factor (нейротрофический фактор

мозга)

GFP green fluorescent protein (зеленый флюоресцентный белок)

НЕК human embryonic kidney (линия клеток эмбриональной почки

человека)

NGF neuronal growth factor (фактор роста нервной ткани)

PEDF pigment epithelium-derived factor (фактор роста пигментного эпителия)

VEGF vascular endothelial cell growth factors (сосудистый эндотелиальный фактор роста клеток)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии фиксации изолированных клеток при субретинальной трансплантации»

ВВЕДЕНИЕ

Патология сетчатки является одной из ведущих причин слабовидения и слепоты в мире. К такой патологии относятся посттравматические и воспалительные заболевания, гипертоническая ангиопатия сетчатки, посттромботическая ретинопатия, возрастные макулярные дегенерации, диабетическая ретинопатия и наследственные заболевания.

Несмотря на широкий спектр существующих в настоящее время медикаментозных, лазерных и хирургических методов лечения, заболевания сетчатки по-прежнему остаются главной причиной необратимого снижение зрения, основу которой составляют ухудшение обменных и восстановительных процессов, нарушение микроциркуляции и структурной организации тканей глаза. Учитывая вышесказанное, актуальным является поиск новых патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний сетчатки.

Так, возможности генной и клеточной терапии в офтальмологии были продемонстрированы при лечении травматического повреждения сетчатки (Гундорова P.A. с соавт., 2008), ишемии сетчатки (Ченцова Е.В. с соавт., 2007), пигментного ретинита (Jiang Н., 2014; Petrs-Silva Н., 2014), болезни Штаргардта (Han Z., 2014), офтальмологических проявлений синдрома Ашера (Lopes V.S., 2014; Nagel-Wolfrum К., 2014), субретинальной неоваскуляризации (Agrawal S., 2014), ювенильного ретиношизиса (Apaolaza P.S., 2014).

На начальных этапах исследований на экспериментальных животных было показано, что темп нейродегенерации в глазу может быть замедлен при местном введении в патологически измененную ткань нейротрофических, антиапоптотических цитокинов и факторов роста (Chaum Е., 2003; LaVail М.М., 1992, 1998; Wenzel А., 2005). Однако они обладают коротким дистантным действием и подвергаются быстрой

6

инактивации ферментными системами организма, что исключает их системное введение.

Для пролонгирования терапевтического действия нейротрофических факторов и цитокинов необходимо субретинальное введение генетических или клеточных конструкций, осуществляющих продукцию белковых молекул непосредственно в пораженной ткани (Bennett J., 2000; Borras T., 2003; Carvalho L.S., 2014; Hauswirth W., 1998; Hermens W.T., 1998; Isenmann S., 2004; Martin K.R., 2002; Surace E.M., 2003).

Одним из подходов для такой генной терапии в эксперименте является использование генетических конструкций на основе аденовирусов, лентивирусов и герпес-вирусов (Bainbridge J., 2001; Cheng L., 2002a; Fraefel C., 2005; Miyoshi H., 1997; Spencer В., 2000; Trapani I., 2014; Tschernutter M., 2005; Van Adel B.A., 2003). Однако инъекция вирусных конструкций в ткань глаза может вызывать активацию клеточного звена иммунитета, местную воспалительную реакцию, инактивацию генной конструкции, что приведет к резкому сокращению времени продукции трофических факторов (Cayouette M., 1998; Hermens

W.T., 1998; Hoffman L.M., 1997; Isenmann S., 2001, 2004; Reichel M.B.,

d

1998; Ruitenberg M.J., 2002).

Другим вариантом клеточной и генной терапии заболеваний сетчатки является использование стволовых или прогениторных клеток, обладающих высокой секреторной активностью или клеток, трансфецированных генетическими конструкциями и продуцирующих нейротрофические факторы (Aramant R.B., 2005; Banin Е., 2006; Böhm M.R., 2012; Cramer А.О., 2013; Das A.M., 2005; Ikeda H., 2005; Klassen H., 2004b; Lund R.D., 2001, 2003; McConnell M.P., 2004).

Среди клеток, пригодных для трансфекции генов и последующей трансплантации в сетчатку глаза, следует выделить клеточную культуру эмбриональных стволовых клеток человека (human embryonic kidney -НЕК-293), полученную в 70-х годах в лаборатории Dr. Alex van der Eb's

7

laboratory в Лейдене (Голландия) из почки абортированного плода (Dr. Alex van der Eb., 1972). Данный штамм был позже трансформирован при помощи аденовируса 5 DNA для достижения большей устойчивости (Graham F.L., 1977). Преимуществом полученной культуры является возможность проведения трансфекции любыми генетическими конструкциями и последующее использование данных клеток для опосредованного влияния в патологическом очаге (Amar L., 2006; Kanno T., 2006; Li T., 2006).

В случае нейродегенеративных заболеваний в офтальмологии особое значение имеет возможность доставки фактора роста нервной ткани (NGF). В литературе встречаются работы по успешной трансфекции клеток НЕК-293 NGF: авторы показали экспрессию этого фактора из клеток в условиях in vitro в течение 5 дней (Me Conell М.Р., 2004) и даже в течение 9 дней (Jimenez J.C., 2004), но, в связи с миграцией клеток после трансплантации в условиях in vivo, было сложно оценить длительность экспрессии этого фактора.

Однако эффект клеточной терапии при лечении патологии сетчатки резко снижается из-за того, что трансплантированные клетки, обладая homing-эффектом, мигрируют из зоны введения в привычное для себя микроокружение - в орган, из которого они выделены.

Другим ограничением для использования клеточной трансплантации в иммунопривелигированные органы (глаз, нервная ткань и т.д.) является потенциальная возможность злокачественной трансформации введенных клеток после трансплантации (Germain N.D., 2012; Gordeeva O.F., 2013; Kawazaki H., 2002; Odorico Y.S., 2001).

Существует ряд подходов для локального удержания

трансплантированных клеток в тканях глаза. Это использование

полупроницаемых капсул, имплантируемых в стекловидное тело (Bush

R.A., 2004; Sieving P.A., 2006; Uteza Y., 1999), которые обеспечивают

диффузию нейротрофических факторов, предотвращают миграцию и

8

неконтролируемую пролиферацию имплантата, но могут вызывать местную воспалительную реакцию и нарушать прозрачность оптических сред глаза (Sieving P.A., 2006).

В настоящее время популярным направлением становится использование магнитных технологий для фиксации трансплантируемого клеточного материала в месте его введения. Впервые с этой целью клетки, содержащие магнитные наночастицы были использованы для движения клеток при внутривенном введении к области печени (Arbab A.S., 2004; Song М., 2010). Затем стволовые клетки с магнитными наночастицами были использованы для движения к месту повреждения сосудов и сердца (Kyrtatos P.G., 2009; Leong W.S., 2010). Авторами достигалось направленное и контролируемое движение клеток к месту повреждения под действием внешнего магнитного поля и локальная фиксация материала в заданные сроки наблюдения.

Основным недостатком предложенных методов является крайне высокий процент (до 80%) гибели клеток в течение первых суток при введении в них наночастиц, что делает невозможным использование данного подхода в офтальмологии для длительного лечения нейродегенеративных заболеваний сетчатки.

По данным литературы, в офтальмологии была проведена успешная попытка направленной доставки мезенхимальных стволовых клеток, меченных суперпарамагнитными частицами в область сетчатки, но сроки наблюдения за животными были короткими, и целью исследования не являлась фиксация трансплантированного материала в зоне введения (Yanai А., 2012).

Очевидно, что разработка метода, позволяющего получать функционально активные и жизнеспособные клетки, содержащие магнитные частицы, для локальной фиксации в зоне введения, является перспективным и многообещающим направлением в генной и клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний сетчатки.

Таким образом, целью исследования явилась разработка и экспериментальное обоснование эффективности технологии контролируемой субретинальной трансплантации клеточного материала, обладающего потенциальным терапевтическим эффектом, и его фиксации.

Задачи исследования

1. Разработать технологию введения микронных магнитных частиц в эмбриональные стволовые клетки почки человека линии НЕК-293, трансфецированные геном GFP.

2. Разработать оригинальный магнитный имплантат для эписклеральной фиксации.

3. Разработать хирургический способ и устройства для локальной субретинальной трансплантации клеток линии НЕК-293, содержащих магнитные частицы.

4. Провести клинико-морфологическое обоснование эффективности способа субретинальной трансплантации клеточных элементов, меченных магнитными частицами, их фиксации в эксперименте in vivo.

Научная новизна результатов исследования

1. Впервые разработана технология введения микронных магнитных частиц в цитоплазму клеточной культуры, используемую для проведения генной терапии и позволяющую получить функционально активную клеточную популяцию, длительно сохраняющую жизнеспособность после субретинальной трансплантации.

2. Впервые доказано, что магнитные частицы, введенные в цитоплазму клеток, используемых для генной терапии, не влияют на активность трансфецированного гена.

3. Впервые создан оригинальный полимерный эластичный магнитный имплантат с лазерным зондом для эписклеральной фиксации.

4. Впервые разработаны хирургический способ и устройство для локальной дозированной субретинальной трансплантации клеточного материала, содержащего магнитные частицы.

5. Впервые доказано, что предложенный способ позволяет осуществить длительную фиксацию трансплантированного клеточного материала в зоне его локального введения, и исключает миграцию клеток из субретинального пространства в полость стекловидного тела.

Практическая значимость результатов работы

1. Разработанная технология введения магнитных частиц в клетки линии НЕК-293 позволяет использовать полученную культуру для направленной доставки и фиксации клеточного материала в зоне повреждения.

2. Разработанный полимерный эластичный магнитный имплантат с лазерным зондом осуществляет интраоперационную диафаноскопию, что открывает широкие перспективы для проведения генной и клеточной терапии в экспериментальной офтальмологии.

3. Разработанное устройство дает возможность точно дозировать объем суспензии, вводимой субретинально, и обеспечивает доступ pars plana в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией сетчатки и окружающей ткани, что может использоваться для подачи жидкостей, вводимых при витреоретинальных операциях в офтальмологии.

4. Разработанный хирургической способ позволяет осуществлять контролируемую локальную трансплантацию клеточного материала в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией окружающих

тканей, а также фиксировать трансплантированный клеточный материал в зоне введения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Трансфецированные геном GFP клетки линии НЕК-293 с введенными в них микронными магнитными частицами сохраняют активность генетической конструкции и остаются жизнеспособными после трансплантации в сетчатку глаза экспериментальных животных.

2. Разработанная методика локальной субретинальной трансплантации клеточного материала, меченного магнитными частицами, с помощью оригинального устройства дозирования и полимерного эластичного магнитного имплантата позволяет осуществлять трансплантацию с минимальной травматизацией окружающей ткани и фиксировать материал в месте введения сроком до 21 дня.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на VIII Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2013), на XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения-2013» (Москва, 2013), на научно-клинической конференции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва, 2014).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 7 - в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Имеется один патент РФ на изобретение, подана заявка на получение патента РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 64 рисунками, содержит 2 таблицы. Список использованной литературы включает 176 источников, из них - 29 отечественных и 147 зарубежных.

Исследование безопасности и эффективности технологии насыщения магнитными частицами стволовых клеток клеточной линии НЕК-293 GFP в эксперименте in vitro выполнялось на базе лаборатории клеточных и физико-химических медицинских технологий ГБУЗ г. Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» и Института биологии гена Российской академии наук под руководством д.м.н. A.A. Темнова.

В качестве источника слабого постоянного магнитного поля использовали оригинальные имплантаты на основе полимерных эластичных магнитных материалов, разработанные нами совместно с ООО НЭП «Микрохирургия глаза» (Москва), намагничивание проводили в ООО «ЭЛМАТ-ПМ» (Калуга). Оптоволокно (лазерный световод), имплантированное внутрь магнита, производства ООО «Полироник» (Москва).

Экспериментальные исследования in vivo выполнены на базе

Калужского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.

13

Федорова» Минздрава России (директор - д.м.н. A.B. Терещенко) под руководством зам. директора по научной работе - д.м.н., проф. Ю.А. Белого.

Морфологические исследования выполнены на двух базах: лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (зав. центром - д.м.н. С.А. Борзенок) ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, при непосредственном участии зав. лабораторией, к.м.н. A.B. Шацких; отдела геномики и клеточных технологий Института биологии гена Российской академии наук, при непосредственном участии старшего научного сотрудника группы нейрогенетики и генетики развития (руководитель группы — д.б.н., профессор Г.В. Павлова), к.б.н. A.B. Ревищина.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Патология сетчатки является одной из ведущих причин слабовидения и слепоты в мире. К такой патологии относятся посттравматические и воспалительные заболевания сетчатки, гипертоническая ангиопатия сетчатки, посттромботическая ретинопатия, возрастные макулярные дегенерации, диабетическая ретинопатия и наследственные заболевания сетчатки.

Первоначально торможение восстановительных процессов в нервной ткани сетчатки при ее повреждении связывали с глиальным рубцом, но с совершенствованием техники диагностического исследования было выяснено, что ингибиция регенеративных процессов связана с ранним развитием в зоне повреждения дисбаланса тканевых пептидов — дефицитом белковых ростстимулирующих нейротрофических факторов и переизбытком белков - ингибиторов роста. В результате сочетанного воздействия факторов деструкции и регенерации зона повреждения сетчатки последовательно проходит через несколько этапов формирования необратимого структурного повреждения [13, 20, 29].

Врожденная патология сетчатки включает большой спектр

заболеваний, в основе которых лежат процессы, вызывающие

повреждение пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). Наследственные

дегенерации сетчатки можно разделить на две группы: первую, в которой

дефект связан с конкретным геном, и вторую, которая имеет сложную

этиологию, включающую экологические и генетические аспекты. Первая

группа включает в себя ряд относительно редких заболеваний, среди

которых самое распространенное - пигментный ретинит, который

затрагивает приблизительно 1 миллион людей во всем мире. Ко второй

группе относятся глаукомная нейропатия, возрастная макулярная

дегенерация (ВМД) и -диабетическая ретинопатия (ДР). Эти патологии

сетчатки и зрительного нерва имеют генетический компонент, так как они

15

происходят чаще в семьях, где наблюдались поражения пробандов, хотя связаны и с другими ненаследственными факторами, такими как повышение внутриглазного давления, возраст и уровень сахара в крови [82, 84].

Экономическую и медицинскую составляющую этих трех заболеваний можно оценить по количеству лиц, ими страдающих: ВМД затрагивает более 30 миллионов, диабетическая ретинопатия - более 40 миллионов, а глаукома более 65 миллионов людей во всем мире [82, 84, 164]. Неоваскуляризация, которая часто сопровождает эти заболевания, частично связана со снижением производного фактора роста пигментного эпителия (РЕОИ), поскольку РЕОР является не только нейропротектором, но также мощным ингибитором неоваскуляризации. В последние несколько лет для предотвращения васкуляризации используются антитела против сосудистых эндотелиальных факторов роста клеток (УЕОР). В моделях на животных было показано, что трансфекция клеток ПЭС геном РЕОР и другими факторами роста может предотвратить или замедлить дегенерацию нервной ткани [164]. Ограниченное число исследований на людях также показали, что трансфецированные геном РЕОР клетки ПЭС в естественных условиях являются эффективными для предотвращения дегенерации и частичного восстановления зрения [164]. Однако перспективы генной терапии для лечения офтальмопатологии ограничиваются не только вышесказанным.

1.1. Перспективы генной терапии и доставка генного материала при патологии органа зрения

Большое количество наследственных и приобретенных

нейродегенеративных заболеваний сетчатки прямо или косвенно связано с

повреждением, фоторецепторов ,„и/или пигментного эпителия сетчащ^и

(ПЭС). В последние 15-20 лет большинство экспериментальных

16

исследований в области генной и клеточной терапии были направлены на спасение или замену данных клеток [82]. Так же, интерес многих авторов связан с возможностью восстановления ганглионарных клеток сетчатки (ГКС), которые повреждаются при оптической нейропатии [92, 93, 112, 123, 138], глаукоме [101, 134, 138], диабете [41], рассеянном склерозе [126], ишемии [29, 106, 113, 124, 138], болезни Альцгеймера [43, 44] и пигментном ретините [127, 159].

Существует множество различных терапевтических подходов для лечения фоторецепторной патологии и/или патологии ПЭС, таких как медикаментозные, лазерные, электро- и магнитостимуляции. В то же время интенсивно проходят исследования генной терапии и трансплантации клеток и тканей на моделях животных [67, 88, 161].

Направленная доставка генных конструкций и клеток в сетчатку глаза имеет ряд неоспоримых преимуществ, в сравнении с другими органами и нервными тканями, поскольку глаз изолирован от других систем, имеет более ограниченный иммунный ответ, и необходимый объем для интравитреальных инъекций незначительный, что сводит к минимуму потенциальные осложнения, связанные с системными побочными эффектами [67, 82, 84].

Дегенерация фоторецепторов может быть замедлена внутриглазным введением факторов роста или антиапоптотических факторов [56, 107, 108, 173]. Были обнаружены положительные влияния факторов роста в защите фоторецепторов, включая кислотный и основной факторы роста фибробластов (АГОР и ЬРОР), мозговой нейротрофический фактор (ВО№), мерцательный нейротрофический фактор (СШТ), фактор ингибирующий лейкоз (ЬШ), интерлейкин-1Ь и фактор роста пигментного эпителия (РЕБР). Существует мнение, что влияние этих факторов может проявляться опосредовано через другие клетки сетчатки [171]. Но, к сожалению, эти белки имеют относительно короткий период полураспада

и их действие, как правило, преходящее, даже после повторного применения.

Для решения вопроса более длительного высвобождения ростовых и нейротрофических факторов предложены различные их генетические модифицикации, а также способы их введения. Преимущественным считается субретинальный способ введения этих факторов в виде суспензии, так как он обеспечивает максимальное приближение терапевтических агентов к месту дефекта [87, 109, 119]. Однако существует также интравитреальный способ введения факторов, инкапсулированных в полупроницаемые капсулы [50, 153, 169]. Инкапсуляция обеспечивает постепенную диффузию нейротрофических факторов, предотвращает миграцию и неконтролируемую пролиферацию имплантата, но может вызывать местную воспалительную реакцию и нарушать прозрачность оптических сред глаза [50, 153, 169].

С развитием технологий в настоящее время особую популярность

приобретает использование вирусных векторов для введения генов в

клетки, обеспечивая устойчивость конструкции и открывая долгосрочные

перспективы для влияния генетических конструкций в области

повреждения. Однако локальные инъекции таких конструкций могут

оказывать и негативное влияние на пост-митотические нейроны сетчатки,

глию и/или на клетки, не относящиеся к нервной ткани [42, 46, 85, 93, 122,

161]. В большинстве случаев, в эксперименте при дегенеративных

заболеваниях сетчатки у животных используют аденовирусный вектор

(ADV) или более распространенный рекомбинантный адено-

ассоциированный вирусный вектор (AAV). Лентивирусный и

герпесвирусные векторы используются реже и, в основном, для доставки

генной информации в сетчатку грызунов в экспериментах [38, 58, 73, 130,

156, 168, 170]. Аденовирусные векторы представляют собой линейные

двухцепочечные ДНК-конструкции, вмещающие в себя до 8 кб ДНК.

Большинство типов клеток восприимчивы к инфекциям и аденовирусные

18

векторы могут обеспечить доставку трансгенов как в пролиферирующие клетки, так и не в пролиферирующие. Однако прямая инъекция вирусных конструкций в ткань глаза может вызывать активацию клеточного звена иммунитета, местную воспалительную реакцию, инактивацию генной конструкции, что приведет к резкому сокращению времени продукции трофических факторов [53, 85, 86, 92, 93, 144, 148].

Новое поколение аденовирусных векторов считается более перспективным. Так, например, аденовирусный вектор-носитель PEDF, используемый для лечения ВМД не вызывал никаких серьезных воспалительных реакций или побочных эффектов в течение нескольких месяцев [51]. Рекомбинантные адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) представляют собой одноцепочечную ДНК, являются производными от парвовирусов, и относятся к непатогенным и нетоксичным вирусам. Эти векторы могут эффективно встраиваться в клетки любого типа, и в настоящее время известно более чем 100 известных серотипов, из которых широко используются 11 [75]. Наиболее часто используемыми серотипами являются нейротрофические [47, 49]. Векторы AAV-2 и AAV-5, наиболее часто применяются для интраокулярного введения [67, 161]. Недостатком AAV в настоящее время является их незначительная емкость, в них могут разместиться только около 4,5 кб ДНК, хотя большинству основных генов, которые используются при лечении заболеваний глаз, достаточно этого объема для расположения в AAV.

В целях доставки векторов к фоторецепторам, их, как правило, вводят в субретинальное пространство, то есть между внешними слоями сетчатки и пигментным эпителием сетчатки. Стоит отметить, что интравитреальные инъекции AAV у взрослых крыс преимущественно ведут к преобразованию в ганглионарные клетки сетчатки (ГКС), а подобные инъекции у новорожденных крыс приводят к преобразованию преимущественно в фоторецепторы [83]. Известно, что после

19

субретиналыюго введения AAV существует системный гуморальный ответ, но это не мешает дополнительной трансдукции клеток после повторного введения фактора [33].

Проведены множественные исследования генетической составляющей пигментного ретинита. Пигментный ретинит (ПР) относится к группе первичных, хронических наследственных нарушений, при которых фоторецепторы и/или клеточные аномалии ПЭС приводят к прогрессирующей дегенерации фоторецепторов [59, 127]. Примерно в 50% случаев ПР возникает у пациентов, у которых в семье случаи ПР не фиксировались, в 20% случаев наследуется как аутосомно-доминантный, у 20% пациентов как аутосомно-рецессивный и у 10% пациентов этот ген сцеплен с Х-хромосомой.

Клинические проявления ПР могут наблюдаться отдельно или в сочетании с другими системными заболеваниями. За исключением дефекта гена родопсина, который составляет примерно 25% от аутосомно-доминантной формы ПР, генетические основы для ПР разнообразны, вызваны рядом мутаций в более чем 100 идентифицированных генов, при этом каждая мутация влияет на одну или несколько функций фоторецепторов, что делает практически невозможным исправление первичного генетического дефекта при этой патологии без проведения генной терапии [81, 83].

Подавление и заместительная терапия представляют собой способ

лечения, который обходит мутационную гетерогенность наследственных

заболеваний. Такой подход был использован в эксперименте на модели

мыши с родопсин-связанной аутосомно-доминантно наследуемой формой

ПР [128]. Авторы совместно вводили два адено-ассоциированных

вирусных вектора для подавления и замены дефектного гена родопсина у

трансгенных мышей с родопсин-связанной аутосомно-доминантной

наследуемой формой ПР. При этом наблюдалось значительное

функциональное улучшение по данным электроретинографии и улучшение

20

ультраструктуры фоторецепторов. Аутосомно-рецессивная форма ПР вызвана мутацией фосфодиэстеразы-6 в фоторецепторах, что приводит к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и дегенерации фоторецепторов [54]. В одной из первых попыток генной терапии пигментного ретинита с мутацией фосфодиэстеразы-6 в модели на животных субретинально вводили векторы, созданные на основе вируса иммунодефицита человека, содержащие ген, кодирующий фосфодиэстеразу-6. Через 24 недели после инъекции наблюдалось от одного до трех рядов ядер фоторецепторов [163]. Другими авторами использовали лентивирусный вектор, и в результате было достигнуто только частичное спасение фоторецепторов [66].

Другая стратегия для лечения ПР - это спасение клеток фоторецепторов посредством доставки нейротрофических факторов. Было показано, что интравитреальное введение цилиарного нейротрофического фактора позволяет сохранить колбочки и их функции [115]. Тем не менее, устойчивая доставка нейротрофического фактора при интравитреальном введении затруднена в связи с коротким периодом полураспада. Была проведена работа и по доставке гена глиального нейротрофического фактора при помощи адено-ассоциированного вирусного вектора, в результате чего в сетчатке экспериментальных животных отмечался высокий уровень этого фактора и устойчивое функциональное спасение в течение 5 месяцев [64].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Миргородская, Светлана Александровна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеев А.Г., Резникова Л.Л. Эластичные источники магнитных полей // Магнитные поля в теории и практике медицины: Обл. научно-практ. конф.: Тез. докл. - Куйбышев, 1984. - С. 3-6.

2. Алиева Е.Г. К вопросу о механизме действия постоянного магнитного поля при его локальном действии на организм // Изв. АН Тадж. ССР. Отд-ние биол. наук., 1989. - № 2. - С. 77-80.

3. Аристархов В.М., Пирузян Л.А., Цыбышев В.П. Физико-химические основы первичных механизмов биологического действия магнитного поля // Реакции биологических систем и магнитные поля: Сб. науч. ст. - М.: Наука, 1978.-С. 6-25.

4. Белый Ю.А. Разработка новых витреоретинальных технологий на базе полимерных эластичных магнитных имплантатов: Дис. ... д-ра мед. наук. - М., 2002.

5. Быков В.П., Какулия М.Г. Новый способ удаления магнитных внутриглазных инородных тел труднодоступной локализации // Теоретические и клинические исследования как основа медикаментозного и хирургического лечения травм органа зрения: Научно-практ. конф.: Материалы. - М., 2000. - С. 120-122.

6. Вайнштейн Е.С., Зобина Л.В. Переменное магнитное поле в лечении некоторых заболеваний сетчатки и хориоидеи // Патология сосудистой и сетчатой оболочек глаза. - Кишинев, 1981. - С. 138-139.

7. Вайнштейн Е.С., Зобина Л.В., Орловская Л.С. Применение магнитотерапии при дистрофии сетчатой оболочки у детей // Магнитные поля в биологии, медицине, сельском хозяйстве: Обл. научно-практ. конф., 2-я: Тез. докл. - Ростов-на-Дону, 1985. - С. 175-176.

8. Верзин A.A., Колесникова Л.Н. Изменения гидродинамических показателей глаза при воздействии постоянного магнитного поля // Вестн. офтальмологии.-1981.-№ 1.-С. 13-14.

9. Веселова Е.В., Каменских Т.Г., Райгородский Ю.М. и др. Магнитотерапия с воздействием на шейные симпатические ганглии в лечении больных первичной открытоугольной глаукомой // Вопросы курортологии, физиотерапии и ЛФК. - 2010. - № 5. - С. 21-24.

10. Волобуев А.Н., Овчинников Е.П., Труфанов Л. А. Уровни воздействия постоянного магнитного поля на биологические ткани // Самарский мед. архив: Сб. ст. - Самара, 1996. - № 1. - С. 34-35.

11. Володин П.Л. Хирургическое лечение центральных дистрофий сетчатки с использованием полимерных эластичных магнитных имплантатов: Дис. ... канд. мед. наук. - М., 2004. - С. 33-40.

12. Гундорова P.A., Быков В.П., Какулия М.Г. Результаты и перспективы применения постоянных магнитов в офтальмологии // Офтальмохирургия. -2002.-№4.-С. 22-26.

13. Гундорова P.A., Ченцова Е.В., Купрашвили И.Т. и др. Влияние ксенотрансплантации мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на восстановление структурной организации и функциональной активности сетчатки при ее повреждении // Вестн. офтальмологии. - 2008. - Т. 124. -№3.- С. 14-18.

14. Демецкий A.M., Алексеев А.Г. Искусственные магнитные поля в медицине. - Минск, 1981. - 94 с.

15. Железнов Е.А., Шелудченко В.М., Федоров A.A. Состояние эпителиальных клеток и тканей при воздействии электромагнитного поля // Вестн. офтальмологии. - 2009. - № 6. - С. 43-46.

16. Жерновой А.И., Чирухин В.А., Шаршина Л.М. Влияние магнитного поля на дыхательную функцию // Мед. техника. - 1999. - № 2. - С. 5-8.

17. Зайкова М.В., Горкунов Э.С., Кошевой В.П. и др. Наш опыт применения постоянного магнитного поля магнитоэластов в офтальмологической практике // Офтальмол. журн. - 1981. - № 6. - С. 328331.

18. Ивашина А.И., Антропов Г.М., Багров С.Н. и др. Магнитотерапия

но

при кератотомии // Офтальмохирургия. - 1991. - № 4. - С. 37-40.

19. Кальметьев Г.Г. Применение постоянного магнитного поля магнитофоров при лечении проникающих ран роговицы // Офтальмол. журн. - 1978. -№ 6. - С. 446-448.

20. Купрашвили И.Т. Экспериментальное изучение эффективности клеточной трансплантации при посттравматической патологии сетчатки: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. -М., 2009. - 13 с.

21. Линник Л.Ф., Антропов Г.М., Максимов Г.В. и др. Биофизические и функциональные отклики биологических тканей на воздействия магнитными полями и электрическими токами // Новые технологии микрохирургии глаза. - Оренбург, 1995. - С. 35-37.

22. Линник Л.Ф., Оглезнева O.K., Антропов Г.М. Лечение некоторых глазных заболеваний методом магнитостимуляции: Метод, рек. - М., 1994. -8 с.

23. Митбрейт М.И. Применение магнитных полей в офтальмологии // Вестн. офтальмологии. - 1980. - № 4. - С. 69-72.

24. Онищенко H.A., Крашенинников М.Е. Клеточная трансплантация — перспективное направление регенерационной медицины // Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. - М., 2009.-С. 49-61.

25. Семенов А.Д., Качалина Г.Ф., Саркизова М.Б. и др. Магнитотерапия после фоторефрактивной кератэктомии // Офтальмохирургия. — 2000. — № 1.-С. 3-13.

26. Скринник A.B., Думброва Н.Е. Влияние постоянного и импульсного магнитных полей на ультраструктуру некоторых элементов глаза // Офтальмол. журн. - 1981. - № 6. - С. 331 -334.

27. Скрипка В.К. Результаты применения магнитного поля в офтальмологии // Офтальмол. журн. - 1981. -№ 6. - С. 321-325.

28. Федоров С.Н., Линник Л.Ф., Шигина H.A. и др. Магнитотерапия при посттравматических атрофиях зрительного нерва // Офтальмохирургия. -1990.-№4.-С. 25-31.

29. Ченцова Е.В., Купрашвили И.Т., Зуева М.В. и др. Влияние ксенотрансплантации нейральных/прогениторных клеток из обонятельного эпителия на функциональную активность сетчатки после моделирования ишемии // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - Т. 2.-№4.-С. 47-51.

30. Agrawal S., Chaqour В. MicroRNA signature and function in retinal neovascularization//World J. Biol. Chem.-2014.-Vol. 5.-No. 1.-P. 1-11.

31. Ali M., McKibbin M., Booth A. et al. Null mutations in LTBP2 cause primary congenital glaucoma // Am. J. Hum. Genet. - 2009. - Vol. 84. - P. 664671.

32. Amar L., Desclaux M., Faucon-Biguet N. et al. Control of small inhibitory RNA levels and RNA interference by doxycycline induced activation of a minimal RNA polymerase III promoter //Nucleic Acids Res. - 2006. - Vol. 34. -No. 5.-P. 37.

33. Anand V., Chirmule N., Fersh M. et al. Additional transduction events after subretinal readministration of recombinant adeno-associated virus // Hum. Gene Ther. - 2000. - Vol. 11. - P. 449^157.

34. Antonetti D.A., Barber A.J., Khin S. et al. Vascular permeability in experimental diabetes is associated with reduced endothelial occludin content: vascular endothelial growth factor decreases occludin in retinal endothelial cells // Penn State Retina Research Group. Diabetes. - 1998. - Vol. 47. - P. 19531959.

35. Apaolaza P.S., Delgado D. et al. A novel gene therapy vector based on hyaluronic acid and solid lipid nanoparticles for ocular diseases // Int. J. Pharm. - 2014. - Vol. 465. -No. 1-2. - P. 413-26.

36. Aramant R.B., Seiler M.J. Progress in retinal sheet transplantation // Prog. Retin. Eye Res. - 2005. - Vol. 23. - P. 474-494.

37. Arbab A.S., Jordan E.K., Wilson L.B. et al. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells // Hum. Gene Ther. - 2004. -Vol. 15.-No. 4.-P. 351-360.

38. Bainbridge J., Stephens C., Parsley K. et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal epithelium and retinal pigment epithelium // Gene Ther. - 2001. -Vol. 8.-P. 1665-1668.

39. Bainbridge J.W., Smith A.J., Barker S.S. et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis // New Engl. J. Med. - 2008. -Vol. 358.-P. 2231-2239.

40. Banin E., Obolensky A., Idelson M., Hemo I. et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 246-257.

41. Barber A.J. A new view of diabetic retinopathy: a neurodegenerative disease of the eye // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psych. - 2003. - Vol. 27. - P. 283-290.

42. Bennett J. Gene therapy for retinitis pigmentosa // Curr. Opin. Mol. Ther. - 2000. - Vol. 2. - P. 420-425.

43. Blanks J.C., Torigoe Y., Hinton D.R., Blanks R.H. Retinal pathology in Alzheimer's disease. I. Ganglion cell loss in foveal/parafoveal retina // Neurobiol. Aging. - 1996a. - Vol. 17. - P. 377-384.

44. Blanks J.C., Schmidt S.Y., Torigoe Y. et al. Retinal pathology in Alzheimer's disease. II. Regional neuron loss and glial changes in GCL // Neurobiol. Aging. - 1996b. - Vol. 17. - P. 385-395.

45. Bohm M.R., Pfrommer S., Chiwitt C. et al. Crystallin-p-b2-overexpressing NPCs support the survival of injured retinal ganglion cells and photoreceptors in rats.// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. -2012. - Vol. 53. - No. 13.-P. 8265-8279.

46. Borras T. Recent developments in ocular gene therapy // Exp. Eye Res. -2003.-Vol. 76.-P. 643-652.

47. Broekman M.L.D., Comer L.A., Hyman B.T., Sena-Esteves M. Adeno-asociated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain //Neuroscience.-2006.-Vol. 138. - P. 501-510.

48. Bull N.D., Irvine K.A., Franklin R., Martin K. Transplanted oligodendrocyte precursor cells reduce neurodegeneration in a model of glaucoma // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2009. - Vol. 50. - P. 4244-4253.

49. Burger C., Gorbatyuk O.S., Velardo M.J. et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system // Mol. Ther. - 2004. - Vol. 10. - P. 302-317.

50. Bush R.A., Lei B., Tao W. et al. Encapsulated cell-based intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor in normal rabbit: dosedependent effects on ERG and retinal histology // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2004. - Vol. 45. - P. 2420-2430.

51. Campochiaro P.A., Nguyen Q.D., Shah S.M. et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial // Hum. Gene Ther. - 2006. — Vol. 17.-P. 167-176.

52. Carvalho L.S., Vandenberghe L.H. Promising and delivering gene therapies for vision loss // Vision Res. - 2014. - Vol.14. - P. 6989.

53. Cayouette M., Behn D., Sendtner M. et al. Intraocular gene transfer of ciliary neurotrophic factor prevents death and increases responsiveness of rod photoreceptors in the retinal degeneration slow mouse // J. Neurosci. - 1998. -Vol. 18.-P. 9282-9293.

54. Chang B., Hawes N.L., Hurd R.E. et al. Retinal degeneration mutants in the mouse // Vision Res. - 2002. - Vol. 42. - P. 517-525.

55. Chaudeurge A., Wilhelm C., Chen-Tournoux A. et al. Can magnetic targeting of magnetically labeled circulating cells optimize intramyocardial cell retention? // Cell Transplant. - 2012. - Vol. 21. - No. 4. - P. 679-691.

56. Chaum E. Retinal neuroprotection by growth factors: a mechanistic perspective // J. Cell Biochem. - 2003. - Vol. 88. - P. 57-75.

57. Cheng K., Li T.S. et al. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction//Circ. Res.-2010.-Vol. 106,-No. 10.-P. 1570-1581.

58. Cheng L., Chaidhawangul S., Wong-Staal F. et al. Human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) vector-mediated in vivo gene transfer into adult rabbit retina // Curr. Eye Res. - 2002a. - Vol. 24. - P. 196-201.

59. Cideciyan A.V., Hood D.C., Huang Y. et al. Disease sequence from mutant rhodopsin allele to rod and cone photoreceptor degeneration in man // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1998. - Vol. 95. - P. 7103-7108.

60. Cideciyan A.V., Hauswirth W.W., Aleman T.S. et al. Human RPE65 gene therapy for Leber congenital amaurosis: persistence of early visual improvements and safety at 1 year // Hum. Gene Ther. - 2009. - Vol. 20. - P. 999-1004.

61. Cramer A.O., McLaren R.E. Translating induced pluripotent stem cells from bench to bedside: application to retinal deceases // Curr. Gene Ther. — 2013.-Vol. 13.-No. 2.-P. 139-151.

62. Czyz C.N., Foster J.A., Lam V.B. et al. Efficacy of pulsed electromagnetic energy in postoperative recovery from blepharoplasty // Dermatol. Surg. - 2012. - Vol. 38. - No. 3. - P. 445-450.

63. Dai G.H., Xiu J.G., Zhou Z.J. et al. Effect of superparamagnetic iron oxide labeling on neural stem cell survival and proliferation // Chinese J. Nan. Fang. Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. - 2007. - Vol. 27. - No. 1. - P. 49-51.

64. Dalkara D., Kolstad K.D., Guerin K.I. et al. AAV Mediated GDNF secretion from retinal glia slows down retinal degeneration in a rat model of retinitis pigmentosa // Molecular Therapy. - 2011. - Vol. 19. - P. 1602-1608.

65. Das A.M., Zhao X., Ahmad I. Stem cell therapy for retinal degeneration: retinal neurons from heterologous sources // Semin. Ophthalmol. - 2005. - Vol. 20.-P. 3-10.

66. Davis R.J., Tosi J., Janisch K.M. Functional rescue of degenerating photoreceptors in mice homozygous for a hypomorphiccGMPphosphodiesterase 6 allele (Pde6bH620Q) // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2008. - Vol. 49. - P. 5067-5076.

67. Dinculescu A., Glushakova L., Min S.H., Hauswirth W.W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease // Hum. Gene Ther. -2005.-Vol. 16.-P. 649-663.

68. Dr. Alex van der Eb. USA FDA CTR For Biologies Evaluation and Research Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting//USA, 2012.-Lines 14-22: USFDA.-P. 81.

69. Dreyer E. B., Grosskreutz C. L. Excitatory mechanisms in retinal ganglion cell death in primary open angle glaucoma (POAG) // Clin. Neurosci. - 1997. -Vol. 4.-P. 270-273.

70. Eckardt C., Hennig G. Transcleral magnetic fixation of the retina in complicated retinal detachment. A preliminary report of our experiences // Klin. Mbl. Augenheilkd. - 1984. - Vol. 185. - P. 296-298.

71. Falkner-Radler C.I., Krebs I., Glittenberg C. et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study // Br. J. Ophthalmol. -2011.-Vol. 95.-P. 370-375.

72. Feng Y., Jin X., Dai G. et al. In vitro targeted magnetic delivery and tracking of superparamagnetic iron oxide particles labeled stem cells for articular cartilage defect repair // J. Huazhong. Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. - 2011. - Vol. 31. - No. 2. - P. 204-209.

73. Fraefel C., Mendes-Madeira A., Mabon O. et al. In vivo gene transfer to the rat retina using herpes simplex virus type 1 (HSV-l)-based amplicon vectors // Gene Ther. - 2005. - Vol. 12. - P. 1283-1288.

74. Frank J.A., Miller B.R., Arbab A.S. et al. Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents // Radiology. - 2003. - Vol. 228. - No. 2. - P. 480-487.

75. Gao G., Vandenberghe L.H., Wilson J.M. New recombinant serotypes of AAV vectors // Curr. Gene Ther. - 2005. - Vol. 5. - P. 285-297.

76. Germain N.D., Hartman N.W., Cai C. et al. Teratocarcinoma formation in embryonic stem cell-derived neural progenitor hippocampal transplants // Cell Transplant. - 2012. - Vol. 21. - No. 8. - P. 1603-1611.

77. Gordeeva O.F., Nikinova T.M. Development of experimental tumors formed by mouse and human embryonic stem and teratocarcinoma cells after subcutaneous and intraperitoneal transplantations into immunodeficient and immunocompetent mice // Cell Transplant. - 2013. - Vol. 22. - No. 10. - P. 1901-1914.

78. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5 // J. Gen. Virol. - 1977. - Vol. 36. - No. 1. - P. 59-74.

79. Han Z., Conley S.M., Naash M.I. Gene therapy for Stargardt disease associated with ABCA4 gene // Adv. Exp. Med. Biol. - 2014. - Vol. 801. - P. 719-724.

80. Harper M., Grozdanic S.D., Blits B. et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2011. - Vol. 52. - P. 4506-4515.

81. Hartong D.T., Berson E.L., Dryja T.P. Retinitis pigmentosa // Lancet. -2006. - Vol. 368. - P. 1795-809.

82. Harvey A.R., Hu Y., Leaver S.G. et al. Gene therapy and transplantation in CNS repair: the visual system // Prog. Retin. Eye Res. - 2006. - Vol. 25. -No. 5.-P. 449-489.

83. Harvey A.R., Kamphuis W., Eggers R. et al. Intravitreal injection of adenoassociated viral vectors results in the transduction of different types of retinal neurons in neonatal and adult rats: a comparison with lentiviral vectors // Mol. Cell Neurosci. - 2002. - Vol. 21. - P. 141-157.

84. Hauswirth W., Mclnnes R. Retinal gene therapy 1998: Summary of a workshop // Molecular Vision. - 1998. - Vol. 4 - P. 11.

85. Hermens W.T., Verhaagen J. Viral vectors, tools for gene transfer in the nervous system // Prog. Neurobiol. - 1998. - Vol. 55. - P. 399-432.

86. Hoffman L.M., Maguire A.M., Bennett J. Cell-mediated immune response and stability of intraocular transgene expression after adenovirus-mediated delivery // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1997. - Vol. 38. - P. 2224-2233.

87. Hojo M., Abe T., Sugano E. et al. Photoreceptor protection by iris pigment epithelial transplantation transduced with AAV-mediated brain-derived neurotrophic factor gene // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2004. - Vol. 45. - P. 3721-3726.

88. Humayun M.S., de Juan Jr. E., del Cerro M. et al. Human neural retinal transplantation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2000. - Vol. 41. - P. 31003106.

89. Ideno J., Mizukami H., Kakehashi A. et al. Prevention of diabetic retinopathy by intraocular soluble fit-1 gene transfer in a spontaneously diabetic rat model // Intl. J.Mol. Med. - 2007. - Vol. 19. - P. 75-79.

90. Ikeda H., Osakada F., Watanabe K. et al. Generation of Rx+/Pax6+ neural retinal precursors from embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2005. -Vol. 102. - P. 11331-11336.

91. Isenmann S., Engel S., Kugler S. et al. Intravitreal adenoviral gene transfer evokes an immune response in the retina that is directed against the heterologous lacZ transgene product but does not limit transgene expression // Brain Res. - 2001. - Vol. 892. - P. 229-240.

92. Isenmann S., Kretz A., Cellerino A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration // Prog. Retin. Eye Res. -2003. - Vol. 22. - P. 483-543.

93. Isenmann S., Schmeer C., Kretz A. How to keep injured CNS neurons viable - strategies for neuroprotection and gene transfer to retinal ganglion cells // Mol. Cell Neurosci. - 2004. - Vol. 26. - P. 1-16.

94. Ishikawa H., Takano M., Matsumoto N. et al. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode // Gene Ther. - 2005. - Vol. 2. - P. 289-298.

95. Ito A., Honda H., Kamihira M. Construction of 3D tissue-like structure using functional magnetite nanoparticles // Japanese Journ., Yakugaku Zasshi. -2008.-Vol. 128.-No. 1.-P. 21-28.

96. Jacobson S.G., Cideciyan A.V., Ratnakaram R. et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by rpe65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years // Arch. Ophthalmol. - 2012. - Vol. 130.-P. 9-24.

97. Jiang H., Xiong S., Xia X. Retinitis pigmentosa-associated rhodopsin mutant T17M induces endoplasmic reticulum (ER) stress and sensitizes cells to ER stress-induced cell death // Mol. Med. Rep. - 2014. - Vol. 9. - P. 17371742.

98. Jimenez J.C., Tyson D.R., Dhar S. et al. Human embryonic kidney cells (HEK-293 cells): characterization and dose-response relationship for modulated release of nerve growth factor for nerve regeneration // Plast. Reconstr. Surg. — 2004. - Vol. 113. - No. 2. - P. 605-610.

99. Kanno T., Yamamoto H., Yaguchi T. et al. The linoleic acid derivative DCP-LA selectively activates PKC-epsilon, possibly binding to the phosphatidylserine binding site // J. Lipid Res. - 2006. - Vol. 47. - No. 6. — P. 1146-1156.

100. Kawazaki H., Suemori H., Mizuseku K. et al. Generation of DOPA neurons and pigmented epithelia from primate ESC by stromal cell-derived in during activating // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 15801585.

101. Kerrigan L.A., Zack D.J., Quigley H. et al. TUNEL-positive ganglion cells in human primary open-angle glaucoma // Arch. Ophthalmol. - 1997. -Vol. 115.-No. 8.-P. 1031-1035.

102. Klassen H., Sakaguchi D.S., Young M.J. Stem cells and retinal repair // Prog. Retin. Eye Res. - 2004b. - Vol. 23. - P. 149-181.

103. Kong J., Kim S-R., Binley K. et al. Correction of the disease phenotype in the mouse model of Stargardt disease by lentiviral gene therapy // Gene Ther. -2008.-Vol. 15.-P. 1311-1320.

104. Kyrtatos P.G., Lehtolainen P., Junemann-Ramirez M. et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury // JACC Cardiovasc. Interv. - 2009. - Vol. 2. - No. 8. - P. 794-802.

105. Kwak N., Okamoto N., Wood J., Campochiaro P. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2004. - Vol. 4. - P. 3158-3164.

106. Lafuente M.P., Villegas-Perez M.P., Sobrado-Calvo P. et al. Neuroprotective effects of alpha(2)-selective adrenergic agonists against ischemiainduced retinal ganglion cell death // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. -2001. - Vol. 42. - P. 2074-2084.

107. LaVail M.M., Unoki K., Yasumura D. et al. Multiple growth factors, cytokines, and neurotrophins rescue photoreceptors from the damaging effects of constant light//Proc. Natl. Acad. Sci. - 1992. - Vol. 89.-P. 11249-11253.

108. LaVail M.M., Yasumura D., Matthes M.T. et al. Protection of mouse photoreceptors by survival factors in retinal degenerations // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1998. - Vol. 39. - P. 592-602.

109. Lawrence J.M., Keegan D.J., Muir E.M. et al. Transplantation of Schwann cell line clones secreting GDNF or BDNF into the retinas of dystrophic Royal College of Surgeons rats // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2004. - Vol. 45. - P. 267-274.

110. Leong W.S., Tay C.Y., Yu H. et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. -Vol. 401. - No. 2. - P. 287-292.

111. Levin L.A. Neuroprotection and regeneration in glaucoma // Ophthalmol. Clin. North Am. - 2005. - Vol. 18. - P. 585-96.

112. Levin L.A., Gordon L.K. Retinal ganglion cell disorders: types and treatments // Prog. Retin. Eye Res. - 2002. - Vol. 21. - P. 465-484.

113. Levin L.A., Louhab A. Apoptosis of retinal ganglion cells in anterior ischemic optic neuropathy // Arch. Ophthalmol. - 1996. - Vol. 114. - P. 488491.

114. Li T., Paudel H.K. Glycogen synthase kinase 3beta phosphorylates Alzheimer's disease-specific Ser396 of microtubule-associated protein tau by a sequential mechanism //Biochemistry. - 2006. - Vol. 45. - No. 10. - P. 31253133.

115. Li Y., Tao W., Luo L. NTF induces regeneration of cone outer segments in a rat model of retinal degeneration // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - P. 9495.

116. Lobel D., Hale J.R., Montgomery D.B. A new magnetic technique for the treatment of giant retinal tears // Am. J. Ophthalmol. - 1978. - Vol. 85. - No. 5. -P. 699-703.

117. Lopes V.S., Diemer T., Williams D.S. Assessment of different virusmediated approaches for retinal gene therapy of Usher IB // Adv. Exp. Med. Biol.-2014.-Vol. 801.-P. 725-731.

118. Lund R.D., Kwan A.S., Keegan D.J. et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease // Prog. Retin. Eye Res. - 2001. - Vol. 20. - P. 415449.

119. Lund R.D., Ono S.J., Keegan D.J., Lawrence J.M. Retinal transplantation: progress and problems in clinical application // J. Leukoc. Biol. - 2003. - Vol. 74.-P. 151-160.

120. Maguire A.M., Simonelli F., Pierce E.A. et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis // New Engl. J. Med. - 2008. - Vol. 358.-P. 2240-2248.

121. Maguire A.M., High K.A., Auricchio A. et al. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis a phase 1 dose-escalation trial // Lancet. - 2009. - Vol. 374. - P. 1597-1605.

122. Martin K.R., Klein R.L., Quigley H.A. Gene delivery to the eye using adeno-associated viral vectors // Methods. - 2002. - Vol. 28. - P. 267-275.

123. Martin K.R., Quigley H.A. Gene therapy for optic nerve disease // Eye. -2004.-Vol. 18.-P. 1049-1055.

124. Matthews M.K. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy // Curr. Opin. Ophthalmol. - 2005. - Vol. 16. - P. 341-345.

125. McConnell M.P., Dhar S., Naran S. et al. In vivo induction and delivery of nerve growth factor, using HEK-293 cells // Tissue Eng. - 2004. - Vol. 10. -No. 9-10.-P. 1492-1501.

126. Meyer R., Weissert R., Diem R. et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis // J. Neurosci. - 2001. - Vol. 21. - P. 6214-6220.

127. Milam A.H., Li Z.Y., Fariss R.N. Histopathology of the human retina in retinitis pigmentosa // Prog. Retin. Eye Res. - 1998. - Vol. 17. - P. 175-205.

128. Millington-Ward S., Chadderton M., O'Reilly M. et al. Suppression and replacement gene therapy for autosomal dominant disease in a murine model of dominant retinitis pigmentosa // Mol. Ther. - 2011. - Vol. 19. - P. 642-664.

129. Miyazaki M., Ikeda Y., Yonemitsu Y. et al. Pigment epithelium-derived factor gene therapy targeting retinal ganglion cell injuries: neuroprotection against loss of function in two animal models // Hum. Gene Ther. - 2011. - Vol. 22.-P. 559-565.

130. Miyoshi H., Takahashi M., Gage F.H., Verma I.M. Stable and efficient gene transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1997. - Vol. 94. - P. 10319-10323.

131. Mozaffarieh M., Grieshaber M.C., Flammer J. Oxygenand blood flow: players in the pathogenesis of glaucoma // Mol. Vision. - 2008. - Vol. 14. - P. 224-233.

132. Nagel-Wolfrum K., Baasov T., Wolfrum U. Therapy strategies for Usher syndrome Type 1C in the retina // Adv. Exp. Med. Biol. - 2014. - Vol. 801. - P. 741-747.

133. Nahum Y., Barliya T., Bahar I. et al. Remote manipulation of posterior lamellar corneal grafts using a magnetic field // Cornea. - 2013. - Vol. 32. — No. 6.-P. 851-854.

134. Nickells R.W., Zack D.J. Apoptosis in ocular diseases: a molecular overview//Ophthalmic Genet. - 1996.-Vol. 17.-No. 4.-P. 145-165.

135. Nikolaeva N.V., Bolotova N.V., Kamenskikh T.G. et al. Transcranial magnetotherapy for the correction of initial manifestations of diabetic retinopathy in children // Vopr. Kurortol. Fizioter. Lech. Fiz. Kult. - 2009. -Vol. 3.-P. 25-28.

136. Odorico Y.S., Kanfman D.S., Thomson Y.A. Multilineage differentiation from human ESC lines//Stem Cells.-2001.-Vol. 19.-P. 193-204.

137. Ohno-Matsui K. Molecular mechanism for choroidal neovascularization in age-related macular degeneration // Nippon Ganka Gakkai Zasshi. — 2003. — Vol. 107.-P. 657-673.

138. Osborne N.N., Casson R.J., Wood J.P. et al. Retinal ischemia: mechanisms of damage and potential therapeutic strategies // Prog. Retin. Eye Res. - 2004a. - Vol. 23. - P. 91-147.

139. Osborne N.N., Melena J., Chidlow G., Wood J.P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implications for the treatment of glaucoma // Br. J. Ophthalmol. - 2001. - Vol. 85.-P. 1252-1259.

140. Pasek J., Pasek T., Herba E. et al. Magnetotherapy in the treatment of viral conjunctivitis and keratitis // Wiad Lek. - 2008. - Vol. 61. - No. 10-12. -P. 288-290.

141. Pechan P., Rubin H., Lukason M. et al. Novel anti-VEGF chimeric molecules delivered by AAV vectors for inhibition of retinal neovascularization //Gene Ther. - 2009. - Vol. 16.-P. 10-16.

142. Petrs-Silva H., Linden R. Advances in gene therapy technologies to treat retinitis pigmentosa // Clin. Ophthalmol. - 2014. - Vol. 8. - P. 127-136.

143. Quigley H.A., Broman A.T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020 // Br. J. Ophthalmol. - 2006. - Vol. 90. - P. 262267.

144. Reichel M.B., Ali R.R., Thrasher A.J. et al. Immune responses limit adenovirally mediated gene expression in the adult mouse eye // Gene Ther. -1998.-Vol. 5.-P. 1038-1046.

145. Ribble D., Goldstein N.B., Norris D.A., Shellman Y.G. A simple technique for quantifying apoptosis in 96-well plates // BMC Biotechnol. -2005.-Vol. 5.-P. 12.

146. Riegler J., Liew A., Hynes S.O. et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticle targeting of MSCs in vascular injury // Biomaterials. - 2013. - Vol. 34.-No. 8.-P. 1987-1994.

147. Rudelius M., Daldrup-Link H.E., Heinzmann U. et al. Highly efficient paramagnetic labelling of embryonic and neuronal stem cells // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging.-2003.-Vol. 30.-No. 7.-P. 1038-1044.

148. Ruitenberg M.J., Plant G.W., Christensen C.L. et al. Viral vector-mediated gene expression in olfactory ensheathing glia implants in the lesioned rat spinal cord // Gene Ther. - 2002. - Vol. 9. - P. 135-146.

149. Santos J.M., Mohammad G., Zhong Q., Kowluru R.A. Diabetic retinopathy, superoxide damage and antioxidants // Curr. Pharm. Biotechnol. -2011.-Vol. 12.-P. 352-361.

150. Sheikpranbabu S., Haribalaganesh R., Gurunathan S. Pigment epithelium-derived factor inhibits advanced glycation endproducts-induced cytotoxicity in retinal pericytes // Diabetes Metab. - 2011. - Vol. 37. - P. 505-511.

151. Shen C., Gu M., Song C. et al. The tumorigenicity diversification in human embryonic kidney 293 cell line cultured in vitro // Biologicals. - 2008. -Vol. 36. - No. 4. - P. 263-268.

152. Shimizu K., Ito A., Yoshida T. et al. Bone tissue engineering with human mesenchymal stem cell sheets constructed using magnetite nanoparticles and

magnetic force // J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. - 2007. - Vol. 82. -No. 2.-P. 471-480.

153. Sieving P.A., Caruso R.C., Tao W. et al. Ciliary neurotrophic factor (CNTF) for human retinal degeneration: phase I trial of CNTF delivered by encapsulated cell intraocular implants // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2006. - Vol. 103.-P. 3896-3901.

154. Simonelli F., Maguire A.M., Testa F. et al. Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration // Mol. Therapy. - 2010. - Vol. 18. - P. 643-650.

155. Song M., Kim Y.J., Kim Y.H. et al. Using a neodymium magnet to target delivery of ferumoxide-labeled human neural stem cells in a rat model of focal cerebral ischemia//Hum. Gene Ther.-2010.-Vol. 21.-No. 5.-P. 603-610.

156. Spencer B,, Agarwala S., Miskulin M. et al. Herpes simplex virusmediated gene delivery to the rodent visual system // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.-2000.-Vol. 41.-P. 1392-1401.

157. Stargardt K. Uber familiare progressive Degeneration in der Maculagegend des Auges // Graefes Arch. Ophthalmol. - 1909. - Vol. 71. - P. 534-550.

158. Stoilov I., Akarsu A.N., Sarfarazi M. Identification of three different truncating mutations in cytochrome P4501B1 (CYP1B1) as the principal cause of primary congenital glaucoma .(Buphthalmos) in families linked to the GLC3A locus on chromosome 2p21 // Hum. Mol. Genet. - 1997. - Vol. 6. - P. 641-647.

159. Stone J.L., Barlow W.E., Humayun M.S. et al. Morphometric analysis of macular photoreceptors and ganglion cells in retinas with retinitis pigmentosa // Arch. Ophthalmol. - 1992.-Vol. 110.-P. 1634-1639.

160. Sun H., Molday R.S., Nathans J. Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter responsible for Stargardt disease // J. Biol. Chem. - 1999. -Vol. 274.-P. 8269-8281.

161. Surace E.M., Auricchio A. Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer // Prog. Retin. Eye Res. - 2003. - Vol. 22. - P. 705-719.

162. Suzuki Y., Nakazawa M., Suzuki K. et al. Expression profiles of cytokines and chemokines in vitreous fluid in diabetic retinopathy and central retinal vein occlusion // Jpn. J. Ophthalmol. - 2011. - Vol. 55. - P. 256-263.

163. Takahashi M., Miyoshi H., Verma I.M., Gage F.H. Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency virus vector-mediated gene transfer // J. Virol. - 1999. - Vol. 73. - P. 7812-7816.

164. Thumann G. Prospectives for gene therapy of retinal degenerations // Curr. Genomics.-2012.-Vol. 13.-No. 5.-P. 350-362.

165. Tong J.P., Chan W.M., Liu D.T. et al. Aqueous humor levels of vascular endothelial growth factor and pigment epithelium-derived factor in polypoidal choroidal vasculopathy and choroidal neovascularization // Am. J. Ophthalmol. -2006.-Vol. 141.-P. 456-462.

166. Trapani I., Puppo A., Auricchio A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies // Prog. Retin. Eye. Res. - 2014. - Vol. 14. - P. 44-45.

167. Trudeau K., Molina A.J., Roy S. High glucose induces mito chondrial morphology and metabolic changes in retinal pericytes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2011. - Vol. 52. - P. 8657-8664.

168. Tschernutter M., Schlichtenbrede F.C., Howe S. et al. Long-term preservation of retinal function in the RCS rat model of retinitis pigmentosa following lentivirus-mediated gene therapy // Gene Ther. - 2005. - Vol. 12. — P. 694-701.

169. Uteza Y., Rouillot J.S., Kobetz A. et al. Intravitreous transplantation of encapsulated fibroblasts secreting the human fibroblast growth factor 2 delays photoreceptor cell degeneration in Royal College of Surgeons rats // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999.-Vol. 96.-P. 3126-3131.

170. Van Adel B.A., Kostic C., Deglon N. et al. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal

ganglion cells for an extended period of time // Hum. Gene Ther. - 2003. - Vol. 14. - P. 103-115.

171. Wahlin K.J., Campochiaro P.A., Zack D.J., Adler R. Neurotrophic factors cause activation of intracellular signaling pathways in Muller cells and other cells of the inner retina, but not photoreceptors // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. -2000. - Vol. 41. - P. 927-936.

172. Weng J., Mata N.L., Azarian S.M. et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice // Cell. - 1999. - Vol. 98. - P. 13-23.

173. Wenzel A., Grimm C., Samardzija M., Reme' C.E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration // Prog. Ret. Eye Res. - 2005. - Vol. 24. - P. 275-306.

174. Wollensak G., Muchamedjarow F., Funk R. Evaluation of treatment by pulsed electromagnetic fields in a rabbit hyphema model // Ophthalmologica. -2003.-Vol. 217.-No. 2.-P. 143-147.

175. Yanai A., Hafeli U.O., Metcalfe A.L. et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles // Cell Transplant. -2012 - Vol. 21. - No. 6. - P. 1137-1148.

176. Yoshida T. Molecular mechanism of choroidal neovascularization in age-related macular degeneration // Nippon Ganka Gakkai Zasshi. - 2007. - Vol. 111.-P. 881-891.