Разработка технологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза для получения D-тагатозы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат технических наук Воеводина, Ольга Сергеевна

• Воеводина, Ольга Сергеевна
• кандидат технических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат технических наук Воеводина, Ольга Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 Обзор литературы.

1.1 Функциональные продукты питания.

1.1.1 Концепция развития функциональных продуктов.

1.1.2 Основные категории функциональных продуктов.

1.2 Пищевые и биологически активные добавки.

1.3 Сахарозаменители и подсластители.

1.4 Способы получения сахарозаменителей.

1.5 Б-тагатоза.

1.5.1 Структура и свойства О-тагатозы.

1.5.2 Метаболизм Б-тагатозы.

1.5.3 Применение Б-тагатозы.

1.5.4 Способы получения Б-тагатозы.

1.5.4.1 Химический способ получения Б-тагатозы.

1.5.4.2 Биологический способ получения Б-тагатозы.

1.6 Ь-арабинозозомераза.

1.6.1 Б-ксилозоизомераза и Ь-арабинозозомераза.

1.6.2 Ь-арабинозозомераза и ее свойства.

1.6.3 Иммобилизация фермента Ь-арабинозозомераза.

ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований.

2.1 Микроорганизмы.

2.2 Образцы почв для скрининга.

2.3 Скрининг микроорганизмов-продуцентов фермента Ь-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания.

2.4 Питательные среды.

2.5 Ферментные препараты.

2.6 Оборудование и приборы.

2.7 Методы.

2.7.1 Методы исследования бактерий.

2.7.2 Выращивание культуры Bacillus mojavensis Х2 в условиях глубинной ферментации.

2.7.3 Отделение биомассы продуцентов.

2.7.4 Метод аддитивно-решетчатого математического описания объекта для оптимизации состава питательной среды для биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы микроорганизмами.

2.7.5 Интенсификации биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы бактериями Bacillus mojavensis Х2 путем совершенствования состава питательной среды по содержанию источника углерода.

2.7.6 Определение содержания сухих веществ.

2.7.7 Определение величины pH растворов.

2.7.8 Определение белка.

2.7.9 Методы определения активностей ферментов.

2.7.9.1 Определение активности L-арабинозоизомеразы цистеин-карбазольным методом.

2.7.9.2 Определение протеолитической активности (модифицированный метод Ансона).

2.7.9.3 Определение целлюлолитической активности модифицированным фотоколориметрическим методом.

2.7.10 Дезинтеграция клеток Bacillus mojavensis Х2.

2.7.10.1 Дезинтеграция с помощью ультразвука.

2.7.10.2 Автолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 под действием органических растворителей.

2.7.10.3 Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 ферментами различного происхождения.

2.7.10.4 Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 многокомпонентными ферментными комплексами.

2.7.11. Определение эффективных условий дезинтеграции биомассы с использованием метода аддитивно-решетчатого описания объекта.

2.7.12 Выделение фермента L-арабинозоизомеразы. Осаждение фермента органическими растворителями.

2.7.13 Определение температурного оптимума действия L-арабинозоизомеразы.

2.7.14 Определение pH-оптимума L-арабинозоизомеразы.

2.7.15 Определение D-тагатозы методом тонкослойной хроматографии.

2.7.16 Определение D-тагатозы методом газовой хроматографии.

ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1 Скрининг микроорганизмов-продуцентов фермента L-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания.

3.2. Исследование бактерий рода Enterobacter на способность синтезировать L-арабинозоизомеразу.

3.3. Исследование фенотипических признаков бактериального штамма КБ4.

3.3.1 Морфологические особенности клеток.

3.3.2 Культуральные признаки штамма КБ4.

3.3.3 Физиолого-биохимические признаки штамма КБ4.

3.3.4 Филогенетический анализ штамма-продуцента.

3.3.5 Устойчивость штамма Bacillus mojavensis, продуцирующего фермент L-арабинозоизомеразу, к факторам внешней среды.

3.4 Определение наиболее эффективного состава питательной среды для биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы Bacillus mojavensis Х2 методом аддитивно-решетчатого математического описания объекта.

3.5. Совершенствование состава питательной среды по содержанию источника углерода для интенсификации биосинтеза фермента L-арабинозоизомераза бактериями В. mojavensis Х2.

3.6 Изучение динамики биосинтеза фермента L-арабинозоизомеразы культурой Bacillus mojavensis Х2 на питательной среде улучшенного состава.

3.7 Изучение дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 различными методами.

3.7.1 Дезинтеграция биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью ультразвука.

3.7.2 Исследование процесса автолиза биомассы Bacillus mojavensis

Х2 под действием органических растворителей.

3.7.2.1 Проведение автолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью этанола.

3.7.2.2 Проведение автолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 с помощью изопропанола, изобутанола и толуола.

3.7.3. Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2.

3.7.4 Ферментолиз биомассы Bacillus mojavensis Х2 под действием лизоцима.

3.7.5 Исследование ферментолиза биомассы Bacillus mojavensis Х2 комплексом ферментов.

3.7.6 Интенсификация дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 с использованием метода аддитивно-решетчатого описания объекта.

3.8 Выделение L-арабинозоизомеразы из водных растворов.

3.8.1 Осаждение фермента этанолом при различных его концентрациях и значениях pH автолизата биомассы Bacillus mojavensis Х2.

3.8.2 Осаждение фермента изопропанолом при различных его концентрациях и значениях pH автолизата биомассы Bacillus mojavensis XI.

3.8.3 Осаждение фермента ацетоном при различных его концентрациях и значениях pH автолизата биомассы Bacillus mojavensisXl.

3.9 Исследование физико-химических свойств ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

3.9.1 Определение температурного оптимума ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

3.9.2 Определение pH-оптимума ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10х.

3.10 Разработка технологии получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г1 Ох из биомассы Bacillus mojavensis Х2.

3.11 Наработка опытных партий препарата L-арабинозоизомеразы Г10х Bacillus mojavensis Х2.

3.12 Определение D-тагатозы методом тонкослойной хроматографии.

3.13 Определение D-тагатозы методом ГХ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза для получения D-тагатозы»

Актуальность темы.

В условиях современного ритма жизни потребление сахара неуклонно растет. Но каждый знает, что калорийность сахара достаточно велика, и если человек живет в условиях сниженных энергозатрат, то избыток калорий превращается в жир, в результате чего у большинства населения возникает угроза ожирения и сахарного диабета. При чрезмерных дозах употребления сахароза может привести к тяжелым нарушениям углеводного и жирового обмена, а также способствовать развитию различных заболеваний.

Натуральные заменители сахара такие, как фруктоза, ксилит и сорбит отличаются довольно высокой калорийностью, поэтому синтезировали низкокалорийные искусственные подсластители, которые превосходят сахар по сладости, но никак не влияют на выброс инсулина и уровень сахара в крови. Однако искусственные подсластители имеют ряд недостатков, поэтому в настоящее время всё чаще возникает вопрос о пользе и безопасности этих соединений.

В связи с этим во многих странах проводят исследования по разработке технологии безопасного и эффективного низкокалорийного подсластителя, применение которого возможно для широкого ассортимента пищевых продуктов и разновозрастного круга населения.

D-тагатоза - полностью натуральный сахар, представляющий собой моносахарид, используемый как подсластитель. D-тагатоза фактически не отличается по вкусу от сахарозы, но с точки зрения более быстрого ощущения сладости подобна фруктозе. Её сладость составляет около 0,9 ед. SES. D-тагатоза имеет невысокую калорийность (1,5 ккал/г), в отличие от других заменителей сахарозы она лишена слабительного эффекта.

Для ферментативной конверсии D-галактозы в D-тагатозу используют фермент L-арабинозоизомераза, не обладающий выраженной субстратной специфичностью.

В настоящее время в РФ производство Б-тагатозы отсутствует, хотя в данном направлении проводятся исследования. Тем не менее, нарастает высокий интерес к этому уникальному заменителю сахарозы во всех странах, в том числе и РФ. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза с целью получения Б-тагатозы актуальна и перспективна.

Настоящая работа посвящена разработке технологии ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза для получения Б-тагатозы.

Цель и задачи исследования.

Основная цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного продуцента Ь-арабинозоизомеразы, разработке технологии очищенного ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10Х для трансформации Б-галактозы в Б-тагатозу.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов-продуцентов Ь-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей Ь-арабинозоизомеразной активностью;

- идентификация штамма-продуцента Ь-арабинозоизомеразы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;

- подбор наиболее эффективного состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;

- разработка технологии получения ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10х;

- наработка ферментного препарата Ь-арабинозоизомеразы в опытно-промышленных условиях;

- изучение основных параметров действия ферментного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10х и его апробация как катализатора при биотрансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Научная новизна работы.

Проведен направленный скрининг микроорганизмов с L-арабинозоизомеразной активностью, выделенных из различных видов почв.

В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент L-арабинозоизомеразы с максимальной активностью (25,30 ед.АиС/г). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.

На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом Bacillus mojavensis Х2 L-арабинозоизомеразной активности от условий культивирования, а также выхода фермента, от параметров дезинтеграции биомассы, выделения и его очистки, впервые в РФ научно-обоснована биотехнология ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮх для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.

Практическая значимость и реализация результатов работы.

В результате скрининга почвенных изолятов бактерий, обладающих L-арабинозоизомеразной активностью, создана лабораторная коллекция микроорганизмов, синтезирующих внутриклеточную L-арабинозоизомеразу. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus mojavensis Х2 разработана биотехнология получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮх.

Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат L-арабинозоизомераза ГЮх. Проведена наработка препарата L-арабинозоизомераза ГЮх в условиях опытного производства. Выход препарата составил 6,8г/дм3, активность ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮХ - 772 ед.АиС/г. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».

Проведена апробация каталитического действия полученного препарата Ь-арабинозоизомераза Г10Х в лабораторных условиях. В результате изомеризации Б-галактозы под действием Ь-арабинозоизомераза Г10х получена Б-тагатоза с выходом 34,81%, что соответствует разработкам зарубежных ученых.

Апробация работы.

Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставки "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты"; конференции молодых ученых "Инновационные технологии продуктов здорового питания" (Москва, 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудования для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009); Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 201 источника, и 5 приложений. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 34 таблиц и 51 рисунок.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)», Воеводина, Ольга Сергеевна

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного скрининга микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы из различных источников отобран бактериальный штамм КБ4 с L-арабинозоизомеразной активностью 25,30 едА-иС/г.

2. Изучение совокупности культуральных, морфологических, физио-лого-биохимических признаков и проведенный филогенетический анализ показали, что целевой штамм относится к роду Bacillus виду mojavensis с точностью 99%.

3. На основании экспериментальных данных сконструирован наиболее эффективный состав питательной среды для культивирования в лабораторных условиях штамма Bacillus mojavensis XI, подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальную активность внутриклеточной L-арабинозоизомеразы - 45,01 ед.АиС/г. Исследована динамика биосинтеза внутриклеточной L-арабинозоизомеразы бактериями Bacillus mojavensis Х2, на сновании которой выявлено, что фермент синтезируется после накопления биомассы бактериями, а максимум активности в культуральной жидкости приходится на 36 ч роста при значении pH питательной среды 6,8.

4. Подобраны условия дезинтеграции биомассы Bacillus mojavensis Х2 с целью выделения внутриклеточного фермента L-арабинозоизомеразы в бесклеточный экстракт. Оптимальные условия дезинтеграции: концентрация лизоцима 0,7%; время лизиса 20 мин; температура лизиса 40°С; время действия ультразвуковой обработки 5 мин при частоте ультразвуковых колебаний — 35 кГц; температура 35°С. Подобраны условия выделения фермента L-арабинозоизомераза Г10х при осаждении этанолом (соотношение объемов автолизат биомассы Bacillus mojavensis Х2 : 96%-ный этанол равно 1:5; pH 7,2).

5. Разработаны технология получения препарата L-арабинозоизомераза ПОх и проекты нормативно-технических документов: лабораторного регламента и технических условий.

6. Осуществлена наработка ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г10Х в опытно-промышленных условиях на пилотной установке ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» на основе разработанной технологической схемы. Выход воздушно-сухого препарата L-арабинозоизомераза Г10х составил 6,8 г/дм (общий выход препарата 47,6 г). Активность L-арабинозоизомераза Г10х в готовом препарате составила 772 ед.АиС/г. Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии ферментного препарата L-арабинозоизомераза Г1 Ох, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне 2630,17 руб за 1 кг.

7. Определены наиболее эффективные значения температуры и рН для действия ферментного препарата L-абинозоизомераза: 45°С, рН 6,0-7,5. Проведена апробация каталитического действия L-арабинозоизомеразы на 5%-ный раствор D-галактозы. С помощью газовой хроматографии установлено, что при концентрации фермента 1% выход D-тагатозы составил 34,81%.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Воеводина, Ольга Сергеевна, 2011 год

1. Азрилевич М.Р. Заменители сахара // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки.2001. №2. С. 42-44

2. Азрилевич М.Р. Заменители сахара // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки.2002. № 1.С. 42-45.

3. Безбородов A.M. Ферментативные процессы в биотехнологии / A.M. Безбородов, H.A. Загустина, В.О. Попов; отв. Ред. Л.И. Воробьева.; Ин-т биохимии им. А.Н. Баха РАН. М.: Наука, 2008. - 335с.

4. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с.

5. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М.: КолосС, 2004. -296с.

6. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. Издательская фирма «Наука». СПб| 1995г.

7. Бугаенко И.Ф., Сорокин А.И. Заменители сахара и их применение. М.: АгроНИИТЭИПП, 1997. Вып. 1-2. 36 с

8. Васильев С.Н., Гамова И.А., де Векки A.B., Дейнеко И.П. и др. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Часть П.НПО "Профессионал" 2005, -1142с.

9. Грачев Ю.П., Плаксин Ю.М. Математические методы планиерования экспериментов. -М.: ДеЛи принт, 2005.- 296 с.

10. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов / Грачева И.М., Кривова А.Ю. 3-е изд. - М.: Элевар, 2000. - 512 с. - (Учеб. и учеб. пособия для студентов вузов).

11. Грейсс.Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография): пер.с англ. М.: Мир, 1999. 753 с.

12. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. Учебник для студ. Биол. специальностей вузов. 4-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия»,2003. 464 с.

13. Дане JI. Функциональное питание . Современные аспекты // Маь. Всерос. Конференции «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и леччении наиболее распространенных заболеваний человека». М., 21-23 апреля 1999, с. 15-17.

14. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. 2002, Изд-во «ГрантЪ», 295 с.

15. Евдокимов. И.А., Никишина И.Н., Серов A.B. и др. Нанобиотехнология получения тагатозы // Переработка молока. 2007, № 12, стр. 40-41

16. Евдокимов. И.А., Никишина И.Н., Серов A.B. и др. Нанобиотехнология получения тагатозы // Переработка молока. 2007, № 12, стр. 40-41.

17. Ефимов, Е.И. Осторожно! Вредные продукты: Не все вкусное полезно / Е.И. Ефимов. СПб.: Невский проспект, 2005. - 160 с

18. Закревский, В.В. Безопасность пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище. Практическое руководство по санитарно-эпидемиологическому надзору / В.В. Закревский. СПб.: ГИОРД, 2004 - 280с.

19. Иванова JI.A., Войно Л.И. и др. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по дисциплине «Технология биоконверсии растительного сырья». М.:Издательский комплекс МГУПП, 2002. -66с.

20. Иванова Л.А., Войно Л.И. Методические рекомендации к проведению лабораторных работ по технологии белковых препаратов, аминокислот и липидов.- М.: Издательский комплекс МГУПП, 1985. -42 с.

21. Иванова Л.А., Войно Л.И., Иванова И.С. Пищевая биотехнология. Кн.2. Переработка растительного сырья. М.: КолосС, 2008. - 472с.

22. Костенко A.B., Даеничева В.А., Костенко A.B. Особенности рынка сахара // Сахар. 2002. № 6. С. 14-17.

23. Костенко A.B., Даеничева В.А., Костенко Ан.В. Особенности рынка сахара // Сахар. 2002. № 6. С. 14-17.

24. Кочеткова A.A., Ипатова Л.Г., Нечаев А.П., Шубина О.Г. / Под ред. A.A. Кочетковой. Функиональные продукты питания: Учебное пособие. М.: Издательский комплекс МГУПП, 2007. - 104с.

25. Крутошикова А., Угер М. Природные и синтетические сладкие вещества. М.: Мир, 1988.120 с

26. Кулакова A.B., Орещенко A.B., Дурнев А.Д. Антимутагенная активность аспартама // Хранение и переработка сельхозсырья. 2003. № 5. С. 90.

27. Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ». Москва. 2004, 36 стр. Изд. ГОУ «Оренбург. Гос. Университет»

28. Мировое производство подслащивающих веществ / H.A. Романика, М.А. Деулина, Н.Б. Шорохова, В.А. Маханова. М.: АгроНИИТЭИПП, 1986. Вып. 8.16 с

29. Моурик C.B. В фокусе сладости: альтернатива натуральному сахару // Пиво и напитки. 2007, №2, с. 62-64.

30. Нечаев А.П., Коткова Т.В. Ингредиенты разные, а задачи участников СППИ-общие// Пищевые ингредиенты.Сырьи добавки. 2005, №2. 12-13

31. Нечаев А.П., Кочеткова A.A., Мартынова Н.В., Николаева Ю.В. Пищевые и биологически активные добавки: Учебное пособие. М.: Издательский комплекс МГУПП, 2004. - 116с.

32. Нилов Д.Ю., Т.Э.Некрасова. Современное состояние и тенденции развития рынка функциональных продуктов питания и пищевых добавок. .// Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2005, №2.28-2935.