Разработка РДСК для диагностики бабезиоза собак тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.19, кандидат биологических наук Расстригин, Алексей Евгеньевич

• Расстригин, Алексей Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Расстригин, Алексей Евгеньевич

1. Введение 4

2. Обзор литературы

2.1. Исторический обзор заболевания 10

2.2. Восприимчивость 15

2.3. Жизненный цикл ' 21

2.4. Патогенез 22

2.5. Исследование иммунитета 28

2.6. Серологические методы диагностики бабезиоза собак 35

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы 37

3.2. Результаты исследования

3.2.1. Выбор штамма возбудителя и определение его видовой принадлежности 42

3.2.2. Определение условий, влияющих на степень переболевания и выраженность паразитемии у зараженных бабезиозом собак 46 —

3.2.3. Опыты с неспленэктомированными собаками 47

3.2.4. Опыт со спленэктомированными щенятами 49

3.2.5. Опыт с подсосными 3-4 недельными щенками 50

3.2.6. Способ приготовления антигена для РДСК 52

3.2.7. Способ приготовления позитивной и негативной сыворотки для РДСК

3.2.7.1.

Способ приготовления позитивной и негативной сывороток от собак

3.2.7.2. Способ приготовления позитивной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов 56

3.2.8. Сравнительное изучение активности нативных и высушенных антигенов, положительных и отрицательных сывороток в РДСК 59

3.2.9. Методика постановки РДСК 66

3.2.10. Динамика паразитемии и комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом собак 72

3.2.11. Результаты серологических исследований на бабезиоз собак из разных регионов России 74

4. Обсуждение 82

5. Выводы 88

6. Практические предложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка РДСК для диагностики бабезиоза собак»

Общая характеристика работы 1.1. Актуальность проблемы.

Бабезиоз - остро протекающее заболевание собак, вызванное паразитированием в эритроцитах животного простейших из отряда Piroplasmida, и сопровождающееся высокой температурой тела, угнетением, анемичностью и желтушности слизистых оболочек, гемоглобинурией, нарушением сердечной деятельности и нередко приводящим к летальному исходу.

В настоящее время трудно представить себе жизнь человека без общения с четвероногими.

Собака является слугой и другом, она преданный член семьи, компаньон в играх и помощник на охоте. Собака - помощник в повседневной жизни и спасатель в экстремальных ситуациях. Собака - символ статуса, престижа и моды. Собака служит в армии и милиции. О собаке говорят, что она создаёт комфорт и является близким товарищем. Собака - первое животное, одомашненное человеком, оно следует за ним по всему миру от Арктики до Антарктики. Приручив это животное, человек взял на себя обязанность заботы о его здоровье, охраны его от воздействия патогенных факторов.

Бабезиоз - грозное заболевание, именуемое также пироплазмоз, характеризуется трансмиссивностью, природной очаговостью и проявляется лихорадкой непостоянного типа, глубокой анемией, кахексией (Davis J.W., Anderson R.C. 1971;

Кровопаразитарные болезни животных. 1995; Jacobson L.S. et al.,1996).

В России переносчиками бабезиоза является клещ Dermacentor marginatus, а за рубежом отмечены клещи: Rhipicephalus sanguineus, Haemaphysalis leachi (Марков А.А. и др. 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995). Многими исследователями отмечена трансовариальная передача клещами возбудителя бабезиоза, а если учитывать, что восприимчивыми животными к заражению B.canis являются и дикие плотоядные семейства собачьих (Canis) (Велю Г. 1930; Якимов B.JI. 1931; Button С., 1979), то они, следовательно, могут служить и природными резервуарами (Henning M.W., 1956). Заболевание обладает ярко выраженной весенней и осенней сезонностью (Sanders D.A., 1937; Matthewman L.A. et al., 1993; Zahler M. et al. 1998; Sanders D.A. et al., 2002). Срок носительства после переболевания отмечен более 130 дней (Botros В.А.М. et al., 1975; Yonamine Н. et al., 1984). Заболевание широко распространено во всех регионах земного шара, чаще в тропической зоне (Марков А.А. и др, 1935; Uilenberg G. et al., 1989; Hauschild S. et al., 1995).

Несмотря на профилактическую обработку против клещей, смертность остается значительной. Это обусловлено отсутствием надежной диагностики при массовом обследовании животных и выявлении природных очагов.

Диагностика бабезиоза собак основана на учете эпизоотического состояния, сезона года, клинических признаков, патоморфологических изменений и результатов микроскопического исследования мазков крови. Решающими в диагнозе являются положительные результаты микроскопического исследования мазков крови. При окраске мазков крови по Романовскому-Гимза

Babesia canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, но в основном находят парногрушевидную форму паразита (Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных., 1956; Протозойные болезни с/х животных., 1982; Паразитология и инвазионные заболевания животных., 1998; Балагула Т.В., 2000. Walter S. et al., 2002;). Все формы могут различно ассоциироваться в одном эритроците (Якимов В. Л., 1931).

Ограниченные возможности световой микроскопии сдерживают своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью. Трудности в идентификации бабезий, и особенно при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие как серологические.

Для предотвращения распространения бабезиоза необходима современная диагностика заболевания.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности исследований по серологической диагностике бабезиоза собак.

1.2. Цель и задачи исследования: Учитывая необходимость своевременного выявления заболевания, основной целью работы явилось - усовершенствовать существующие методы диагностики, освоить и разработать производство новых, более чувствительных тест-систем.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- отработать оптимальные режимы для получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК. установить периоды появления и исчезновения бабезийных антител у экспериментально зараженных щенят в РДСК.

- провести выборочное серологическое исследование на бабезиоз собак в разных городах России.

1.3. Научная новизна

Разработан метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных -доноров после спленэктомии.

Впервые доказана возможность экспериментального заражения бабезиозом щенят в подсосный период.

С помощью РДСК изучена динамика антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных и уточнена эпизоотическая ситуация по бабезиозу собак в разных городах России.

1.4.Практическое значение работы

Предложена и разработана методика получения бабезийного антигена B.canis для серологических реакций РДСК.

Предложена комплексная схема получения позитивной и негативной сыворотки собак и её высушивания.

Предложена схема получения антигена B.canis от экспериментально зараженных интактных щенят, от спленэктомированных и потом зараженных, и от щенят в подсосный период.

По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из B.canis для РДСК», рассмотренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004года.

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 11 Московском международном ветеринарном конгрессе 17-19 апреля 2003 г. Москва.

• «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». 15-16 мая 2003 г. Москва.

• Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г.

• Заседание ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003.

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2005.

1.6. Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 работ в журналах «Ветеринарная медицина», «Ветеринарный консультант» и «Ветеринарная патология».

1.7. На защиту выносятся

1. Отработка оптимального режима получения высокой паразитемии бабезий у неспленэктомированных и спленэктомированных щенят, щенят в подсосный период с целью использования высокоактивных антигенов в РДСК.

2. Метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики бабезиоза собак, включающий получение высокой паразитемии у животных - доноров после спленэктомии.

3. Материалы по заражению бабезиозом подсосных щенят.

4. Материалы по изучению периода появления и исчезновения комплементсвязывающих антител у экспериментально зараженных бабезиозом щенят.

5. получения Метод положительных сывороток крови от зараженных бабезиозом щенят и от паразитоносителей.

6. Метод получения положительной сыворотки от иммунизированных бабезийным антигеном кроликов.

7. Метод лиофилизации сывороток и антигенов. Материалы по их титрации.

8. Материалы по изучению динамики антителогенеза у экспериментально зараженных бабезиозом животных с помощью РДСК и уточнения эпизоотической ситуации по бабезиозу собак в разных городах Европейской части РФ.

9. Оптимизация режима постановки реакции длительного связывания комплемента для диагностики бабезиоза собак.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список использованной литературы включает 142 наименования, из них 102 иностранных автора. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 5 рисунками. В приложении представлен документ, подтверждающий наиболее важный результат исследования и его практическую ценность.

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Расстригин, Алексей Евгеньевич

5. ВЫВОДЫ.

1. Инкубационный период у щенков при экспериментальном заражении равен 5.7 дней. Однако, если проводить заражение тем же объёмом крови, но с большей паразитемией — срок инкубации сокращается. У подсосных щенков клинические признаки появились на 3-й день, к пятому дню 4 щенка пали.

2. Активность бабезийных антигенов находится в прямой зависимости от паразитемии крови, используемой для их приготовления, а степень пораженное™ эритроцитов бабезиями зависит от дозы вводимых донору паразитов.

3.Переболевание собак бабезиозом сопровождается реакцией иммунокомпетентных систем организма, одной из форм которой является образование специфических антител, для выявления которых была использована РДСК с антигеном из B.canis, антиген получен из крови собак по усовершенствованной (попеременное замораживание-оттаивание, примененное при экспериментальном бабезиозе; а так же центрифугирование на больших оборотах) методике, обеспечивающей накопление большой массы возбудителя и повышение его серологической активности.

4.Изучена динамика антителообразования у щенков при экспериментальном бабезиозе с использованием полученного по усовершенствованной методике антигена. Показано:

А) Выявление антител в сыворотке крови по срокам не совпадает с обнаружением бабезий в мазках из периферической крови. Б) Паразитемия обычно предшествует появлению и нарастанию титров комплементсвязующих антител;

5. РДСК с антигеном из бабезий является надёжным диагностическим тестом при бабезиозе и бабезионосительстве собак.

6. Установлено, что высушенные бабезийные антигены сохранили свои высокие титры (от 1:16 до 1:64) в течение 2-х лет, при хранении в холодильнике при 4°С (срок наблюдения).

7. Позитивные сыворотки сохранили свою активность и не были антикомплементарными. Негативные высушенные сыворотки тоже не были антикомплементарными.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по приготовлению и контролю антигенов из В.canis для РДСК», рассмотренные и утвержденные на заседании Ученого Совета ВИЭВ 10 августа 2004года.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Расстригин, Алексей Евгеньевич, 2005 год

1. Акаевский А.И. Анатомия домашних животных. М: «Колос» 1975.

2. Биохимия животных. Под редакцией проф. А.В.Чечёткина, М: «Высшая школа», 1982.

3. Большая медицинская энциклопедия. М: "Советская энциклопедия", 1984.

4. Бондаренко М. Пироплазмоз на практике. "Друг", 1998, №6

5. Балагула Т.В. автореферат диссертации М.2000

6. Велю Г. Пироплазмы и пироплазмозы. Под редакцией проф. С.И.Драчинского. М: «Сельхозгиз», 1930.

7. Вилли К. Биология. М: "Мир", 1968

8. В.Ф.Вракин, М.В.Сидорова. Морфология с/х животных. М: Агропромиздат, 1991.

9. Георгиу X. Дисс. Канд. Вет. наук. М. 1980.

10. Ю.Георгиу X., Расстригин А.Е. Следствие жизнедеятельности B.canis. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения проф. А.А.Маркова. Москва 2002 г.стр.37-38.

11. П.Георгиу X. Расстригин А.Е. Гемолитическая анемия прибабезиозе собак. Там же стр. 38-39.

12. Георгиу X., Расстригин А.Е. Изготовление и контроль антигенов из B.canis для РДСК. Ветеринарная медицина №1 (5). Москва- 2003 г. стр. 144-147.

13. З.Георгиу X., Расстригин А.Е. Методы' диагностики бабезиоз собак (B.canis). Одиннадцатый Московский Международный конгресс 17-19 апреля 2003 г. Москва стр. 2425.

14. Георгиу X., Расстригин А.Е. Динамика накопления антител у кроликов, иммунизированных антигеном B.canis. Одиннадцатый Московский Международный конгресс 17-19 апреля 2003 г. Москва. Там же стр. 28.

15. Георгиу X., Расстригин А.Е. Обзор зарубежной и российской литературы по бабезиозу собак. Ветеринарный консультант №17 (65), Москва 2003 г., стр. 21-23.

16. Дьяконов Л.П. Биологические особенности, ультраструктура и вопросы таксономии кровопаразитов рогатого скота. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва, 1972, стр. 359.

17. Дьяконов Л. П. Роль неспецифических хозяев в поддержании пироплазмидозных очагов. // Бюлл. Всес. инст. экспер. ветерин. 1974. № 18. С. 15-18.

18. Казаков Н.А. Пироплазмоз собак. В книге «Протозойные болезни с/х животных». Под редакцией Степановой Н.И. М: «Колос», 1982. стр.68-72

19. Кровопаразитарные болезни животных. Подготовили: Ятусевич А. И. Заблоцкий В.Т. Витебск. ВГАВМ. 1995. стр.21 -22.

20. Крылов М. В. Определитель паразитических простейших. // Санкт-Петербург: Наука, 1996.

21. Лебедева В. Л. Сравнительный анализ активности нуклеиновых кислот при пироплазмозе собак. //Диагн., леч., профил. инваз. и инфекц. забол. с.-х. жив-х: Сб. науч. тр. -. Ставрополь, 1992.-С.27-33.

22. Лебедева В. Л. Пироплазмоз собак. // Докл. 5 Всес. съезда протозоологов. / Витебск, 1992. № 4. С. 85.

23. Макашов А.В. К вопросу о методике спленэктомии у собак. Журнал научной и практической ветеринарной медицины. 10(3):87-93.1910.

24. Марков А.А., Петрашевская Е.М., Калмыков Е.С. Пироплазмозы сельскохозяйственных животных. М: «Сельхозгиз», 1935.

25. Никитин В. Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. М: «государственное издательство сельскохозяйственной литературы», 1949.

26. Назаров С.Б., Горожанин Л.С. системный подход к изучению физиологии эритрона и его реализация в онтогенетических исследованиях. Вестник Ивановской медицинской академии. 1996, т. 1 №3-4, стр. 30-37.

27. Ниманд Х.Г., Сутер П.Ф. Болезни собак, практическое руководство для ветеринарных врачей. М: «Аквариум», 1998, стр 261-262.

28. Паразитология и инвазионные заболевания с/х животных. Под редакцией Ершова B.C. М: Госиздат с\х литературы. 1956,стр. 420-422.

29. Протозойные болезни с/х животных. Под редакцией Степановой Н.И. М: «Колос», 1982. стр.68-72

30. Паразитология и инвазионные заболевания животных. Под редакцией д-ра вет. наук Акбаева М.Ш. М: «Колос», 1998, стр. 241-242.

31. Паразитология и инвазионные болезни животных. Под ред. проф. М.Ш.Акбаева, М: «Колос», 1998.

32. Патологическая анатомия. Курс лекций под редакцией В.В.Серова, М.А.Пальцева. М: Медицина, 1998, стр. 59.

33. Руководство по иммунологии. Под редакцией проф. О. Е. Вязова и проф. Ш. X. Ходжаева. М: «Медицина», 1973.

34. Степанова Н.И., Малахов А.Г. Усовершенствованный метод приготовления анаплазменного антигена. Тр. ВИЭВ, т. XXVIII, 1963, стр. 215-218.

35. Степанова Н.И. Действие ультразвука на антигенные свойства анаплазм. Тр.ВИЭВ, 1970, т. 38, стр. 90-95.

36. Учайкин В.Ф. Руководство по инфекционным болезням у детей. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА. 1998г.

37. Хейсин Е. М. Некоторые данные о строении Piroplasma bigemina и Piroplasma canis. // Паразитология. 1968. Т. 2., № 1. С. 77-82.

38. Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных. Сборник' научных трудов. — Новосибирск, 1997, стр. 38-40.

39. Якимов B.JT. Болезни домашних животных, вызываемые простейшими (Protozoa). М: Государственное издательство сельскохозяйственной и колхознокооперативной литературы. 1931.

40. Andersen А.С., Gee W. Normal blood values in the beagle. Vet. Med., 53:135, 1958.

41. Aikawa, M., and Antonovych, Т. Т.: Electron Microscopic Observations of Plasmodium berghei and Kupffer's Cells in the Liver of Rats. J. Parasitol., 50, (1964): 620-629.

42. Aikawa, M., and Sprinz, H.: Erythrophagocytosis in the Bone Marrow of Canary Infected with Malaria. Electron Microscope Observations. Lab. Invest., 24, (1970): 45-54

43. Andersen A.C., Schalm O.W. The beagle as an experimental dog. pp. 261-281. In Hematology. Andersen A.C., ed Iowa state university press, Ames, 1970.

44. Anderson J.F., Magnarelli L.A., Sulzer A.J. Canine babesiosis indirect fluorescent antibody test for North American isolate of B.gibsoni. Am. J. Vet. Res., 41, 1980, 2102-2105.

45. Atlas of hematology of the dog and cat. / P. Keller and U. Freudiger. Berlin; Hamburg: Parey, 1983.

46. Adachi K., Yoshimoto A., Hasegawa T et al. Anti-erythrocyte membrane antibodies detected in sera of dogs naturally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. (1992), 54(6): 1081-1084.

47. Adachi K., Makimura S. Changes in anti-erythrocite membrane antibody level of dogs experimentally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. (1992) 54(6): 1221-1223.

48. Adachi K., Makimura S. Changes in anti-erythrocyte membrane antibody level of dogs experimentally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. 54(6): 1221-1223, 1992.

49. Adachi K., Ueno C., Makimura S. Immunosuppression in dogs naturally infected with Babesia gibsoni. J. Vet. Med. Sci. 55(3): 503-505, 1993

50. Adachi K., Watanabe Т., Yamane S., Makimura S. Isolation of Babesia gibsoni piroplasms from infected erythrocytes of dogs. J. Vet. Med. Sci. 55(3): 487-490, 1993

51. Bradley O.C. Topographical anatomy of the dog. Edinburgh: Oliver and Boyd. 1935.

52. Bosson P.A., Pienaar J.C. Canine babesiosis: a report on the pathology of three cases with special reference "celebral" form. . Journal of the South African Veterinary Associations., 36:333341, 1965.

53. Bulgin M.S. et al. Hematologic changes to 4V2 years of age in clinically normal beagle. J. Amer. Vet. Med. Ass., 157:1064,1970.

54. Botros B.A.M., Moch R.W., Barsoum I.S. Some observations on Experimentally induced infecteion of dogs with Babesia gibsoni. Am. J. Vet. Res. (1975), 36(3): 293-296.

55. Bellamy J.E.C., MacWilliams P.S., Searcy G.P. Cold-agglutinin hemolytic anemia and Haemobartonella canis infection in a dog. J. Am. Vet. Med. Ass., (1978), 173(4):397-401.

56. Button C. Metabolic and electrolyte disturbances in acute canine babesiosis. J. Am. Vet. Med. Ass., 1979, 175:5 475-479.

57. Bobade P.A., Oduye O.O. Antibody titres in naturally occurring Babesia canis infections in dogs. Rev. Eiev. Med. vet. Pays, trop., 1986,39 (2): 185-188.

58. Bobade P.A., Oduye O.O. Aghomo H.O. Prevalence of antibodies against Babesia canis in dogs in an endemic area. Rev. Eiev. Med. vet. Pays, trop., 1989, 42 (2): 211-217.

59. Baneth G., Breitschwerdt E.B., Hegarty B.C., Pappalardo В., Ryan J. A survey of tick-born bacteria and protozoa in naturally exposed dogs from Israel. Veterinary Parasitology 74:133-142, 1998

60. Clinicopathologic principles for veterinary medicine / edited by W. R. Robinson and C. R. R. Huxtable, Cambridge, 1988.

61. Conrad P., Thomford J., Yamane I., Whiting J., et al., Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infection in dogs. . J. Vet. Med. Assoc., 199:601-605,1991.

62. Camacho A.T., Pallas E., Gestal J.J., Guitian F.J., Olmeda A.S. Babesia canis infections in a splenectomised dog. Bull Soc Pathol Exot, 94, p. 17-19,2001.

63. Camacho A.T., Pallas E., Gestal J.J., Guitian F.J., Olmeda A.S. Goethert H.K., Telford S.R. Infection of dogs in north-west Spain with a Babesia microti-like agent. The vet. Rec. 3, pp. 552-555, 2001.

64. Camacho A.T., Pallas E., Gestal J.J., Guitian F.J., Olmeda A.S. Natural infections by a Babesia microti-like piroplasm in a splenectomised dog. The vet. Rec. 23, pp. 381-382, 2002.

65. Dougherty J.H. and RosenblattL.S. Changes in the hemograme of the beagle with age. J. Gerontol., 20:131, 1965

66. Doxey D.L. Cellular changes in the blood as an aid to diagnosis. J. small animal pract., 7:77,1966

67. Dorner J.L. Clinical and pathologic features of canine babesiosis. J. Amer. Vet. Med. Ass., 154(6), 1969, 648-652.

68. Davis J.W., Anderson R.C. Parasitic diseases of wild mammals. The Iowa state university press, Iowa, U.S.A. 1971.

69. Eaton P. Piroplasma canis in Florida. J. of Parasit. 20:312-313, 1934.

70. Ederstrom H.E., DeBoer В., Changes in the blood of the dog with age. Anat. Rec., 94:663, 1946.

71. Ewing S.A. Evaluation of methods used to detect Babesia canis infections in dogs. Cornell Veterinarian, 56:211-220, 1965.

72. Ewing S.A. Method of reproduction of Babesia canis in erythrocytes, Am. J. Vet. Res., 26:112, 727-733; 1965

73. Earl F. L. The hemogram and bone marrow profile of normal neonatal, and weanling beagle dogs.' Lab. Anim. Sci., 23:690, 1973.

74. Farwell G.F., LeGrand E.K., Cobb C.C. Clinical observations on Babesia gibsoni and Babesia canis infections in dogs. J. Am. Vet. Med. Ass., 180(5):507-511.1982.

75. Freeman M.J., Kirby B.M., Panciera D.L., Henik R.A., Rosin E., . Sullivan L.J. Hypotensive-shock syndrome associated with acute

76. Babesia canis infections in a dog. J. Am. Vet. Med. Ass. 204:9496, 1994.

77. Graham-Smith G.S. Canine piroplasmosis. III. Morbid anatomy. Journal of Hygiene, 5:250-267, 1905.

78. Gilles H.M., Maegraith B.G. The liver in Babesia canis infection. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 47:426-430, 1953.

79. Henning M.W. Animal diseases in South Africa. South Africa: central news agency LTD., 1956.

80. Hagan W.A., Bruner D.W. The infections diseases of domestic animals. London: Bailliere, Findall & Cox, 1957.

81. Heneghan T. Hematological and biochemical variables in the greyhound. Vet. Sci. commun., 1:277, 1977

82. Harvey J.W., Taboada J., Lewis J.S. Babesiosis in a little of pups. J. Amer. Vet. Med. Ass., 192(12): 1751-1752, 1988.

83. Higuchi S., Simomura S., Yoshiba H., Kawamura S., Yasubo Y. Developed of Babesia gibsoni in the gut epithelium of the tick Haemaphysales longicornis. J. Vet. Med. Sci. (1991), 53(1):129-131.

84. Horak I.G. Ixodid tics collected at the Faculty of Veterinary Science, Onderstepoort, from dogs diagnosed with Babesia canis infections. Journal of the South African Veterinary Associations. 66:170-171, 1995.

85. Hauschild S., Shayan P., Stein E. Characterization and comparison of merozoite antigens of different B.canis isolates by serological and immunological investigations. Parasitol Res. (1995) 81:638642.

86. Ishimine Т., Nagasawa H., Suzuki N. An in vitro study of monocyte phagocytosis in the peripheral blood of healthy and Babesia-infected beagles. Jap. J. Vet. Sci. (1979), 41: 487-493.89Jain N.C. Veterinary hematology. Philadelphia, Lea & Febiger, 1986.

87. Jacobson L.S., Clark I. The pathophysiology of Canine babesiosis: new approaches to an old puzzle. Journal of the South African Veterinary Associations 65:134-145, 1994.

88. Jacobson L.S., Swan G.E. Supportive treatment of canine babesiosis. Journal of the South African Veterinary Associations. 66:95-105, 1995.

89. Jacobson L.S., Lobetti R.G., Vaughan-Scott T. Blood pressure changes in dogs with babesiosis. Journal of the South African Veterinary Associations., 71:14-20, 2000.

90. Lewis R.M. A syndrome of autoimmune hemolytic anemia and thrombocytopenia in dogs. Proc. Annu. Meeting Amer. Vet. Med. Ass., (1963), 100:140.i

91. Lund J.E. Hemaglobin crystals in canine blood. Amer. J. Vet. Res., 35:575, 1974

92. Lee et. al. Blood volume changes and production and destruction of erythrocytes in newborn dogs. Amer. J. Vet. Res., 37:561,1976

93. Lewis B.D., Penzborn B.L., Lopez-Rebollar L.M. Immune responses to South African Babesia canis and the development of a preliminary vaccine. Journal of the South African Veterinary Associations., 66:61-65, 1995.

94. Lewis B.D., Penzborn B.L., Lopez-Rebollar L.M. Isolations of South African vector-specific strain of Babesia canis. Vet. Parasitol. 63:9-16, 1996.

95. Lobetti R.G. and Reyers F. Met-haemoglobinuria in occurring Babesia canis infection. J. of the South Afr. Vet. Ass. (1996), 67(2):88-90.

96. Mcllvane J. P, McCampbell E. F. Infectious jaundice due to piroplasma commune. Centralblat fur bacteriologie, parasitenkunde und infektionskrankheiten. 47(1908) 592-608.

97. Maegraith В., Gilles H.M., Devakul K. Pathological processes in Babesia canis infections. Trop. Med. Parasitol., 8:485514,1957.

98. Michaelson S. M. et al.; The blood of the normal beagle. J. Amer. Vet. Med. Ass., 148:532, 1966.

99. Maronpot R.R., Guindi E. Preliminary study of Babesia gibsoni Patton in wild carnivores and domesticated dogs in Egypt. Am. J Vet. Res., 31(4): 797 799, 1970.

100. Moore D.J. Williams M.C. Disseminated intravascular coagulation: a complication of Babesia canis infections in the dog. Journal of the South African Veterinary Associations., 50:265275, 1979.

101. Mehlhorn H. The life cycles of piroplasms and related groups. / Proceedings of fifth international congress of parasitology held in Toronto, Canada, on 7-14 august, 1982// Editors D. F. Mettrick and S. S. Desser Elsevier biomedical press

102. Amsterdam New York - Oxford, 53-56. (жизненный цикл бабезий).

103. Mimori Т., Kono I., Sakamoto Т., Yasuba N. Morphological studies of multiplication of Babesia gibsoni in canine erythrocytes. Jpn. J. Vet. Sci. (1982), 44(4):669-701.

104. Mehlhorn H., Schein E. The piroplasms: life cycle and sexual stages. Adv. Parasitol. 23:37-103, 1984.

105. Martinod S., Brossard M., Moreau. Immunity of dogs against Babesia canis, its vector tics Dermacentor reticulatus, and Ixodes ricinus in endemic area. J. Parasitology., 71(3),1985, pp. 269-273.

106. Martinod S., Laurent N., Moreau Y. Resistance and immunity of dogs against Babesia canis in an endemic area. Vet. Parasitol., 19(1986): 245-254.

107. Matthewman L.A., Kelly P.J., Bobade P.A., Tagwira M., Mason P.R., Majok A. Brouqui P., Raoult D. Infections with Babesia canis and Ehrlichia canis in dogs in Zimbabwe. Vet. Rec., 2,344-346,1993.

108. Mehlhorn H., Schein E. The piroplasms: "A long story in short" or "Robert Koch has seen it". Europ. J. Protistol. 29:279293, 1993.

109. Murase Т., Hashimoto Т., Ueda Т., Maede Y. Multiplication infected dogs: the different in the activity between self and nonself red blood cells. J. Vet. Med. Sci. 55(2): 203-206, 1993

110. Morita Т., Saeki H., Imai S., Ishii T. Reactivity of anti-erythrocyte antibody induced by Babesia gibsoni infection against aged erythrocytes. Veterinary Parasitology 58 (1995) 291-299.

111. Piercy S.E. Hyper-acute canine babesia. The veterinary record., 59(44): 612-613, 1947.

112. Porter J.A., Canaday W.R. Hematologic values in mongrel and greyhound dogs being screened for research. J. Amer. Vet. Med. Ass., 159:1603,1971

113. Pharles F. Simpson. Phagocytosis of Babesia canis by Neutrophils in the Peripheral Circulation. J. Amer. Vet. Med. Ass., 53(6):1105-1110., 1974.

114. Pinkerton P.H. Hereditary stomatocytosis with hemolytic anemia in the dog. Blood, 44:557,1974

115. Robinson F.R. Ziegler R.F. Clinical laboratory values of beagle dogs. Lab. Anim. Care,, 18:39, 1968

116. Reece W.O., Snodgrass R.R. Effect of splenectomy in postfeeding changes in packed cell volume of dog. Amer. J. Vet. Res., 33:635, 1972

117. Ristic M. Babesiosis of domestic animals and man. Boca Raton, Florida, 1988.

118. Reyers F., Leisewitz A.L., Lobetti R.G., Milner R.J., Jacobson L.S. Canine babesiosis in South Africa: more that one disease. Does this serve as a model for falciparum malaria? Annals of tropical medicine and parasitology, Vol.92 №4 (1998) 489-502

119. Sanders D.A.: Observations on canine babesiasis (pyroplasmosis). J. Am. Vet. Med. Ass., 1937, 43:1, 27-40

120. Seneviratna P. Studies of Babesia gibsoni (Patton, 1910) infections in the dogs. Brit. Vet. J. (1965), 121: 263-271.

121. Simpson, C. F., Kling, J. M., and Love, J. N.: Morphology and Histochemical Nature of Anaplasma marginale. Am. J. Vd Res., 28,(1967): 1055-1065.

122. Simpson, C. F.: Electron Microscopic Comparison Babesia spp. and Hepatic Changes in Ponies and Mice. Am. J Vet. Res., 31, (1970): 1763-1768.

123. Shifrine M. et al.: Hematologic changes to 60 days of age in clinically normal beagles. Lab. Anim. Sci., 23:894, 1973.

124. Schetters Th.P.M., Kleuskens J.A.G.M., Scholtes N.C. et al. Vaccination of dogs against Babesia canis infection using antigens from culture supernatants with emphasis on clinical babesiosis. Veterinary Parasitology (1994), 52:219-233.

125. Schetters P.M., Scholtes N.C., Kleuskens J.A.G.M., Bos H.J. Strain variation limits protective activity of vaccines based on soluble Babesia canis antigens. Parasite immunology, 1995, 17: 215-218.

126. Schetters Th.P.M., M.Kleuskens J.A.G., Scholtes N.C. et al. Vaccination of dogs against Babesia canis infection. Veterinary Parasitology (1997), 73:35-41.

127. Schetters Th. P. M., Moubri K., Precigout E. et al. Different babesia canis isolates, different diseases. Parasitology. (1997), 115,485-493.

128. Schetters P.M., Scholtes N.C., Kleuskens J.A.G.M., Bos H.J. Not peripheral parasitaemia but the level of soluble antigen in plasma correlates with vaccine efficacy against Babesia canis. Parasite immunology 18, 1-6, 1999.

129. Schetters P.M., Scholtes N.C., Kleuskens J.A.G.M., Gorenflot A., Moubri K., Vermeulen A.N. Vaccination of dogs against heterologous Babesia canis infection using antigens from culture supernatants. Veterinary Parasitology 100 (2001), 75-86.

130. Taylor J.H., Guthrie A.J., Van Der Walt J.G., Leisewitz A. The effect of Babesia canis induced haemolysis on the canine haemoglobin oxygen dissociation curve. J. S. Afr. Vet. Ass.(1993), 64(4): 141-143.

131. The Merk Manual. Под редакцией Robert Berkow, M: «Мир», 1997, стр. 788-790.

132. Uilenberg G., Franssen F.F.J., Perie N.M., and Spanjer A.A.M. Three groups of Babesia canis distinguished and a proposal for nomenclature. The veterinary quarterly. (1989), 11(1): 33-40.

133. Vercammen F., R. De Deken, Maes L. Duration of protective immunity in experimental canine babesiosis after homologous and heterologous challenge. Veterinary Parasitology. 68(1997) 51-55.

134. Walter S., Mehlhorn H., Zweygarth E., Shein E.: Electron microscopic investigations on stages of dog piroplasms cultured invitro: Asian isolates of Babesia gibsoni and strain of B. canis from France and Hungary., Parasitol Res., (2002), 88:32-37

135. Yamane I., Thmford J.W., Gardner I.A., Dubey J.P., Levy M., Conrad P.A., Evaluation of the indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Babesia gibsoni infections in docs. Amer. J. Vet. Res., 54(10): 1579-1584, 1972

136. Yonamine H., Ichici H., Hamakawa M., Shimabukuro Т., Sugiyama M., Isoda M. Studies on canine babesiosis in Okinawa Island, The Jap. J. of Vet. Sci., 46:4, 511-518, 1984.

137. Yamane I., Conrad P.A., Gardener I.A. Babesia gibsoni infections in dogs. J. Protozool. Res. 3:11-125, 1993.

138. Zwart D., Brocklesby D.W. Babesiosis: non-specific resistance, immunological factors and pathogenesis. Adv. Parasitol. 17:49-113,1979.

139. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ И КОНТРОЛ Ю АНТИГЕНОВ ИЗ B.CANIS ДЛЯ РДСК.

140. Исходным материалом для получения антигенов является кровь больных животных (собак), зараженных соответствующим возбудителем.

141. Для получения выраженной паразитарной реакции животных спленэктомируют. На высоте паразитемии (не менее 50% пораженных эритроцитов) животное обескровливают, но не позднее 5.6 дней с момента операции, чтобы избежать антикомплементарности антигена.

142. Кровь берут из яремной вены в стерильную сосуды, содержащие ; натрия цитрат из расчета 50 мл 20%-ного натрия цитрата на 2 литра крови. Дальнейшею обработку крови проводят в день её взятия.

143. На специфичность антиген проверяют с сыворотками животных, перенесших болезни непротозойной природы.

144. Компоненты Разведение антигена контрольреакции 1:2 1:4 1:8 1:6 1:32 1:64 1:128

145. Антиген одно разведение 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

146. Сыворотки 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

147. Комплемент 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

148. Холодильник при температуре +2-4°С на 18-20 часов, затемпри комнатной температуре 30 минут.1. Гемолитическая0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2система

149. Водяная баня при 37-38°С 20 минут, затем холодильник при2.4°С на 4-5 часов.

150. Учет реакции производится по степени гемолиза. По этой схеме ставят реакцию и с остальными разведениями сыворотки.

151. Для контроля антигена используют ряд пробирок с физиологическим раствором (по 0,1мл) вместо сыворотки, в которые добавляют те же компоненты.

152. Рабочий титр антигена определяют по сыворотке низкого титра. Обычно он соответствует двойной или тройной дозе предельного титра (в данном случае 1:16).

153. Приготовленную серию антигена лиофилизируют или разливают во флаконы и хранят в морозильной камере бытового холодильника.

154. Примерный результат реакции

155. Разведения Разведение антигена б/асывороток 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

156. Позитивная сыворотка: 1:5 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+1:10 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 1:20 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ + 1:40 4+ 4+ 3+ 2+ + -

157. Нормальная сыворотка 1:5 Физиологический раствор - - - - - -

158. ПОСТАНОВКА И УЧЕТ РЕАКЦИИ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК) С АНТИГЕНАМИ В. CANIS.

159. Реакцию ставят в объеме 0,5 .мл (по 0,1мл каждого компонента) в пробирках 10-12X120 мм.1. Компоненты реакции

160. Антиген (лиофилизированный) с наполнителем из сахарозы и карбоксиметилцеллюлозы. Имеет вид пористой таблетки, хорошо растворим в физиологическом растворе, хранится при плюс 2-4°С. Используют в рабочем титре, указанном на этикетке ампулы.

161. Испытываемые и контрольные (позитивная и нормальная) сыворотки животных в разведеннии 1:5, инактивированные при 58-59°С в течение 30 мин в день постановки реакции.

162. Комплемент сыворотка морской свинки (свежая или лиофилизированная).

163. Гемолитическая сыворотка гемолизин, выпускаемый биопромышленностью. В реакции используют тройной титр гемолизина.

164. Эритроциты барана, отмытые 3 раза физиологическим раствором путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят 2%-ную взвесь в физиологическом растворе.

165. Перед постановкой реакции взвесь эритроцитов и гемолизин, разведенный в тройном титре, смешивают в равных объемах (гемолитическая система) и выдерживают 20 мин при температуре 37°С для сенсибилизации эритроцитов.

166. Нативный комплемент перед титрованием разводят физиологическим раствором в соотношении 1:30 (0,1 мл комплемента + 2,9 мл физиологического раствора). Сухой комплемент разводят в соотношении 1:20 (0,1 мл комплемента + 1,9 мл физиологического раствора)

167. Водяная баня при 37.38°С- 10.15 минрезультат нг нг чг пг пг пг пг пг пг пг

168. Примечание: НГ нет гемолиза

169. ЧГ частичный гемолиз ПГ - полный гемолиз

170. Титром является наименьшее количество разведенного 1:30 (1:20) комплемента, который дает полный гемолиз эритроцитов. В приведённом примере титр равен 0,04. Для реакции берут 2 дозы, т.е. 0,08.

171. Расчет количества комплемента необходимого для главного опыта делают по формуле: АХБ------------- = хВ1. Где:

172. А рабочая доза комплемента, Б — количество пробирок в реакции, В - разведение комплемента, Х- количество чистого комплемента.1. Пример: 0,8 X 100-------------- = 0,420

173. Так как общий объем разведенного комплемента, необходимого для 100 пробирок, равен 10 мл (100X0,1мл), то к 0,4 мл чистого комплемента следует добавить 9,6 мл физиологического раствора.1. Главный опыт.

174. Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 с антигеном и без антигена.

175. Для контроля в реакцию берут 2 позитивные (бабезийные) и 2 негативные (нормальные) сыворотки в разведении 1:5.

176. Одновременно ставят контроль антигена на антикомплементарность (антигена 0,2 + комплемента 0,1 + гемолитической системы 0,2) и на гемотоксичность (антигена 0,1 мл + физиологического раствора 0,2 мл + 0,2 гемолитической системы).1. Схема главного опыта.

177. Компонент Пробирки для каждой сыворотки Контроль Контроль гемолитиреакции 1 ? антигена ческойсистемы1. Испытуемая 0,1 0,1 сыворотка Физиоло- гический раствор (0,85%) Антиген в — 0,1 0,2рабочем 0,1 0,2 0,1титре

178. Комплемент 1:30 0,1 0,1 0,1 (1:20)

179. После чего пробирки ставят в холодильник при температуре 2.4°С на 18.20 часов, а затем на 30 мин при комнатной температуре.

180. Гемолитическая 0,2 0,2 0,2 0,2 системаводяная баня при 37.38°С 10. 15 мин в зависимости от прохождения контролей. Холодильник при 2.4°С на 4.5 часов.

181. Примечание: позитивные и негативные сыворотки (контроли) испытывают по схеме главного опыта.