Разработка промышленных технологий очистки рекомбинантных белков: гормона роста человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Кононова, Наталья Вячеславовна

• Кононова, Наталья Вячеславовна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кононова, Наталья Вячеславовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Характеристика выделяемых объектов.

1.1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.

1.1.1. Функции.

1.1.2. Структура.

1.1.3. Секреция и механизм действия.

1.1.4. Применение препарата рчГ-КСФ в медицинской практике.

1.2. Соматотропин.

1.2.1 Функции.

1.2.2. Структура.

1.2.3. Секреция и механизм действия.

1.2.4. Свойства рекомбинантного ГРЧ.

1.2.5. Применение препарата ГРЧ в медицинской практике.

2. Солюбилизация и ренатурация эукариотических белков, экспрессируемых в Е. coli в виде телец включения.

2.1. Введение.

2.2. Характеристика телец включения.

2.3. Фолдинг белков в живой клетке.

2.4. Промежуточные состояния и их роль в образовании агрегированных форм белка.

2.5. Ренатурация белков in vitro.

2.6. Методы солюбилизации и ренатурации белков, формирующих тельца включения.

2.6.1. Традиционные методы.

2.6.2. Методы, позволяющие улучшить проведение процесса ренатурации белка, полученного из телец включения.

2.6.3. Новейшие методы солюбилизации белков, позволяющие добиться высокого выхода белка после ренатурации.

3. Требования зарубежных фармакопей к фармацевтическим генноинженерным препаратам.

3.1. Введение.

3.2. Определяемые примеси и методы контроля.

3.3. Эндотоксины.

3.3.1. Методы определения эндотоксинов.

3.3.2. Взаимодействие эндотоксинов с белками.

3.3.3. Методы удаления эндотоксинов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Оборудование, реактивы, сорбенты.

2. Методы.

2.1. Аналитические методы.

2.2. Препаративные методы.

3. Математические расчеты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Оптимизация процесса ренатурации Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

1.1. Введение.

1.2. Солюбилизация в мягких условиях (Схема 1).

1.3. Солюбилизация в жестких условиях (Схема 2).

1.4. Масштабирование процесса ренатурации.

2. Подбор условий очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

2.1. Ионообменная хроматография.

2.1.1. Исследование влияния рН и размера частиц сорбента на процесс ИОХ.

2.1.2. Определение динамической емкости сорбента.

2.1.3. Определение рабочей скорости проведения ИОХ.

2.2. Оценка чистоты Met- рГРЧ и рчГКСФ после ИОХ.

2.3. Подбор условий отщепления N-концевого метионина от Met-рГРЧ.

2.4. Гидрофобная хроматография.

2.5. Масштабирование процессов очистки.

3. Анализ качества выпускаемых препаратов.

3.1. Анализ рГРЧ.

3.2. Анализ рчГКСФ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка промышленных технологий очистки рекомбинантных белков: гормона роста человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора»

Актуальность исследования.

Получение лекарственных препаратов с помощью методов генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Возможность получения фармацевтических генно-инженерных белков в промышленности дает следующие преимущества: отсутствие ограничений по источнику сырья и низкая себестоимость конечного продукта.

В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из природных источников, на их рекомбинантные аналоги. Такие препараты, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня успешно применяются в медицинской практике. Способы получения инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста человека, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, окситоцина и др. были запатентованы в разных странах. Они характеризуются различными способами экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовой вариабельностью и видовым разнообразием продуцирующих культур, способами очистки и качеством самих препаратов. Однако в России, по ряду причин, отсутствуют как собственные технологии получения многих, из перечисленных выше, терапевтических препаратов, а имеющиеся инновационные разработки не внедрены в производство.

Одним из путей быстрого развития биофармацевтической промышленности является производство дженериков - лекарственных препаратов, срок действия патентной защиты на которые уже закончился. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях ОМР, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми.препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.

Цель исследования:

Целью диссертационной работы являлась разработка технологий получения и очистки рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения для организации полномасштабного промышленного производства активных фармацевтических субстанций.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать условия проведения процессов солюбилизации и ренатурации рГРЧ и рчГ-КСФ в различных условиях.

2. Подобрать условия, позволяющие оптимально осуществить хроматографическую очистку рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения на промышленных сорбентах.

3. Подобрать условия ферментативного отщепления Ы-концевого метионина от Ме^рГРЧ.

4. Выявить критерии, определяющие масштабирование процессов получения рГРЧ и рчГ-КСФ.

5. Масштабировать процессы получения рГРЧ и рчГ-КСФ в условиях опытно-промышленного производства.

6. Провести сравнительную оценку качества полученных препаратов с импортными аналогами.

Научная новизна полученных результатов

1. Впервые, для ренатурации белков, Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ, был применен пероксид водорода, который позволяет быстро и эффективно проводить процесс при высокой концентрации белка.

2. Установлено, что применение Си804 в процессе ренатурации осложняет очистку белков от эндотоксинов.

3. Выявлена новая, ранее нигде не опубликованная структурная модификация рГРЧ, связанная с преобразованием дисульфидной связи

11 СО

Суэ -Суэ в тиоэфирную при рН 12.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 150 г субстанций рГРЧ за один производственный цикл.

2. Разработанный технологический процесс производства рГРЧ используется для производства лекарственного препарата «Растан».

3. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 100 г субстанции рчГ-КСФ за один производственный цикл.

4. Разработанный технологический процесс производства рчГ-КСФ используется для производства лекарственного препарата «Нейпомакс».

Список опубликованных научных работ по теме диссертации:

1. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, Т.И. Костромина, Т.Д. Мелихова, A.A. Вайнсон, Е.В. Свешникова, A.A. Зинченко, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили: Разработка и оптимизация технологического процесса получения субстанции филграстима // Биотехнология.—2009.— № 5.—С.24 - 32.

2. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, С.А. Косарев, Г.О. Кожевников, A.B. Демин, Д.И. Баирамашвили, А.И. Мирошников // Опытно-промышленная технология получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека.—Биотехнология.—2008.—№ 5.—С.ЗЗ - 42.

3. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Т.Г. Галкина, Д.И. Баирамашвили: Сравнительный анализ качества российского препарата РАСТАН с зарубежными аналогами ГЕНОТРОПИН и ХУМАТРОП // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме Биофарма 2009 —2009.—Турция.—С. 19.

4. Н.В. Кононова, А.И. Бобрускин, И.А. Пучков, Д.И. Баирамашвили: Технология производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в промышленных масштабах // Тезисы научных докладов на Международной школе-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетики.—2008.—Москва.—С.49.

5. А.И. Бобрускин, Н.В. Кононова, Д.И. Баирамашвили: Промышленная технология производства рекомбинантного гормона роста // Тезисы научных докладов на IV Московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития.—2007.—Москва.—С.85.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Кононова, Наталья Вячеславовна

выводы.

1. Подобраны оптимальные условия солюбилизации, ренатурации и хроматографической очистки Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения.

2. Оптимизированы условия отщепления метионина от 1М-концевой части Ме^рГРЧ лейциновой амнопептидазой Аеготопаэ рго1ео1уиса. Показано, что отщепление метионина происходит полностью, без образования побочных продуктов.

3. Проведены масштабирование и валидация каждого технологического процесса и сформулированы основные универсальные подходы к масштабированию хроматографических методов очистки рекомбинантных белков.

4. Разработана общая технологическая схема выделения двух препаратов рГРЧ и Г-КСФ, которая стандартизует процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями вМР.

5. Показано, что выделяемые белки соответствуют фармакопейным требованиям и не уступают в качестве импортным аналогам.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность руководителям работы: д.х.н., профессору В. И. Швецу; д.х.н. Д. И. Баирамашвили; начальнику цеха экспериментальной ферментации ОБП ИБХ РАН Т. И. Костроминой; с.н.с лаборатории протеомики ИБХ РАН, к.б.н P. X. Зиганшину за помощь в проведении масс-спектрометрического анализа; руководителю лаборатории лучевых методов лечения опухолей, д.б.н. А. А. Вайнсону за помощь в проведении экспериментов по выявлению специфической активности препаратов; всех сотрудников ЗАО «Мастерклон» за помощь в проведении экспериментальных исследований; доценту кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, к.х.н Ю. Г. Кирилловой; доценту кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, к.х.н О. В. Есиповой; с.н.с. лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, к.х.н. Р. С. Есипову, руководителю отдела сервиса GE Healthcare А.Н. Веретенникову и заведующему центра коллективного пользования ГосНИИгенетики, к.т.н. Е. И. Кандыбе за консультации во время проведения работы и написания диссертации.

Отдельно автор выражает глубокую признательность и особую благодарность заведующему лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, академику РАН, д.х.н А. И. Мирошникову за всестороннее участие и поддержку в работе; профессору, чл.-корр. РАН д.х.н. Е. В. Гришину за помощь в приобретении опыта и знаний в области молекулярной биологии, белковой химии и хроматографии во время работы в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кононова, Наталья Вячеславовна, 2010 год

1. River, Andrew V. Turnbull and Catherine L.: Regulation of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis by Cytokines: Actions and Mechanisms // Physiological reviews — 1999.—V.—P. 61-71.

2. Avalos B.R.: Molecular analysis of the granulocyte colony-stimulating factor receptor//Blood.—1996.—Aug.—'V. 88(3).—P. 761 777.

3. Motojima H., Kobayashi Т., Shimane M. et al.: Quantitative enzyme immunoassay for human granulocyte colonystimulating factor (G-CSF) // J. Immunol. Methods.— 1989.— Vol. 31.— 118(2).—P. 187 192.

4. Козлов В. А.: Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: физиологическая активность, патофизиологические и терапевтические проблемы // Цитокины и воспаление.—2004.— Т. 3.—№ 2. С. 315.

5. Nicola N.A, Metcalf D.: The colony-stimulating factors and myeloid leukemia // Cancer Surv.—1985.—V. 4(4).—P. 789 815.

6. Emerson S.G., Sieff C.A., Wang E.A., Wong G.G., Clark S.C., Nathan D.G.: Purification of fetal hematopoietic progenitors and demonstration of recombinant multipotential colony-stimulating activity // J Clin Invest.— 1985.—V. 76(3).—P. 1286-1290.

7. Ki Jun Jeong and Sang Yup Lee: Secretory Production of Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor in Escherichia coli // Protein Expression and Purification.—2001 .—V. 23.— P. 311 318.

8. Kubota N., Orita Т., Hattori K.: Structural characterization of natural and recombinant human granulocyte colony-stimulating factors // J Biochem.— 1990.—V. 107.—P. 486 492.

9. Lu H.S., Boone T.C., Souza L.M., Lai P.H.: Disulfide and secondary structures of recombinant human granulocyte colony stimulating factor // Arch Biochem Biophys.— 1989.—Jan.—V. 268(1).—P. 81-92.

10. Asano S.: Human granulocyte colony-stimulating factor: its basic aspects and clinical applications // Am J Pediatr Hematol Oncol.— 1991.—V. 13(4).—P. 400-413.

11. Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto O., Hirata Y., Kubota N., Oheda M., Nomura H., Yamazaki Т.: The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor // EMBO J.— 1986.—Mar;5(3).—P. 575 581.

12. Higuchi M., Oh-eda M., Kuboniwa H., Tomonoh K., Shimonaka Y., Ochi N.: Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin // J. Biol. Chem.—1992.—V. 267.—P. 7703 7709.

13. Gervais, V., Zerial, A., Oschkinat, H.: NMR investigations of the role of the sugar moiety in glycosylated recombinant human granulocyte-colony stimulating factor // Eur. J. Biochem.—1997.—V. 247—P. 386 395.

14. Lovejoy В., Choe S., Cascio D., McRorie D.K, DeGrado W.F., Eisenberg D.: Crystal structure of a synthetic triple-stranded alpha-helical bundle // Science.—1993.—Feb 26.—V. 259(5099).—P. 1288 1293.

15. Lovejoy B, Cascio D, Eisenberg D.; Crystal structure of canine and bovine granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) // J Mol Biol.— 1993.—Dec 5.—V. 234.—No.3 .—P. 640 653.

16. Wells J.A., Vos A.M.: Hematopoietic receptor complexes // Annu Rev Biochem.—1996.—V. 65.—P. 609 613.

17. Румянцев C.A., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г.: Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток // Вопросы гематологии, онкологии и иммунологии в педиатрии.—2003.— Т. 2,—№ 4.—С. 5 9.22,2324,25