Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2a и альфа-2b тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Шамонов, Николай Алексеевич

• Шамонов, Николай Алексеевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Шамонов, Николай Алексеевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Интерферон. Общие сведения

1.2. Структура интерферона альфа-2

1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2

1.4. Активация синтеза интерферона в клетках

1.5. Рецепторы интерферона альфа

1.6. Сигналы, вызванные действием интерферона на клетку

1.7. Клиническое применение интерферона

1.7.1. Общая информация

1.7.2. Терапия хронического гепатита В

1.7.3. Терапия хронического гепатита С

1.7.4. Терапия волосоклеточной лейкемии

1.7.5. Терапия саркомы Капоши

1.8. Требования качества к интерферон - содержащим препаратам

1.9. Недостатки использования нативного интерферона альфа-2

1.10. Создание лекарственных препаратов с пролонгированным дей- 28 стви-

ем

1.10.1. Способы пролонгирования действия белковых молекул

1.10.2. Пегилирование. Общая информация

1.10.3. Химия пегилирования

1.10.3.1. Активированные ПЭГ первого поколения

1.10.3.2. Активированные ПЭГ второго поколения

1.10.3.2.1. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 37 аминогрупп

1.10.3.2.2. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 39 цистеинов

1.10. 3.2.3. Активированные ПЭГ второго поколения для модицифкации 40 окисленных карбогидратов

1.10.3.3. Реверсивное пегилирование

1.10.3.4. Гетерофункциональные активированные ПЭГ

1.10.4. Структура активированных ПЭГ

1.10.5. Влияние пегилирования на физико - химические и 43 биологические свойства белковых молекул

1.10.5.1. Влияние на гидрофилыюсть, молекулярный вес и гидродина- 44 мический радиус

1.10.5.2. Влияние на конформацию

1.10.5.3. Влияние на заряд

1.10.6. Клиренс пегилированных препаратов

1.10.7. Токсичность ПЭГ

1.10.8. Критические параметры реакции пегилирования. Очистка пеги- 49 лированных белков

1.10.8.1. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидродина- 50 мическом радиусе

1.10.8.2. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидро- 52 филыюсти

1.10.8.3. Очистка пегилированных белков за счет разницы в заряде мо- 53 лекулы

1.10.9. Примеры использования пегилированных препаратов в меди- 54 цине

1.10.10. Пегилированный интерферон альфа-2 - различные стратегии

1.10.10.1. Пегилированный интерферон альфа-2Ь (ПЕГИНТРОН)

1.10.10.2. Пегилированный интерферон альфа-2а (ПЕГАСИС)

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.1. Материалы

2.1.2. Аналитические методы

2.1.2.1. Гельфильтрация на сорбенте Superóse

2.1.2.2. Ионообменная хроматография на сорбенте TSKgel SP-5PW

2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии

2.1.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии

лаурилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих

условиях) с окраской нитратом серебра

2.1.2.5. Определение специфической активности

2.1.3. Препаративные методы

2.1.3.1. Растворение телец включения предшественника интерферона 68 альфа-2

2.1.3.2. Процесс ренатурации интерферона альфа-2

2.1.3.3. Предварительная очистка интерферона альфа-2 методом катио- 69 нообменной хроматографии на сорбенте СМ ЗерЬагоБе РР

2.1.3.4. Процесс тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катио- 70 нообменной хроматографии на сорбенте УМС Вюрго Б30

2.1.3.5. Процесс концентрирования интерферона альфа-2 методом кати- -70 онообменной хроматографии на сорбенте СМ БерИагозе РР

2.1.3.6. Перевод очищенного интерферона альфа-2 в буфер хранения 71 методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте 8ирегс1ех

2.1.3.7. Процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь

2.1.3.8. Процесс пегилирования интерферона альфа-2а

2.1.3.9. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа- 73 2Ь

2.1.3.10. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа- 73 2а

2.1.3.11. Процесс концентрирования пегилированного интерферона 74 альфа-2 на сорбенте МасгоСар 8Р

2.1.3.12. Перевод очищенного монопегилированного интерферона аль- 74 фа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии

на сорбенте БерИас^х в25

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1. Разработка технологии ренатурации телец включений интерферо- 75 на альфа-2

2.2.1.1. Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерфе- 76 рона альфа

2.2.1.2. Исследование влияния окисляющих и восстанавливающих аген- 78 тов на процесс ренатурации

2.2.1.3. Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации

2.2.1.4. Исследование влияния ионной силы раствора, концентрации 82 хаотропного агента и значения рН на процесс ренатурации

2.2.1.5. Исследование влияния дополнительных компонентов на про- 84 цесс ренатурации

2.2.1.6. Определение оптимальной нагрузки телец включений на рена- 85 турационный буфер

2.2.1.7. Определение оптимальной продолжительности процесса рена- 86 турации

2.2.1.8. Масштабирование оптимизированного процесса ренатурации

2.2.2. Разработка технологии очистки интерферона альфа-2

2.2.2.1. Разработка стадии предварительной очистки интерферона аль- 88 фа-2

2.2.2.2. Разработка стадии тонкой очистки интерферона альфа-2

2.2.2.3. Стадия концентрирования интерферона альфа-2

2.2.2.4. Стадия перевода интерферона альфа-2 в буфер хранения

2.2.3. Разработка технологии пегилирования и дальнейшей очистки ин- 100 терферона альфа-2а и альфа-2Ь

2.2.3.1. Разработка процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь

2.2.3.1.1. Оптимизация значения рН реакционного буферного раствора

2.2.3.1.2. Исследование кинетики реакции пегилирования интерферона 105 альфа-2Ь, определение оптимальной температуры

2.2.3.1.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирова- 107 ния

2.2.3.1.4. Оптимизация соотношения белок - ПЭГ в реакционном буфе-

ре

2.2.3.1.5. Определение оптимальной концентрации интерферона альфа- 110 2Ь в реакционном буфере

2.2.3.2. Разработка технологии очистки монопегилированного безмети- 112 онинового интерферона альфа-2Ь

2.2.3.2.1. Очистка методом тангенциальной фильтрации

2.2.3.2.2. Очистка пегилированного интерферона альфа-2 методом гель- 113 фильтрации

2.2.3.2.3. Очистка методом гидрофобной хроматографии

2.2.3.2.4. Очистка монопегилированного интерферона альфа-2Ь мето- 116 дом катионообменной хроматографии

2.2.3.2.5. Концентрирование монопегилированного интерферона альфа- 120 2Ь

2.2.3.2.6. Перевод монопегилированного интерферона альфа-2Ь в буфер 121 хранения

2.2.3.2.7. Сравнение полученного препарата монопегилированного ин- 122 терферона альфа-2Ь с коммерческим препаратом Пегинтрон

2.2.3.3. Разработка технологии пегилирования интерферона альфа-2а

2.2.3.3.1. Влияние значения рН на процесс пегилирования интерферона 124 альфа-2а

2.2.3.3.2. Изучение кинетики процесса пегилирования интерферона 126 альфа-2а, определение оптимальной температуры процесса

2.2.3.3.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирова- 127 ния

2.2.3.3.4. Исследование влияния концентрации интерферона на процесс 128 пегилирования

2.2.3.3.5. Определение оптимального соотношения белок - ПЭГ

2.2.3.3.6. Изучение влияния структуры растворителя на процесс пеги- 130 лирования интерферона альфа-2а

2.2.3.4. Разработка технологии очистки монопегилированного интерфе- 133 рона альфа-2а

2.2.3.5. Сравнение полученного препарата монопегилированного ин- 136 терферона альфа-2Ь с коммерческим препаратом Пегасис

2.2.4. Масштабирование технологии получения субстанции пегилиро- 137 ванного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, валидация процессов

2.2.5. Исследование стабильности полученных препаратов пегилиро- 139 ванного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь

2.2.6. Экономическая эффективность процесса производства пегилиро- 140 ванных форм интерферона

3.ВЫВОД Ы

4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ 142 РЕЗУЛЬТАТОВ

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ 142 ВЫВОДОВ

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка промышленной технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2a и альфа-2b»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. На сегодняшний день мир сталкивается все с новыми вызовами, связанными с распространением тяжелых вирусных заболеваний. Только от хронического гепатита С в мире ежегодно умирают около 500 тыс. человек . В Российской Федерации по официальной статистике число больных хроническим гепатитом В и С составляет около 5,35 млн. человек, общее число носителей около 9 млн [139].

Значительную проблему представляет и распространение вирусных заболеваний у различных видов животных. К примеру, в случае молодняка крупного рогатого скота значительную опасность представляет вирусная диарея, падеж от которой составляет 30 - 50 % [34]. Не меньшую опасность представляют и другие вирусные заболевания: ящур, везикулярный стоматит, герпес, гепатит и т.д.

Классическим подходом к терапии вирусных заболеваний считается терапия интерфероном альфа. Интерферон альфа - это цитокин, синтезируемый в основном лейкоцитами и моноцитами в ответ на проникновение инфекции [12].

Однако, терапия гепатита нативным интерфероном не в полной мере эффективна и безопасна из-за недостатков, присущих всем препаратам на основе натив-ных белковых молекул: малое время полужизни в крови пациента, высокая имму-ногенность, большой объем распределения препарата в организме пациента и т.д [62]. Обозначенные недостатки были нивелированы за счет создания пролонгированных форм интерферона - пегилированного интерферона альфа-2Ь (препарат Пегинтрон, 2000 г) [122] и пегилированного интерферона альфа-2а (препарат Пе-гасис, 2001 г) [10]. Важно отметить, что обозначенные препараты созданы на основе интерферона альфа без N - концевого метионина, что так же повышает их эффективность. Препараты пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь получили широкое распространение при терапии больных с вирусом гепатита С.

Пегинтрон и Пегасис входят в список жизненно важных лекарственных

средств и востребованы в больших объемах. При этом в Российской Федерации не

производятся. По этой причине разработка отечественной технологии промыш-

7

ленного производства субстанций интерферона альфа-2Ь и альфа-2а без N - концевого метионина и дальнейшего получения на их основе пегилированных форм путем ковалентной сшивки с молекулами ПЭГ является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования являлась разработка промышленной технологии производства субстанции нативных (без N -концевого метионина) и пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести оптимизацию процесса ренатурации интерферона альфа-2.

2. Разработать схему хроматографической очистки интерферона альфа-2.

3. Определить оптимальные параметры пегилирования интерферона альфа-2.

4. Разработать схему выделения монопегилированной формы интерферона альфа-2

5. Провести масштабирование разработанных процессов на производственной площадке ООО «Фармапарк» и их последующую валидацию.

6. Рассчитать экономическую эффективность разрабатываемой технологии производства пегилированных форм интерферона альфа-2.

Научная новизна. Впервые в России проведена работа по установлению критических параметров проведения процесса ренатурации интерферона альфа-2 (концентрация окисляющих и восстанавливающих агентов; значение рН; тип детергента; ионная сила раствора; концентрация хаотропных агентов; температура проведения процесса; продолжительность процесса; нагрузка телец включений) и определению их оптимальных значений. Впервые в мире проведена оптимизация процесса пегилирования интерферона альфа-2 и определены критические параметры данного процесса (соотношение белок / ПЭГ; исходная концентрация белка; температура и продолжительность процесса; влияние структуры растворителя). На основании разработанных технологий впервые в России получены субстанции пегилированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

По результатам проведенной работы подана заявка на патент России № 2014114369 от 11.04.2014 на изобретение «Способ получения отдельных изоформ пегилированного интерферона альфа-2Ь и их смеси».

Практическая значимость. Разработаны и утверждены руководством ООО «Фармапарк» промышленные регламенты на производство: субстанции интерферона альфа-2Ь (ПР 56882590-22-14 от 04.12.14), субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь (ПР 56882590-23-15 от 13.01.15); пусковой регламент на производство готовой лекарственной формы пегилированного интерферона альфа-2Ь (ПУР 56882590-21-14 от 02.07.2014). Субстанции интерферона альфа-2Ь и его пе-гилированной формы внесены в реестр лекарственных средств под № ФС 000434 (решение Минздрава РФ от 15.11.12) и № ФС 000831 (решение Минздрава РФ от 06.05.14). Готовая лекарственная форма пегилированного интерферона альфа-2Ь (торговое название ПегАльтевир) внесена в реестр лекарственных средств под № ЛП 002542 (решение Минздрава РФ от 23.07.14).

Полученная субстанция интерферона альфа-2а использована для производства препарата пегилированного интерферона альфа-2а, который в настоящее время проходит доклинические исследования на обезьянах

Личный вклад соискателя. Автором была проведена работа по оптимизации процесса по оптимизации процесса ренатурации интерферона альфа-2 из телец включений; разработке технологии очистки интерферона альфа-2; оптимизации процесса пегилирования интерферона альфа-2а и альфа-2Ь и дальнейшей очистки целевой монопегилированной формы. Автор провел анализ и статистическую обработку полученных данных и на основании этого сделал выводы и скорректировал план дальнейших работ. Совместно с начальником лаборатории биохимии ООО «Фармапарк» Селищевым С. В. автором выполнено масштабирование разработанных процессов и их перенос на производственную площадку, где была проведена их валидация.

Совместно с с.н.с., к.б.н. Гавриловой Н. А., н.с. Орловой Н. В. автор разработал нормативную документацию на субстанцию и готовую лекарственную форму пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников Государственного научно-

исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2014).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Биофармацевтический журнал).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; описания собственных исследований; материалов и методов исследований; результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; описания практического использования результатов; рекомендаций по использованию научных выводов; списка литературы и приложений. Работа изложена на 163 страницах, включая 68 рисунков, 17 таблиц и 6 страниц приложений. Список цитируемой литературы содержит 140 источников, в том числе 3 на русском языке.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Проведенная оптимизация процесса ренатурации интерферона альфа-2 из телец включений (по параметрам: концентрация окисляющих и восстанавливающих агентов; значение рН; тип детергента; ионная сила раствора; концентрация хаотропных агентов; температура проведения процесса; продолжительность процесса; нагрузка телец включений) позволяет увеличить выход процесса на 90±0,5 %, повысить содержание целевого белка в ренатурате до 81±0,4 %, снизить стоимость процесса ренатурации на 40 % по сравнению с известным аналогом.

2. Разработанная промышленная технология получения интерферона альфа-2 (без N - концевого метионина) обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 11±0,5 г белка с одного производственного цикла в течение 4 суток.

3. Проведенная оптимизация процесса пегилирования (по параметрам: соотношение реагирующих компонентов; концентрация белка в реакционном буфере; значение рН; продолжительность процесса; температура процесса; структура растворителя) позволяет увеличить эффективность пегилирования в 4,2 раза (в случае интерферона альфа-2Ь) и в 3 раза (в случае интерферона альфа-2а).

4. Разработанная промышленная технология получения субстанций пегили-рованного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а обеспечивает выпуск продукта с производительностью не менее 450±20 мг белка (в случае пегилированного интерферона альфа-2Ь) и 600±25 мг (в случае интерферона альфа-2а) с одного производственного цикла в течение 4 суток.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Интерферон. Общие сведения

В 1957 году Азеком и Линдеманом было обнаружено, что после инкубации клеток хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов с инактивированным вирусом гриппа высвобождается новый фактор. Данный фактор при добавлении к свежим клеткам хорион-аллантоисной оболочки препятствовал их заражению живым вирусом гриппа. Данное явление было названо вирусной интерференцией, а фактор, препятствующий заражению - интерфероном [66].

На сегодняшний день открыто несколько классов интерферонов: альфа, бета, гамма, омега и тау [12]. Все классы интерферонов обладают антивирусной, анти-пролиферативной и иммуномодулирующей функциями [8].

Все интерфероны разделяют на два класса в зависимости от типа рецептора, с которым происходит взаимодействие [89]:

- интерфероны первого типа. К данному типу относятся интерфероны альфа,

бета, омега и тау. Данный тип характеризуется взаимодействием с рецептор-

ным комплексом ШИАЯ на поверхности клетки - мишени [76];

- интерфероны второго типа. К данному типу относится интерферон гамма.

Интерферон гамма взаимодействует с рецептором ШИСЯ [124].

Синтез интерферонов запускается в ответ на попадание в организм антигенов. Интерфероны первого типа синтезируются в ответ на двухцепочную РНК вирусов или липополисахариды бактерий, а так же цитокины [96;67]. Интерфероны

второго типа вырабатываются в ответ на митогены [127]. Все три типа интерфе-

11

рона участвуют в первичном противовирусном ответе и в дальнейшем в формировании специфического иммунного ответа [138].

Человеческий интерферон альфа представляет собой семейство белков, состоящих из 22 различных подтипов [12], за синтез которых отвечают 14 различных генов, локализованных в девятой хромосоме человека [35;54;63]. Интерферо-ны бета и гамма представляют собой единичные белки, представленные в геноме единственным геном, расположенным в 9 [12] и 12 хромосоме [89], соответственно. Полиморфизм генов интерферона альфа связан с несколькими причинами [138]:

- тканево-специфическим типом экспрессии;

- тропизмом к различным тканям;

- использованием различных сигнальных систем клеток.

При этом различные субтипы интерферона альфа обладают различной активностью по отношению к различным вирусам [45; 132]. Все субтипы интерферона альфа представляют собой белковые цепи длиной 166 аминокислотных остатков, за исключением альфа-2 длиной 165 аминокислотных остатков [12]. Гомогенность между различными субтипами интерферонов альфа составляет около 80 %. При этом гомогенность между альфа-2 и бета составляет около 30%, между альфа и гамма интерферонами 75% [73].

Наиболее широкое применение в медицинской практике в качестве противовирусного, антиполиферативного и иммуномодулирующего препарата нашел интерферон альфа-2. Изначально его получали из лейкоцитарной или моноцитарной массы путем ее обработки вирусами [23]. Такой подход обеспечивает получение интерферона, идентичного по своим свойствам интерферону альфа-2, вырабатываемому в организме человека. Получаемый таким способом препарат характеризуется гетерогенностью и содержит около 15 субтипов интерферона. На четыре основных (1РМ-а1, №N-012, 1РИ-а4, ШИ-со) приходится около 95 % от общего количества интерферонов. Субтипы 1РЫ-а5,1РЫ-а7,1Р]М-а8, ШЫ-аЮ, ШМ-аМ, ШЫ-а17, 1Р]\Г-а21 являются минорными и представлены в незначительных количествах. Основными ограничениями данной технологии являются низкий выход ин-

12

терферона, лимитированное количество лейкоцитов и необходимость их использования в течение 48 часов после выделения [119]. Все эти параметры влияют на стоимость конечного продукта. При этом велики риски контаминации вирусами готовых лекарственных форм и как следствие заражение пациентов.

По вышеобозначенным причинам на данный момент абсолютное большинство препаратов интерферона альфа-2 получают на основе рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2, синтезируемого в бактериальных клетках, так как такой подход является наиболее безопасным и эффективным. Интерферон альфа-2, синтезируемый в бактериальных клетках, не в полной мере повторяет структуру интерферона, синтезируемого в организме. Однако, данные отличия не являются критическими. В частности такой интерферон не подвергается внутриклеточному гликолизилированию, а N - концевой аминокислотой является мети-онин, что обусловлено спецификой экспрессионной системы бактериальных клеток.

1.2. Структура интерферона альфа-2.

•

Интерферон альфа-2 - белковая молекула с молекулярной массой около 19,3 кДа и длиной 165 аминоскислотных остатков. Существует два подтипа интерферона альфа-2: интерферон альфа-2Ь и интерферон альфа-2а. Отличие между данными подтипами заключается в одном аминокислотном остатке в позиции 23 (лизин в случае интерферона альфа-2а или аргинин в случае интерферона альфа-2Ь) [112]. Сайт О — гликозилирования находится в позиции 106 (остаток треонина в позиции 106) и отличает интерферон альфа-2 от других интерферонов альфа, не имеющих остатка треонина в 106 позиции [3;93]. Структура интерферона альфа-2 включает два дисульфидных мостика, образованных остатками цистеина в позициях 1 и 98 (мостик Су б 1-98); 29 и 138 (мостик СуБ 29-138) [125; 126]. При этом показано, что первый из них не задействован в связывании рецептора и, по всей видимости, необходим для поддержания структуры.

По данным исследования методом кругового дихроизма в молекуле интерферона альфа-2 около 59 % всех структур приходится на альфа спирали и около 16 % на бета листы [64]. Методами кристаллографии и ядерного магнитного резонанса установлена точная структура белков, относящихся к классу интерферона альфа-2 [24]. Структура интерферона альфа-2 приведена на рисунке 1.

Рис. 1. Структура интерферона альфа-2 человека [24]

Основа структуры интерферона альфа-2 - пять антипараллельных альфа спиралей (А, В+В', С, О, Е), пересекающихся под углом от 18 до 31 градуса, четыре из которых (А, В+В', С, Е) формируют сердцевину молекулы [103]. Спираль А располагается от 11 до 21 аминокислотного остатка, В - от 52-68, В' - от 70 до 75, С - от 78 до 100, О - от 110 до 132, Е - от 137 до 157 . Все альфа спирали прямые за исключением спирали В, имеющей ярковыраженный изгиб (около 70°С) в положении 69 (остаток тирозина) [103]. Участок спирали В после изгиба принято обозначать как В'. Соединение между спиралями осуществляется петлями АВ, ВС, СЭ и ЭЕ. При этом петли ВС, СЭ, ЭЕ относительно просты по своей структуре, их размер составляет 2, 6 и 4 аминокислотных остатка, соответственно.

Петля АВ значительно крупнее других петель и более гетерогенна по своей структуре. В частности, в ней выделяют три участка: АВ1 (22-33), АВ2 (34-39) и АВЗ (40-51). Участок АВ1 располагается перпендикулярно к осям спиралей и со-

единен с N - концом спирали Е путем образования дисульфидной связи между остатками цистеина в положениях 29 и 138. Участки петли АВ1 26-29 и 30-33 формируют две Зю спирали: ЗюА и ЗюВ. Остатки лейцин 26, фенилаланин 27 и лейцин 30 спиралей ЗюА и ЗюВ формируют поверхности, имеющие значительную доступность для растворителей. ЗюВ спираль предшествует участку АВ2 и разворачивает основную цепь на 90° параллельно центральным альфа спиралям. Кон-формация ЗюВ позволяет осуществлять дополнительные взаимодействия с боковыми цепями аминокислотных остатков спирали D. Остатки АВ2 глицин 37, фенилаланин 36 и фенилаланин 38 формируют вытянутую структуру, входящую в гидрофобный кор молекулы. Сразу после участка АВ2 остатки участка АВЗ 40-43 формируют третью Зю структуру - ЗюС. Следующие за структурой ЗюС остатки 44-51 соединяют петлю АВ со спиралью В [103].

Гидрофобный кор молекулы интерферона альфа-2 состоит в основном из гидрофобных остатков за исключением шести полярных остатков (Serll, Thrl4, Ser72, Ser 150, Serl54, Thrl55) и четырех заряженных боковых цепей (Glu87, Glul41, Argl44, Glul46) [73]. Атом кислорода в позиции у остатка серина 11 способен образовывать водородные связи с кислородом el остатка глицина 91, в то время как гидроксильные атомы кислорода других полярных аминокислот, входящих в состав гидрофобного кора, формируют водородные связи с карбонильными атомами кислорода основной цепи. Для глутамина в позиции 87 не обнаружено партнеров для образования водородных связей. Боковые цепи глутамина 141 и аргинина 144 стабилизированы за счет образования внутренних солевых мостиков друг с другом и сетью гидрофобных связей с боковой цепью аргинина 22 в случае глутамина 141 или карбонильными атомами кислорода лейцина 12 или глутамина 141 в случае аргинина 144 [59]. 0е атомы глутамина 146 образуют водородные связи с атомом азота основной цепи фенилаланина 36, с Ол атомом тирозина 122 и гуанидиновой группой аргинина 149. Спираль D и петля АВ так же включены в гидрофобный кор за счет гидрофобных остатков (лейцин, изолейцин и валин) в случае спирали D и за счет ароматических колец остатков фенилаланина в случае петли АВ.

1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2

Известно, что интерферон проявляет свою биологическую активность за счет взаимодействия со специфическими рецепторами [38;92; 116]. В структуре интерферона альфа-2 выделяют несколько областей, ответственных за связывание рецептора: 29 - 35, 78 - 95 и 123 - 140. Участки 29 - 35 и 123 - 140 находятся в непосредственной близости за счет формирования дисульфидной связи между остатками цистеина 29 и 138, соединяющей петлю AB со спиралью Е [76].

Замена или делеция цистеинов в позициях 29 или 138 значительно снижает биологическую активность интерферона альфа-2. Третий участок 78 - 95 так же ответственен за связывание с рецептором [75]. Более подробное изучение данных участков показало, что участки 29 — 35 и 123 - 140 ответственны в первую очередь за антивирусной активности интерферона альфа-2. Изучение влияния остатков отдельных аминокислот на активность показало, что одним из важнейших является аргинин в позиции 33. Его замена, к примеру, на лизин или аланин приводит к снижению биологической активности в 500 и 2500 раз, соответственно [21]. Более подробное изучение области 78 - 95 показало, что она ответственна преимущественно за антипролиферативную активность [44]. Показано, что регион 81-95 является важным участком, ответственным за антипролиферативную активность интерферон альфа-2 [64]. В своей работе Ни с коллегами методом сайт -направленного мутагенеза установили, что остатки тирозина и изолейцин в позициях 86 и 90 являются ключевыми аминокислотными остатками, ответственными на антипролиферативную активность. В процессе своей работы авторы заменяли тирозин в положении 86 на аспарагиновую кислоту, изолейцин, лизин или аланин. Замена на изолейцин не принесла значительных изменений в антипрофилератив-ной активности, в остальных трех случаях наблюдалось снижение активности в 100 раз. В противоположность, замена изолейцина в позиции 90 на тирозин значительно увеличивала активность. При этом методом кругового дихроизма было

показано, что при описанных заменах значительного изменения во вторичной

16

структуре не происходило, т.е. не было значительных конформационных изменений, способных повлиять на взаимодействие интерферона с рецептором.

1.4. Активация синтеза интерферона в клетках

В процессе ответа на специфические компоненты вирусов или других патогенов клетки актируют различные сигнальные каскады, которые выражаются в синтезе цитокинов и хемокинов, которые в свою очередь препятствуют репликации вируса и инициируют иммунный ответ. Антивирусный и антимикробный сигналинг выражается в активации транскрипционных факторов, таких как М7-кВ, ¡ИР и АР-1 за счет посттрансляционной модификации - преимущественно фосфорилирования. После активации данных белков за счет специальных механизмов эти клеточные белки взаимодействуют с промоторами генов интерферона альфа и других иммуномодуляторных генов для дальнейшей инициации антивирусного ответа [85; 108; 111].

После синтеза интерферона альфа происходит паракринная или аутокрин-ная регуляция синтеза новых молекул иммунного ответа по средствам МК-БТАТ сигнального пути, в результате чего активируются интерферон-стимулируемые гены (ИСГ). Транскрипция ИСГ достигается за счет фактора ГБОРЗ, включающего фактор 111Р9 и гетеродимер, состоящий из белков БТАТ1 и 8ТАТ2. Данный комплекс поступает в ядро, где далее связывается с ДНК в специальной области -1811Е, в результате чего происходит индукция синтеза интерферона и других цитокинов [89].

1.5. Рецепторы интерферона альфа

Как уже отмечалось выше, биологическая активность интерферона осуществляется за счет его взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности интерферон - чувствительных клеток. Интерфероны 1 типа, к которым относится интерферон альфа-2, взаимодействует с двумя типа рецепторов: высо-коафинным рецептом ШИАт и низкоафинным рецептором 1РМАИ2 [124].

Несмотря на то, что интерферон альфа стимулирует множественные клеточные эффекты, он действует через основной рецепторный комплекс ШКАЯ (ре-цепторный комплекс для всех интерферонов первого типа), который представлен в незначительных количествах на поверхности клеток (от 100 до 5000 рецепторов на клетку) позвоночных. Данный рецепторный комплекс состоит из двух субчастиц: ШЫАШ и 1РМАЯ2. Структура субъединиц рецепторного комплекса представлена на рисунке 2.

1РЫАРЛ

Рис. 2. Структура субъединиц рецепторного комплекса интерферона

альфа [49]

Зрелый ШКАИЛ представляет собой белок длиной 530 аминокислотных остатков, интегрированный в клеточную мембрану [76]. Он состоит из внеклеточного домена (409 аминокислотных остатков), трансмембранного домена (21 аминокислотный остаток) и внутриклеточного домена (100 аминокислотных остатков) [12].

Зрелый человеческий 1РЫАЯ2 представлен в трех формах. Основная форма - 1РМАЯ2с состоит из 487 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 115 кДа [12]. Внутриклеточный домен состоит из 251 аминокислотных остатков. Две другие формы 1РЫАЯ2 отличаются значительно меньшим размером и называются ШИЛИСЬ и IFNAR2a. ШЧАЬ^Ь состоит из 303 аминокислотных остатков, из которых лишь 67 составляют внутриклеточный домен [92; 98]. 1РЫА112а представляет собой растворимую форму 1РЫАЯ2 с молекулярной массой 40 кДа и лишен трансмембранного и внутриклеточного доменов [92]. На данный момент роль

растворимых форм рецепторов до конца не ясна, однако, показано, что они могут выступать как в роли агонистов и при взаимодействии с интерфероном проявлять антивирусную активность, так и в роли антагонистов, блокируя интерферон-индуцированный ответ.

Рецепторы интерферонов первого типа относятся ко второму классу семейства спиралевидных цитокиновых рецепторов и содержат консервативную фиб-ронектин тип III - подобную (FNIII) структуру, которая формирует внеклеточный лиганд-связывающий сайт [115]. Внеклеточная область IFNAR1 состоит из четырех фибронектин тип III - подобных повторностей, которые формируют два домена, разделенных последовательностью из трех пролинов. Каждый домен состоит из примерно 200 аминокислотных остатков и так же может быть рассмотрен в виде двух гомологичных субдоменов размером 100 аминокислотных остатков каждый. Внеклеточная область рецептора IFNAR-2 состоит из двух FNIII доменов, каждый из которых состоит из 100 аминокислотных остатков [115].

Существует модель взаимодействия молекулы интерферона с комплексным рецептором. Согласно данной модели, N - терминальный FBN III домен рецептора IFNAR-1 формирует «крышку» вокруг присоединившегося лиганда [12].

IFNAR1 и IFNAR2 имеют разный вклад в связывание лиганда, но при этом оба необходимы для формирования функционально активного сайта связывания молекул интерферона.

Трансмембранные участки IFNAR1 и IFNAR2 не обладают ферментативной активностью, но их внутриклеточные домены нековалентно связаны с тирозино-выми киназами TYK-2 и JAK-1 соответственно [92; 114; 115]. После связывания интерферона с экстраклеточным доменом рецепторного комплекса, цитоплазма-тические домены активируют данные киназы. Вдобавок к тирозиновым киназам с комлексом IFNAR так же связаны тирозин фосфатазы. Их роль состоит в регуляции участия TYK-2 и JAK - 1 в интерферон-индуцированном ответе [100].

Продемонстрирована важность наличия обоих элементов IFNAR комплекса.

В отсутствие одного из них не происходит высокоафинного связывания молекул

интерферона с рецепторным комплексом, активации тирозин киназ и белков

19

STAT, и как следствие не происходит биологического ответа на интерферон. Константа диссоциации IFNAR комплекса составляет 10"п, при этом IFNAR1 обладает более высокой аффинностью (Ю"7) по отношению к интерферонам первого типа, чем IFNAR2 (10'9) [30; 107].

Один из самых интересных аспектов рецепторного комплекса состоит в способности различать различные типы и субтипы интерферонов первого типа и осуществлять различный биологический эффект в зависимости от типа лиганда. Различные типы интерферонов первого типа вызывают различный биологический ответ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шамонов, Николай Алексеевич, 2015 год

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Abuchowski, A. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol / A. Abuchowski, T. Es, N. Palczuk, F. Davis // J. Biol. Chem. - 1977. - Vol. 252. - P. 3578- 81.

2. Abuchowski, A. Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immu-nogenicity and circulating life of bovine liver catalase / A. Abuchowski, J. McCoy, N. Palczuk, T. Es // J. Biol. Chem. - 1977. - Vol. 252. - P. 3582-86.

3. Adolf, G. Natural human interferon- alpha 2 is O- glycosylated / G. Adolf, I. Kalsner, H. Ahorn // Biochem. J. - 1991. - Vol. 276. - P. 511- 518.

4. Ahmed, S. Interferon in the treatment of hairy- cell leukemia / S. Ahmed, K. Rai // Best. Pract. Res. Clin. Haematol. - 2003. - Vol. 16. - P. 69- 81.

5. Alden, C. L. Handbook of Toxicology Pathology. Urinary system / C. L. Alden, C.H. Frith. - New York: Acedemic Press, 1991. - P. 339-341.

6. Andreoni, M. Primary human Herpesvirus- 8 infection in immunocompetent children / M. Andreoni, L. Sarmat, E. Nicastri // J. Am. Med. Ass. - 2002. - Vol. 287.-P. 1295-1300.

7. Aoki, Y. HIV- 1 Tat enhances KSHV infectivity / Y. Aoki, G. Tosato // Blood -2004.-Vol. 104.-P. 810-14.

8. Asmana Ningrum, R. Human interferon alpha- 2b: a therapeutic protein for cancer treatment / R. Asmana Ningrum // Scientifica (Cairo). - 2014. - Vol. 2014. P. 1-8.

9. Bailon, P. PEG- modifed biopharmaceuticals / P. Bailon, C. Y. Won // Expert open drug Deliv. - 2009. - Vol. 6. - P. 1- 16.

lO.Bailon, P. Rational design of a potent, long- lasting form of interferon a- 2a for the treatment of hepatitis C / P. Bailon, A. Palleroni, C.A. Schaffer // Bioconjug. Chem. - 2001. - Vol. 12. - P. 195 - 202. 11 .Beauchamp, C.O. A new procedure for the synthesis of polyethylene glycol- protein adducts, effects on function, receptor recognition and clearance of superoxide dismutase, lactoferrin and a2- macroglobulin / C.O. Beauchamp, S.L. Gonias, D.P. Menapace//Anal. Biochem. - 1983. - Vol. 131. - P. 25 -33.

12.Bekisz, J. Human interferons alpha, beta and omega / J. Bekisz, H. Schmeisser, J. Hernandez et al // Growth Factors. - 2004. - Vol. 22. - P. 243- 51.

13.Ben- Bassat, A. Amino- terminal processing of proteins / A. Ben- Bassat, K. Bauer // Nature. - 1987. - Vol. March - P. 315- 26.

14.Bentley M. D., Fang Z., Harris M. H. Activated polyoxazolines and compositions comprising the same // US002626. - 2008.

15.Bentley M. D., Fang Z., Harris M. H. Heterobifiinctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation // US023536. - 1999.

16.Beranova, M. Effect of cytochrome P-450 inhibition and stimulation on intensity of polyethylene degradation in microsomial fraction of mouse and rat livers / M. Beranova, R. Wasserbauer, D. Vancurova et al. // Biomaterials. - 1990. - Vol. 11.-P. 521-24.

17.Brierley, M. M. IFN- a/b receptor interactions to biologic outcomes: understanding the circuitry / M. M. Brierley, E. Fish // J. Interferon Cytokine Res. - 2002. -Vol. 22. - P. 835-45.

18.Buckel, P. Recombinant Protein Drugs - Milestones in Drug Therapy / P. Buckel. - Basel: Birkhaeuser, 2001. - 207 p.

19.Butt, T. R. SUMO fusion technology for difficult to express proteins / T. R. Butt // Prot. Expr. Purif. - 2005. - Vol. 43- P. 1- 9.

20.Calceti, P. Development and in vivo evaluation of an oral insulin- PEG delivery system / P. Calceti, S. Salmaso, G. Walker // Eur. J. Pharm. Sci. - 2004. - Vol. 22.-P. 315-23.

21.Camble, R. Functionally important conserved amino- acids in interferon- a2 identified with analogues produced from synthetic genes / R. Camble, M. Edge // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1986. - Vol. 134. - P. 1404 - 11.

22.Cammas, S. Heterobifunctional poly(ethylene oxide): synthesis of alpha- meth-oxy- omega- amino and alpha- hydroxy- omega- amino PEOs with the same molecular weights / S. Cammas, Y. Nagasaki, K. Kataoka // Bioconjug. Chem. -1995.-Vol. 6.-P. 226-30.

23.Cantell, K. Production of interferon in human leukocytes from normal donors with the use of Sendai virus / K. Cantell., S. Hirvonen., H. L. Kauppinen et al. // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 78. - P. 29- 38.

24.Carson, M. Ribbons 2.0 / M. Carson // J. Appl. Ciystallog. - 1991. - Vol. 24. - P. 958-61.

25.Carter, M.C. Instability of succinyl ester linkages in 02'- monosuccinyl cyclic AMP- protein conjugates at neutral pH / M.C. Carter, M.E. Meyerhoff // J. Immunol. Methods. - 1985. - Vol. 81. - P. 245 - 57.

26.Clark, R. Long- acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol / R. Clark, K. Olson, G. Fuh // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271. -P. 21969-77.

27.Chamow, S. Modification of CD4 immunoadhesin with monomethoxypolyeth-ylene glycol aldehyde via reductive alkylation / S. Chamow, T. Kogan, M. Venuti // Bioconjugate Chem. - 1994. - Vol. 5. - P. 133 - 40.

28.Cheng, T. L. Accclcrated clearance of polyethylene glycol- modified proteins by anti- polyethylene glycol IgM / T.L. Cheng, P.Y. Wu, M.F.Wu et al. // Bioconj. Chem. - 1999. - Vol. 10. - P. 520- 28.

29.Cheng, T. L. Monoclonal antibody- based quantitation of poly(ethylene glycol)-derivatized proteins, liposomes and nanoparticles / T.L. Cheng, C.M. Cheng, B.M. Chen et al. // Bioconj. Chem. -2005. - Vol. 16. - P. 1225-31.

30.Cutrone, E. C. Contributions of cloned Type I interferon receptor subunits to differential ligand binding / E. C. Cutrone, J. A. Langer // FEBS Lett. - 1997. -Vol. 404.-P. 197-202.

31 .David, M. Signal transduction by Type I interferons / M. David // Biotechniques - 2002. - Vol. 33. - P. S58-S65.

32.Davis, B. G. Controlled site- selective glycosylation of proteins by a combined sitedirected mutagenesis and chemical modification approach / R.C. Lloyd, J.B. Jones // (1998). J. Org. Chem. - 1998. - Vol. 63. - P. 9614- 15.

33.Delgado, C. Analytical partitioning of poly(ethylene glycol)- modified proteins / C. Delgado, M. Malmsten, J.M. Van Alstine // Journal of Chromatography. -1997. - Vol. 692. - P. 263-72.

34.Deregt, D. Bovine viral diarrhea virus: biotypes and disease / D. Deregt, K. G. Loewen // Can. Vet. J. - 1995. - Vol. 36. - P. 371-78.

35.Diaz, M. Structure of the human type-1 interferon gene clustcr determined from a YAC clone contig / M. Diaz, H. Pomykala, Bohlander S. et al // Genomics. -1994.-Vol. 22.-P. 540-52.

36.Di Bisceglie, A. M. A randomized controlled trial of recombinant alpha interferon therapy for chronic hepatitis B / A. M. Di Bisceglie, N. Bergasa, T.L. Fong // Am. J. Gastroenterol. - 1993. - Vol. 88. - P. 1887-92.

37.Dolence E.K., Hu C., Tsang R. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces // US 08/304656. -1997.

38.Domanski, P. Cloning and expression of a long form of the beta subunit of the interferon alpha beta receptor that is required for signaling / P. Domanski, M. Witte, M. Kellum //J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 21606-11.

39.Edwards, C. Design of PEGylated soluble tumor necrosis factor receptor type I (PEG sTNF- RI) for chronic inflammatory diseases / C. Edwards, S. Martin, J. Seely // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2003. - Vol. 55. - P. 1315-36.

40.Esposito, P. PEGylation of growth hormone- releasing hormone (GRF) analogues / P. Esposito, L. Barbero, P. Caccia // Adv. Drug Del. Rev. - 2003. - Vol. 55.-P. 1279-91.

41.Fasler- Kan, E. Interferon- activates signal transducers and activators of transcription 5 and 6 in Daudi cells / E. Fasler- Kan, A. Pansky, M. Wiederkehr, M. Battegay // Eur. J. Biol. - 1998. - Vol. 3. - P. 514- 19.

42.Fee, C. J. Prediction of the Viscosity Radius and the Size Exclusion Chromatography Behavior of PEGylated Proteins / C. J. Fee, J. Van Alstine // Bioconjugate Chemistry. - 2004. - Vol. 15. - P. 1304- 13.

43.Fee, C. J. Size comparison between proteins PEGylated with branched and linear poly(ethyleneglycol) molecules / C. J. Fee // Biotechnol. Bioeng. - 2007. - Vol. 98.-P. 725-31. 117.

44.Fish, E. Definition of receptor binding domains in interferon- alpha / E. Fish // J. Interferon Res. - 1992. - Vol. 12. - P. 257 - 66. 34.

45.Foster, G. R. Different Relative Activities of Human Cell- Derived Interferon- a Subtypes: IFN- a8 Has Very High Antiviral Potency / G. R. Foster, O. Rodrigues, F. Ghouze et al. // J. Interferon Cytok. - 1996. - Vol. 16. - P. 1027- 33. 16.

46.Foser, S. Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon a- 2a (PEGASYS) / S. Foser, A. Schacher, K. A. Weyer, D. Brugger // Protein. Expr. Purif. - 2003. - Vol. 30. - P. 78- 87. 72.

47.Friman, S. Hepatic excretion and metabolism of polyethylene

glycols and mannitol in the cat / S. Friman, B. Egestad, J. Sjovall et al. // J. Hepa-tology. - 1993. - Vol. 17. - P. 48-55. 114.

48.Fruijtier- Polloth, C. Safety assessment on polyethylene glycols (PEGs) and their derivatives as used in cosmetic products / C. Fruijtier- Polloth // Toxicology. -2005.-Vol. 214.-P. 1-38. 118.

49.Ghislain, J. Evidence for glycosphingolipid modification of the type 1 IFN receptor/J. Ghislain, C.A. Lingwood, and E.N. Fish//J. Immunol. - 1994. - Vol. 153. -P. 3655-63.40.

50.Goodbourn, S. Interferon's: cellsignaling, immune modulation, antiviral responses and virus counter-measures / S. Goodbourn, L. Didcock and R.E. Randall // J. Gen. Virol. -2000. - Vol. 81. - P. 2341-64. 51.

51.Goodson, R. J. Site- directed pegylation of recombinant interleukin- 2 at its gly-cosylation site / R. J. Goodson, N.V. Katre // Biotechnology. - 1990. - Vol. 8. -P. 343-46.98

52.Grace, M. Structural and biologic characterization of pegylated recombinant IFN- alpha2b / M. Grace, S. Youngster, G. Gitlin // J. Interferon Cytokine Res. -2001.-Vol. 21.-P. 1103-15.

53.Graham, L. Pegaspargase: a review of clinical studies / L. Graham // Adv. Drug. Deliv. Rev. - Vol. 55. - P. 1293-1302.

54.Hardy, M. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes / M. Hardy, C. Owczarek, L. Jermiin // Genomics. - 2004 - Vol. 84. -P. 331-45.

55.Harris, J. M. Effect of pegylation on pharmaceuticals / J. M. Harris, B. Robert // Nature Reviews Drug Discovery - 2003. - Vol. 2. P. 214- 221. 69.

56.Harris, J. M., Hcrati, R. M. Preparation and use of polyethylene glycol propio, naldehyde // US5252714A. - 1993.

57.Harris, J. M. Improvements in protein PEGylation: pegylated interferons for treatment of hepatitis C / J. M. Harris, A. Kozlowski // J. Controlled Release. -2001.-Vol. 72.-P. 217-24.

58.Harris J. M., Kozlowski A. Polyethylene glycol and related polymers monosub-stituted with propionic or butanolic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications // WO 1997003106. - 1997.

59.Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical / J. M. Harris. - New York: Plenum Publishing, 1992. - 388 p.

60.Heathcote, E. Re- treatment of chronic hepatitis C with consensus interferon / E. Heathcote, E. Keeffe, S. Lee // Hepatology. - 1998. - Vol. 27. - P.l 136-43. 142.

61.Heymann, В. Elastic properties of poly(ethylene- glycol) studied by molecular dynamics stretching simulations / B.IIeymann, H.Grubmuller // Chemical Physics Letters. - 1999. - Vol. 307. - P. 425- 32.

62.Hoofnagle, J. Treatment of chronic поп - Л, поп- В hepatitis with recombinant human alpha- Interferon / J. Hoofnagle, K. Mullen , D. Jones // N. Engl. J. Med. - 1986.-Vol. 315.-P. 1575-78.

63.Humphray, S. DNA sequence and analysis of human chromosome 9 / S. Humphray, J. K. Oliver, A. R. Hunt et al // Nature. - 2004. - Vol. 429. - P. 36974.

64.Hu, R. Human IFN- a Protein Engineering: The Amino Acid Residues at Positions 86 and 90 Are Important for Antiproliferative Activity / R. Hu, J. Bekisz, H. Schmeisser // The J. of Immun. - 2001. - Vol. 167.- P. 1482-89.

65.1nada, Y. Application of PEG- enzyme and magnetite- PEG- enzyme conjugates for biotechnological processes / Y. Inada, K. Takahashi, T. Yoshimoto et al. // Trends in Biotechnology. - 1988. - Vol. 6. - P. 131- 34.

66.1saacs, A. Virus interference. I. The interferon / A. Isaacs, J. Lindenmann // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. - 1957, - Vol. 147. - P. - 258- 67.

67.Kadowaki, N. Distinct CpG DNA and polyinosinic- polycytidylic acid double-stranded RNA, respectively, stimulate CDllc-type 2 dendritic cell precursors and CDllc+dendritic cells to produce type I IFN / N. Kadowaki, S. Antonenko, Y.- J. Liu // J. Immunol. - Vol. 166. - P. 2291-95.

68.Kalvakolanu, D. V. Alternate interferon signaling pathways / D. V. Kalvakolanu // Pharmacol. Ther. - 2003. - Vol. 100. - P. 1-29.

69.Kaposi's Sarcoma [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/kaposissarcoma.html (дата обращения: 27.06.2005).

70.Katze, М. G. Viruses and interferon: a fight for supremacy / M. G. Katze, Y. He and M.Jr. Gale // Nat. Rev. Immunol. -2002. - Vol. 2. - P. 675-87. 49.

71.Kawai, F. Microbial degradations of polyethers / F. Kawai // Appl. Microbiol. Biotechnology. - 2002. - Vol. 58. - P. 30-38.

72.Kinstler, O.B. Characterization and stability of N- terminally PEGylated rhG-CSF / O.B. Kinstler, D.N. Brems, S.L. Lauren // Pharm. Res. - 1996. - Vol. 13. -P. 996-1002.

73.Klaus, W. The three- dimensional high resolution structure of human interferon a- 2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution / W. Klaus, B. Gsell, A. Labhardt, B. Wipf// J. Mol. Biol. - 1997. - Vol. 274. - P. - 661- 75.

74.Kogan, T. P. The synthesis of substituted methoxy- poly(ethylene glycol) derivatives suitable for selective protein modification / T.P. Kogan // Synth. Commun. -1992. - Vol. 22. - P. 2417 - 24.

75.Kom, A. Three dimensional model of a human interferon- a consensus sequence /

A. Korn, D. Rose, E. Fish // J. Interferon Res. - 1994. - Vol. 14. - P. 1- 9.

76.Kumaran, J. A structural basis for interferon- alpha- receptor interactions / J. Kumaran, L. Wei, L. Kotra et al // FASEB J. - 2007, - Vol. 21. - P. 3288- 96.

77.Leader, B. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification /

B. Leader, Q. J. Baca, D.E. Golan // Nat. Rev. Drug Discovery. - 2008. - Vol. 7. -P. 21-39.

78.Lee, D. Preparation and characterization of monopegylated human granulocyte-macrophage colonystimulating factor / D. Lee, I. Sharif, S. Kodijalli // J. Interferon Cytokine Res. - 2008. - Vol. 28. - P. 101.

79.Lee, L. Prolonged circulating lives of single- chain Fv proteins conjugated with polyethylene glycol: a comparison of conjugation chemistries and compounds / L. Lee, C. Conover, C. Shi // Bioconj. Chem. - 1999. - Vol. 10. - P. 973 - 81.

80.Lee, H. Preparation and characterization of mono- PEGylated epidermal growth factor: evaluation of in vitro biologic activity / H. Lee, T. Park // Pharm. Res. -2002.-Vol. 19.-P. 845-51.

81.Levy, Y. Adenosine deaminase deficiency with late onset of recurrent infections: response to treatment with polyethylene glycol- modified adenosine deaminase / Y. Levy, M. Hershfield, C. Fernandez- Mejia // J. Pediatr. - 1988. - Vol. 113.-P. 312-17.

82.Li, Y. Role of p38a map kinase in Type I Interferon signaling / Y. Li, A. Sassano, B. Majchrzak, D.K. Deb // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 970- 79.

83.Lok, A. S. F. A controlled trial of interferon with or without prednisone priming for chronic hepatitis / A. S. F. Lok, P.C. Wu, C.L. Lai, J.Y.N. Lau // Gastroenterology- 1992. - Vol. 102. - P. 2091-97.

84.Maeda, II. SMANCS and polymer- conjugated macromolecular drugs: advantages in cancer chemotherapy / H. Maeda // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2001. -Vol. 46.-P. 169-85.

85.Malmgaard, L. Induction and regulation of IFNs during viral infections / L. Malmgaard, T. Taniguchi, K. Ogasawara // J. Interferon Cytokine Res. - 2004. -Vol. 24.-P. 439-54.

86.Manjula, B. N. Site- specific PEGylation of hemoglobin at Cys- correlation between the colligative properties of the PEGylated protein and the length of the conjugated PEG chain / B.N. Manjula, A. Tsai, R. Upadhya et al. // Bioconj. Chem. - 2003. - Vol. 14. - P. 464-72.

87.Martinez, A. L., Sherman, M. R., Saifer, M. G. P.,Williams, L. D. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof // W0030617. -2004.

88.Matsushima, A. Modification of E. Coli asparaginase with 2,4- bis(o- methoxy-polyethylene glycol)- 6- chloro- s- triazine (activated PEG2); disappearance of binding ability towards anti- serum and retention of enzymatic activity / A. Matsushima, H. Nishimura, Y. Ashihara // Chem. Lett. - 1980. - P. 773 - 76.

89.Meager, A. The Interferons: Characterization and Application / A. Meager. -Weinheim: Wiley- Blackwell, 2006.-460 p.

90.Miron, T. A simplified method for the preparation of succinimidyl carbonate polyethylene glycol for coupling to proteins / T. Miron, M. Wilchek // Bioconjug. Chem. - 1993. - Vol. 4. - P. 568 - 69.

91.Morpurgo, M. Preparation and characterization of poly(ethylene glycol) vinyl sul-fone / M. Morpurgo, F. M. Veronese, D. Kachensky // Bioconjug. Chem. - 1996. - Vol. 7. - P. 363 - 68.

92.Novick, D. The human interferon alpha/beta receptor: characterization and molecular cloning / D. Novick, B. Cohen, M. Rubinstein // Cell. - 1994. - Vol. 77. -P. 391-400.

93.Nyman, A. Identification of nine interferon- alpha subtypes produced by Sendai virus- induced human peripheral blood leucocytes / T. Nyman, H. Tolo, J. Park-kinen // Biochem. J. - 1998. - Vol. 329. - P. 295 - 302.

94.0esterhelt, F. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene- glycol) in water / F. Oesterhelt, M. Rief, H.E. Gaub // New J. Phys. - 1999. - Vol. 1. - P.6.1-6.11.

95.Pasut, G. Protein, peptide and non- peptide drug PEGylation for therapeutic application / G. Pasut, A. Guiotto, F. Veronese // Expert Opinion on Therapeutic Patents. - 2004. - Vol. 14. - P. 859-94.

96.Pestka, S. Interferons and their actions / S. Pestka, J. Langcr, K. Zoon et al // An-nu. Rev. Biochem. - 1987. - Vol. 56. - P. 727-77.

97. Pestka, S. The human interferon- alpha species and hybrid Proteins. / S. Pestka // Semin. Oncol. - 1997. - Vol. 24. - P. 9-17.

98. Pfeffer, L. M. The short form of the interferon alfa/beta receptor chain 2 acts as a dominant negative for Type I interferon action / L. Pfeffer, L. Basu, S.R. Pfeffer, C.H. Yang //J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P. 11002-5.

99. Piquet, G. Set- up of large laboratory- scale chromatographic separations of poly(ethylene glycol) derivatives of the growth hormone- releasing factor 1-29 analogue / G. Piquet, M. Gatti, L. Barbero // J. Chromatogr. A. - 2002. - Vol. 944. -P. 141 -48.

100. Platanias, L. C. The p38 mitogen- activated protein kinase pathway and its role in interferon signaling / L. Platanias // Pharm. Ther. - 2003. - Vol. 98. - P. 12942.

101. Polyethylene glycols. [Электронный ресурс] / /Who Food Additives Series 14. - 2014. - Режим доступа: www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/vl4jel 9.htm (дата обращения: 13.08.2011).

102. Poynard, T. Randomized trial of interferon alfa 2b plus ribavirin versus interferon alfa 2b plus placebo for 48 weeks for treatment of chronic infection with hepatitis C virus / T. Poynard. P. Marcellin, S.S. Lee // Lancet - 1998. - Vol. 352. -P. 1426-31.

103. Radhakrishnan, R. Zinc mediated dimer of human interferon- alpha 2b revealed by X- ray crystallography / R. Radhakrishnan, L. Walter, A. Hruza // Structure. -1996.-Vol. 4.-P. 1453-63.

104. Ranucci, E. Synthesis and molecular weight characterization of end functional-ized poly(N- vinylpyrrolidone) oligomers / E. Ranucci, G. Spagnoli, L. Sartore, P. Bigotti // Macrom. Chem. Phys. - 1995. - Vol. 196. - P. 763- 74.

105. Richter, A. W. Antibodies against polyethylene glycol produced in animals by immunization with monomethoxy polyethylene glycol modified proteins / A.W.

Richter, E. Akerblom // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. - 1983. - Vol. 74. - P. 121-24.

106. Roberts, M.J. Chemistry for peptide and protein PEGylation / M.J. Roberts, M.D. Bentley, J.M. Harris // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2002. - Vol. 54. -P. 459-76.

107. Russell- Harde, D. Reconstitution of a high affinity binding site for Type I interferons / D. Russell- Harde, H. Pu, M. Betts, R.N. Harkins // J. Biol. Chem. -1995. - Vol. 270. - P. 26033-36.

108. Samuel, C. Antiviral actions of interferons / C. Samuel // Clin. Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 14. - P. 778-809.

109. Schiavon, O. Therapeutic proteins: a comparison of chemical and biological properties of uricase conjugated to linear or branched poly(ethylene glycol) and poly(N- acryloylmorpholine) / O. Schiavon, P. Caliceti, P. Ferruti, F.M. Veronese // Farmaco. - 2000. - Vol. 55. - P. 264-69.

110. Schlapschy, M. PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins / M. Schlapschy , U. Binder, C. Borger et al //Protein. Eng. Des. Sel. - 2013. - Vol. 26. - P. 489-501.

111. Sen, G. Viruses and interferons / G. Sen // Annu. Rev. Microbiol. - 2001. -Vol. 55.-P.255-81.

112. Siemers, R. Localization of the receptor binding site of IFN- alpha 2b / R. Siemers, L. Hensley, H. Ozer// J. Immunol.- 1988.-V 141.-P. 1550-55.

113. Simmonds, P. Viral heterogeneity of the hepatitis C virus / P. Simmonds // Journal of I lepatology. - 1999. - Vol. 31. - P. 54-60.

114. Stark, G. R. How cells respond to interferons / G. R. Stark, I.M. Kerr, B.R. Williams, R.H. Silverman // Annu. Rev. Biochem. - 1998. - Vol. 67. - P. 227- 64.

115. Uze, G. A and b interferons and their receptors and their friends and relations / G. Uze, G. Lutfalla, K.E. Mogensen // J. Interferon Cytokine Res. - 1995. - Vol. 15.-P. 3-26.

116. Uze, G. Genetic transfer of a functional human interferon alpha receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA / G. Uze, G. Lutfalla, I. Gresser // Cell. - 1990. - Vol. 60. - P. 225 - 34.

117. Veronese, F. M. Activation of monomethoxy poly(ethylene glycol) by phe-nylchloroformate and modification of ribonuclease and superoxide dismutase / F.M. Veronese, R. Largajolli, E. Bossu // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1985. -Vol. 11.-P. 141-52.

118. Veronese, F. M. Protein PEGylation, basic science and biological Applications/ F. M. Veronese. - Basel: Birkhaeuser, 2009. - 289 p.

119. Viscomi, G. C. Human Leukocyte Interferon Alpha: Structure, Pharmacology, and Therapeutic Applications / G. C. Viscomi, M. Grimaldi, E. Palazzini et al. // Med. Res. Rev. - 1995. - Vol. 15. - P. 445-78.

120. Von Spect, B.H. Polyvinylpyrrolidone as a soluble carrier of proteins / B. H. Von Spect, H. Seinfeld, W. Brendel // Physiol. Chem. - 1973. - Vol. 354. - P. 1659-60.

121. Wang, K. Inhibition of neutrophil apoptosis by Type 1 IFN depends on crosstalk between phosphoinositol 3- Kinase protein kinase C- d, and NF- kB signaling pathways / K. Wang, D. Scheel- Toellner, S.H. Wong, R. Craddock // J. Immunol. -2003.-Vol. 171.-P. 1035-41.

122. Wang, Y. Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha- 2b and its therapeutic implications / Y. Wang, S. Youngster, M. Grace // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2002. - Vol. 54. - P. 547-70.

123. Webster, R. PEGylated proteins: evaluation of their safety in the absence of definitive metabolism studies / R. Webster, E. Didier, P. Harris et al. // Drug Metab. Dispos. - 2007. - Vol. 35. - P. 9-16.

124. Weerd, N. Type I interferon receptors: biochemistry and biological functions / N. Weerd, S. Samarajiwa, P. Hertzog // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - P. 20053- 7.

125. Wetzel, R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon / R. Wetzel // Nature. - 1981. - Vol. 289. - P. 606-7.

126. Wetzel, R. Properties of a human alpha- interferon purified from E. coli extracts / R. Wetzel, L. Perry, D. Estell // J. Interferon. Res. - 1981. - Vol. 1. - P. 381 -90.

127. Wilkinson, M. Interferon gamma produced by mitogen- activated T lymphocytes does not directly mediate lymphoproliferation / M. Wilkinson, H. Leung, I. Crane et al // Eur. J. Immunol. - 1985. - Vol. 15. - P. 404- 7.

128. Woghiren, C. Protected thiol-polyethylene glycol: a new activated polymer for reversible protein modification / C. Woghiren, B. Sharma, S. Stein // Bioconjug. Chem. - 1993. - Vol. 4. - P. 314 - 18.

129. Wong, D. K. Effect of alphainterferon treatment in patients with hepatitis B e antigenpositive chronic hepatitis B / D. K. Wong , A.M. Cheung, K. O'Rourke, C.D. Nay lor / Ann Intern Med. - 1993. - Vol. 119. - P. 312-23.

130. Wylie, D. Carboxyalkylated histidine is a pH- dependent product of pegylation with SC- PEG / D. Wylie, M. Voloch, S. Lee // Pharmaceutical Research. - 2001. -Vol. 18.-P. 1354-60.

131. Yang, B. Polyethylene glycol modification of filgrastim results in decreased renal clearance of the protein in rats / B. Yang, P. Lum, M. Hayashi // J. Pharm. Sci. - 2004/- Vol. 93. - P. 1367-73.

132. Yeow, W. S. Antiviral activities of interferon- a subtypes in vivo / W. S. Yeow, С. M. Lawson, M. W. Beilharz// J. Immunol. - Vol. 160. - P. 2932-39.

133. Yokoyama, M. Synthesis of poly(ethylene oxide) with heterobifunctional reactive groups at its terminals by an anionic initiator / M. Yokoyama, T. Okano, Y. Sakurai // Bioconjug. Chem. - 1992. - Vol. 3. - P. 275 - 76.

134. Zalipsky, S. Evaluation of a new reagent for covalent attachment of polyethylene glycol to proteins / S. Zalipsky, R. Seltzer, S. Mennon- Rudolph // Appl. Bi-ochem. - 1992. - Vol. 15. - P. 100 - 14.

135. Zalipsky, S. Facile synthesis of a- hydroxy- со- arboxymethylpolyethylene oxide / S. Zalipsky, G. Barany // J. Bioact. Compat. Polym. - 1990. - Vol. 5. - P. 227 -31.

136. Zalipsky, S. Hydrazide derivatives of poly(ethylene glycol) and their bioconju-gates / S. Zalipsky. - Washington, DC.: ACS Books, 1997. - P. 318 - 340.103

137. Zalipsky, S. Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides / S. Zalipsky, C. Lee // Biotechnical and Biomedical Applications. -1992.-P. 347-70.

138. Ершов, Ф.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) / Ф. И. Ершов, О. И. Киселев. - Москва: ГЭОТАР- Медиа, 2005. - 368 с.

139. Онищенко Г. Г. О состоянии заболеваемости инфекционными гепатитами в Российской Федерации и неотложных медицинских мерах по ее стабилизации / Г. Г. Онищенко // Вопр. вирусол. - 2001. - № 46. - С. 4-7.

140. Шукуров, P.P. Создание стабильной клеточной линии — продуцента ре-комбинантного дарбэпоэтина - альфа на основе клеток СНО / Р. Р. Шукуров, Н. В. Лобанова, И.Н. Савинова, И.Г. Воробьева // Биотехнология - 2013. - № 2.-С. 46- 54.