Разработка подхода к созданию универсальных систем направленной доставки в опухолевые клетки на основе денримеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Яббаров, Никита Григорьевич

• Яббаров, Никита Григорьевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Яббаров, Никита Григорьевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Направления и пути создания противоопухолевых препаратов 14 избирательного действия

1.2. Противоопухолевые препараты направленного действия

1.2.1. Препараты на основе моноклональных антител

1.2.2. Системы пассивной (ненаправленной) доставки 18 противоопухолевых препаратов

1.3. Повышение эффективности систем доставки путем введения в их 25 состав векторных молекул

1.4. Рецептор альфа-фетопротеина как мишень для доставки 26 противоопухолевых препаратов в клетки-мишени

1.4.1. Структура альфа-фетопротеина

1.4.2. Функции и регуляция биосинтеза альфа-фетопротеина

1.4.3. Регуляция экспрессии гена альфа-фетопротеина

1.4.4. Рецепторы альфа-фетопротеина

1.5. Эпидермальный фактор роста 34 1.5.1. Рецептор эпидермального фактора роста

1.6. Направленная доставка биологически-активных соединений в 38 клетки-мишени с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза

1.7. Множественная лекарственная устойчивость 41 1.7.1. Подходы к преодолению множественной лекарственной 42 устойчивости

Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы

2.2. Оборудование

2.3. Получение рекомбинантного С-концевого домена альфа- 47 фетопротеина (rAFP3D)

2.4. Анализ rAFP3D

2.4.1. Определение концентрации rAFP3D

2.4.2. Определение концентрации тиольных групп

2.4.3. ВЭЖХ анализ рекомбинантного rAFP3D

2.5. Получение FITC-меченого rAFP3D

2.6. Получение FITC-меченных полиамидоаминовых дендримеров 51 (G2)

2.7. Потенциометрическое титрование

2.8. Синтез конъюгата rAFP3D с G2 и FITC

2.9. Синтез конъюгата G2 с доксорубицином (Dox)

2.10. Синтез конъюгата rAFP3D с G2 и Dox

2.11. Синтез конъюгатов EGF, YH и MY с G2 и Dox

2.12. Изучение кинетики высвобождения Dox из конъюгата G2-Dox

2.13. Культивирование клеток

2.14. Анализ связывания и эндоцитоза конъюгатов опухолевыми 57 клетками и лимфоцитами с помощью проточной цитометрии

2.15. Исследование внутриклеточной локализации конъюгатов с 57 помощью лазерной конфокальной микроскопии

2.16. Исследование цитотоксической активности конъюгатов 5

2.17. Определение уровня экспресии и аутофосфорилирования EGFR с 58 помощью проточной цитометрии

Глава 3. Результаты

3.1. Получение rAFP3D

3.2. Анализ биологической активности rAFP3D in vitro

3.3. Синтез и характеристика конъюгатов G2-FITC и rAFP3D-G2-FITC

3.4. Синтез и характеристика конъюгатов G2-Dox и rAFP3D-G2-Dox

3.5. Высвобождение Dox из конъюгата G2-Dox

3.6. Эндоцитоз и внутриклеточное распределение rAFP3D-G2-Dox и

G2-Dox

3.7. Цитотоксическая активность G2-Dox и rAFP3D-G2-Dox

3.8. Синтез и характеристика конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и 76 MY-G2-Dox

3.9. Анализ уровня EGFR (Herl) на поверхности опухолевых клеток и 78 функциональной активности EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2-Dox

3.10. Эндоцитоз и внутриклеточное распределение EGF-G2-Dox, YH- 81 G2-Dox и MY-G2-Dox

3.11. Цитотоксическая активность EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2- 85 Dox

Глава 4. Обсуждение результатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

а.о. аминокислотный остаток

БСА бычий сывороточный альбумин

ДМСО диметилсульфоксид

ДТНБ 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)

ДТТ дитиотреитол

МА моноклональные антитела

МЛУ множественная лекарственная устойчивость

ГШ противоопухолевый препарат

ПЭГ полиэтиленгликоль

РОЭ рецептор-опосредованный эндоцитоз

ТВ тельца включения

ТХУ трихлоруксусная кислота

ФГА фитогемагглютинин

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЧСА сывороточный альбумин человека

ABC-транспортеры АТФ-связывающие (зависимые) транспортеры

(ATP binding cassette)

AFP альфа-фетопротеин

AFPR рецептор альфа-фетопротеина (AFP receptor)

rAFP3D С-концевой рецепторсвязывающий фрагмент

AFP

ВСА бицинхониновая кислота

DAG диацилглицерол

Dox доксорубицин

EDC водорастворимый карбодиимид

EGF эпидермальный фактор роста

EGFR рецептор эпидермального фактора роста

ERK1/2 extracellular signal-regulated kinase 1/2

FBS эмбриональная бычья сыворотка

FITC G2

GAB

GSH/GSSG

IP3 LB MAP

MEK (MAPKK) PAAG

РАМАМ дендримеры

PgP

PIP2

PIP3

PI3K

PMSF

RAF SOS STAT

TRAIL

флуоресцеин-5-изотиоцианат полиамидоаминовые дендримеры 2-го поколения

Grb2-associated binding (GAB) proteins Red/Ox пара - глутатион восстановленный/глутатион окисленный Инозитолтрифосфат Lysogeny broth mitogen-activated protein mitogen-activated protein kinase kinase полиакриламидный гель полиамидоаминовые дендримеры гликопротеин PI70, MDR1, АВСВ1 фосфотидилинозитол (3,4)-бибосфат фосфотидилинозитол (3,4,5)-трифосфат фосфотидилинозитол-4,5-бифосфат 3-киназа бензилсульфонилфторид (phenylmethylsulfonyl fluoride), ингибитор сериновых протеиназ семейство серин/треонин киназ группа GEF (guanine nucleotide exchange factors) группа цитоплазматических транскрипционных факторов (signal transducer and activator of transcription)

tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подхода к созданию универсальных систем направленной доставки в опухолевые клетки на основе денримеров»

Введение

Актуальность проблемы

Онкозаболевания характеризуются неконтролируемым ростом и делением злокачественно-трансформированных клеток, которые при этом могут проникать в окружающие ткани и метастазировать в другие части организма. Злокачественные новообразования являются одной из основных причин смертности среди населения - около 5 млн. человек заболевает и около 2 млн. погибает ежегодно по данным Всемирной организации здравоохраниея. Каждый третий человек сталкивается с опухолевыми заболеваниями. Современная терапия опухолевых заболеваний включает в себя такие методы как хирургическое вмешательство, радиационное облучение, а также химиотерапию. Местное лечение, такое как хирургическое вмешательство или радиотерапия, имеет шансы на успех только тогда, когда малигнизированная ткань полностью находится в области обработки. Использование же химиотерапии направлено в первую очередь против метастазированйя и малигнизации новообразованных очагов поражения, так как метастазы являются основной причиной смерти при онкологических заболеваниях. Противоопухолевые препараты (1И1) используемые для химиотерапии преимущественно поражают активно делящиеся клетки, модифицируя и повреждая клеточные мембраны, нарушая биосинтез белка, РНК или ДНК, процессы митоза и метаболизма клетки, образуя прочные комплексы с ДНК, и вызывая тем самым гибель клетки. Избирательность действия таких препаратов основывается на высокой скорости деления опухолевых клеток, помимо которых в организме имеется множество других тканей с высоким пролиферативным индексом, которые, вследствие этого также подвергаются воздействию 1111. Другой причиной низкой эффективности химиотерапии является низкая биодоступность химиопрепаратов для опухолевых тканей, и, как следствие, необходимость применения высоких доз противоопухолевых агентов. Ограниченный

уровень поглощения лекарственных препаратов биологически-гетерогенными опухолями приводит к выживанию части опухолевых клеток, даже после продолжительных курсов химиотерапии. Результатом продолжительного использования химиопрепаратов является возникновение тяжелых системных побочных эффектов, что часто вынуждает прекратить лечение. Часто, использование химиопрепаратов для лечения пациентов с опухолевыми поражениями приводит к непродолжительной ремиссии и следующим за ней осложнениям в виде возникновения более агрессивной формы заболевания с высокой степенью инвазивности, метастазирования, малигнизирования, а также развития множественной лекарственной устойчивости, что делает используемые препараты неэффективными. В основе развития множественной лекарственной устойчивости лежат различные внутриклеточные механизмы, такие как снижение транспорта препаратов через плазматическую мембрану клетки вследствие изменения ее липидного и белкового состава, изменение уровня экспрессии онкогенов, нарушение систем сигнальной трансдукции и др. В качестве примера можно привести повышенную экспрессию трансмембранных белков семейства АВС-транспортеров, специализирующихся на выбросе малых гидрофобных молекул растворенных в цитоплазматической мембране клетки за счет энергии АТФ, на поверхности многих устойчивых линий опухолевых клеток. В настоящее время различают более 50 различных АВС-транспортеров входящих в состав нескольких подсемейств. Одним из наиболее известных представителей является Pgp. Несмотря на десятилетия интенсивных исследований, прогнозы для пациентов с агрессивными формами опухолевых заболеваний не являются обнадеживающими, и современная химиотерапия нуждается в новых подходах к лечению и инновационных препаратах со сниженной токсичностью и повышенным терапевтическим индексом.

Среди наиболее эффективных подходов для повышения селективности действия химиопрепаратов можно выделить следующие: создание новых высокоселективных соединений и разработка новых систем их

избирательного транспорта в опухолевые клетки. Часто для повышения селективности транспорта в клетки-мишени противоопухолевый препарат может быть соединен с векторной молекулой, которая обладает сродством к специфическим лигандам на поверхности клеток, ковалентно, либо нековалентно. Таким образом, использование векторной молекулы определяет взаимодействие такой системы со строго определенными клетками и тканями, в том числе, опухолевыми. Такими векторными молекулами могут являться физиологические лиганды рецепторов факторов роста или онкофетальных белков, а также антитела, РНК-аптамеры к поверхностным белкам и так далее. Связывание векторной молекулы со специфическим рецептором на поверхности клетки иницирует процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза, в результате которого происходит аккумуляция химиопрепрата опухолевыми клетками, мишень которого находится внутри клетки. Необходимо отметить, что при рецептор-опосредованном эндоцитозе препарат попадает в клетку через эндолизосомальный компартмент, избегая прямого транспорта через цитоплазматическую мембрану, в процессе которого он может быть захвачен и выброшен из клетки с помощью АВС-транспортеров. Таким образом, данный подход является не только методом повышения селективности действия препарата, но и одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости.

Существенной проблемой при таком подходе является ограниченное количество активных химических групп на векторных молекулах пригодных для конъюгирования с 1111, либо малое количество сайтов связывания, и, как следствие низкое соотношение количества 1111 к вектору в конечном препарате. Это приводит к необходимости получения и использования больших количеств вектора. Одним из решений проблемы низкого соотношения ПП к векторной молекуле в таких конъюгатах и комплексах является использование макромолекулярных носителей: жидкие или твердые золи или гели различного состава, липосомы, полимерные наночастицы,

полимеры содержащий большое количество активных химических групп и др. Подобные носители, нагруженные 1111, способны самостоятельно проникать в клетку опухоли посредством неспецифического эндоцитоза. Связывание таких макромолекулярных носителей с векторными молекулами способно привести к увеличению эффективности 1111.

Решение проблемы избирательного транспорта 1111 на основе рецептор-опосредованного эндоцитоза определяется, в первую очередь, выбором векторной молекулы. Векторные молекулы должны удовлетворять ряду требований, к которым относятся высокая афинность к соответствующим рецепторам, стабильность, возможность химической модификации при конъюгирования с 1111 без потери биологических свойств, доступность в препаративных количествах. Указанным требованиям наиболее близко соответствуют онкофетальный белок альфа-фетопротеин (AFP) и эпидермальный фактор роста человека (EGF). Важными факторами при разработке систем направленной доставки 1111 также являются выбор лекарственного препарата и линкера, соединяющего адресный и цитотостатический компоненты. Кроме того, если используется макромолекулярный носитель - он должен обладать низким уровнем токсичности и быть биодеградируемым. Скрининг созданных конструкций in vitro и изучение их внутриклеточного поведения позволяет выявить наиболее оптимальные варианты систем направленной доставки. Целью настоящей работы являлось исследование потенциала рекомбинантного С-концевого домена альфа-фетопротеина человека (rAFP3D), эпидермального фактора роста и пептидов взаимодействующих с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) для создания универсальной системы направленной доставки биологически-активных соединений на основе макромолекулярных носителей (полиамидоаминовых дендримеров) в опухолевые клетки.

Задачи исследования:

• Выбор белковых и пептидных векторных молекул для избирательной доставки биологически-активных соединений;

• Создание штамма-продуцента rAFP3D, экспрессия, очистка, фолдинг и характеристика полученного белка;

• Исследование связывания рекомбинантного белка rAFP3D с рецептором AFP, а также EGF и синтетических пептидов (YH и MY) с рецепторами эпидермального фактора роста;

• Синтез конъюгатов флуоресцеина и доксорубицина с макромолекулярным носителем (РАМАМ дендримеры 2-го поколения) и белковыми и пептидными векторными молекулами (rAFP3D, EGF, YH и MY);

• Исследование эффективности интернализации и внутриклеточного распределения конъюгатов в сравнении с интернализацией векторных белков (пептидов), дендримеров и доксорубицина;

• Исследование возможности преодоления множественной лекарственной устойчивости с помощью синтезированных систем направленного транспорта Dox;

• Оценка противоопухолевой эффективности Dox в составе полученных систем направленной доставки in vitro.

Научная новизна и практическая значимость

Предложен новый высокоэффективный метод, позволяющий в один этап провести очистку и фолдинг rAFP3D.

Разработаны методы конъюгации РАМАМ дендримеров с доксорубицином с использованием кислотолабильного линкера.

Разработаны методы синтеза конъюгатов РАМАМ дендримеров содержащих Dox и FITC с такими векторными молекулами как rAFP3D, EGF и синтетическими пептидами взаимодействующими с EGFR - YH и MY.

Доказана способность синтезированных конъюгатов избирательно связываться с поверхностью опухолевых клеток и с высокой эффективностью интернализоваться ими.

Доказана эффективность и избирательиость противоопухолевого действия синтезированных конъюгатов in vitro в отношении ряда клеточных линий опухолей человека. Изучены закономерности их внутриклеточной локализации. Показана зависимость эффективности действия конъюгатов от лабильности химической связи между белком и цитостатическим агентом.

При использовании систем адресной доставки на основе AFP3D обнаружена возможность преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

Личный вклад автора

Личный вклад автора состоит в участии в постановке задач исследования, разработке экспериментальных подходов, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов. Все эксперименты выполнены непосредственно автором. Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на 4th International Congress of Molecular Medicine (2011, Istanbul, Turkey), 8th International Dendrimer Symposium (2013, Madrid, Spain), 38th FEBS Congress (2013, Saint Petersburg, Russia), 17 конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (2013, Пущино, Россия), XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (2013, Москва) Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 статей, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 публикаций в материалах Российских и зарубежных конференций. Структура и объем диссертации

Работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения

результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 177 источников. Диссертация содержит 30 рисунков и 2 таблицы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Направления и пути создания противоопухолевых препаратов избирательного действия

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти в большинстве стран мира. Низкая выявляемость на ранних стадиях, недостаточная эффективность и избирательность действия современных методов лечения делают актуальной проблему поиска новых методов их диагностики и терапии. Обычно, такие методы лечения как радиотерапия, химиотерапия, иммунотерапия используются для окончательной элиминации из организма больного оставшихся раковых клеток после хирургического удаления опухоли [1]. Однако, при метастазировании опухоли основным методом лечения является химиотерапия. Эффективность большинства современных 1111, ограничена такими факторами как низкий терапевтический индекс, опасность развития МЛУ, гетерогенность популяций опухолевых клеток, образование метастазов. Низкая биодоступность 1111 для опухоли, ненаправленный характер, а также необходимость использовать высокие дозы приводят к развитию серьезных побочных эффектов [2].

Таким образом, главной целью при разработке новых 1111 является идентификация агентов, эффективных для лечения рака и при этом вызывающих минимальные побочные эффекты. Опухолевые клетки имеют множество отличий от здоровых. С точки зрения химиотерапии, главным отличием, является не способность к неконтролируемому делению, а их геномная нестабильность - высокая чувствительность к ДНК-повреждающим агентам, связанная с дефектами репарационной системы. В первую очередь мишенями ПП являются системы синтеза ДНК, ферменты, участвующие в отдельных стадиях митоза, а также непосредственно структуры аппарата митоза.

Прогресс, достигнутый на сегодняшний день в изучении метаболических путей, в том числе в опухолевых клетках, а также развитие

современных методов молекулярной биологии, позволяют разрабатывать 1111 на основе уникальных молекулярных мишеней, продуцируемых опухолевыми клетками пациента. Такие ГШ могут достигать мишени либо самостоятельно, либо в составе систем доставки, ориентированных на определенные органы или ткани. Современный прогресс в области молекулярной биологии раковых клеток и их микроокружения позволяет разрабатывать новые варианты 1111 направленного действия.

1.2. Противоопухолевые препараты направленного действия

1.2.1. Препараты на основе моноклоиальных антител

Среди механизмов противоопухолевого действия моноклоиальных антител (МА) можно выделить такие как антитело-зависимая и комплемент-зависимая клеточная цитотоксичность, активация апоптоза, ингибирование сигнальной трансдукции, механизм действияАЬ2 вакцин и фагоцитоз [3].

Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность реализуется посредством связывания гипервариабельного участка с определенным антигеном на поверхности опухолевой клетки, а константным доменом с Fc-рецептором цитотоксического лимфоцита, который способен синтезировать и выделять, в дополнение к ряду других веществ, перфорины и сериновые протеазы, повреждающие клеточную мембрану.

Комплемент-зависимая цитотоксичность опосредована связыванием антитела с антигеном на поверхности клетки, после чего активируется система комплемента, результатом активации которой является формирование пор в клеточной мембране.

Действие АЬ2 вакцин реализуется при использовании МА, содержащих чужеродный белок, в ответ на введение которого, в организме образуются собственные анти-идиотипические антитела, связывающиеся с антигеном на поверхности клетки и способные запускать один из вышеуказанных механизмов цитотоксичности.

Основными проблемами использования МА для лечения злокачественных опухолей являются их нестабильность, иммуногенность антител животного происхождения, высокая специфичность, гетерогенность опухолевых клеток, а также сложная фармакокинетика антител.

В терапии используют неконъюгированные и конъюгированные МА, терапевтический эффект которых обусловлен присоединением к антителу токсических веществ.

До недавнего времени применение МА было ограничено из-за развития аллергических реакций вплоть до анафилактического шока, а также недостаточную эффективность мышиных антител из-за образования нейтрализующих антител. После клонирования генов иммуноглобулинов стало возможным получение как частично, так и полностью гуманизированных МА со сниженной иммуногенностыо. Ритуксимаб -пример химерного антитела, зарегистрированного и применяемого в США с 1997 г. для лечения В-клеточных неходжкинских лимфом [4]. В качестве же примера гуманизированных МА, одобренных для использования в клинике, можно привести алемтузумаб - МА к антигену С052, присутствующего в высокой плотности на всех клетках хронического лимфолейкоза человека [5].

Би- и триспецефические МА, которые были сконструированы для повышения терапевтической эффективности антител действуют через механизм активации естественного иммунитета. Такие МА одним гипервариабельным доменом связывается с антигенным рецептором Т-клетки, а другим - с антигеном опухолевой клетки, обеспечивая плотный контакт и имитируя тем самым естественный иммунный ответ [6]. Триспецифические МА, проходящие на данный момент клинические испытания, помимо опухолевой и Т-клетки связываются своим константным доменом - с Бс-рецептором антигенпрезентирующей клетки (рис. 1). Введение таких антител вызывает не только пассивную иммунную реакцию, но и запускает активный специфический противоопухолевый иммунный ответ.

ОПУХОЛЕВАЯ АППОПТОЗ

КЛЕТКА УЧ ^ШШШШШШШШ

АППОПТОЗ ФАГОЦИТОЗ

Рис. 1. Механизм действия триспецифических МА.

С другой стороны примером МА, действие которого не опосредовано иммунным ответом, является трастузумаб - первый препарат зарегистрированный для лечения солидных опухолей [7]. Связываясь с НЕЫ2/пеи-рецептором, гиперэкспрессия которого наблюдается на поверхности опухолевых клеток молочной железы, он блокирует пролиферацию и вызывает апоптоз опухолевых клеток [8].

Также следует отметить, что химерные и гуманизированные МА не вызывают клинически значимого иммунного ответа даже при использовании в течение продолжительного периода [9].

Другим подходом является использование МА в качестве переносчиков лекарственных препаратов и радиоактивных изотопов. Такие МА способны проявлять токсический эффект в результате доставки лекарственных препаратов к поверхности или внутрь клетки-мишени. Радиоиммуноконъюгаты проявляют особенно высокую активность в отношении гематологическических опухолей, в то время как в отношении солидных их активность была на довольно низком уровне. На сегодняшний день зарегистрировано два препарата содержащих моноклональные антитела связанные с радионуклидами - ибритумомаб и тозитумомаб. Среди многочисленных опытных образцов конъюгатов МА с лекарственными препаратами зарегистрированным является лишь - Милотарг, применяемый в лечении рецедивов острого промиелоцитарного лейкоза [10]. Для конъюгирования используют как широко известные лекарственные

препараты, так и новые, в частности ранее известные высокотоксичные соединения или бактериальные и растительные токсины. Так например, к клиническим испытаниям допущен конъюгат МА к антигену CD30 с высокоэффективным ингибитором полимеризации тубулина монометилауристатином Е и конъюгат МА к EGFR с паклитакселом [11, 12]. Также в настоящее время ведутся клинические испытания множества вариантов иммуноконъюгатов с токсинами , например, МА к CD25 и CD30 с А-цепыо рицина [13].

Все же при вышеописанных преимуществах препаратов на основе МА следует учитывать важный недостаток - высокая специфичности, другими словами, опухолевые клетки обладая высокой генетической нестабильностью могут иметь отличный друг от друга антигенный портрет и, таким образом, клетки не несущие антиген, против которого используется МА, будут устойчивы к применяемому препарату [14].

1.2.2. Системы пассивной (ненаправленной) доставки противоопухолевых препаратов

К системам пассивной доставки 1111 относят широкий ряд конструкций, которые не обладают векторными свойствами. К ним можно отнести полимерные и металлические нано- и микрочастицы, липосомы, непосредственно полимеры и др. Лекарственный препарат в таких системах может находиться как в свободном так и в связанном ковалентно состоянии (с применением различных конъюгирующих агентов), как на поверхности так и внутри носителя, общим является то, что такая конструкция обеспечивает более длительную циркуляцию 1111 в организме. Время циркуляции препарата является важным фактором, так как ткани солидных опухолей обладают эффектом повышенного удержания и накопления, что позволяет частицам с размерами до 600 нм проникать и накапливаться в опухолевой ткани. Более того, помимо увеличения времени циркуляции, изменяется

фармакокинетика и снижается токсичность включенного в такую транспортную систему препарата.

На сегодняшний день в многочисленных публикациях описано огромное количество вариантов использования разнообразных систем направленной доставки ПП, с различными способами включения 1111, некоторые из них уже одобрены для использования в клинике. Разнообразие подходов при создании таких систем обусловлено разработкой и внедрением новых типов полимеров и носителей, в том числе и биодеградируемых, как искусственного, так и естественного происхождения.

Липосомы представляют собой искусственные везикулы, стенка которых представлена липидным бислоем. В качестве средства доставки лекарственных препаратов, а также других биологически активных веществ, том числе белков и нуклеиновых кислот, липосомы были использованы одними из первых, несколько десятилетий назад [15, 16]. В самом простом случае в состав билипидного слоя липосом входят фосфолипиды, но с развитием химии полимеров такие слои, схожие по свойствам с билипидными, стало возможным делать из множества амфифильных молекул, например, из янус-дендримеров [17]. При синтезе систем доставки на основе липосом гидрофильные препараты включаются во внутреннюю полость везикулы, при этом билипидный слой препятствует их высвобождению, гидрофобные же препараты преимущественно растворяются в самой билипидной мембране. Однако, обладая биосовместимостыо и простотой получения липосомы в качестве средства доставки имеют и отрицательные стороны, например, быстрый вывод из кровяного русла вследствие фагоцитоза макрофагами. С другой стороны, время циркуляции липосом может быть увеличено путем ПЭГилирования, что может привести к накоплению их в целевом органе благодаря эффекту повышенного проникновения и удержания. Имеется множество работ, в которых для создания направленных систем доставки, липосомы конъюгировали с векторными молекулами. Также был разработан более

более изящный и простой подход - при образовании липосом, в растворе присутствовал векторный белок, содержащий гидрофобный аминокислотный мотив, посредством которого вектор сам встраивался в мембрану липосомы. На данный момент такие системы адресной доставки проходят доклинические испытания. Результатом множества исследований является используемый сегодня в клинике доксорубицин включенный в липосомы, а также ряд других препаратов проходящих клинические испытания.

Наночастнцы на основе полимеров искусственного и природного происхождения используются в качестве систем доставки лекарственных препаратов уже более 40 лет [18]. В зависимости от метода синтеза, препарат может заключаться внутрь наночастиц, сорбироваться на поверхности, или ковалентно присоединяться к носителю. В качестве полимеров для получения наночастиц используют полимеры молочной и гликолевой кислот, и их комбинаций, эфиры метакриловой кислоты, е-капролактона, 2-п-бутилцианоакрилата, альбумин, полисахариды, полиалкилцианоакрилаты и другие [19]. Высвобождение лекарственного препарата из наночастицы может происходить в результате десорбции с поверхности, диффузии из матрицы, в результате биодеградации носителя, а также, если 1111 был коныогирован с носителем, в результате деградации спейсера. В зависимости от типа полимера и его химических модификаций возможно получать наночастицы предназначенные для определенного типа введения в организм, с контролируемым временем деградации, деградацией в специфических условиях, а также предназначенные для накопления в определенных тканях и органах, что позволяет оптимизировать биораспределение и фармакокинетику используемого 1111 [20]. Так например, полимеры на основе метакрилатов используюся для получения наночастиц для перорального введения, а на основе их модификаций с различными алкоксильными остатками разработана серия сополимеров, скорость биодеградации которых увеличивается при определенных значениях рН среды. Другим примером являются наночастицы на основе

полибутилцианакрилата используемые для доставки лекарственных препаратов через гематоэнцефалический барьер, так как при парентеральном введении таких наночастиц заметно увеличивается накопление включенного в их состав препарата в мозге [21]. В результате подбора оптимального полимера, способа включения препарата, а также при необходимости модификации поверхности наночастиц, в том числе векторными молекулами, можно добиться накопления исследуемого соединения в очаге поражения и минимизировать при этом побочные эффекты.

В качестве систем доставки часто используют линейные или разветвленные полимерные молекулы. Особенно интересными из них являются дендримеры. Они представляют собой разветвленные сферические симметричные или несимметричные макромолекулы, с большим числом терминальных ветвей, количество которых находится в прямой зависимости от поколения молекулы дендримера (рис. 2). Так, например, 1-е поколение полиамидоаминовых (РАМАМ) дендримеров содержит 8 терминальных первичных аминогрупп, 2-е - 16, 3-е - 32, при этом центральная коровая часть содержит соответствующее количество вторичных и третичных атомов азота, которые вносят вклад в общий заряд молекулы. Первоначально планировалось использовать такого рода молекулы либо в качестве катализаторов, либо в качестве подложки для них.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яббаров, Никита Григорьевич, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jain R.K. Delivery of molecular and cellular medicine to solid tumors. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. P. 149-168.

2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Drug delivery and transport to solid tumors. // Pharm Res. 2003. V. 20. №9. P. 1337-1350.

3. Presta L.G., Chen H., O'Connor S.J., Chisholm V., Meng Y.G., Krummen L., Winkler M., Ferrara N. Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. // Cancer Res. 1997. V. 57. №20. P. 4593-4599.

4. Huhn D., von Schilling C„ Wilhelm M., Ho A.D., Hallek M., Kuse R., Knauf W., Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab therapy of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Blood. 2001. V. 98. №5. P. 1326-1331.

5. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-1H) in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. // Oncogene. 2007. V. 26. №25. P. 3644-3653.

6. Stern M., Herrmann R. Overview of monoclonal antibodies in cancer therapy: present and promise. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. №1. P. 1129.

7. Goldenberg M.M. Trastuzumab, a recombinant DNA-derived humanized monoclonal antibody, a novel agent for the treatment of metastatic breast cancer. // Clin Ther. 1999. V. 21. №2. P. 309-318.

8. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado В., Gascon P. Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies: scientific update on trastuzumab and 2C4. // Adv Exp Med Biol. 2003. V. 532. P. 253-268.

9. Piccart-Gebhart M.J., Procter M., Leyland-Jones В., Goldhirsch A., Untch M., Smith I., Gianni L., Baselga J., Bell R., Jackisch C., Cameron D., Dowsett M., Barrios C.H., Steger G., Huang C.S., Andersson M., Inbar M., Lichinitser M., Lang I., Nitz U., Iwata H., Thomssen C., Lohrisch C., Suter T.M.,

Ruschoff J., Suto T., Greatorex V., Ward C., Straehle C., McFadden E., Dolci M.S., Gelber R.D. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. // N Engl J Med. 2005. V. 353. №16. P. 1659-1672.

10. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: an anti-CD33 immunoconjugate for the treatment of acute myeloid leukaemia. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. №4. P. 527-540.

11. Ricart A.D., Tolcher A.W. Technology Insight: cytotoxic drug immunoconjugates for cancer therapy. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. №4. P. 245-255.

12. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) for Relapsed CD30-Positive Lymphomas. //New England Journal of Medicine. V. 363. №19. P. 1812-1821.

13. Goyal A., Batra J.K. Inclusion of a furin-sensitive spacer enhances the cytotoxicity of ribotoxin restrictocin containing recombinant single-chain immunotoxins. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.

14. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Monoclonal antibody therapy for solid tumors. // Cancer Treat Rev. 2000. V. 26. №4. P. 269-286.

15. Baselga J. A review of EGFR targeted therapy. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. №4. P. 218-219.

16. Piccart-Gebhart M.J., Procter M., Leyland-Jones B., Goldhirsch A., Untch M., Smith I., Gianni L., Baselga J., Bell R., Jackisch C., Cameron D., Dowsett M., Barrios C.H., Steger G., Huang C.S., Andersson M., Inbar M., Lichinitser M., Lang I., Nitz U., Iwata H., Thomssen C., Lohrisch C., Suter T.M., Ruschoff J., Suto T., Greatorex V., Ward C., Straehle C., McFadden E., Dolci M.S., Gelber R.D. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. //N Engl J Med. 2005. V. 353. №16. P. 1659-1672.

17. Mohsen A., Ali K.F., Fatemeh A., Beheshteh K. C., Farhad B. Thermo- and pPI-sensitive dendrosomes as bi-phase drug delivery systems //

Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 2014. V. 9. №8. P. 12031213.

18. Ravi Kumar M.N. Nano and microparticles as controlled drug delivery devices. // J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. №2. P. 234-258.

19. Branco M.C., Schneider J.P. Self-assembling materials for therapeutic delivery. // Acta Biomaterialia 2009 V.5 P. 817.

20. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. // Adv Drug Deliv Rev. 2012. V. P.

21. Гельперина C.E. Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных частиц. Диссертация на соискание научной степени доктора химических наук. Москва 2010.

22. Tomalia D.A., Baker Н., Dewald J. et al. A new class of polymers: starburst-dendritic macromolecules // Polym. J. 1985. V. 17. №1. P. 117-132.

23. Hua C., Peng S.M., Dong C.M. Synthesis and characterization of linear-dendron- like poly(e-caprolactone)-b-poly(ethylene oxide) copolymers via the combination of ring-opening polymerization and click chemistry. // Macromolecules 2008. V. 41. №18. P. 6686-6695.

24. Svenson S., Tomalia D.A. Dendrimers in biomedical applications-reflections on the field. // Adv. Drug Delivery Rev. 2005. V. 57. №15. P. 21062129.

25. Tomalia D.A. Birth of a new macromolecular architecture: dendrimers as quantized building blocks for nanoscale synthetic polymer chemistry. // Prog. Polym. Sci. 2005. V. 30. №3-4. P. 294-324.

26. Cheng Y.Y., Xu Z.H., Ma M.L. et al. Dendrimers as drug carriers: applications in different routes of drug administration. // J. Pharm. Sci. 2008. V. 97. №1. P. 123-143.

27. Gillies E.R., Frechet J.M.J. Dendrimers and dendritic polymers in drug delivery. // Drug Discovery Today. 2005. V. 10. №1. P. 35-43.

28. Gupta U., Agashe H.B., Asthana A. et al. Dendrimers: novel polymeric nanoarchitectures for solubility enhancement. // Biomacromolecules. 2006. V. 7. №3. P. 649-658.

29. Emanuele A., Attwood D. Dendrimer-drug interactions. // Adv. Drug Delivery Rev. 2005. V. 57. №15. P. 2147-2162.

30. Kannan S., Dai H., Raghavendra S.et al. Dendrimer-based postnatal therapy for neuroinflammation and cerebral palsy in a rabbit model. // Sci. Transl. Med. 2012. V. 4. №130. P. 130-146.

31. Haba Y., Harada A., Takagishi T. et al. Synthesis of biocompatible dendrimers with a peripheral network formed by linking of polymerizable groups. //Polymer. 2005. V. 46. №6. P. 1813-1820.

32. Orive G., Hernandez R.M., Gascon A.R. et al. Micro and nano drug delivery systems in cancer therapy. // Cancer Therapy. 2005. V. 3. P. 131-138.

33. Patri A.K., Majoros I.J., Baker J.J.R. Dendritic polymer macromolecular earners for drug delivery. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. V. 6. №4. P. 466-471.

34. Agarwal A., Saraf S., Asthana A., Gupta U., Gajbhiye V., Jain N.K. Ligand based dendritic systems for tumor targeting. // International Journal of Pharmaceutics 2008. V. 350. P. 3-13.

35. Chen K., Mitchell D. Monoclonal antibody therapy for malignant glioma. //Adv. Exp. Med. Biol. 2012. V. 746. P. 121-141.

36. Miyano T., Wijagkanalan W., Kawakami S., Yamashita F., Hashida M. Anionic amino acid dendrimer-trastuzumab conjugates for specific internalization in HER2-positive cancer cells. // Molecular Pharmaceutics 2010. V. 7. P. 1318-1327.

37. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Nanoparticle Albumin - bound (nab) Technology is a Promising Method for Anti-cancer Drug Delivery. // Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 2009. V. 4. №3. P. 262-272.

38. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Targeting of albumin-embedded paclitaxel nanoparticles to tumors. //Nanomedicine. 2009. V. 5. №1. P. 73-82.

39. Campone M., Rademaker-Lakhai J.M., Bennouna J., Howell S.B., Nowotnik D.P., Beijnen J.H., Schellens J.H. Phase I and pharmacokinetic trial of AP5346, a DACH-platinum-polymer conjugate, administered weekly for three out of every 4 weeks to advanced solid tumor patients. // Cancer Chemother Pharmacol. 2007. V. 60. №4. P. 523-533.

40. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstration of a new protein fraction in serum from the human fetus. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. №2. P. 174.

41. Абелев Г.И., Перова С.Д., Храмкова Н.И., Постникова З.А., С. И.И. Эмбриональный сывороточный альфа-глобулин и его синтез перевиваемыми гепатомами мышей. //Биохимия. 1963. V. 28. №4. Р. 625-634.

42. Татаринов Ю.С. Обнаружение эмбриоспецифического а-глобулина в сыворотке крови больного первичным раком печени. // Вопр. мед. химии. 1964. V. 10. Р. 90-91.

43. Абелев Г.И., Эльгорт Д.А. Альфа-фетопротеин как иммунологический маркер гепатоцеллюлярного рака и тератокарциномы яичка и яичников. // Онкология. 1978. V. 10. Р. 3-17.

44. Brock D.J., Bolton А.Е., Monaghan J.M. Prenatal diagnosis of anencephaly through maternal serum-alphafetoprotein measurement. // Lancet. 1973. V. 2. №7835. P. 923-924.

45. Deutsch H.F. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. P. 253-312.

46. Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake C„ Ho S.K. Structures of disease-specific serum alpha-fetoprotein isoforms. // Br J Cancer. 2000. V. 83. №10. P. 1330-1337.

47. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. The presence of fatty acids in human alpha-fetoprotein. // J Biol Chem. 1978. V. 253. №7. P. 2114-2119.

48. Mizejewsky G. Alfa-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes and conformational variants. // Exp Biol Med. 2001. V. 226. №5. P. 377-408.

49. Terentiev A, Moldogazieva N. Cell adhesion proteins and a-fetoprotein. similar structural Motifs as prerequisites for common functions. // Biochemistry 2007. V. 72. №9. P. 920-35.

50. Luft A.J., Lorscheider F.L. Structural analysis of human and bovine alpha-fetoprotein by electron microscopy, image processing, and circular dichroism. // Biochemistry. 1983. V. 22. №25. P. 5978-5981.

51. Dudich I., Tokhtamysheva N., Semenkova L., Dudich E., Hellman J., Korpela T. Isolation and Structural and Functional Characterization of Two Stable Peptic Fragments of Human R-Fetoprotein. // Biochemistry 1999. V. 38. P. 1040614.

52. Алексеева M.JI. АФП: Использование в онкологии и перинатологии. //Проблемы репродукции 2000. V. 4. Р. 24-30.

53. Mizejewski G.J. Biological roles of alpha-fetoprotein during pregnancy and perinatal development. // Exp Biol Med. 2004. V. 229. №6. P. 439463.

54. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. The presence of fatty acids in human alpha-fetoprotein. // J Biol Chem. 1978. V. 253. №7. P. 2114-2119.

55. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez В., Anel A., Pineiro A. Effect of alpha-fetoprotein and albumin on the uptake of polyunsaturated fatty acids by rat hepatoma cells and fetal rat hepatocytes. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. №1. P. 81-88.

56. Mizejewski G.J., Pass K.A. Fatty acids, alpha-fetoprotein, and cystic fibrosis. //Pediatrics. 2001. V. 108. №6. P. 1370-1373.

57. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Effects of heavy metals on alpha-fetoprotein in maternal sera and amniotic fluid of pregnant mice. // Toxicology. 1990. V. 64. №1. P. 19-32.

58. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Estradiol-activated alpha-fetoprotein suppresses the uterotropic response to estrogens. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. №9. P. 2733-2737.

59. Jacobson H.I., Bennett J.A., Mizejewski G.J. Inhibition of estrogen-dependent breast cancer growth by a reaction product of alpha-fetoprotein and estradiol. // Cancer Res. 1990. V. 50. №2. P. 415-420.

60. Jacobson H.I., Lemanski N., Narendran A., Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Hormones of pregnancy, alpha-feto protein, and reduction of breast cancer risk. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. P. 477-484.

61. Terentiev A, Moldogazieva N. Structural and functional mapping of a-fetoprotein. // Biochemistry 2006. V. 71. №2. P. 120-32.

62. Абелев Г. И. Альфа-фетопротеин - взгляд в биологию развития и природу опухолей. // Соросовский образовательный журнал 1998. V. 9. Р. 813.

63. Laan-Putsep К., Wigzell Н., Cotran P., Gidlund М. Human alpha-fetoprotein (AFP) causes a selective down regulation of monocyte MHC class II molecules without altering other induced or noninduced monocyte markers or functions in monocytoid cell lines. // Cell Immunol. 1991. V. 133. №2. P. 506-518.

64. Chakraborty M., Mandal C. Immuno-suppressive effect of human alphafetoprotein: a cross species study. // Immunol Invest. 1993. V. 22. №5. P. 329-339.

65. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. {alpha}-Fetoprotein Impairs APC Function and Induces Their Apoptosis. // J Immunol. 2004. V. 173. №3. P. 1772-1778.

66. Matsuura E., Kang Y., Kitakawa H., Ogata A., Kotani Т., Ohtaki S., Nishi S. Modulation of T cell function by alpha-fetoprotein: An in vivo study on porcine thyroid peroxidase-induced experimental autoimmune thyroiditis in transgenic mice producing human alpha-fetoprotein. I I Tumour Biol. 1999. V. 20. №3. P. 162-171.

67. Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Amelioration of autoimmune neuroinflammation by recombinant human alpha-fetoprotein. // Exp Neurol. 2006. V. 198. №1. P. 136144.

68. Черешнев B.A., Родионов С.Ю., Черкасов B.A., Малютина Н.Н., Орлов О.А. Альфа-фетопротеин. // Екатеринбург: УрО РАН. 2004.

69. Mizejewski G.J. Biological role of alpha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. №6. P. 709-735.

70. Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. The promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402 cell line. // World J Gastroenterol. 2002. V. 8. №3. P. 469-475.

71. Li M.S., Li P.F, Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. The intracellular mechanism of alpha-fetoprotein promoting the proliferation of NIH 3T3 cells. // Cell Res. 2002. V. 12. №2. P. 151-156.

72. Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Enhancement of proliferation of HeLa cells by the alpha-fetoprotein. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2002. V. 34. №6. P. 769-774.

73. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alpha-fetoprotein: A new member of intracellular signal molecules in regulation of the PI3K/AKT signaling in human hepatoma cell lines. // Int J Cancer. V. P. 2011. V.128. №3. P.524-32.

74. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto Т., Lisanti M.P. Caveolins, liquid-ordered domains, and signal transduction. // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. №11. P. 7289-7304.

75. Laderoute M.P., Pilarski L.M. The inhibition of apoptosis by alpha-fetoprotein (AFP) and the role of AFP receptors in anti-cellular senescence. // Anticancer Res. 1994. V. 14. №6B. P. 2429-2438.

76. Ohkawa К., Hatano Т., Tsukada Y., Matsuda M. Chemotherapeutic efficacy of the protein-doxorubicin conjugates on multidrug resistant rat hepatoma cell line in vitro. II Br J Cancer. 1993. V. 67. №2. P. 274-278,

77. Li M.S., Ma Q.L., Chen Q., Liu X.H., Li P.F., Du G.G., Li G. Alpha-fetoprotein triggers hepatoma cells escaping from immune surveillance through altering the expression of FaslFasL and tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand and its receptor of lymphocytes and liver cancer cells. // World J Gastroenterol. 2005. V. 11. №17. P. 2564-2569.

78. Mengsen L., Sheng Z., Xinhua L., Pingfeng L., Michael A.M., Gang L. □-Fetoprotein shields hepatocellular carcinoma cells from apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. // Cancer letters. 2007. V. 249. №2. P. 227-234.

79. Li M., Li H., Li C., Zhou S., Guo L., Liu H., Jiang W., Liu X., Li P., McNutt M.A., Li G. Alpha fetoprotein is a novel protein-binding partner for caspase-3 and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells. // Int J Cancer. 2009. V. 124. №12. P. 2845-2854.

80. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. №5. P. 377-408.

81. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Tandem arrangement of the albumin and alpha-fetoprotein genes in the human genome. // Gene. 1984. V. 32. №3. P. 255-261.

82. Лазаревич Н.Л. Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена альфа-фетопротеина. // Биохимия. 2000. V. 65. №1. Р. 139-158.

83. Jose-Estanyol М., Danan J.L. A liver-specific factor and nuclear factor I bind to the rat alpha-fetoprotein promoter. // J Biol Chem. 1988. V. 263. №22. P. 10865-10871.

84. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Hepatocyte nuclear factor 3 relieves chromatin-mediated repression of the alpha-fetoprotein gene. // J Biol Chem. 1999. V. 274. №35. P. 25113-25120.

85. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. The alpha 1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family. // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. №7. P. 3853-3865.

86. Bernier D., Thomassin H., Allard D., Guertin M., Hamel D., Blaquiere M., Beauchemin M., LaRue H., Estable-Puig M., Belanger L. Functional analysis of developmentally regulated chromatin-hypersensitive domains carrying the alpha 1-fetoprotein gene promoter and the albumin/alpha 1-fetoprotein intergenic enhancer. //Mol Cell Biol. 1993. V. 13. №3. P. 1619-1633.

87. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 is a repressor of a-fetoprotein expression in human hepatoma cell lines. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. №6. P. 2772-2780.

88. Taube J.H., Allton K., Duncan S.A., Shen L., Barton M.C. Foxal Functions as a Pioneer Transcription Factor at Transposable Elements to Activate Afp during Differentiation of Embryonic Stem Cells. // Journal of Biological Chemistry. V. 285. №21. P. 16135-16144.

89. Cui R., Nguyen T.T., Taube J.H., Stratton S.A., Feuerman M.H., Barton M.C. Family Members p53 and p73 Act Together in Chromatin Modification and Direct Repression of 0±-Fetoprotein Transcription. // Journal of Biological Chemistry. 2005. V. 280. №47. P. 39152-39160.

90. Van Reeth T., Gabant P., Szpirer C., Szpirer J. Stimulation of the [alpha]-fetoprotein promoter by unliganded thyroid hormone receptor in association with protein deacetylation. // Molecular and Cellular Endocrinology. 2002. V. 188. №1-2. P. 99-109.

91. Lienard P., De Mees C., Draze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Regulation of the alpha-fetoprotein promoter: Ku binding and DNA spatial conformation. // Biochimie. 2006. V. 88. №10. P. 1409-1417.

92. Xie Z., Zhang H., Tsai W., Zhang Y., Du Y., Zhong J., Szpirer C., Zhu M., Cao X., Barton M.C., Grusby M.J., Zhang W.J. Zinc finger protein ZBTB20 is a key repressor of alpha-fetoprotein gene transcription in liver. //

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. V. 105. №31. P. 1085910864.

93. Piper R.C., Luzio J.P. Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. // Traffic. 2001. V. 2. №9. P. 612-621.

94. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, a membrane-remodelling GTPase. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. №2. P. 75-88.

95. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinomas and its usefulness in tumor scintigraphy. //Cancer Res. 1984. V. 44. №11. P. 5314-5319.

96. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Role of dynamin in clathrin-coated vesicle formation. // Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. 1995. V. 60. P. 235-242.

97. Stahl P.D., Barbieri M.A. Multivesicular bodies and multivesicular endosomes: the "ins and outs" of endosomal traffic. // Science's STKE : signal transduction knowledge environment. 2002. V. 2002. №141. P. pe32.

98. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Alphafoetoprotein uptake by cloned cell lines derived from a nickel-induced rat rhabdomyosarcoma. // Br J Cancer. 1983. V. 48. №2. P. 261-269.

99. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. The uptake of alphafoetoprotein by C-1300 mouse neuroblastoma cells. // Br J Cancer. 1985. V. 51. №6. P. 791-797.

100. Laborda J., Naval J., Allouche M., Calvo M., Georgoulias V., Mishal Z., Uriel J. Specific uptake of alpha-fetoprotein by malignant human lymphoid cells. //Int J Cancer. 1987. V. 40. №3. P. 314-318.

101. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. №3. P. 1322-1327.

102. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Cell-type-specific receptors for alpha-fetoprotein in a mouse T-lymphoma cell line. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. №10. P. 3301-3305.

103. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. // J Clin Invest. 1992. V. 90. №4. P. 1530-1536.

104. Moura V., Lacerda M., Figueiredo P., Corvo M.L., Cruz M.E., Soares R., de Lima M.C., Simoes S., Moreira J.N. Targeted and intracellular triggered delivery of therapeutics to cancer cells and the tumor microenvironment: impact on the treatment of breast cancer. // Breast cancer research and treatment. 2012. V. 133. №1. P. 61-73.

105. Biddle W., Sarcione E.J. Specific cytoplasmic alpha-fetoprotein binding protein in MCF-7 human breast cancer cells and primary breast cancer tissue. // Breast Cancer Res Treat. 1987. V. 10. №3. P. 279-286.

106. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein binding proteins: implications for transmembrane passage and subcellular localization. // Life Sci. 1995. V. 56. №1. P. 1-9.

107. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Activation of an alpha-fetoprotein (AFP)/receptor autocrine loop in HT-29 human colon carcinoma cells. // Int J Cancer. 1991. V. 49. №3. P. 425-430.

108. Posypanova G. A., Gorokhovets N. V., Makarov V .A., Savvateeva L. V., Kireeva N. N., Severin S. E. and Severin E. S. Recombinant alpha-fetoprotein C-tenninal fragment: The new recombinant vector for targeted delivery. // Journal of Drug Targeting 2008. V.16. №4. P.321 - 328.

109. Cohen S. Isolataion of a mous submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eylid opening in the new-born animal. // J. Biol. Chem. 1962. V. 273. P.1555-1562.

110. Gregory H. Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor. // Nature. 1975. V. 257. P. 325-327.

111. Savage Jr C.R., Hash G.H., Cohen S. Epidermal growth factor, location of disulfide bonds. // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 7669-7672.

112. Savage Jr C. R., Inagami T., Cohen S. The primary structure of epidermal growth factor. // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 7612-7621.

113. Uriel J., Failly-Crepin C., Villacampa M.J., Pineiro A., Geuskens M. Incorporation of alpha-fetoprotein by the MCF-7 human breast cancer cell line. // Tumor Biology. 1984. V. 5. P. 41-46.

114. Ullrich A., Coussens L., Hayflick J.S., Dull T.J., Gray A., Tarn A.W., Lee J., Yarden Y., Libermann T.A., Schlessinger J. Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells. //Nature 1984. V. 309. P. 418-425.

115. Coussens L., Yang-Feng T.L., Liao Y.C., Chen E., Gray A., McGrath J., Seeburg P.H., Libermann T.A., Schlessinger J., Francke U. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. // Science 1985. V. 230. P. 1132-1139.

116. Kraus M.H., Issing W., Miki T., Popescu N.C., Aaronson S.A. 1989 Isolation and characterization of ERBB3, a third member of the ERBB/epidermal growth factor receptor family: evidence for overexpression in a subset of human mammary tumors. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. P. 9193-7.

117. Plowman G., Culouscou J., Whitney G., Green J., Carlton G., Foy L., Neubauer M., Shoyab M. Ligand-specific activation of HER4/pl80erbb4, a fourth member of the epidermal growth factor receptor family. // Proc Natl Acad Sci USA 1993. V. 90. P. 1746-1750.

118. Sako Y., Minoghchi S., Yanagida T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. // Nat Cell Biol. 2000. V. 2. P. 168172.

119. Alroy I., Yarden Y. The ErbB signaling network in embryogenesis and oncogenesis: signal diversification through combinatorial ligand-receptor interactions. //FEBS Lett. 1997. V. 410. P. 83-86.

120. Riese D.J., Stern D.F. Specificity within the EGF family/ErbB receptor family signaling network. // Bioessays 1998. V.20 P. 41-48.

121. Grant S., Qiao L., Dent P. Roles of erbB family receptor tyrosine kinases, and downstream signalling pathways, in the control of cell growth and survival. // Front Biosci. 2002. V. 7. P. 376-389.

122. Testa J.R., Bellacosa A. AKT plays a central role in tumorigenesis. //Proc Natl Acad Sci USA 2001. V. 98. P. 10983-10985.

123. Kainulainen V., Sundwall M., Maatta S.A. A natural erbB4 isoform that does not activate phosphoinositide 3-kinase, mediates proliferation but not survival or chemotaxis. // J Biol Chem 2000. V. 275. P. 8641-8649.

124. Kikani C.K., Dong L.Q., Liu F. "New"-clear functions of PDK1: beyond a master kinase in the cytosol? // J Cell Biochem. 2005. V. 96. P. 1157-62.

125.Fearn J.C., King A.C. EGF receptor affinity is regulated by intracellular calcium and protein kinase C. // Cell 1985. V. 40. P. 991-1000.

126. Belsches A.P., Plaskell M.D., Parsons S.J. Role of c-Src tyrosine kinase in EGF-induced mitogenesis. // Front Biosci. 1997. V. 2. P. 501-18.

127. Shi C.S., Kehrl J.H. Pyk2 amplifies epidermal growth factor and c-Src-induced Stat3 activation. // J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 17224-31.

128. Shu L., Shayman J.A.. Src kinase mediates the regulation of phospholipase C-gamma activity by glycosphingolipids. // J Biol Chem. 2003. V. 15. P. 31419-25.

129. Bost F., McKay R., Dean N., Mercola D. The JUN kinase/stress-activated protein kinase pathway is required for epidermal growth factor stimulation of growth of human A549 lung carcinoma cells. // J.Biol.Chem. 1997. V. 272. P. 33422-33429.

130. Lo H.W. Nuclear mode of the EGFR signaling network: biology, prognostic value, and therapeutic implications. // Discov Med. 2010. V. 10. P. 4451.

131. Arteaga,C.L. (2002) Epidermal growth factor receptor dependence in human tumors: more than just expression? // Oncologist. 2002. V. 7. P. 31-39.

132. Roepstorff K., Grovdal L., Grandal M., Lerdrup M., van Deurs B. Endocytic downregulation of ErbB receptors: mechanisms and relevance in cancer. // Histochem Cell Biol. 2008. V. 129. P. 563-78.

133. Sorkin A., Goh L.K. Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs. //Exp Cell Res. 2008. V. 314. P. 3093-106.

134. Grandal M.V., Madshus I.H. Epidermal growth factor receptor and cancer: control of oncogenic signalling by endocytosis. // J Cell Mol Med. 2008. V. 12. P. 1527-34.

135. Rodemer C., Haucke V. Clathrin/AP-2-dependent endocytosis: a novel playground for the pharmacological toolbox? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. №186. P. 105-122.

136. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // The Biochemical journal. 2004. V. 377. №Pt 1. P. 1-16.

137. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. // The Journal of cell biology. 1993. V. 123. P. 1373-1387.

138. Stahl P.D., Barbieri M.A. Multivesicular bodies and multivesicular endosomes: the "ins and outs" of endosomal traffic. // Science's STKE : signal transduction knowledge environment. 2002. V. 2002. №141. P. pe32.

139. Piper R.C., Luzio J.P. Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. // Traffic. 2001. V. 2. №9. P. 612-621.

140. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Endolysosomal proteolysis and its regulation. // The Biochemical journal. 2002. V. 363. №3. P. 417-429.

141. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. №1. P. 32-45.

142. Lajoie P., Nabi I.R. Chapter 3 - Lipid Rafts, Caveolae, and Their Endocytosis. In: Kwang W.J., editor. International Review of Cell and Molecular Biology: Academic Press. 2010. P. 135-163.

143. Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Liposome composition is important for retention of liposomal rhodamine in P-glycoprotein-overexpressing cancer cells. // Drug Deliv. 2009. V. 16. №5. P. 261-267.

144. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tamaoki T. Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA. // Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. №15. P. 4604-4608.

145. Bogush Т., Robert J. Comparative evaluation of the intracellular accumulation and DNA binding of idarubicin and daunorubicin in sensitive and multidrug-resistant human leukaemia K562 cells. // Anticancer Res. 1996. V. 16. № 1. P. 365-368.

146. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Factors Influencing the Ability of Nuclear Localization Sequence Peptides To Enhance Nonviral Gene Delivery. //Bioconjugate Chemistry. 2003. V. 15. №1. P. 152-161.

147. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Synthesis of 2'-0-[2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethyl] modified nucleosides and oligonucleotides. // J Org Chem. 2002. V. 67. №2. P. 357-369.

148. Ohkawa K., Hatano Т., Tsukada Y., Matsuda M. Chemotherapeutic efficacy of the protein-doxorubicin conjugates on multidrug resistant rat hepatoma cell line in vitro. II Br J Cancer. 1993. V. 67. №2. P. 274-278.

149. Guillemard V., Uri Saragovi H. Prodrug chemotherapeutics bypass p-glycoprotein resistance and kill tumors in vivo with high efficacy and target-dependent selectivity. // Oncogene. 2004. V. 23. №20. P. 3613-3621.

150. Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Cellular accumulation and cytotoxicity of macromolecular platinum complexes in cisplatin-resistant tumor cells. // J Control Release. 2008. V. 131. №2. P. 100-106.

151. Chitambar C.R. Gallium compounds as antineoplastic agents. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. №6. P. 547-552.

152. Shen W.C., Ryser H.J. cis-Aconityl spacer between daunomycin and macromolecular carriers: a model of pH-sensitive linkage releasing drug from a lysosomotropic conjugate. // Biochem Biophys Res Commun. 1981. V. 102. P. 1048-1054.

153.B6yum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood // Scand J Clin Lab Invest Suppl 1968. V. 21. P. 77-89.

154. Denizot F., Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival, Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. // J Immunol Methods 1986. V. 89. P. 271-277.

155. Batas D., Chaudhuri J. Protein refolding at high concentration using size-exclusion chromatography // Biotechnol. Bioeng. 1996. V. 50. P. 16-23.

156. Gu Z., Su Z., Janson J. Urea gradient size-exclusion chromatography enhanced the yield of lysozyme refolding. // J Chromatogr A 2001. V. 918. P. 311318.

157. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature 1970. V. 277. P. 680-685.

158. Ellman G. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82. P. 70-77.

159. Ницветов М.Б., Родина A.B., Москалева Е.Б. и др. // Вопр. Биол. Мед. Фармац. Химии 2001. Т. 3. С. 19

160. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. (1989) Mol. Immunol. 1989. V. 26. P. 851-857.

161. Rostovtsev V.V., Green L.G., Fokin V.V., Sharpless K.B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective "Ligation" of Azides and Terminal Alkynes. // Angew. Chem. 2002. V. 41. P. 2596-2599.

162. Sampathkumar S.G., Yarema K.J. Dendrimers for cancer treatment and diagnosis. // Nanotechnologies for the Life Sciences, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2007. V. 7.

163. Perumal O.P., Inapagolla R., Kannan S., Kannan R.M. The effect of surface functionality on cellular trafficking of dendrimers. // Biomaterials 2008. V. 29. P. 3469-3476.

164. Kitchens K.M., Kolhatkar R.B., Swaan P.W., Ghandehari H. Endocytosis inhibitors Prevent Poly(Amidoamine) Dendrimer Internalization and permeability across Caco-2 cells. //Mol. Pharm. 2008. V. 5. P. 364-369.

165. Saovapakhiran A., D'Emanuele A., Attwood D., Penny J. Surface modification of РАМАМ dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. //Bioconjug. Chem. 2009. V. 20. P. 693-701.

166. Qi R., Mullen D.G., Baker J.R., Banaszak Holl M.M. The mechanism of polyplexes internationalization into cells: testing the GMl/caveolin-1-mediated lipid raft mediated endocytosis pathway. // Mol. Pharm.2009. V. 7. P. 267-279.

167. Kitchens K.M., Foraker A.B., Kolhatkar R.B., Swaan P.W., Ghandehari H. Endocytosis and Interaction of Poly(amidoamine) (РАМАМ) dendrimers with Caco-2 Cells. // Pharm. Res. 2007. V. 24. P. 2138-2145.

168. Seib F.P., Jones A.T., Duncan R. Comparison of the endocytic properties of linear and branched PEIs, and cationic РАМАМ dendrimers in В16П0 melanoma cells. // (2007) J. Contr. Rel. 2007. V. 117. P. 291-300.

169. Albertazzi L., Serresi M., Albanese A., Beltram F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. // (2010) Mol. Pharm. 2010. V. 7. P. 680-688.

170. Moskaleva E.Y., Posypanova G.A., Koromyslova I.A., Shmyrev I.I., Krivonos A.V., Myagkikh I.V., Feldman N.B., Finakova G.V., Katukov V.Y., Luzhkov Y.M., Nakachian R., Andreani J., Severin E.S., Severin S.E. In vivo antitumor activity of cytotoxic drugs conjugated with human alpha-fetoprotein. // Tumor Targeting 1996. V. 2. P. 299-306.

171. Северин C.E., Посыпанова Г.А., Сотниченко А.И., Москалева ЕЛО., Фельдман Н.Б., Григорьев М.И., Северин Е.С., Петров Р.В. Противоопухолевая активность ковалентного конъюгата ендиинового антибиотика эсперамицина А1 с а-фетопротеином человека. // (1999) Докл. Акад. Наук. 1999. V. 366. Р. 561-564.

172. Годованный А.В., Савватеева М.В., Сотниченко А.И., Яббаров Н.Г., Климова О.В., Гнучев Н.В. Изучение противоопухолевой активности in vitro конъюгата рекомбинантного С-концевого домена АФП с цисплатином. // Молекуляр. Медицина 2011. V. 1. Р. 44-48.

173. Schäfer A., Pahnke A., Schaffert D., van Weerden W.M., de Ridder C.M., Rödl W., Vetter A., Spitzweg C., Kraaij R., Wagner E., Ogris M. Disconnecting the yin and yang relation of epidermal growth factor receptor (EGFR)-mediated delivery: a fully synthetic, EGFR-targeted gene transfer system avoiding receptor activation. // Hum Gene Ther. 2011. V. 22. P. 1463-73.

174. Moro R., Tcherkassova J., Song E. A new broad-spectrum cancer marker. IVD Technology http://www.ivdtechnology.com/article/new-broad-spectrum-cancer-marker. IVD Technology http://www.ivdtechnology.com/article/new-broad-spectrum-cancer-marker 2005 [cited; Available from: http://www.ivdtechnology.com/article/new-broad-spectrum-cancer-marker.

175. Шарапова O.A., Позднякова H.B., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Посыпанова Г.А., Андронова С.М., Федоров А.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Выделение и характеристика рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека, соответсвующего С-концевому структурному домену //Биоорг. Химия 2010. V. 36. Р. 760-768.

176. Esteban, С., Trojan, J., Macho, A., Mishal, Z., Lafarge-Frayssinet, С., Uriel, J. Activation of an alpha-fetoprotein/receptor pathway in human normal and malignant peripheral blood mononuclear cells. // Leukemia 1993. V. 7. P. 18071816.

177. Фельдман Н.Б. Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных факторов. Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук. Москва 2010.