Разработка основных технологических процессов промышленного производства сухой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Павленко, Игорь Викторович

• Павленко, Игорь Викторович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Павленко, Игорь Викторович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Разработка питательной среды для выращивания листерий

2.2.2. Разработка управляемого процесса культивирования листерий

2.2.3. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении живой сухой вакцины против листериоза сельскохозяйствен -ных животных

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 66 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 67 ПРИЛОЖЕНИЯ

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

АНКУМ - 2М - аппаратура непрерывного культивирования микроорганизмов НТД - научно - техническая документация

РФ - Российская Федерация

ИСОПОЛ - Международный симпозиум по листериозу

ВНИТИБП - Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

ФГМС - ферментативный мышечный гидролизат сухой

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

ЗС - защитная среда высушивания

ПФЭ - полный факторный эксперимент

ДФЭ - дробный факторный эксперимент рН - концентрации водородных ионов еН - окислительно-восстановительный потенциал рС>2 - парциальное давление растворённого кислорода

КФБ - калий-фосфатный буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка основных технологических процессов промышленного производства сухой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных»

Актуальность проблемы. Листериоз является широко распространенной инфекционной болезнью, наносящей значительный ущерб животноводству, и представляет серьезную угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, наличием большого числа как патогенных, так и непатогенных штаммов. Основным источником возбудителя листериоза являются сельскохозяйственные животные - овцы, свиньи и крупный рогатый скот. Длительное бактерионосительство среди животных приводит к высокому уровню обсеменения листериями пищевого сырья и продуктов его переработки [117, 120, 132, 143, 146, 148, 149]. Экономический ущерб от листериоза связан с большой летальностью, снижением продуктивности животных, абортами, а также затратами на ветеринарно-санитарные ограничительные мероприятия. Листериоз появляется спорадически, реже эпизодически. Летальность при нервных формах может достигать 98 - 100 %,а при септических - 50 % [7, 61, 62]. Листериоз животных зарегистрирован в 82 странах мира, Россия входит в их число [59].

Долгое время производство ветеринарных биопрепаратов базировалось на эмпирических данных. В настоящее время разработка технологических процессов производства биопрепаратов немыслима без математических методов планирования эксперимента.

Традиционные питательные среды, используемые для культивирования листерий не стандартны, не оптимальны по своему составу и имеют высокую стоимость. Усовершенствование питательной среды для выращивания листерий приведет к оптимизации её состава.

Технология изготовления бактериальных вакцин - многоцелевая проблема, одним из ключевых направлений которой является разработка современных процессов культивирования микроорганизмов, позволяющая увеличить выход конечного продукта и получить эффективные ветеринарные препараты.

В фундаментальных работах, посвященных культивированию непатогенных микроорганизмов, приводятся материалы исследований, связанные с общими вопросами микробиологического синтеза, закономерностями и факторами, оказывающими влияние на рост и развитие продуцентов, а также с разработкой научных основ оптимизации выращивания микроорганизмов с применением современного технологического и аппаратного оформления процессов [1, 8, 13, 55,80].

Общие теоретические и прикладные аспекты проблемы культивирования отдельных патогенных микроорганизмов достаточно глубоко рассматриваются рядом медицинских исследователей [9, 10, 11, 12].

До настоящего времени процесс неуправляемого культивирования листерий длится 16 - 18 часов и при этом выход накопления биомассы невысок. Управляемое культивирование может привести к сокращению времени выращивания микроорганизмов и повысить выход конечного продукта.

Сублимационное высушивание является конечной стадией производства живых биопрепаратов, при этом важное значение отводится защитным средам, которые влияют не только на процесс высушивания бактериальной массы, но и на сохраняемость её свойств, особенно при длительном хранении.

Поэтому, изыскание оптимальных защитных сред высушивания, которые могут обеспечить высокую эффективность биологических препаратов по окончании сублимационной сушки и при последующем хранении, является насущной проблемой.

В связи с вышеизложенным, весьма актуальным задачей при производстве вакцин против листериоза сельскохозяйственных животных является разработка технологических этапов, основными из которых являются: разработка питательных сред для выращивания листерий; разработка управляемого режима культивирования и оптимизация защитной среды высушивания. Поставленная задача по разработке технологических этапов решалась с использованием современных методов оптимизации (математического планирования эксперимента и статистической обработки результатов).

Цель и задачи исследования. Целью работы явились исследования по разработке основных технологических этапов изготовления сухой живой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- оптимизация состава питательной среды для выращивания листерий;

- разработка управляемого процесса глубинного культивирования листерий;

- оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении живой сухой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных.

Научная новизна работы. Разработаны основные технологические этапы производства живой сухой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных, с использованием математических методов планирования эксперимента, что позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления листерий, значения концентраций компонентов питательной среды, параметры управляемого режима культивирования листерий, оптимизировать защитную среду высушивания.

Разработанная питательная среда позволяет в 2,3 раза повысить накопление листерий по сравнению с традиционной. Одним из преимуществ этой среды является замена автолизата печени крупного рогатого скота и добавляемой смеси витаминов группы В на дрожжевой экстракт.

Впервые разработанный режим управляемого культивирования позволил сократить время выращивания листерий в 1,5-2 раза и повысить количество жизнеспособных листерий в 2 раза.

Разработка защитной среды высушивания позволила на 20 - 40 % повысить сохранность жизнеспособных листерий после сублимационного высушивания в процессе хранения, чем традиционная защитная среда.

Практическая ценность работы. Разработанный оптимальный состав питательной среды, режим глубинного управляемого культивирования, оптимизированная защитная среда высушивания рекомендованы для использования в производстве вакцины против листериоза.

На основании полученных результатов разработана и утверждена научно-техническая документация:

- «Инструкция по изготовлению вакцины бивалентной сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных», утверждена директором Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности 26.10.1994 г.;

- Технические условия 080-64-19-48-94 «Вакцина бивалентная сухая живая против листериоза сельскохозяйственных животных», утверждены директором Всероссийского государственного института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов 02.11.1994 г.;

- получен патент РФ на изобретение № 2053790 от 10.02.96 г. «Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных».

Опытно-промышленные серии сухой живой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных изготовлены и выпущены на Ставропольской биофабрике; прошли испытания в животноводческих хозяйствах края с положительным результатом.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации доложены на:

-Всероссийской научно-практической конференции ВНИТИБП (1996 г.);

-Международной научно-практической конференции ВНИТИБП (2003 г.);

-межлабораторном совещании сотрудников ВНИТИБП (2003 г.).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Со времени первого описания листериоза у животных прошло более 100 лет. Значение этой инфекции в патологии людей и животных не только не уменьшилось, а даже возросло.

Официальная регистрация болезни в нашей стране производится с 1956 года у животных и с 1992 года у людей [5, 155].

С 50-х годов 20-го столетия началось интенсивное изучение листериоза в мире. С 1957 года регулярно, каждые четыре года, проводятся Международные Симпозиумы по листериозу (ИСОПОЛ) [7].

Проблемой листериоза занимаются такие видные ученые как Д. Джонс (Англия), Ж. Рокур (Франция), И. Иванов (Болгария), Б. Ралович (Венгрия), И.А. Бакулов, В.М. Котляров (Россия) [7].

Работы Российских ученых И.А. Бакулова, В.М. Котлярова, И.И. Гуславского, С.П. Карпова, Я.П. Лысенко, В.Л. Адамовича, В.И. Гершуна и др. - посвящены изучению биологии возбудителя листериоза, путей выделения листерий во внешнюю среду, способов заражения, эпизоотологии заболевания (пути распространения болезни, характер течения инфекции в хозяйствах, периодичность, сезонность, повторяемость, летальность), иммунитета; изысканию высокоэффективных средств профилактики заболевания и технологии производства вакцин [7].

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных технологических процессов. При производстве биопрепаратов можно выделить следующие технологические процессы: очистка и стерилизация газов, приготовление посевного материала, приготовление питательных сред, культивирование микроорганизмов, выделение и очистка бактерийных препаратов, инактивация микробной среды, инактивация микробной массы, стандартизация вакцины, расфасовка вакцины, лиофильное высушивание биопрепаратов, укупорка и закатка флаконов или запайка ампул, этикетировка и упаковка готовой продукции [99].

1.1. Питательные потребности микроорганизмов

Одним из основных факторов, определяющих рост микроорганизмов является питательная среда и её состав.

При подборе состава питательной среды для культивирования микроорганизмов следует учитывать множество факторов. Один из них связан со стереометрией роста бактерий и количеством биомассы, которое необходимо получить в процессе культивирования. Основой расчетов является материальный баланс, связанный с превращением в процессе клеточного роста низкомолекулярных органических и неорганических соединений в биомассу. Для синтеза заданного количества биомассы в систему культивирования необходимо ввести достаточное количество питательных веществ, взятых в определенном соотношении [99].

Источники углерода. Среди элементов, используемых в качестве питательных веществ, одним из важнейших является углерод, содержание которого в пересчете на сухую массу составляет около 50%. Любое углеродное соединение расщепляется клеткой до низкомолекулярного вещества.

В качестве источников углерода микроорганизмы используют разнообразные органические соединения: сахара, спирты, органические кислоты, углеводороды, липиды и др.

Способность к усвоению того или иного углеродсодержащего субстрата в значительной степени определяется видом микроорганизма, однако можно выделить и общие закономерности. Наиболее доступны для большинства микроорганизмов соединения, содержащие полуокисленные атомы углерода в группах - СН2ОН, - СНОН -, = СОН -, то есть сахара, органические спирты (глицерин, маннит) и органические кислоты. Такие вещества, с одной стороны, обладают достаточно большим запасом энергии, выделяющейся при их окислении, с другой стороны, они легко вступают в окислительно-восстановительные реакции, протекающие в клетке. Нередко источником углерода служат высокомолекулярные соединения, например, крахмал или целлюлоза, однако такие вещества сначала расщепляют на составляющие их низкомолекулярные вещества (крахмал - на глюкозу), которые далее вовлекаются в биохимические процессы. Высокомолекулярные соединения могут распадаться в процессе предварительной обработки сырья (например, при кислотном гидролизе) или непосредственно во время ферментации с помощью выделяемых микроорганизмами ферментов [55, 99, 100].

В процессе окисления углеродосодержащих субстратов в клетках высвобождается энергия при разрыве макроэнергитических связей в молекулах аденозинтрифосфата (АТФ), поэтому источник углерода в большинстве случаев служит одновременно источником энергии для микроорганизмов [55, 99].

Источники азота. Азот необходим клеткам для построения ряда жизненно важных веществ, в первую очередь аминокислот и белков. Наиболее доступен для большинства микроорганизмов ион аммония NH * , легко проникающий через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану и используемый для синтеза амино- и иминогрупп аминокислот. В связи с этим в состав питательных сред часто включают аммонийные соли (NH^SC^ и NH4CI.

При потреблении ионов аммония культурой происходит подкисление

-2 культуральной жидкости вследствии образования избытка анионов SO4 или С1", что приводит к торможению роста бактерий. Для ослабления этого нежелательного эффекта в состав питательных сред вместе с аммонийными солями обычно вносят нейтрализирующий агент, связывающий освобождающиеся анионы. Аммонийный азот может быть внесен в среду также в виде водного раствора аммиака. Этот раствор часто используют в качестве титрующего агента для поддержания рН культуральной жидкости, и одновременно он служит источником азота [55, 99].

Многие микроорганизмы наряду с аммонийным способны усваивать и нитринный азот, вносимый с солями NaNC>3, KN03 NH4NO3 (последняя соль содержит азот в нитратной и в аммонийной формах). Однако при этом микроорганизмы предварительно восстанавливают нитратный азот до аммиака и при росте на среде, содержащей нитрат аммония, в первую очередь потребляют ионы аммония и лишь затем анионы NO3. При потреблении нитратного азота в среде остаются катионы К+, Na+, вызывающие под-щелачивание среды, поэтому нитратный азот предпочтительней использовать для культивирования микроорганизмов, которые не могут развиваться в кислой среде.

В качестве источников азота микроорганизмы могут использовать органические соединения: аминокислоты, пептиды, белки. Белки, как и все высокомолекулярные соединения, потребляются после расщепления на аминокислоты и пептиды с помощью протеиназ, поэтому расти на средах, содержащих в качестве единственного источника азота белки или продукты их частичного гидролиза (пептоны), могут лишь микроорганизмы, обладающие высокой протолитической активностью. Наряду с пептонами нередко используются субстраты, полученные при кислотном гидролизе белка (чаще всего казеина), в которые входят свободные аминокислоты. Гидролизат казеина содержит полный набор аминокислот (за исключением триптофана, разрушающегося при кислотном гидролизе) и является универсальным источником азота. При внесении гидролизата казеина в среду совместно с триптофаном микроорганизмы переключаются на так называемый «аминогетеротрофный» тип питания, потребляют аминокислоты в готовом виде. Подкисления или подщелачивания среды не происходит. Иначе обстоит дело, когда в гидролизате не хватает хотя бы одной из аминокислот, необходимых для синтеза белков. В этом случае клетка вынуждена синтезировать недостающие аминокислоты из имеющихся или из органических кислот, или аммиака, получаемого при дезаминировании аминокислот. Вполне понятно, что смесь отдельных аминокислот усваивается хуже, чем полная смесь аминокислот и аммонийных солей [55, 99].

Источники фосфора. Фосфор необходим микроорганизмам для синтеза ряда важнейших соединений - фосфолипидов, коферментов, нуклеиновых кислот, АТФ и др. Органические соединения фосфора используются микроорганизмами как аккумуляторы энергии, освобождающейся в процессе окисления. В питательной среде должны присутствовать фосфаты в виде неорганических одно - или двузамещенных фосфатов калия или натрия КН2Р04, K2HP04, NaH2P04, Na2HP04. Реже используются органические источники фосфора, например продукты разложения нуклеиновых кислот. Довольно большое количество фосфора содержится в таком распространенном сырье, как кукурузный экстракт [99].

Микроэлементы и факторы роста. Термин «факторы роста» используется для обозначения особенно важных источников питания, таких как аминокислоты, витамины, пуриновые и пиримидиновые соединения. Факторы роста необходимы микроорганизмам в малых дозах, которые используются для построения клеточных структур, а также потому, что они входят в состав активных центров многих ферментов [55].

В относительно больших количествах микроорганизмам необходим углерод, кислород, азот, водород, фосфор, сера, калий, кальций, железо, магний. Содержание сухих веществ в бактериальной массе составляет от 2 до 14%. Необходимы также и микроэлементы: медь, цинк, кобальт, никель, хлор, натрий, кремний, молибден, марганец и др. Факторы роста требуются только в тех случаях, когда культура неспособна самостоятельно синтезировать те или иные органические соединения. Они неодинаковы для разных микроорганизмов -одно и тоже вещество может стимулировать рост одной культуры и не влиять или даже подавлять рост другой. Многие микроорганизмы вообще не требуют ростовых факторов. Факторы роста вносятся в питательную среду в чистом виде или в составе комплексных источников питания (например, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт) [55, 99].

Вода. Для развития микроорганизмов не меньше, чем питательные вещества необходима вода. Как известно, многие органические продукты могут длительное время храниться в сухом виде, не подвергаясь разложению микроорганизмами [135, 136]. Содержание воды в растворе или субстрате количественно выражают величиной активности воды (aw) - отношением парциального давления пара раствора (р) к давлению водяного пара (р0). aw = р / ро.

При известном составе раствора активность воды можно определить с помощью уравнения:

In (aw) = -nmY / 55,5, где n - число ионов, образованных растворенным веществом; ш - молярная концентрация растворенного вещества;

Y - молярный осмотический коэффициент.

Для разбавленных сред активность практически совпадает с концентрацией воды. Для чистой воды aw = 1,00, а для совершенно сухого вещества aw = 0.

Микроорганизмы способны развиваться на питательных средах, в которых активность воды (aw) находится в пределах от 0,63 до 0,93, причем для бактерий этот диапазон значительно уже (от 0,93 до 0,99), чем для дрожжей и микроскопических грибов. Это обуславливает возможность роста ряда культур на плотных питательных средах с относительно низким aw (так называемые поверхностные культуры) [99].

Принципы составления питательных сред. Для нормального роста микроорганизмов и биосинтеза целевых продуктов метаболизма недостаточно только присутствия в питательной среде всех необходимых компонентов. Необходимо также, чтобы эти компоненты содержались в определенных соотношениях. Кроме того, из большого числа, например, источников углерода и энергии нужно выбрать тот, который наиболее соответствует физиологическим потребностям данной культуры.

Для предварительного подбора количества компонентов питательной среды обычно пользуются данными химического состава биомассы. Если культура синтезирует и выделяет в среду значительные количества какого-либо продукта метаболизма, дополнительно требуется учитывать химическую формулу этого продукта. При определении количества глюкозы или другого углеродсодержащего субстрата следует учитывать, что гетеротрофы используют этот субстрат на конструктивные и энергетические нужды. Расход глюкозы на эти цели определяют по выходу АТФ.

Если один из компонентов среды должен быть лимитирующим (часто небезразлично, какой элемент исчерпывается в первую очередь), то его количество определяют по материально - энергетическому балансу, а остальные компоненты вносят в избытке.

Среды, составленные по описанным выше принципам, называют минимальными, они содержат минимум веществ, необходимых для синтеза заданного количества биомассы. На практике обычно используют более сложные среды, содержащие аминокислоты, белки, витамины и многие другие вещества, способствующие интенсивному росту микроорганизмов и синтезу целевых продуктов. Для ауксотрофных мутантов определенная аминокислота или витамин должны входить и в состав минимальной среды, так как без них рост невозможен.

Богатая» среда содержит, кроме необходимых для роста источников питания, дополнительные вещества, обычно аминокислоты, витамины, предшественники нуклеиновых кислот и другие промежуточные соединения синтеза клеточных компонентов. Обогащение сред для культивирования микроорганизмов приводит к увеличению скорости роста и изменению ферментного состава биомассы.

При подборе состава питательных сред часто используют математические методы планирования и обработки экспериментов, что резко сокращает трудоемкость и длительность работы.

Потребности микроорганизмов в питании могут различаться качественно и количественно в зависимости от условий культивирования. На изменение потребностей в факторах роста способны влиять температура, рН, режим аэрации, перемешивание и др.

Для начала роста в небольшом количестве посевного материала требуется более обогащенная среда, чем для начала роста с высокой плотностью популяции.

Питательные среды по своему назначению делятся на диагностические и производственные. Диагностические питательные среды предназначены, в основном, для обнаружения, выделения и идентификации патогенных микроорганизмов по морфологическим и физиологическим признакам. Производственные питательные среды по составу делятся на «нестандартные», изготовленные на основе пищевых продуктов, полупродуктов, гидролизатов и белково-витаминных концентратов, и синтетические - с гарантированным составом компонентов [55, 99].

В соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю вакцины сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных» (1988) в условиях производства используют питательные среды на основе перевара Хоттингера, гидролизата казеина или лактоальбумина. Кроме того, перед засевом вакцинного штамма к средам добавляют смесь водорастворимых витаминов В, и В2 [55, 99, 105, 109].

1.2.Процессы культивирования микроорганизмов Основой производства любого бактерийного препарата, предназначенного для диагностики, лечения или профилактики инфекционных заболеваний, является культивирование микроорганизмов.

Вопросы теоретического и экспериментального обоснования методов и режимов культивирования микроорганизмов, обеспечивающих воспроизводимое получение популяций с определенными свойствами, всегда привлекали внимание исследователей [12, 14, 15,16,21, 29, 32,44, 99,103].

J. Monod в 40-х годах прошлого века впервые использовал зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата для изучения жизнедеятельности микроорганизмов [142]. В 60-х годах прошлого века Н.Д. Иерусалимский применил уравнение неконкурентного ингибирования ферментативных реакций к ингибированию роста микробных культур продуктами их метаболизма [51]. S.J. Pirt развил это направление, особое внимание уделяя вопросам влияния внешних факторов на рост микроорганизмов. С помощью уравнений и графиков изложил вопросы физиологии, связанные с их ростом [83].

В последние десятилетия значительно расширился объем исследований по разработке процессов культивирования и поиску наиболее рациональных режимов биосинтеза у непатогенных микроорганизмов. Появились публикации отечественных и зарубежных авторов по теории культивирования бактерий и проблемам микробиологической технологии, которые в большей степени касаются общих вопросов технологии, влияния внешних факторов на рост и развитие непатогенных микроорганизмов, динамики развития культур и оптимизации периодических и непрерывных процессов микробиологического синтеза, управления биосинтезом и метаболизмом, математическому описанию и моделированию процессов роста и жизнедеятельности бактерий [4, 10, 11 15, 20 21, 24, 29, 30, 83, 84, 87, 90, 91, 95, 103, 114, 123, 144, 150].

Классификация методов культивирования. Первые попытки классификации методов культивирования микроорганизмов были предприняты в 60-70-х годах прошлого века и касались, в основном, непрерывных систем.

В последующем появилось множество новых процессов и систем, что обусловило необходимость их классификации. Известны принципы систематизации процессов культивирования по состоянию среды, способу действия, наличию или отсутствию перемешивания, содержанию кислорода, способу управления, наличию или отсутствию рециркуляции клеток или среды, количеству используемых ферментаторов, физическому состоянию веществ в ферментаторе, количеству потоков среды, способу добавления субстрата [12, 14, 48, 86].

Процессы культивирования могут быть поверхностными на плотных или жидких питательных средах, глубинными в жидких питательных средах с перемешиванием [12].

По способу действия процессы культивирования делятся на открытые и закрытые. Открытыми считаются процессы с непрерывным притоком питательной среды и непрерывным оттоком культуральной жидкости; закрытыми - без протока [12, 83].

Гомогенным считается процесс, в котором с помощью различных способов перемешивания все микроорганизмы в любой части рабочего объема ферментатора в каждый момент времени находятся в одинаковых условиях, питательная среда и продукты метаболизма распределяются равномерно и, следовательно, микроорганизмы растут и размножаются с одинаковой скоростью. В противоположность гомогенному гетерогенным называют процесс, в котором микроорганизмы в разных частях рабочего объема ферментатора находятся в неодинаковых условиях и, следовательно, развиваются с разной скоростью. Непрерывным гетерогенным процессом можно назвать процесс полного вытеснения.

Процессы, промежуточные между гомогенными и гетерогенными, в которых содержимое ферментатора перемешивается, но при этом не достигается идеального смешения, называют процессами неидеального смешения [14].

По принципу наличия или отсутствия перемешивания процессы можно назвать соответственно динамическими и статическими [12, 14].

В зависимости от содержания кислорода процессы культивирования бывают аэробными и анаэробными [12].

При непрерывном культивировании различают хемостатный и турби-достатный способы управления. Хемостатным культивированием называют процессы, в которых плотность популяции микроорганизмов определяется химическим составом среды, скорость разбавления фиксирована, а концентрация биомассы подстраивается к уровню, обусловленному концентрацией лимитирующего рост фактора. В турбидостате подача среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, а скорость разбавления подстраивается под заданное значение плотности популяции [14, 40,42].

По способу управления процессы могут быть оксистатными, рН-сташыми, СОг-статными и др. [14, 42,73,121].

Процессы культивирования микроорганизмов могут осуществляться при наличии рециркуляции клеток или среды. Рециркуляция или возврат клеток или среды может быть частичной или полной [14, 86].

По количеству используемых ферментаторов процессы делятся на одно-, двух- и многостадийные. Одностадийными считаются процессы, протекающие в одном ферментаторе. Если для осуществления процесса необходимо два или более ферментаторов, процесс называют двухстадийным или многостадийным [12, 14, 86].

Кроме перечисленных критериев существующие процессы культивирования могут быть подразделены по физическому состоянию веществ, находящихся в ферментаторе, на однофазные, двухфазные и многофазные. По количеству потоков среды - на однопоточные, двух- и многопоточные. По способу добавления субстрата - на процессы с дробной или непрерывной подпиткой [14, 86].

Все перечисленные принципы систематизации процессов культивирования отражают лишь технологический подход и позволяют выделить три класса процессов: периодический, полунепрерывный и непрерывный, но не дают представления о кинетике роста биомассы и продукта [14].

В связи с тем, что в основе процесса культивирования лежит рост и развитие живых организмов, в работах И.А. Баснакьян приводится классификация процессов глубинного культивирования микроорганизмов в ферментаторах, используя в качестве основного критерия физиологических показателей соотношение удельной скорости роста и концентрации микроорганизмов, которые изменяются во времени. По этой классификации процессы делятся на шесть классов:

-периодический, прод ленный периодический;

-продленный оптимизированный периодический процесс с подпиткой и без нее;

-многоциклический;

-полунепрерывный, при котором скорость роста постоянна, а концентрация микроорганизмов колеблется около постоянной величины;

-непрерывно-синхронный, в процессе, которого можно получить множество синхронизированных циклов, когда большинство клеток популяции делится почти одновременно;

-непрерывный, в установившемся режиме которого концентрация клеток и скорость роста являются постоянными величинами [12, 14].

При периодическом культивировании микроорганизмов кулыура проходит один полный цикл развития. Этот метод выращивания предусматривает одноразовую загрузку системы питательной средой и посевной культурой микроорганизмов в начале процесса и разгрузку культуры (биомасса и продукты ее жизнедеятельности) по достижении заданной фазы развития популяции.

К продленным периодическим процессам относят такие, в которых микроорганизмы проходят также один цикл развития, как и в периодическом процессе, однако фазы роста и развития культуры (экспоненциальная и стационарная) удлинены за счет улучшения питания культуры при помощи питательных добавок (подпитки) или отвода продуктов метаболизма диализом.

Процессы, в которых цикл выращивания культуры повторяется многократно без повторения стерилизации аппарата, являются многоциклическими.

В полунепрерывных системах полная загрузка ферментатора осуществляется однократно, однако в процессе роста культуры часть ее многократно сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой.

При непрерывных процессах питательная среда подается непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности также непрерьюное.

Приведенная классификация процессов культивирования обеспечивает выбор наиболее эффективного из них в конкретных условиях в соответствии с масштабами производства, разрабатываемой или совершенствуемой технологии изготовления препарата. В первую очередь приступают к оптимизации условий периодического культивирования, с которого начинается любой из 6 классов процессов [12].

В настоящее время многие промышленные процессы микробиологического синтеза и производства биологических препаратов для специфической иммунопрофилактики инфекционных заболеваний осуществляются с использованием периодического культивирования микроорганизмов, что указывает на актуальность разработки и совершенствование процессов этого класса [18,21,22, 35, 79,152].

Культивирование патогенных микроорганизмов. Процессы культивирования микроорганизмов имеют важное значение в производстве средств специфической профилактики инфекционных болезней животных и птиц, так как на этом технологическом этапе происходит синтез антигенов, необходимых для изготовления иммунопрепаратов. В то же время этот процесс является частью биотехнологической системы производства продуктов микробиологического синтеза [65, 98]. По мнению A.JI. Воробьева биотехнология этих продуктов сводится к трем основным процессам:

-выращивание микроорганизма в искусственных производственных условиях с целью накопления исходного материала для обработки сырья; -извлечение из культур продуктов метаболизма (синтеза) или разрушение клетки с целью извлечения из нее определенных соединений (антигенов и др-);

-выделение, очистка, концентрирование целевого продукта с последующим конструированием конечного препарата и его стандартизацией [32, 97]. Значительный объем исследований процессов культивирования микроорганизмов, позволяющих выявить закономерности их роста и развития, выполнен на непатогенных бактериях при использовании преимущественно непрерывного выращивания в синтетических и питательных полусинтетических средах. Переносить результаты этих исследований применительно к патогенным бактериям, вероятно, было бы неправильным, поскольку их физиология и подходы к культивированию имеют свои особенности, связанные, в первую очередь, с получением чистых культур [43, 64, 100].

Материалы экспериментальных исследований процессов культивирования патогенных микроорганизмов достаточно широко представлены преимущественно в медицинской литературе [10, 11, 12, 13]. При этом подчеркивается тесная связь проблемы культивирования с использованием штаммов микроорганизмов, питательных сред и посевного материала, обеспечивающих высокопроизводимое получение популяций микроорганизмов с заданными свойствами и определяющих стандартность процесса.

В создании рациональных технологий исключительно важным является решение проблемы получения и поддержания устойчивых характеристик производственных штаммов микроорганизмов [18, 32, 58, 64, 100, 101].

Большое значение имеет подбор питательных сред, обеспечивающих потребности культур микроорганизмов в источниках углерода, азота, минеральных веществ и других компонентах, необходимых для роста бактерий.

Один из основных элементов культивирования микроорганизмов - получение посевного материала, обеспечивающего оптимальные параметры процесса ферментации. Характер развития процесса производственного культивирования в значительной степени зависит от условий выращивания и состояния физиологической активности культур микроорганизмов [18, 57]. Исследования показали преимущества использования бактерий в фазе экспоненциального роста в качестве посевных культур, которые способствовали развитию последующего процесса с высокими показателями максимальной удельной скорости роста и продуктивности процесса [18, 44,60,80,104].

На рост, физиологическое состояние и свойства микроорганизмов в процессе их культивирования существенное воздействие оказывают физико-химические факторы, а именно: рН, парциальное давление растворенного в культурапьной жидкости кислорода (р02), окислительно-восстановительный потенциал (еН) [2, 3, 15, 57,.79, 87, 99, 116]. Экспериментально показано влияние аэрации на рост пастерелл, бруцелл, коклюшных бактерий [85,92,96].

Сравнительно с периодическими процессами культивирования следующими по сложности технологического уровня являются многоциклические процессы, когда цикл выращивания культуры в одном и том же или в разных ферментаторах многократно повторяется. Этот метод нашел применение для анализа процессов культивирования патогенных микроорганизмов, в частности, дифтерийных и коклюшных бактерий [54, 72]. Тем не менее, несмотря на преимущества многоциклических процессов, они еще несовершенны, так как мало пригодны для управления жизнедеятельностью бактерий.

В исследованиях теоретических аспектов выращивания патогенных микроорганизмов, наряду с периодическим методом культивирования, достаточно широкое применение нашел непрерывный метод, идея которого получила обоснование в работах J.Monod. Детальное описание принципов непрерывного культивирования осуществлено рядом авторов [14, 15, 48,86,89,141,142].

В процессе непрерывного выращивания изучена жизнедеятельность сальмонелл в условиях лимита и избытка углеводного субстрата [8,9,31].

Установлено влияние изменений исходной концентрации глюкозы на характер метаболизма сальмонелл. Содержание макромолекулярных соединений в клетках и интенсивность дыхания зависят от концентрации микроорганизмов в культуре [8,9,31].

Определены пределы концентрации микроорганизмов, при которых биологическая активность популяций наиболее высока. Показано, что в процессе развития тифозных бактерий при высоких не ингибируюших рост концентрациях растворенного в среде кислорода в условиях лимита глюкозы преобладает аэробный метаболизм, а в условиях ее избытка при тех же концентрациях кислорода - анаэробный. Это обусловливает особенности процесса деления бактерий. Разработан алгоритм управления биосинтетической активностью тифозных бактерий и продуктивностью процесса культивирования [6,43].

При периодическом и непрерывном культивировании изучено влияние изменения исходной концентрации глюкозы в среде на морфологию бактерий. Установлена возможность использования морфологических тестов для оценки стабильности, однородности и жизнеспособности культур при определении оптимальных режимов выращивания бактерий [43]. Исследования чистой культуры микроорганизмов позволили получить данные, пригодные для обобщающих выводов о закономерностях роста бактерий [44].

Теоретические проблемы культивирования различных видов патогенных бактерий, используемых в производстве медицинских иммунопрофилактических препаратов, интенсивно разрабатывались в течение 70-80-х годов пропитого века. Полученные авторами результаты исследований опубликованы в виде обзорных работ по оптимизации процессов, синхронизации деления микробных клеток, культивированию анаэробных бактерий, ингибированию и стимуляции жизнедеятельности микроорганизмов при культивировании, количественному описанию жизнедеятельности, морфологии, физиологии и патологии микроорганизмов [7, 8, 13, 16, 17, 18, 60,67, 82, 88, 89].

Прикладное направление исследований процессов выращивания патогенных микроорганизмов, в той или иной мере связанное с разработкой биотехнологии медицинских иммунопрепаратов, проводилось на моделях менингококков, дифтерийных коринебактерий, коклюшных бактерий, пневмококков с использованием преимущественно полусинтетических питательных сред, содержащих аминокислоты, соли минеральных и органических кислот и другие компоненты [32, 37, 53, 72].

Стратегия разработки условий культивирования должна включать: выбор, поддержание и сохранение штаммов; подбор питательных сред; оптимизацию периодического процесса культивирования в направлении сокращения длительности лаг-фазы, увеличения экспоненциальной фазы и числа жизнеспособных клеток; прогнозирование новых процессов; определение основных параметров роста при оптимизированном периодическом культивировании; осуществление процесса для получения бактериальной массы с заданными свойствами [12]. До настоящего времени в производстве биопрепаратов, а также в лабораторных условиях широкое применение находит периодический процесс глубинного культивирования патогенных микроорганизмов [15, 100].

Физиологическое состояние микроорганизмов в процессе роста и развития при периодическом культивировании. Изучение процессов жизнедеятельности микроорганизмов является проблемой, непосредственно связанной с созданием средств специфической профилактики инфекционных заболеваний [27, 47,131].

Выращивание микроорганизмов нередко осуществляется с неизвестными, лимитирующими и ингибирующими рост факторами, что затрудняет управление их жизнедеятельностью и осложняет разработку совершенных методов культивирования [66]. В этой связи одна из главных задач при разработке условий культивирования заключается в необходимости изучения и учета, в каждом конкретном случае, состояния популяций микроорганизмов, которым присущи как нормальные физиологические, так и неадекватные реакции, приводящие к стрессу и патологическому состоянию [16, 17, 82, 90, 151]. Хотя исследователи не приходят к общему выводу даже в определении понятия «физиологическое состояние» и критериев его оценки, применение знаний о состояниях популяций и фазах роста во многом определяет успех в разработке процессов культивирования [16, 17, 24, 34,39, 78,90].

В процессе периодического культивирования микроорганизмы проходят несколько фаз развития:

- лаг-фаза или фаза приспособления;

- фаза логарифмического или экспоненциального роста;

- фаза замедления скорости размножения;

- стационарная фаза;

- фаза отмирания.

За последние годы в связи с быстрым развитием популяционно-физиологического направления в микробиологии появилось значительное число работ, характеризующих физиологическое состояние микроорганизмов в динамике развития культур [16, 17, 27, 82, 90,151].

После посева инокулята в свежую питательную среду микроорганизмы, как правило, проходят период адаптации и подвергаются воздействию метаболического сдвига, обусловленного изменениями условий выращивания от истощенной питательной среды к среде с высокой концентрацией питательных веществ, полным отсутствием продуктов обмена и т.д. Затем в процессе лаг-фазы развиваются компенсаторно-приспособительные механизмы, которые приводят к адаптации клеток к заданным условиям, и рост культуры не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. В экспоненциальной фазе развития устанавливается максимальная скорость роста, возможная в данных конкретных условиях, т.е. осуществляется наиболее совершенная нормальная физиологическая жизнедеятельность, адекватная условиям выращивания. В процессе экспоненциальной фазы удельная скорость деления клеток остается приблизительно постоянной. Экономический коэффициент - максимальный. Траты на поддержание жизнедеятельности -минимальные. Однако уже в этой фазе в культуральной среде снижается концентрация питательных веществ и начинают накапливаться вредные продукты метаболизма. Это приводит к появлению разобщения между ростом и делением клеток, в результате чего для поддержания постоянства удельной скорости деления к концу экспоненциальной фазы микроорганизмам приходится «жертвовать» содержанием макромолекулярных соединений [8, 9].

Затем, с увеличением биомассы на рост культуры начинает сказываться недостаточное количество питательных веществ среды и ингибирующее действие продуктов обмена. Компенсаторно-приспособительные механизмы уже не в состоянии поддерживать скорость деления на максимальном постоянном уровне, в результате чего она снижается. Лимитирование или ингибирование роста популяции соответствует состоянию стресса, характеризующегося рядом однотипных изменений функционального и структурного характера, мало зависящих от природы стрессора и вида микроорганизма [16, 60, 63]. В начале фазы замедленного роста наблюдается слабая степень лимитирования или ингибирования культуры.

В отличие от экспоненциальной фазы, в фазе замедления роста популяция клеток становится гетерогенной, так как нарастает действие неблагоприятных факторов, которое приводит не только к замедлению процессов роста, но может вызывать отмирание и даже лизис части популяции клеток. По данным И.А. Баснакьян и соавторов, до тех пор, пока лимитирование или ингибирование носит характер неспецифических изменений, т.е. не зависит от вызывающего их фактора, культура находится в состоянии стресса. Более глубокая степень лимитирования или ингибирования сопровождается уже специфическими изменениями в культуре, т.е. стресс сменяется патологическим состоянием [16].

Фазу замедленного роста сменяет стационарная фаза, в которой прирост биомассы по существу прекращается и интенсивность обменных процессов падает. В течение некоторого времени в этой фазе отдельные клетки продолжают размножаться, но этот процесс уравновешивается процессом гибели клеток. Для этой фазы характерна все больше нарастающая гетерогенность клеточной популяции, в которой наряду с отдельными размножающимися клетками, находятся еще живые, но уже потерявшие способность к дальнейшему росту бактерии, а также мертвые и лизирующие клетки [27].

В процессе роста культуры в ней накапливаются разнообразные продукты обмена, а некоторые компоненты питательной среды оказываются полностью исчерпанными, что приводит к наступлению фазы отмирания. В этот период гетерогенность популяции возрастает и в культуре помимо нормальных клеток находится много клеток «теней», появляются инволюционные формы, что свидетельствует о неблагоприятных условиях для жизни клеток. Однако, наряду с этим, в культуре имеются отдельные клетки, в течение длительного времени сохраняющие жизнеспособность, и при пересеве на свежую питательную среду, они начинают активно расти [90].

При культивировании микроорганизмов меняющиеся уровни концентрации лимитирующего фактора (в сторону снижения) и ингибирующего рост (в сторону увеличения) вызывают необратимые изменения, которые приводят к гибели клеток. Это состояние популяции характерно для второй половины фазы замедления скорости роста, стационарной фазы и режимов хемостата непрерывного культивирования при низких скоростях разбавления. По данным И.А. Баснакьян, период отмирания завершается гибелью всех особей [16].

И.Л. Работнова, отмечая, что при изучении микроорганизмов наиболее распространены периодические культуры, указывает на прогрессивность хемостатного непрерывного культивирования. В работах ряда авторов -приводится определение физиологического и патологического состояния бактерий, значения некоторых показателей процессов культивирования для оценки функционального состояния популяции микроорганизмов [16, 17, 82, 90].

Физиологическое состояние микроорганизмов определяется как наиболее совершенная жизнедеятельность, адекватная условиям среды и характеризующаяся следующей совокупностью признаков - это прямая связь со средой; увеличение концентрации субстрата или продуктов метаболизма, приводящие к увеличению скорости роста; конструктивный и энергетический метаболизмы, сопряженые между собой, что выражается высокими и постоянными значениями экономического коэффициента по энергетическому субстрату, затраты этого субстрата на поддержание жизнедеятельности минимальны; удельная скорость роста может быть различной. Это состояние наблюдается в экспоненциальной фазе периодических культур и в режимах турбидостата при непрерывном культивировании. Состояние стресса характеризуется неадекватными неспецифическими реакциями клеток в ответ на неглубокое лимитирование или ингибирование.

Некоторыми исследованиями установлено значение экономического и мегаболитического коэффициентов, как показателей, наиболее четко характеризующих функциональное состояние микроорганизмов в процессе их культивирования. Создана система критериев оценки состояния популяций микроорганизмов, включающая, помимо указанных показателей, скорость роста, длительность фаз роста при периодическом культивировании, наличие или отсутствие соответствия скорости роста значениям показателей выхода биомассы, оптической плотности одного миллиарда клеток. Показана правомерность использования этой системы критериев при разработке условий процесса культивирования менингококков [52,66,82].

И.Ш. Вайсман (1983) подходит к исследованию физиологического состояния микроорганизмов с позиций учения о популяциях на основе изучения некоторых видов бактерий в связи с их функциональными особенностями в динамике развития периодических культур. Автор указывает, что определение таких понятий, как норма, стресс, патологическое состояние, привлеченное из нормальной, патологической физиологии и патологической анатомии человека, применительно к микроорганизмам, правомерно лишь постольку, поскольку жизнедеятельности живых существ любого уровня биологической организации присущи некоторые основные общие закономерности. Что же касается бактерий, которым присущи закрепленные в эволюции способы существования в виде множеств (культур, колоний), то в данном случае применение указанных понятий нуждается в корректировке [27]. Такого же мнения придерживается A.M. Безбородов (1988) [19].

Таким образом, вопрос о функциональном состоянии популяций микроорганизмов до настоящего времени остается в достаточной степени дискуссионным, хотя изучение теоретических и прикладных аспектов разработки процессов культивирования бактерий невозможно без учета состояния микробных популяций, так как от него зависит выбор способа обработки, выделения антигена [17, 18, 82]. Располагая критериями оценки функционального состояния микроорганизмов, можно совершенствовать как стадию культивирования, так и другие этапы технологического процесса изготовления биопрепаратов.

1.3. Защитные среды высушивания

В практике микробиологии давно уделялось внимание вопросу получения сухих биопрепаратов и сохранения их биологической активности. С 1934 года в медицинских научных учреждениях начали разрабатывать методы высушивания бактерийных культур, вирусов и биопрепаратов. И.Л. Сербинов в 1936 году указал на значительную устойчивость микроорганизмов к высушиванию. Изысканиями методов оптимального высушивания занимались А. Климентова, Р. Крук, Г. Ярмольчук, А.Р. Конова, JI.C. Базиливская, С.С Речменский, Н.С. Иттер, К.Е. Долинов, Л.Б. Балаян, Н.Н. Титов, Ю.А. Козлов, Б.С. Дельник, В.В. Виноградов и многие другие исследователи [41, 77].

Особое значение для ветеринарной практики имеет высушивание живых микробных вакцин, позволяющее длительно сохранять иммуногенные свойства этих препаратов. В качестве защитной среды высушивания применяются среды с различными компонентами. Широкое применение в биологической промышленности нашли сахарозо-желатиновые защитные среды [45, 46, 77, 99, 111, 125, 126, 127].

Из большого количества факторов, влияющих на выживаемость и сохранение микроорганизмов в процессе высушивания, наиболее важную роль играет защитная среда. Значительные успехи в повышении выживаемости микроорганизмов при сублимационном высушивании достигнуты благодаря разработке и использованию эффективных защитных сред высушивания [77, 99, 107, 108, 139, 140].

С 50-х годов прошлого века криобиологи и микробиологи изучили и предложили ряд соединений под общим названием «криопротекторы» и с их использованием разработали рецептуру ряда защитных сред высушивания для микроорганизмов [74, 77, 108, 139].

Совершенствованием оборудования и оптимизацией технологических режимов сублимационного высушивания нельзя добиться полного успеха без оптимизации защитных сред [77, 99, 126, 140].

Анализ условий высушивания биопрепаратов показал, что величина температуры плавления замороженной суспензии является сигнальным фактором, ограничивающим скоростные параметры обезвоживания. Существенное влияние на температурную характеристику объекта высушивания оказывают не сами клетки микроорганизмов, а среда их окружения - смесь из питательной среды, метаболитов и других веществ, вводимых ранее в процессе культивирования. Поэтому необходимо снижение концентрации или удаление нежелательных компонентов, либо замещении их защитной средой высушивания [23, 77, 99].

Исследования выживаемости лиофилизированных культур, их зависимость от физико-химических свойств и концентрации ингредиентов защитной среды показало следующее:

- присутствие моно- и низкомолекулярных олигосахаров (сахароза, лактоза, глюкоза, сорбитол) является обязательным для создания щадящих условий замораживания - высушивания бактериальных суспензий, эффективны в концентрации 3 - 10% [99];

- повышению стабильности препаратов после сушки и в процессе хранения способствуют различные соединения. Это природные и синтетические высокомолекулярные соединения - полисахариды (декстран, декстрин, агароза), соли альгиновой кислоты, желатин и поливинилпирролидон. Они создают защитные барьеры для клеток после высушивания, эффективны в концентрациях 1 - 2 %. В более высоких концентрациях (исключая полисахариды) они ухудшают условия удаления влаги при высушивании. Тиомочевина и натриевые соли глутаминовой, лимонной и аскорбиновой кислот, легко окисляясь, блокируют свободнорадикальные и аммоно-карбонильные реакции в сухой биомассе (достаточно 1-3% этих веществ). Сильные неорганические редукторы - сульфиты и тиосульфит, нитрит натрия так же отнесены к стабилизаторам для защитных сред [77, 99, 147].

В практике производства биопрепаратов применяют следующие защитные среды:

- сахарозо-желатиновая;

- обезжиренное молоко;

- полигликоново-глютаматная - для повышения активности ряда сальмо-неллезных вакцин;

- триптическая среда с добавлением небольшого количества лецитина яичного желтка (0,06 - 0,12 %), что увеличивает почти в 2 раза выживаемость бруцелл при высушивании;

- синтетические - на основе поливинилпироллидона, используемые для бруцелл;

- комбинированные - состоящие из 2 или более компонентов [99].

Основными факторами, которые необходимо учитывать при подготовке биоматериалов из бактерий к сублимационному высушиванию, являются условия культивирования, защитная среда высушивания, конечная температура замораживания.

Глубина замораживания от минус 35 до минус 20 °С не оказывает существенного влияния на выживаемость бактериальных клеток, как замораживание - оттаивание, так и замораживание - сублимационное высушивание [74, 77].

Установлено, что бактериальные клетки, используемые для производства ветеринарных биологических препаратов, выдерживают хранение в замороженном состоянии при температурах от минус 45 до минус 20 °С в течение нескольких суток в зависимости от примененной защитной среды высушивания, без снижения качества целевых продуктов после сублимационной сушки [99].

1.4.Вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных.

Сложность борьбы с листериозом обусловлена особенностями биологии её возбудителя, наличием большого количества как патогенных, так и непатогенных штаммов, недостаточностью изученностью генома и антигенной структуры микробных клеток [5, 8, 59,61, 118, 119, 153,156].

Листериоз является сапронозной инфекцией, при которой вегетативные клетки листерий могут переходить в L - формы, а также переходить в не культивируемое состояние.

Доминирующий способ заражения - через продукты питания, такие как молоко и молочные производные, мясо скота и птиц [7, 61, 62, 117, 122, 124, 130, 132, 138, 148, 149, 154].

Основной клинический синдром и характер патологических изменений свидетельствуют о преимущественном поражении центральной нервной системы у людей и у многочисленных видов животных [61, 62, 64].

Широко распространенная в природе бактерия Listeria monocytogenes относится к числу факультативных паразитов. Вызываемая ею инфекция характеризуется тяжестью клинического течения и летальностью до 30%.

L. monocytogenes - это грамположительные, диаметром 0,4 - 0,5 мкм, длиной 0,5 - 2,0 мкм, не образующие спор и капсул, правильной палочковидной формы бактерии. В род Listeria входит семь видов: L. monocitogenes, L. ivanov, L. seeligery, L. grey, L. innocua, L. welshimery, L. murrai.

Листерии растут при температуре от 1° до 45° С, оптимальной для них является температура 30° - 37° С при рН 7,4 - 7,6 [6].

Для специфической профилактики листериоза испытывались различные живые и инактивированные вакцины, но до настоящего времени нет эффективных препаратов [61].

Многочисленные опыты на лабораторных и сельскохозяйственных животных показали, что гипериммунные сыворотки и полученные из них иммуноглобулины также не обладают защитными лечебными свойствами [59].

Установлено, что только вирулентные штаммы листерий способны индуцировать протективный иммунититет. Многократное введение авирулент-ных штаммов не приводит к его стимуляции [61].

Для профилактики листериоза в РФ применяли сухую живую вакцину из слабовирулентного штамма 1-ой серогруппы, аттенуированного воздействием ультрафиолетового излучения, получившего название «АУФ». Данная вакцина не обеспечивает защиту от заболевания, вызываемого листериями других серотипов, которых в России насчитывается семь: 1/2а, 1/2в, За, 4а, 4в, 5, 7. В настоящее время применяется бивалентная вакцина из штаммов УСХИ - 19 и УСХИ - 52, относящихся к наиболее распространенным I и II серогруппам [6,

7].

В соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю вакцины сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных» (1988) в условиях производства используют питательные среды на основе перевара Хоттингера, гидролизата казеина или лактоальбумина. Помимо указанных основ, в состав сред входят пептон (1,0-1,5%),декстран, кислотный автолизат печени крупного рогатого скота (5-10%), натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, магний сернокислый, аммоний сернокислый, железо лимоннокислое. Кроме того, перед засевом вакцинного штамма к

33 средам добавляют смесь водорастворимых витаминов By и В2. Питательная среда имеет рН 7,4 - 7,6.

В качестве посевного материала используют 16-18 -часовую суспензию листерий. Засевная доза составляет 8 - 10 % к объёму питательной среды. Перед засевом и в процессе культивирования через 6, 10 и 14 часов роста добавляют 0,2% глюкозы, в пересчете на сухое вещество, в виде 40%. Культивирование проводится в реакторе при температуре 36° - 37° С в течении 16 часов при постоянной аэрации культуры стерильным воздухом.

Технология производства вакцин против листериоза связанно с рядом нерешенных проблем, основными из которых являются: нестандартность питательных сред из мясных гидролизатов; выращивание бактерийной массы без контроля и регулирования большинства технологических параметров и как следствие - низкое накопление; недостаточная стабильность сухих препаратов -низкая жизнеспособность микроорганизмов при сушке и в процессе хранения вакцины.

В настоящее время, учитывая достижения в области молекулярной биологии и биотехнологии, возможно проведение исследований по разработке оптимальных условий культивирования листерий по основным технологическим параметрам и оптимизация защитных сред высушивания, что позволит усовершенствовать технологию промышленного производства вакцины, повысить её качество, в том числе и за счет повышения жизнеспособности бактерий в процессе длительного хранения.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Павленко, Игорь Викторович

4. Выводы

4.1. С помощью математических методов планирования эксперимента обоснован состав питательной среды для выращивания листерий.

4.2. Определены значимые для роста листерий технологические параметры - рН, р02 и еН и разработан управляемый процесс периодического выращивания листерий по значимым технологическим параметрам.

4.3. Используя математические методы планирования эксперимента, определены оптимальные концентрации компонентов защитной среды высушивания для производства сухой живой вакцины против листериоза.

4.4. Применение разработанной технологии процесса получения и хранения вакцин против листериоза сельскохозяйственных животных при промышленном производстве вакцины:

- позволило в 2,3 раза повысить накопление листерий, за счет лучших ростовых качеств разработанной питательной среды, по сравнению с традиционной;

- впервые разработан управляемый режим культивирования листерий, который позволил увеличить накопление бактерий в 2 раза и сократить время культивирования с 16 - 18 часов до 7 - 9 часов;

- разработанная защитная среда высушивания позволила увеличить сохраняемость жизнеспособных микроорганизмов в вакцине в процессе длительного хранения на 20 - 40% по сравнению с использованием традиционной защитной среды высушивания.

4.5. В условиях Ставропольской биофабрики с использованием разработанных технологических процессов изготовлено две опытно-промышленные серии вакцины бивалентной сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных, которые прошли испытания с положительным результатом в хозяйствах Ставропольского края.

5. Практические предложения

5.1. Разработанная питательная среда, управляемый периодический процесс культивирования листерий, защитная среда высушивания вошли в нормативно-техническую документацию на производство вакцины бивалентной сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных.

5.2. На основании полученных результатов разработаны:

- «Инструкция по изготовлению вакцины бивалентной сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных», утверждена директором Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности 26.10.1994 г.;

- Технические условия 080-64-19-48-94 «Вакцина бивалентная сухая живая против листериоза сельскохозяйственных животных», утверждены директором Всероссийского государственного института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов 02.11.1994 г.

5.3. Технология производства вакцины бивалентной сухой живой против листериоза сельскохозяйственных животных, разработанная во ВНИТИБП, освоена и внедрена в опытно-промышленном производстве на Ставропольской биофабрике.

5.4. Вакцина против листериоза сельскохозяйственных животных, произведенная на Ставропольской биофабрике, прошла успешные испытания в животноводческих хозяйствах края и получила положительные отзывы.

5.5. По теме диссертации получен патент РФ № 2053790 «Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Павленко, Игорь Викторович, 2003 год

1. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Грановский Ю.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. М., Наука, 1976:279с.

2. Андреева Е.А. Физико-биологические перестройки дрожжей Candida utilis в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала. Микробиология, 1974, XLIII, 5: 780-785.

3. Андреева Е.А., Работнова И.Л. Влияние окислительного потенциала на рост аэробных микроорганизмов. Микробиология, 1978, XLII, 4: 637-643.

4. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Биологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий: «Методическое пособие» -Ульяновск, 1999: 25-29.

5. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция.-Ульяновск, 1991, 36

6. Бакулов И.А. «Основные вехи истории изучения листериоза животных и людей» // Мат-лы межд. Симп. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров. 1999: 43- 47.

7. Баснакьян И. А. Экспериментально-аналитическое исследование жизнедеятельности Salmonella typhi при непрерывном культивировании: Автореферат диссерт. д-ра биол. наук. М., 1974: 35 с,

8. Баснакьян И.А., Дубинина Г.П. Морфологические особенности в сопоставлении с физико-биохимическими закономерностями жизнедеятельности микроорганизмов при периодическом и непрерывном культивировании. Ж. Микробиология, 1974, 7: 3-8.

9. Баснакьян И.А, Бирюков В.В., Крылов Ю.М. Управляемое описание основных кинетических закономерностей процесса культивирования микроорганизмов. Ж. Микробиологии, 1976: 5-75.

10. Баснакьян И.А., Карабак В.И., Алексахина Н.Н. и др. Управляющее действие кислорода на питательные потребности Neisseria meningitis. Ж. Микробиологии, 1990, 2: 3-7.

11. Баснакьян И.А. Оптимизация культивирования микроорганизмов в иммунобиотехнологии. Ж. Микробиологии, 1989. 5: 90-96 с.

12. Баснакьян И. А., Шафоростова Л.Д. Культивирование микроорганизмов, используемых для получения вакцин и анатоксинов. «Теоретические и методические основы изучения микроорганизмов». Пущино, 1986:169-181.

13. Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Запорожцев JI.H. Классификация процессов культивирования микроорганизмов. Тр. Моск. научно-исслед. инс-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1981: 5-17.

14. Баснакьян И.А., Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М., Медицина, 1992: 192 с.

15. Баснакьян И. А., Боровкова В.М., Кузьмин С.Н. Патология и физиология микробов. Сообщение 1. Общие вопросы. Ж. Микробиологии, 1981, 9: 14-19.

16. Баснакьян И.А., Усовершенствование технологии культивирования. Ж. Микробиологии, 1982, 12: 28-33.

17. Баснакьян И.А., Мельникова В.А. Перспективы усовершенствования технологии культивирования патогенных микроорганизмов. Тр. центрнауч. исслед. инс-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. Деп. ВНИИМИМЗСССР 16.10.1987, № 14317: 19-36.

18. Безбородов A.M., Коган И.Б., Богева С.С. Основы биотехнологии микробных синтезов. Ростов-на-Дону, 1989: 112с.

19. Белоус А.М., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты. Киев, Наукова Думка, 1979: 198 с.

20. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М., Наука, 1985: 293с.

21. Бланков Б.И. Сохранение жизни микроорганизмов. Анабиоз и преданабиоз микроорганизмов. Рига, Зинанте, 1973: 31-40.

22. Бланков Б.И., Клебанов Д.И. Некоторые критерии при исследовании процесса лифиолизации биологических материалов. Тр. Моск. научно-исслед. инс-та эпидемиологии, микробиологии и гигиены. М., 1960, 7: 5-12.

23. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. М., Медгиз, 1961: 263с.

24. Бортников И.И., Босенко A.M. Машины и аппараты микробиологических производств. Минск, Высшая школа, 1982: 228 с.

25. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций. Ж. Микробиология. 1984, 4: 3-8.

26. Ветеринарная микробиология /Под ред. Е.В. Козловского и П.А. Емельяненко./ М., 1980: 303 с.

27. Виестур У.Э., Кристапсонс М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов М., 1980: 231 с.

28. Вио П. Вторичные эффекты, связанные с замораживанием биологических тканей. Ж. Холодильная техника. 1976:№ 1: 46-50.

29. Волкова Н.В. Изучение физико-биологических показателей жизнедеятельности Salmonella typhi при периодическом и непрерывном культивировании: Автореф. дис. .канд. биол. наук. М., 1973: 24с.

30. Воробьев А. А. Проблемы физико-химической биологии и биотехнологии в микробиологии и иммунологии. Ж. Микробиология, 1982, 11:3-8.

31. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. М., Пищевая промышленность, 1979: 200 с.

32. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М., Агропромиздат. 1987: 335 с.

33. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова JI.A. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., Пищевая промышленность, 1980: 448 с.

34. Громов Б.В., Ждан-Пушкина С.М. О методах анализа бактериальных культур. Ж. Микробиология, 1981 50,2: 389-391.

35. Грубер И.М., Мохов Ю.В. Рост биомассы и размножение популяции пневмококка при глубинном культивировании. Тр. Моск. науч. иссл. инс-та вакцин и сыворотки им. И.И. Мечникова. 1981: 47-55 .

36. Гуйго Э.И., Журавская Н.К., Каухчешвили Э.Ю. Сублимационная сушка в пищевой промышленности. М., Пищевая промышленность, 1975: 433 с.

37. Гутина В.Н. Очерки по истории физиологии микроорганизмов. М., Наука. 1988: 200с.

38. Данилова М.В., Надирова И.М., Ефимцева Т.В. Зависимость жизнеспособности бактерий после лиофилизации и при длительном хранении от величины остаточной влажности Изв.АН СССР.Сер. Биол. 1980 3: 449-451.

39. Доис Э. Количественные проблемы биохимии. М., Мир. 1983: 373 с.

40. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. М., Медицина. 1969: 231 с.

41. Дубинина Г.П. Изучение морфологии и физиологии S. typhi для оценки популяций при периодическом и непрерывном культивировании. Автореф. дисс.канд. мед. наук. М., 1976: 32 с.

42. Дубинина Г.П. Управляемое культивирование патогенных микроорганизмов. Ж. Микробиология, 1982, 12: 40-44.

43. Дузу П. Криобиохимя. М., Мир. 1980: 283 с.

44. Жданова Л.Г. Значение исследований по физиологии патогенных микроорганизмов в вакцинном производстве. Тр. Моск. научно-исслед. инс-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. 1979: 18-28.

45. Запорожцев Л.Н., Баснакьян И.Л., Ильинская Е.А. Биологоэкономи-ческое изучение процессов культивирования. Сообщение II. Сравнение эффективности реальных и прогнозируемых процессов культивирования микроорганизмов. Ж. Микробиологии. 1977: 37-43.

46. Звягин И.В., Токарик Э.Ф., Нежута А.А., Гришин М.А. Методические подходы к разработке типовой технологии сублимационноговысушивания биологических препаратов. Тез. докл. Всесоюзной научной конф. Чернигов-Киев, 1981: 157-158.

47. Звягин И.В., Хорьков И.А., Токарик Э.Ф., Нежута А.А. и др. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов. М., Профиздат. 1981: 34 с.

48. Иерусалимский Н.Д. Теоретические и промышленные аспекты микробиологического синтеза. Вестник АН СССР. 1965, 4: 42-50.

49. Изучение экономических коэффициентов в процессе периодического и многоциклического культивирования Clostridium perfringens типа А. / В.А. Мельникова, И.А. Баснакьян, А.П. Власенко, Т.Н. Ратникова. Ж. Микробиология. 1984, 11:65-68.

50. Ильницкая И.Ю., Кузьмин С.Н. Закономерности роста и токсинообразования Corinebacterium diphtheriae при трехцикличном культивировании. Тр. Моск. науч. -иссл. инс-та вакцин и сывороток им. Мечникова. 1981: 67-73.

51. Ильницкая И.Ю., Баснакьян И.А. Совершенствование культивирования дифтерийных коринебактерий для получения токсино-анатоксина. Ж. Микробиологии. 1987, 7: 40-44.

52. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. М., Агропромиздат. 1991: 272 с.

53. Карпов A.M., Улумеев А.А. Сушка продуктов микробиологического синтеза. М., Легкая и пищевая промышленность. 1982: 216 с.

54. Кинетика процессов периодического культивирования Streptoccocus pneumoniae в зависимости от физиологического состояния посевной культуры. / И.М. Грубер, Л.Г. Жданова, В.Ф. Нисилевич, И.Д. Горбачев . Ж. Микробиология,. 1986, 2: 3-7.

55. Кириллова В.В. К методике отбора производственных штаммов Salmonella cholerae suis. Тр. Всесоюз. науч.-контр. инс-та ветпрепаратов. 1978, 27: 64-68.

56. Книзе А.В., Бузин А.И. Шармак Р.К. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России. // Мат. Международного симпозиума «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров. - 1999: 118-123.

57. Коркмасова М.А., Баснакьян И.А., Мельникова В.А. Фазовое культивирование микроорганизмов. Ж. Микробиологии. 1985, 2: 105109.

58. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий Мат-лы Межд. симп. «Листериоз на рубеже тысячелетий» Покров. 1999: 48 -52.

59. Котляров В.М., Бакулов И.А. Мат. Межд. науч.-практ. конф., ВНИИВВиМ, Покров, 2001: 105-113.

60. Лимитирование и ингибирование микробиологических процессов /Под ред. И.Л. Работновой, И.Г. Минкевича. Пущино. 1980: 177 с.64. «Листериоз на рубеже тысячелетий» Материалы международного симпозиума Покров, 1999: 7-21.

61. Матвеев В.Е. Микробиологическая технология: новое научное направление биотехнологии. Биотехнология. 1985, 1: 6-14.

62. Мельникова В.А. Ингибирование и стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов в процессах культивирования. Ж. Микробиология. 1983, 10: 3-8.

63. Мельникова В.А. Значение состояния популяции микроорганизмов для разработки питательных сред и процессов культивирования. Автореф. дисс. .д-ра биол. наук М., 1987: 43 с.

64. Меныпенин В.В., Самуйленко А .Я., Школьников Е.Э. Усовершенствование питательной среды для культивирования листерий штамм, АУФ. Мат. Межд. симп. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров. 1999: 106-107

65. Методические рекомендации по анализу и оптимизации процессов культивирования микроорганизмов в лабораторных и производственных условиях. /З.А. Исаева, И.А. Баснакьян, JI.H. Запорожцев и др. М., 1978: 18 с.

66. Методические рекомендации к контролю питательных сред по параметрам роста микроорганизмов в процессе их культивирования. /З.А. Исаева, И.А. Баснакьян, JI.H. Запорожцев и др. М., 1980: 18 с.

67. Методика расчета режимных параметров сублимационной сушки биопрепаратов. // Нежута А.А., Сербис Е.А. М., 2003, 16 с.

68. Мирясова Л.В., Баснакьян И.А. Совершенствование технологии культивирования коклюшных бактерий на основе изучения кинетике процессов. Ж. Микробиологии. 1983, 10:20-25.

69. Мутафаров С.Б., Минкевич И.Г., Ерошин В .К. рН-ауксостат: теория и практика. Пущино. 1985: 41 с.

70. Нежута А.А., Павлов В.А. Исследования кинетики сублимационной сушки биоматериалов (второе сообщение). «Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности». Экспресс информация, 1983, 5: 17-20.

71. Нежута А.А., Сербис Е.С. Оптимизация этапа досушивания вакцин против листериоза сельскохозяйственных животных из шт. АУФ. Мат-лы Межд. симп. «Листериоз на рубеже тысячелетий» Покров. 1999: 114-115.

72. Нежута А.А., Сербис Е.С., Ярцев М.Я. Перспективы разработки и усовершенствования технологии сублимационной сушки биопрепаратов. Аграрная наука. 1999, 4: 26 с.

73. Нежута А.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я., Безгин В.М., Сербис Е.С. Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов. Курск. Издательство Курской государственной сельскохозяйственной академии. 2002: 240 с.

74. Об изучении физиологического состояния микроорганизмов. /E.JI. Головлев, JT.A. Литвиненко, А.Н. Шкидченко, А.В. Шульга. Микробиология. 1982, 51, 1: 171-174.

75. Октябрьский О.Н., Смирнов Г.В. Редокс-потенциал как индикатор физиологического состояния бактерий в культурах с добавлением субстрата. «Управляемое культивирование микроорганизмов». Тез. докл. IV Всесоюз. конф. Пущино, 1986: 140.

76. Оптимизация процесса культивирования бактерий рода Проведенция и изучение антигенной активности культур. /Г.М. Машилова, Л.А. Левина, В.П. Рагинская и др. Тр. Моск. науч.-иссл. инс-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. 1981: 25-39.

77. Опарин Ю.Г. Повреждение и защита биоматериалов при замораживании и лиофилизации. Биотехнология. 1996, 7: 3-11.

78. Патология и физиология микробов. Сообщение III. Критерии оценки функциональных состояний. /В.А. Мельникова, И.А. Баснакьян, Т.К. Ратникова, АП. Власенко. Микробиология. 1984, 1: 42-46.

79. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., Мир, 1978:331 с.

80. Петрова Т.А., Степанова Н.В. Интермедиальные модели роста микроорганизмов. Ж. Микробиология. 1990, 59: 43-51 .

81. Процессы культивирования микроорганизмов. /И.Л. Работнова, И.А. Баснакьян, В.И. Боровкова, JI.H. Запорожцев. Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1982, 4: 559-572.

82. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий (рН и гН2) в жизнедеятельности микроорганизмов. М., 1957: 276 с.

83. Работнова И.Л. Пути управления биосинтезами у микроорганизмов. Тез. Докл. III Всесоюзн. совещ. по управл. биосинтезу и биофизике популяций. Красноярск. 1973: 224-244.

84. Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов. М., Наука. 1979: 207с.

85. Работнова И.Л. Об изучении физиологического состояния исследуемых микроорганизмов. Микробиология. 1980 49, 4: 634-638.

86. Работнова И.Л., Позмогова И.Н., Баснакьян И.А. Хемостатное и периодическое культивирование при изучении физиологии микроорганизмов. Итоги науки и техники. Сер. Микробиология. 1981, 11:3-54.

87. Раевский А.А. Разработка управляемого процесса культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин. Автореф. дисс. канд. биол. наук. 2002, 24 с.

88. Размножение В Pertussis в жидкой полусентитической среде при различных уровнях аэрации. /Е.И. Шмелева, Н.У. Мерцалова, И.И. Юлин и др. Тр. Моск. НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. М., 1981: 101-108.

89. Ровенский З.И. К вопросу о биологическом времени. Тр. Ивановского гос. мед. инс-та им. А.С. Бубнова. 1982: 7-19.

90. Рычков Р.С., Попов В.Г. Биотехнология перспективы развития. Ж. Биотехнология. М., 1984: 13-20.

91. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы биотехнологии производства биологических препаратов. (Теоретические основы, оборудование, технологические линии). М., 2000: 782с.

92. Седина С.Г., Разумкова В.Ф., Дубянская Л.Д. Возможности применения штаммов микроорганизмов в медицинской и ветеринарной микробиологии. Микробиология. 1986, 9: 108-110.

93. Середа А.Д., Котляров В.М., Бакулов И.А. Иммунитет при листериозе. ЖМЭИ, 2000. 5:98-102

94. Станишкис Ю. Оптимальное управление биотехнологическими процессами. Вильнюс. 1984: 255 с.

95. Стригулин В.А., Акимов Е.К., Габидуллина Р.Г. Влияние инокуляга на рост культуры бруцелл шт. 82. Экспресс-инфор. ВНИТИБП. 1986, 11: 8-9.

96. Омаров С.М., Меджидов Ш.М., Ахметов Э.М. Питательные среды для выделения и накопления листерий // ЖМЭИ, 2000. 1: 45-48

97. Чечевель С.Ф., Бакулов И.А., Котляров В.М. Патогенетическая сущность листериоза. Мат-лы межд. симп. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров, 1999: 116-118.

98. Ярцев М.Я., Коротеева Л.А., Шишов В.П., Маслак А.А., Емельянов Н.И. Разработка питательной среды на основе аминопептида длякультивирования листерий. Тез. докл. V Всерос. конф. Щелково. 1996: 120-121.

99. Ярцев М.Я., Шишов В.П., Раевский А.А., Коротеева Л.А., Павленко И.В. Патент РФ № 2053790 А 61 К 39/02. «Способ изготовления вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных».

100. Allison Z.M.C., Mann G.F., Percins F.T., Zuckerman A.I. An accelerated stability test procedure for lyophilized measles vaccines. II G. Biol. Stand. -1981.-V. 9, №2.-p. 185- 194.

101. Bajpai P.K., Margaritis A. Errecr of temperature and pH on immobilized Lymomonas mobilis continuous production of ethanol. // Biotehnol. Bioeng. 1986. - p. 244 - 255.

102. Belgrader P. Benett W., Hadley D., Long G., Mariella R. Jr., Milanovich F., Nasarabadi S., Nelson W., Richards J., Stratton P. Rapid pathogen delection using a microchip PCR array instrument. // Clin Chem. 1998. - V. 44. -n.10. - p. 2119 - 2194.

103. Bergter F. Washtum von microorganisms: experimente und modelle. // Jena (DDR): VEB Gustav Fischer Yerl. 1972. - p. 384.

104. Bickley J., Short J., Mc Dowell D., Parkets H. Polymerase chain reaction detection of Listeria monocytogenes in diluted milk and resversal of PCR inhibition caused by calcium ions. // Lett. Appl. Microbiol.- 1996.- V.22. -p. 153 158.

105. Brener D., De Voe J.W., Holbein B.E Increased virulence of Neisseria melitensis after in virto iron-limited growth at low pH. Infect., Immun. 1981. Vol. 33, 1:59-66 p.

106. Cooper G.L. An encephalitic form of Listeriosis in broiler chickens. // Avian Dis. - 1989. - V.18 - n.2- p. 99-104.

107. Comi G., Cocolin L., Cantoni C., Manzano M. A RE-PCR Method to Distinguish Listeria-Monocytogenes Serovars. // FEMS Immun. Med. Microb. 1997. - V.18. - n.2. - p. 95 -98.

108. Curts G.D. A stelective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes.//Lett. Appl.Microbiol. 1989. - v.8. - p. 95 - 98.

109. Danielson-Tham M-L, Bille, Brosh K, Buchrieser C, Persson K, Rocourt J, Schwarzkoft A, Tham W, Using J Characterization of Listeria stains isolated from soft cheese // Int. J. Food Microbiol. 1993. - IS. - p. 161 -166.

110. Dahad S. K. Redox potential as a letter substiture for dissolved oxyden in fermentation process control. // Biothech. and Bioeng. 1982. V. 24, № 12. -p. 2123-2125.

111. Dalton C.B., Austin C.C., Sobel J., Hayes P., Bibb W., Graves L. An Outbreak of Gastroenteritis and Fever Due to Listeria Monocytogenes in Milk. // New Engl. J. Medicine. 1997. - V. 336. - n. 2. - p. 100 - 105.

112. Dunn I. J., Мог J. R. Variable-volume continuouse cultivation. // Bijtech. and Bioeng. 1975. V. 17, № 12. - p. 1805 - 1822.

113. Faber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a Food-Borne Pathogen. //Microbiol. Reviews. 1991. - 55. - p. 476 - 511/

114. Franks F. biological freezing and cryofixation. // J. Microsc. Gr. Brit. -1977.-V. 111, № l.-р.З- 16.

115. Greiff D. Applications of vacuum technigues to the freeze-drying of biological materials. // AIChE. Ser. 1972. - V. 68 125. p, 5 - 7.

116. Greiff D. freeze-diying cicles. Develop. Boil. Standard. - 1976. - V. 36. -p. 105 - 115.

117. Guerra M.M., Bernardo F.M. Characterization of inhibitors of L. monocytogenes «Scott А» produced by ripening microflora of Alentejo s traditional cheeses //Rev. Port. Cienc. Vet. 2001.-V96/ 538.-P. 65 - 69

118. Harwood D.G. Listeriosis in goats. // Goat Veter. Soc. J. 1989. - V. 10 - p. 1-4.

119. Hemert P. Vaccine production as a unit process. Progress in Indus. Microbiol. 1974. 13: 151-273 p.

120. Husu J. R. Epidemiological studies on the occurrence of Listeria monocytogenes in the faeces of dairy cattle. // J/ Vet. Med. 1990. - V. 37 -p. 276 - 282.

121. International Dairv Federation: International Provisional IDF Standart 143: 1990. Detection of Listeria monocytogenes. IDF // Square Vergote 41, В -1040. Brussels. - Belgium. - 1990/

122. Karch H., Schwarzkopf A. and Schmidt H. Amplification methods in diagnostic bacteriology (selected examples). // Acta Vet. Hungarica. 1997. -V. 23.-p. 55 -73.

123. Kuntz J.D., Brassfield T.S., Law G.D., Purcell G.V. Hydration of macromolecules. // Scence. 1969. - V. 163, № 3873 - p. 1328 - 1331.

124. Kuntz J.D., Kauzmann W. Hydration of proteins and polypeptides. // Adv. Protein Chem. 1974. - V. 28. - p. 239 - 347.

125. Loncarevic Semir. Listeria monocytogenes wish special refence to Food product sand Human Listeriosis. // Doctorial thesis, Swedish University or Agricultural Sciences. Uppsala. - 1998.

126. Manzano M., Cocolin L., Ferroni P., Cantoni C., Comi G. A Simple and Fast PCR Protocol to Detect Listeria monocytogenes from Meat. // J.Sci. Food Agriculture. 1997. - V. 74 - n. 1. - p. 25 - 30.

127. Mazur P. Ciyobiology: The freezing of biological system. I I Sciece. 1970. - V. 168, № 393. - p. 939 - 949.

128. Meruman H.T. Criobiology. 1971. - V. 8 - p. 382.

129. Monod I. La technique culture continue. Theorie et applications. // Ann. Inst. Pasteur, Paris 1950 - V. 79. - 390 - 410.

130. Monod I. The growth of bacterial cultures. // Ann. Rev. Microbiol. 1949. -№3.-p. 374-394.

131. Peters M., Pohlenz J., Jaton K., Ninet В., Bille J. Studies of the Detection of Listeria monocytogenes by Culture and PCR in Cerebrospinal Fluid samples Ruminants wist Listeria Encephalitis. // J. Vet. Med. 1995. - V. 42 - p. 84 - 88.

132. Pirt S.J. The maintenance energy of bacteria in growing cultures. // Pro. Roy. Soc. 1965. - V. 163, № 991. - p. 224 - 231.

133. Rebiere Y. Epidemie de Listeriose France - Ete 1993. // Bilan au ler decembre 1993. Jet - Le bull. d'Epiter. - 1994. - V. 7. - n.l. - p. 8 - 11.

134. Rorvik L.M., Caugant D.A., Yndestad M. Contamination pattern of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. In a salmon slaugterhouse and smoked salmonprosseing plant. // Int. J. Food Microbiol. 1995 - V. 25. - p. 19-27.

135. Sakai A., Yoshida S. Role of sugar and related compounds in variations of freezing resistance. // Cryobiol. 1968. - V. 5, № 3. - p. 160 - 165.

136. Terplan G. Bedeutung der Listerien fur die Milchwirtsch. // Dt. Milchwirtsch. 1990. - n. 6. - p. 168 - 169.

137. Unnerstad H., Romell A., Erisson H., Daneilsson Tham M.-L. and Tham W. Listeria monocytogenes in Faeces from Clinically Healthy Dairy Cows in Sweden. //Acta Vet. Scand. - 2000 - V. 41. - p. 167 - 171.

138. Vonod I. The growth of bacterial cultures. Ann. Rev. Micobiol. 1949. 3: 374-394 p.

139. Vrana D., Votruba J., Placek J. Age related changes n the physiological state of budding yeast cells. Exp. Cell. Res. 1982. Vol. 138, 1:57-62 p.

140. Wang B.J.C., Cooney C.L., Demain A.L. Fermentation and enzyme technology. N-Y.: John Willey and sons. 1979 180 p.

141. Weber A., Arand E. et al. Listeria monocytogenes alls Ursache von entzundlichen Augeweranderunden bei Rindern // Tierartztl. Umschau.-1999.-V.54-P. 143-147.

142. Wesley I.V., Bruner J.H., Van der Maaten. Effects of dexamethasone on shedding of Listeria monocytogenes in dairy cattl. // Am. J. Veter. Research. 1989. - V. 50. - p. 2000 - 2013.

143. Wiedman M., Arvik Т., Bruce J. et. Al. Investigation of a listeriose epizootic in sheep in New York state. // Amer. Journ. Vet. Research. -1997. V. 58. - n. 7. - p. 78 - 80.

144. Wu F.M., Muriana P. Genomic Substration in Combination with PCR for Enrichment of Listeria monocytogenes specific sequences. // Inter. J. Food Microb. 1995. - V. 27. n. 2 - 3 - p. 161 - 174.