Разработка новых препаратов на основе моноклональных антител для диагностики холерных вибрионов O1, O139 серогрупп ускоренными методами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Кретенчук, Оксана Федоровна

• Кретенчук, Оксана Федоровна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Кретенчук, Оксана Федоровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гибридомная технология получения МКА

1.2. Серологические методы исследования в лабораторной диагностике холеры

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Лабораторные животные

2.2. Бактериальные штаммы

2.3. Клеточные линии позвоночных

2.4. Питательные среды и реактивы

2.5. Гибридизация клеток

2.6. Клонирование гибридом

2.7. Культивирование гибридом in vitro и in vivo

2.8. Криоконсервирование гибридом

2.9. Подъем из жидкого азота гибридом

2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов

2.11. Маркировка иммуноглобулинов ФИТЦ

2.12. Метод иммунофлуоресценции

2.13. Иммуноферментные методы

2.14. Иммуноблоттинг

2.15. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони

2.16. Реакция агглютинации

2.17 Методы статистической обработки результатов

ГЛАВА 3. ГИБРИДОМЫ-ПРОДУЦЕНТЫ МКА К АНТИГЕНАМ

V. CHOLERAE OI И 0139

3.1. Подъем из азота и оптимизация условий культивирования гибридом-продуцентов МКА, направленных к поверхностным эпитопам V. cholerae 0139

3.2. Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих видоспецифические МКА OI

3.3. Оценка продукции специфических иммуноглобулинов гибридомами в условиях in vitro

3.4. Получение и накопление в препаративных количествах МКА в виде АЖ

3.5. Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов различными методами

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА МКА, НАПРАВЛЕННЫХ К ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЭПИТОПАМ V. CHOLERAE OI И

0139

4.1. Определение специфичности и активности МКА из АЖ и КЖ в различных серологических реакциях

4.2. Определение класса специфических иммуноглобулинов

4.3. Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации

4.4. Эпитопная направленность МКА OI и 0139

ГЛАВА 5. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ НА ОСНОВЕ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ OI И 0139 СЕРОГРУПП

5.1. Оптимизация условий получения видоспецифических флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. cholerae OI и 0139

5.2. Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов

5.3. Лиофилизация флуоресцирующих МКА

5.4. Оценка серологической активности флуоресцирующих препаратов после лиофилизации и в процессе хранения

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ МКА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ OI И 0139 СЕРОГРУПП В РЕАКЦИИ СЛАЙД-АГГЛЮТИНАЦИИ

6.1. Исследование агглютинабельности MICA, выделенных из АЖ и ЮК, в реакции слайд-агглютинации

6.2. Получение экспериментальных серий диагностических агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов

6.3 Стабильность лиофилизированных диагностических

агглютинирующих MICA при хранении

6.4. Оценка возможности применения диагностических наборов для выявления холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп,

подвергнутых воздействию различных факторов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка новых препаратов на основе моноклональных антител для диагностики холерных вибрионов O1, O139 серогрупп ускоренными методами»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Первое десятилетие XXI века отмечено крупными эпидемиями и вспышками холеры в странах Африки и Азии, а также Северной Америки с заносами инфекции из эндемичных очагов практически ежегодно на все континенты, с тенденцией к росту мировой заболеваемости, что определяет неблагоприятный прогноз и для России [77]. Поэтому в нашей стране постоянно проводятся мероприятия, направленные на предупреждение заноса и распространения этого особо опасного заболевания. Одной из важнейших составных частей эпидемиологического надзора за холерой является своевременная диагностика, эффективность которой зависит от наличия высокочувствительных и специфичных препаратов для серологического анализа. Как отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, трудность в борьбе с холерой вызвана недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких тестов.

В последние годы активно развиваются инновационные технологии по созданию рекомбинантных белков, в частности антител, получаемых с помощью молекулярно-генетических манипуляций. Благодаря разработке гибридомной технологии широкое распространение в лабораторной диагностике получили и моноклональные антитела (МКА). Уже первые МКА продемонстрировали уникальные преимущества перед поликлональными сыворотками: высокая специфичность и активность, стандартность, стабильность, возможность получения в неограниченном количестве. Очевидно, что МКА в силу своей уникальной направленности к индивидуальным антигенным детерминантам позволяют разработать на их основе препараты для серологической идентификации и дифференциации холерных вибрионов, отвечающие современным требованиям. Процесс замены поликлональных антител в диагностических наборах на моноклональные начался еще в начале 80-х годов и активно продолжается в настоящее время в направлении создания новых

препаратов на основе MICA [37]. Зарубежные публикации, касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились еще в 1982 году, то есть намного раньше, чем отечественные. В. Gustafsson et al. получили МКА к коровой области ЛПС V. cholerae OI, которые выявляли в реакции слайд-агглютинации антигенную детерминанту, общую для всех представителей вида V. cholerae [132]. Также этой группе авторов удалось получить МКА к А-, В- и С-антигенам V. cholerae 01, на основе которых были приготовлены флуоресцирующие препараты для экспресс-диагностики холерных вибрионов OI. Позже другие зарубежные авторы сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г. создали набор для выявления V. cholerae 0139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции [134]. Несомненно, такие препараты эффективны и полезны как в случае ранней диагностики холеры, так и на различных этапах исследования. В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия. В отечественной практике сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28, 30]. В диссертации О.С. Бурлаковой (1993 г.) показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae 01 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов [29]. Для экспресс-диагностики токсигенных штаммов V. cholerae З.Л. Девдариани с соавторами в 1999 г. предложили использовать МКА в дот-иммуноанализе [38]. В работе Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae 0139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. С 2000 г. в

Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в иммунохроматографических (ИХ) тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11]. Результаты испытания полученных ИХ тест-систем для выявления V. cholerae 01 показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы 01 серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже

о

10 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами (2010 г.) сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+» [22]. Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность

О Q

порядка 10 - 10 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. Экономически затратным является и производство ИХ полосок, так как их себестоимость в итоге получается достаточно высокой. Из современных технологий обращает на себя внимание технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами [80] описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа. Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа. Присутствие в пробах с холерным токсином молока, мясного бульона и воды из открытого водоема не снижает чувствительность методов. Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки. Однако сложная технология

приготовления наряду с высокой себестоимостью анализа ограничивает возможность их использования практическими лабораториями, которым требуются высокочувствительные, специфичные и простые экспресс-методы. На сегодняшний день в лабораторной диагностике холеры согласно МУК 4.2.2870-11 используются лошадиные агглютинирующие 01-сыворотки, иммуноглобулины 01 флуоресцирующие и кроличья агглютинирующая 0139-сыворотка производства института «Микроб». Однако существующие препараты не отвечают в полной мере современным требованиям, так как обладают рядом недостатков: разнородность и гетерогенность популяций антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов, наличие перекрестных реакций. Применение агглютинирующих МКА позволит исключить перекрестные реакции с представителями холерных вибрионов не 01/не 0139, среди которых увеличивается число штаммов, агглютинирующихся холерной сывороткой 01 в низком титре [70]. Проблема повышения качества диагностических препаратов и, как следствие, повышение достоверности лабораторной диагностики холеры была и остаётся в центре внимания специалистов. В институте «Микроб» в последние годы разработан новый диагностический препарат для выявления холерных вибрионов 0139 с помощью прямого метода иммунофлуоресценции [13, 14]. В технологии предусмотрено получение кроличьей сыворотки путем иммунизации убитыми клетками вибрионов и для удаления неспецифических антител необходима неоднократная адсорбция близкородственными микроорганизмами, что сопровождается значительными потерями специфических иммуноглобулинов и соответственно отражается на качестве препарата. Несмотря на неоднократную адсорбцию, не удается избавиться от антител, обеспечивающих перекрестную активность с V. ско1егае 022. Одним из перспективных направлений является создание на основе МКА флуоресцирующих и агглютинирующих препаратов для выявления V. ско1егае 01 и 0139, так как в ряду других иммунодиагностических тестов, предназначенных для ранней диагностики холеры, эти методы обладают рядом преимуществ: экспрессность анализа и простота исполнения.

В связи с вышеизложенным, исследования, направленные на совершенствование и разработку новых холерных иммунодиагностикумов, не утратили своей актуальности и практической значимости.

Цель исследования - совершенствование лабораторной диагностики холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в реакциях прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.

Задачи исследования:

1. Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых, продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных вибрионов 01 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность, аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.

2. Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА, провести их очистку с помощью различных методов, оценить их специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции, слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.

3. Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для выявления V. ско1егае 01 и 0139 в реакции прямой иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов в лиофилизированном виде.

4. Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА 01, МКА 0139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые агглютинирующие МКА.

5. Провести лабораторные испытания экспериментальных серий видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА 01, МКА 0139, оформить нормативную документацию для их государственной регистрации.

Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми располагает лаборатория, расширен за счет получения новых, продуцирующих МКА, направленные к детерминантам О-антигена ЛПС V. cholerae Ol. На основании иммунохимического анализа штаммов холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп установлены диагностически значимые МКА, отличающиеся тем, что они выявляют консервативные эпитопы ЛПС с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности, пространственно расположенные так, что при взаимодействии с антителами не возникает стерических помех. Установление эпитопов, в меньшей степени подверженных модификации и утрате при воздействии различных факторов, способствует повышению диагностической ценности препаратов.

Впервые показана возможность использования в качестве полноценного источника МКА для изготовления препаратов не только асцитической, но и культуральной жидкости, которая в больших объемах накапливается при пассировании гибридом-продуцентов in vitro.

Отработана и оптимизирована технология изготовления моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. cholerae 01 и 0139, заключающаяся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливании диализом, выборе оптимального соотношения флуорохрома и МКА, стабилизации конъюгатов путем лиофильного высушивания.

Теоретическая и практическая значимость работы. Набор гибридом, стабильно продуцирующих видоспецифические МКА Ol и 0139, является источником стандартных моноклональных иммуноглобулинов, на основе которых сконструированы диагностические препараты нового поколения.

Разработана экспериментально-производственная технология изготовления моноклональных флуоресцирующих конъюгатов для диагностики холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в реакции прямой иммунофлуоресценции. Создан диагностический набор агглютинирующих МКА для идентификации и дифференциации V. cholerae 01 и 0139 в реакции слайд-агглютинации. По результатам проведенных исследований оформлен комплект нормативной

документации, включающий в себя инструкцию по применению, справку об изделии медицинского назначения и технические условия на наборы реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae 01/0139 - РИФ» и «Иммуноглобулины моноклональные диагностические сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом РА «ИГ -V. cholerae О I/O 139 — РА», которые в настоящее время находятся на регистрации в Росздравнадзоре.

На гибридомы, стабильно продуцирующие МКА к видоспецифическим эпитопам возбудителя холеры 01 и 0139, получены два патента на изобретение №2425874 от 13.04.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных вибрионов 01 серогруппы» и №2425875 от 07.06.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы».

Экспериментальные серии флуоресцирующих МКА 01 и МКА 0139 были использованы при выполнении кандидатской диссертационной работы Куликаловой Е. С. на базе ФГУЗ «Иркутского научно-исследовательского противочумного института». Разработанные наборы используются при выполнении научно-исследовательских работ во ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, в работе СПЭБ, также для оценки качества препараты в коммерческом виде переданы в Волгоградский и Ставропольский противочумные институты, в ГНЦ ПМБ (г. Оболенск).

Методология и методы исследования. В работе использованы различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, РИФ, слайд-агглютинация, преципитация, иммуноблот), биохимические и микроскопические.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Набор гибридом-продуцентов обеспечивает получение диагностически значимых, стандартных, воспроизводимых МКА, узнающих видоспецифические эпитопы О-антигена холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, позволяет конструировать диагностические препараты нового поколения.

2. Видоспецифические МКА выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате при воздействии различных факторов, что способствует повышению диагностической ценности препаратов.

3. Для создания диагностических препаратов впервые использована культуральная жидкость, являющаяся полноценным источником иммуноглобулинов, получение которой не требует привлечения лабораторных животных.

4. Разработанная биотехнологическая схема экспериментально-производственного изготовления холерных 01, 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препараты, характеризующиеся высокой специфичностью и чувствительностью.

5. Набор диагностических агглютинирующих МКА без дополнительной постановки развернутой реакции агглютинации обеспечивает выявление холерных вибрионов 01, 0139 серогрупп.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях: проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» (г. Ростов-на-Дону, 2009 - 2013 г.); научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвященная 75-летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск, 2009 г.); конференция молодых ученых ФГУЗ РостНИПЧИ (г. Ростов-на-Дону, 2011 г.); Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием:

«Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (г. Пермь, 2012 г.). Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы № 121-4-10 «Создание видоспецифических моноклональных препаратов для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с помощью тестов слайд-агглютинации, прямой иммунофлуоресценции и иммунохроматографии (2010 - 2014)» (номер государственной регистрации 01200907528).

Личный вклад соискателя. Основные разделы диссертационной работы выполнены О.Ф. Кретенчук самостоятельно на базе группы гибридом Ростовского-на-Дону противочумного института. Разработка идей, постановка научных задач, методическая часть работы, конструирование препаратов, получение научных результатов и их обоснование были выполнены автором под руководством д.б.н., профессора Л.П. Алексеевой.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, 5 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК. Получены 2 патента на изобретение №2425874 (13.04.2010 г.) и №2425875 (07.06.2010 г.)

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора (протокол №8 от 19.06.2012 г.)

Структура диссертации. Работа изложена на 134 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 156 источников, в том числе зарубежных - 37. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 19 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Гибридомная технология получения МКА

История развития гибридомной технологии является примером стремительного проникновения идей и методов фундаментальной науки в прикладные области исследований и производственную сферу. Гибридизация соматических клеток, зародившись как метод исследования в области клеточной биологии, становится всё более значимой областью биотехнологии.

Гибридомы как продуценты моноклональных антител заданной специфичности были открыты в 1975 г. G. Kohler, С. Milstein [137]. Гибридные клетки, продуцирующие иммуноглобулины и антитела известной специфичности были описаны и ранее, например, в 1969 г. S. Sinkovics из отдела клинической вирусологии и иммунологии университета в Техасе сделал сообщение о спонтанном получении гибридных клеток между лимфоцитами и плазматическими клетками лейкозных мышей [150]; в 1971 г. В. Mohin опубликовал работы по продукции иммуноглобулинов гибридами, образованными клетками миеломы и лимфомы мышей [142]. Но ни одно из сообщений не привело к скачку в развитии этой отрасли науки [24]. Методика Келера и Мильштейна решила одну из основных проблем, которую иммунологи пытались решить на протяжении многих лет, - проблему длительного воспроизводства больших количеств гомогенных антител к разнообразным антигенам [76]. Именно они, предварительно введя в организм антиген и вызвав таким образом иммунный ответ, извлекли лимфоидные клетки, продуцирующие соответствующие антитела, и объединили их с клетками опухоли (миеломы). В результате получился непрерывно делящийся клеточный гибрид (гибридома), способный синтезировать антитела с заданной специфичностью. Гибридома унаследовала от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту [25]. Продуцировать антитела способны только единичные гибридомы, которые и отбирают после тестирования (рисунок 1).

клетки Т слияние

| Рост на среде ГАТ

О, о

I Тестирование (ИФА) Положительный

Отдельный Отдельный

гибридный клон гибридный

Положительный Отоииательный

Рисунок 1 - Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела

Антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, стали называть моноклональными за их происхождение. Но понятие моноклональности существовало в иммунологии давно. Так в понимании Ф. Бернета [85], одна клетка иммунной системы продуцирует антитела только против одного антигена, то есть иммунная система клонирована по антигену. И то, что моноклональность гибридомных антител (физическая моноклональность) в подавляющем большинстве случаев совпадает с моноклональностью в понимании Бернета (антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток одинаковы), явилось блестящим экспериментальным подтверждением клонально-селекционной теории иммунитета. МКА, продуцируемые одной гибридомой, абсолютно идентичны друг другу по всем параметрам, они взаимодействуют только с одной из представленных в структуре антигена детерминантой. В клинической практике с такими антителами сталкиваются при миеломной болезни. У больных миеломой около 95 % иммуноглобулинов сыворотки крови вырабатываются одним злокачественно трансформированным клоном плазматических клеток. К МКА относят и белки Бене-Джонса - димеры легких цепей иммуноглобулинов, часто обнаруживаемые в большом количестве в моче больных миеломой [78]. Что

касается препаратов, то до гпбридомной технологии в иммунологии не было специфических антител такой степени гомогенности.

После публикации известной статьи в 1975 г. метод гибридизации претерпел существенные изменения. Многочисленна и многообразна литература, посвященная способам получения МКА, что свидетельствует о важности методической части гибридомной технологии, которая состоит из следующих этапов: получение линий опухолевых клеток, иммунизация доноров селезеночных клеток, слияние клеток, селекция гибридом, выявление позитивных культур и их клонирование.

Большинство полученных к настоящему времени гибридом - мышиные по происхождению, потому что мыши являются наиболее доступным источником миеломных клеточных линий, а гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют больше антител, чем межвидовые. Также получают гибридомы крыс, а менее успешно - гибридомы человека [16, 44, 52]. Хотя если мы говорим о терапии с помощью МКА, то мышиные антитела зачастую распознаются иммунной системой человека. Развивающийся при этом иммунный ответ приводит к снижению эффективности вводимых препаратов из-за связывания их с антителами, вырабатываемыми в ходе ответной реакции. Для решения этой проблемы проводят работы по конструированию химерных и гуманизированных антител, имеющих большие преимущества в качестве терапевтических и диагностических препаратов. Для создания химерного антитела константную часть мышиных антител замещают соответствующей константной областью иммуноглобулина человека. Как известно, в константных доменах находится большая часть антигенных детерминант, с которыми связаны основные эффекторные функции (взаимодействие с Рс-рецепторами, системой комплемента и др.), поэтому использование химерных иммуноглобулинов мышь/человек обусловливает нормальное их взаимодействие с иммунной системой человека при сохранении специфичности и сродства к антигену мышиных моноклональных антител. Что касается гуманизированных антител, то для их создания в иммуноглобулинах человека заменяют только аминокислоты, образующие

взаимодействующую с антигеном зону (гипервариабельные регионы), на соответствующие аминокислоты мышиного антитела [25]. Такие антитела практически не вызывают в организме человека специфического иммунного ответа.

Важный этап получения гибридом, можно сказать самый «творческий» -подготовка иммунных спленоцитов. Успех иммунизации зависит от ряда факторов: свойств иммуногена, природы антигена, генотипа животного. Для получения высокого титра антител должна быть оптимизирована схема иммунизации. Если речь идет о мышах, то могут быть использованы животные в возрасте 3-4 месяцев любого пола. Существуют два основных способа иммунизации [91, 105, 128]:

1) in vivo:

а) короткая схема - введение антигена дважды с двухнедельным интервалом в подушечки задних лапок (антиген+ПАФ, антиген+НАФ);

б) длинная схема - введение антигена с интервалом 2 — 4 недели внутрибрюшинно или подкожно, реже внутривенно или орально (первый этап -антиген+ПАФ, последующие - антиген+НАФ) [122].

Важным моментом является то, что спустя неделю после заключительной иммунизации необходимо провести тестирование крови на наличие нужных антител. Обычно иммунизируют ряд животных и выбирают селезенки тех мышей, у которых самый высокий титр антител.

Заслуживает внимание и внутриселезеночная инъекция антигена, разработанная М. Spitz et al. Ее применяли с успехом при получении МКА к различным вирусным антигенам, но в этом случае, как правило, наблюдается образование гибридом к поверхностным антигенам и не всегда гибридизация дает высокую эффективность [127, 151].

2) in vitro:

а) преимущества - 1) сокращение сроков иммунизации до 4 — 5 дней; 2) непосредственный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, минуя

барьеры живого организма; 3) возможность контролировать эффективность иммунного ответа;

б) недостатки - 1) стерильность используемого антигена; 2) наличие качественной культуральной среды и биологически активных иммунофакторов.

Особое значение придается иммунизации in vitro при получении гибридом на основе лимфоцитов человека из-за запрета на иммунизацию in vivo.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кретенчук, Оксана Федоровна, 2014 год

Список литературы

1. Абакумов, М.А. Визуализация экспериментальной глиомы С6 методом МРТ с помощью магнитных наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов / М.А.Абакумов, С.А. Шеин, X. Вишвасрао и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2012. - Т. 154, №8. - С. 242 - 246.

2. Абрамова, Е.Г. Возможность применения иммуноглобулинов флуоресцирующих холерных 0139 для детекции Vibrio cholerae 0139 различными методами экспресс-анализа / Е.Г. Абрамова, Т.В. Аленкина, Г.В. Бочкарева, О.В. Громова // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2004. - Вып. 17. - С. 84 - 85.

3. Абрамова, Е.Г. Применение флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов для выявления Vibrio cholerae 0139 различными методами экспресс-анализа / Е.Г. Абрамова, Т.В. Аленкина, Г.В.Бочкарева, О.В. Громова // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 10 -11.

4. Абрамова, Е.Г. Экспресс-диагностика Vibrio cholerae 0139 методом флуоресцирующих антител / Е.Г. Абрамова, Т.В. Аленкина, Г.В .Бочкарева, О.В. Громова // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. — С. 85 - 86.

5. Алексеева, Л.П. Диагностические препараты на основе МКАт для идентификации возбудителя холеры OI группы в реакциях коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции / Л.П. Алексеева, О.С.Бурлакова, А.С. Новохатский и др. // Совр. направления создания мед. диагностикумов: Тез. докл. Всесоюз. конф. - М., 1988. - С. 38.

6. Алексеева, Л.П. К вопросу об агглютинабельности холерных О-моноклональных иммуноглобулинов / Л.П. Алексеева, О.С. Бурлакова, В.В. Балахнова // Микробиол. журн. - 1992. - Т.54, №6. - С. 50 - 54.

7. Алексеева, Л.П. Моноклональные антитела в исследовании структуры и биологических свойств липополисахарида возбудителя холеры /

Л.П.Алексеева, О.С. Бурлакова, В.В. Балахнова // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов на-Дону, 1992. -С.112- 115.

8. Алексеева, Л.П. Моноклональные антитела к детерминантам О-антигена холерного вибриона OI группы и перспективы их использования / Л.П.Алексеева, А.С. Новохатский, О.С. Бурлакова // Акт. вопр. микробиологии, лаб. диагностики и профилактики холеры: тез. всесоюз. науч. конф. - Ростов-на-Дону, 1988. - С.140 - 144.

9. Алексеева, Л.П. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae 0139 / Л.П. Алексеева, О.И. Сальникова, Б.Л. Мазрухо и др. // Биотехнология. - 2002. - №2. - С. 79 - 84.

Ю.Алексеева, Л.П. Оценка полисахаридных антигенов Vibrio cholerae 0139 различного происхождения с помощью моноклональных антител / Л.П.Алексеева, Б.Л. Мазрухо, О.С. Чемисова и др. // Журн. микробиол. -2002. -№4. _с. 25-29.

П.Алексеева, Л.П. Сравнительная оценка методов дот-иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении холерных вибрионов OI серогруппы / Л.П. Алексеева, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов и др. // Журн. микробиол. - 2010. - №6. - С. 88 - 93.

12.Алексеева, Л.П. Флуоресцирующие моноклональные иммуноглобулины для ускоренной диагностики холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп / Л.П. Алексеева, О.С. Чемисова, Б.Л. Мазрухо, Е.В. Ишина // Соврем, технологии в диагност, особо опас. инф. бол.: Матер. 4-ой Межгос. науч.-практ. конф. госуд.-участ. СНГ. - Саратов, 2003. - С. 13-17.

13.Аленкина, Т.В. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи / Т.В. Аленкина, Г.В.Бочкарева, И.В. Шульгина и др. // Актуал. пробл. предупрежд. и ликвид. последствий чрезвыч. ситуаций в области сан.-эпид. благополучия населения госуд.-участ. СНГ: Матер. X Межгос. науч.-практ. конф. госуд.-участ. СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 161 - 162.

14.Аленкина, Т.В. Разработка и основные этапы внедрения препарата «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139» / Т.В. Аленкина, Г.В. Бочкарева, JI.B. Саяпина и др. // Пробл. особо опас. инф. - Саратов, 2012. - Вып. 113. - С. 74 - 78.

15. Алешина, Ю.А. Свойства экспериментальных и производственных препаратов протективного О-антигена Vibrio cholerae М41 Огава / Ю.А.Алешина, В.И. Павлова, А.В. Комиссаров и др. // Пробл. особо опас. инф. - Саратов, 2013. - Вып. 2. - С. 70 - 72.

16.Антитела: Методы. В 2 кн. Кн.1 / Пер. с англ.; Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991.-287 с.: ил.

17.Антитела: Методы. В 2 кн. Кн.2 / Пер. с англ.; Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991.-384 с.: ил.

18.Антонов, В.А. Современные подходы к диагностике сапа и мелиоидоза. Идентификация и типирование Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei / В.А. Антонов, В.И. Илюхин, Н.П. Храпова и др. // Пробл. особо опас. инф. - Саратов, 2012. -Вып. 2 (112). - С. 46 - 50.

19.Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - JL: Медгиз., 1962. -180с.

20.Бабицын, С.Н. Антиэнтеротоксические моноклональные антитела в диагностике холеры: дис... канд. мед. наук : 14.00.36 / Бабицын Сергей Николаевич. - Алма-Ата, 1991. - 165 с.

21.Баранова, Е.В. Разработка иммунохроматографических тестов для выявления штаммов серогруппы OI и токсинобразующих штаммов холерного вибриона / Е.В. Баранова, Г.Н. Федюкина, П.В. Соловьев и др. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2013. - Вып. 26. - С. 215 - 218.

22. Баранова, Е.В. Разработка иммунохроматографического теста для обнаружения токсигенных штаммов Vibrio cholerae / Е.В. Баранова, П.В.Соловьев, В.В. Агафонова и др. // Актуал. пробл. предупрежд. и ликвид. последствий чрезвыч. ситуаций в области сан.-эпид. благополучия

населения госуд.-участ. СНГ: Матер. X Межгос. науч.-практ. конф. госуд.-участ. СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 165.

23.Биотехнология. Принципы и применение: пер с англ. / под ред. И.Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. - М.: Мир, 1988. - 480 с. : ил.

24.Биотехнология. Т. 20. Гибридомная технология и применение моноклональных антител в медицине и биотехнологии / ВИНИТИ. - М., 1989.- 133 с.

25.Биотехнология: теория и практика: учеб. пособие для вузов / под ред. Н.В. Загоскиной, JI.B. Назаренко. - М.: Издательство Оникс, 2009. - 496 с.

26.Брагина, И.В. Новые технологии в практике работы микробиологических лабораторий госсанэпидслужбы России / И.В. Брагина, Н.С. Криволапова, Э.Ф. Опочинский, Т.В. Воронцова // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 47 - 49.

27.Булатова, Т.В. Эффективность применения тест-системы иммуноферментной моноклональной для оценки активности серий гликопротеина 200 KÜa возбудителя мелиоидоза / Т.В. Булатова // Матер. V Ежегодного Всерос. Конгресса по инф. болезням. - М., 2013. -С. 74.

28.Бурлакова, О.С. Изучение свойств моноклональных антител к О-антигену холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба / О.С. Бурлакова, Л.П.Алексеева, A.C. Новохатский // Акт. вопр. микробиологии, лаб. диагностики и профилактики холеры: тез. Всесоюз. науч. конф. - Ростов-на-Дону, 1988. - С.152 - 154.

29.Бурлакова, О.С. Моноклональные антитела к О-антигену возбудителя холеры: автореф. дис...канд. мед. наук : 03.00.07 / Бурлакова Ольга Спартаковна. - Ростов-на-Дону, 1993. - 23 с.

30.Бурлакова, О.С. Огава-специфический Ко-реагент для обнаружения возбудителя холеры / О.С. Бурлакова, Л.П. Алексеева, A.C. Новохатский, Г.М. Орлова // Актуал. вопр. разработки препаратов для мед. биотехнологии: Тез. конф. - Махачкала, 1988. - 4.2. - С. 237 - 238.

31 .Буханцова, JI.В. Моноклональные антитела против антигенов спор вобудителя сибирской язвы и перспективы их применения / Л.В.Буханцова, Н.П. Храпова, А.В. Липницкий // Соврем, технологии в диагност, особо опас. инф. бол.: Матер. 4-ой Межгос. науч.-практ. конф. госуд.-участ. СНГ. - Саратов, 2003. - С. 34 - 36.

32.Бывалов, А.А. Получение и характеристика моноклональных антител к липополисахариду Yersinia pseudotuberculosis / А.А. Бывалов, Г.Д. Елагин, Д.В. Печенкин и др. // Биотехнология. - 2010. - №3. - С. 78 - 83.

33.Быченкова, Т. А. Комлект индикаторных средств на основе мультиплексного иммуноанализа для детекции патогенов / Т.А.Быченкова, А.Л. Тютерева, Н.С. Короткова и др. // Матер. V Ежегодного Всерос. Конгресса по инф. болезням. - М., 2013. - С. 79.

34.Вергун, О.М. Экспресс-диагностика употребления наркотиков с использованием иммунохроматографических тест-систем, разработанных в республике Беларусь на основе моноклональных антител / О.М. Вергун // Клин. лаб. диагностика. - №9. - 2010. - С. 57.

35.Ганова, Л.А. Диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления антител к Brucella abortus в сыворотке крови и молоке крупного рогатого скота / Л.А. Ганова, Г.Е. Раевская, В.Г. Пилипенко и др. // Соврем, технологии в диагност, особо опас. инф. бол.: Матер. 4-ой Межгос. науч.-практ. конф. госуд.-участ. СНГ. - Саратов, 2003- С. 51-53.

36.Григоренко, Л.В. Особенности агглютинабельности штаммов Vibrio cholerae поп Ol/non 0139, выделенных из воды открытых водоемов / Л.В.Григоренко, В.Д. Кругликов, Э.А. Москвитина и др. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2011. - Вып. 24. - С.114 - 117.

37.Девдариани, З.Л. Научно-методические основы конструирования чумных моноклональных иммуноглобулиновых реагентов с использованием гибридомной биотехнологии: автореферат дис...докт. мед. наук : 03.00.07 / Девдариани Зураб Леванович. - Саратов. - 1993. - 52 с.

38.Девдариани, 3.JL Экспресс-диагностика токсигенных штаммов Vibrio cholerae в дот-иммуноанализе с помощью моноклональных антител / 3.JL Девдариани, Т.В. Аленкина, В.А. Федорова // Клин. лаб. диагностика. -1999.-№8.-С. 24-33.

39. Девдариани, 3.JI. Экспресс-идентификация токсигенных штаммов возбудителя холеры / 3.JL Девдариани, Т.В. Аленкина, В.А. Федорова // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образов, противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т.2. - С. 171 - 172.

40.Деев, С.М. Моноклональные антитела для диагностики и терапии / С.М. Деев // Биотехнология. - 2008. - №2. - С. 3 - 13.

41.Джапаридзе, М.Н. Использование нового штамма Vibrio cholerae 0139 в качестве продуцента энтеральной химической вакцины / М.Н. Джапаридзе, A.B. Наумов, О.В. Громова и др. // Журн. микробиол. — 1996.-№2.-С. 52-55.

42.Дзагурова, Т.К. Разработка иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом / Т.К.Дзагурова, О.Н. Солопова, П.Г. Свешников и др. // Вопросы вирусологии. - 2013. -Вып. 58 (1). - С. 40 - 44.

43 .Доронин, И.И. Получение Fab-фрагментов ОБ2-специфичных антител и анализ их противоопухолевой активности in vitro / И.И. Доронин, И.В. Холоденко, И.М. Молотковская, Р.В. Холоденко // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2012. - Т.154, №11. - С. 616 - 622.

44.Дыкман, JI.A. Технология фагового дисплея антител / JI.A. Дыкман // Бактериофаги: Теоретич. и практ. аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой пром-ти: Матер, науч.-практ. конф. — Ульяновск, 2013. - Т.2. - С. 109-114.

45.3ахарова, T.JI. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности и иммуногенности у холерных вибрионов / Т.Д. Захарова,

С.П. Заднова, Л.Ф. Ливанова и др. // Биотехнология. - 2008. - №2. - С. 88 -96.

46.Иванов, A.A. Терапия моноклональными антителами — панацея или паллиатив? / A.A. Иванов, И.П. Белецкий // Internet, http ://www.remedium.ru/drugs/doctor/psychiatry/detail .php?ID=47547.

47.Иващенко, T.A. Конструирование тест-системы иммуноферментной моноклональной для выявления V антигена Y. pestis / T.A. Иващенко, Е.В.Белова, И.Г. Шемякин // Матер. V Ежегодного Всерос. Конгресса по инф. болезням. - М., 2013. - С. 170.

48.Иващенко, Т.А. Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для выявления капсульного антигена Fl Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, E.B. Белова, C.B. Дентовская и др. // Биотехнология. — 2012. - №6. — С. 76 -85.

49.Ильичев, A.A. Использование фаговых пептидных библиотек для изучения эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 антителами широкого спектра действия Z13E1, VRC03 и VRC01 / A.A. Ильичев, А.Н. Чикаев, Д.Н. Щербаков и др. // Бактериофаги: Теоретич. и практ. аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой пром-ти: Матер, науч.-практ. конф. - Ульяновск, 2013. - Т. 1. - С. 7 - 14.

50.Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, пер. с нем. А. П. Тарасова. - М.: Медицина, 1987. - 472 е.: ил.

51 .Иммунология: практикум: учеб. пособие / под ред. Л.В. Ковальчука, Г.А. Игнатьевой, Л.В. Ганковской. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 176 с.

52.Иммунология: учеб. пособие / Р. Койко, Д. Саншайн, Э. Бенджамини; пер. с англ. A.B. Камаева, А.Ю. Кузнецовой; под ред. Н.Б. Серебряной. - М.: Издательский центр «Академия», 2008. - 368 с.

53.Использование моноклональных антител в научных исследованиях // Internet. - http://ernas.info/content/ispolzovanie-monoklonalnyh-antitel-v-nauchnyh-issledovaniyah.

54.Казачинская, Е.И. Получение моноклональных антител, специфичных к основному тегументному белку рр65 вируса герпеса человека 5-го типа / Е.И. Казачинская, М.А. Суслопаров, В.Б. Локтев // Иммунология. - 2011. -№1. - С. 50-53.

55.Кармакова, Т.А. Тест-система для определения муцина MUC1 в сыворотке крови человека методом иммуноферментного ингибиторного анализа на основе моноклонального антитела ИК025 / Т. А. Кармакова, М.С. Воронцова, В.В. Скрипник и др. // Клин. лаб. диагностика. - 2011. -№11.-С. 53-56.

56.Кисиличина, Д.Г. Особенности оценки экспрессии ZAP-70 в опухолевых клетках при B-клеточном хроническом лимфолейкозе методом проточной цитофлюориметрии / Д.Г. Кисиличина, С.А. Луговская, М.Е. Почтарь и др. // Клин. лаб. диагностика. - 2012. - №8. - С. 47 - 52.

57.Климова, P.P. Моноклональные антитела в диагностике герпесвирусных инфекций, вызываемых вирусом простого герпеса / P.P. Климова, О.В. Масалова, С.Н. Атанадзе, A.A. Кущ // Журн. микробиол. - 1999. -№5.-С. 99-103.

58.Климова, P.P. Моноклональные антитела к пандемическому вирусу гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, обладающие высокой вируснейтрализующей активностью / P.P. Климова, О.В. Масалова, Е.И. Бурцева и др. // Вопросы вирусологии. - 2011. - №3. - С. 15-20.

59.Клотченко, С.А. Создание аналитического биочипа для типирования вируса гриппа с колориметрическим и флуоресцентным способом детекции / С.А. Клотченко, М.А. Плотникова, A.B. Васин // Матер. V Ежегодного Всерос. Конгресса по инф. болезням. - М., 2013 - С. 195.

60.Книрель, Ю.А. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор) / Ю.А. Книрель, Н.К. Кочетков // Биохимия. - 1994. - Т.59, Вып. 12. -С.1784-1851.

61.Кузьмина, Г. А. Использование моноклональных пероксидазных конъюгатов для идентификации холерных вибрионов 01, 0139 серогрупп в реакции дот-иммуноанализа / Г.А. Кузьмина, Л.П. Алексеева, О.Ф.Фатеева и др. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2011.- Вып. 24. - С. 172 - 175.

62. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред. Онищенко Г.Г. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - 472 с.

63 .Лабораторная диагностика холеры: Методические указания МУК 4.2.2218-07. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. - 87 с.

64.Ларионова, Л.В. Конструирование полимерных антигенных холерных диагностикумов для выявления специфических противохолерных антител / Л.В. Ларионова, Н.Р. Телесманич, Е.Ю. Люкшина, Д.И. Симакова // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2013. - Вып. 26. - С. 220 - 223.

65.Ларионова, Л.В. Разработка препаратов для комплексной серологической диагностики холеры у людей / Л.В. Ларионова, А.А. Черникова, И.В.Архангельская и др. // Обмен в-в при адаптации и повреждении (дни мед. лаб. диагностики): Матер. X межвузов, конф. с междунар. участием. -Ростов-на-Дону, 2011. - С. 101 - 103.

66.Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М., 1990. -С.79-80.

67.Лобанов, В.В. Особенности липополисахарида холерных вибрионов / В.ВЛобанов, В.В. Сухарь // Журн. микробиол. - 2002. - №2. - С. 102- 107.

68.Ломов, Ю.М. Выявление липазы у холерных вибрионов 01 серогруппы в реакции агломерации объёмной (РАО) / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, В.В. Агафонова // Журн. микробиол. - 2007. - №1. - С. 74 - 77.

69.Лунева, Н.М. Разработка латексного диагностикума на основе моноклональных антител для идентификации энтерогеморрагической

E.coli 0157 серогруппы / H.M. Лунева, Р.З. Шайхутдинова, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Биотехнология. - 2011. - №5. - С. 85 - 92.

70.Мазрухо, А.Б. Применение препаратов на основе моноклональных антител для выявления возбудителя холеры в условиях работы СПЭБ / А.Б. Мазрухо, В.В. Агафонова, О.А. Татаренко и др. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2011. -Вып. 24.-С. 183- 188.

71.Мазрухо, Б.Л. Серодиагностика холеры, обусловленной вибрионами «Бенгал»: препараты для идентификации / Б.Л. Мазрухо, Е.В. Ишина // Матер, второй Всерос. конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс». — Саратов, 1998.-С. 45.

72.Маркина, О.В. Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток: автореф. дис...канд. биол. наук : 03.00.07 / Маркина Ольга Владимировна. - Ставрополь, 2008. - 22 с.

73.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учеб. по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов учреждений высш. проф. образования / Под ред. В.В. Зверева, М.Н.Бойченко. - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2010. - Т.2. - 480 е.: ил.+CD.

74.Методические рекомендации по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к бактериальным антигенам. - М., 1986. — 38 с.

75.Михеева, Е.А. Получение и применение моноклональных антител для обнаружения холерного токсина / Е.А. Михеева, З.Л. Девдариани, Н.Е.Терешкина и др. // Соврем, технологии в совершенствов. мер предупр. и отв. действий на ЧС в области обществ, здравоохр. сан.-эпид. характера: Матер. XI Межгос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2012. - С. 162 - 164.

76.Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. Пер. с англ. / Под ред. Р.Г. Кеннета, Т. Дж. Мак-Керна, К.Б.Бехтол. -М.: Медицина, 1983. - 416 с. : ил.

77.Москвитина, Э.А. Оценка эпидемиологической обстановки по холере в мире в современный период. Прогноз / Э.А. Москвитина, А.Б. Мазрухо, Ю.М. Ломов и др. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2011. - Вып. 24. - С. 9 - 14.

78.Новикова, И.А. Клиническая иммунология и аллергология: учеб. пособие / И.А. Новикова. - Минск: Тесей, 2011. - 392 с.

79.Основы биотехнологии: учеб. пособие для высших пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. - М.: Издат. центр «Академия», 2003. - 208 с.

80.Петрова, Е.Э. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину / Е.Э. Петрова, Р.Л. Комалева, O.E. Лахтина и др. // Биоорганическая химия. - 2009. - Т.35, №3. - С. 357 - 367.

81.Помухина, О.И. Антигенная вариабельность холерных вибрионов в условиях дефицита кислорода / О.И. Помухина, И.Я. Черепахина, О.С.Бурлакова и др. // Диагност., лечение и профилакт. опас. инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер, юбил. науч. конф., посвящ. 70-лет. НИИ микробиол. МО РФ. - Киров, 1998. - С. 195 - 196.

82.Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: Методические указания МУК 4.2.2870-11. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. - 83 с.

83.Прохватилова, Е.В. О разработке новых иммунобиологических препаратов на основе моноклональных антител к Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei / E.B. Прохватилова, Н.П. Храпова, В.В.Алексеев, М.Я. Кулаков // Пробл. особо опас. инф. - Саратов, 2003. -Вып. 86.-С. 153-159.

84.Родина, A.B. Получение и характеристика моноклональных антител к адипонектину человека для его количественного определения в сыворотке крови / A.B. Родина, Н.В. Гороховец, В.А. Макаров и др. // Биотехнология. -2011.-№4.-С. 73-81.

85.Рыбальский, Н.Г. Моноклональные антитела и гибридомы / Н.Г.Рыбальекий, М.А. Серова, Г.А. Игнатьева, А.П. Старчеус. - Москва: ВАСХНИЛ, 1989. - 343 с.

86.Савельева, И.В. К совершенствованию серологической диагностики холеры / И.В. Савельева, В.И. Ефременко, А.Д. Антоненко и др. // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиол.-микробиол. и паразитол. - М., 2007. - Т.З. - С. 78.

87.Савельева, И.В. Липосомальная тест-система для серологической диагностики холеры / И.В. Савельева, В.И. Ефременко // Сб. науч. тр., посвящ. 75-лет. НИИ микробиол. МО РФ. - Киров, 2003. - С. 52 - 53.

88.Савельева, И.В. Экспериментальная разработка липосомального энтеротоксического диагностикума для серологической диагностики холеры: автореф. дис...канд. мед. наук: 03.00.07, 14.00.36 / Савельева Ирина Вилориевна. - Ростов-на-Дону, 2002 - 20 с.

89.Самелия, Ж.Г. Изучение антигенной структуры различных серовариантов возбудитиеля псевдотуберкулеза с использованием поли- и моноклональных антител: автореф. дис...канд. биол. наук: 03.00.07, 14.00.36 / Самелия Жанна Гурамовна. - Саратов. - 2002. - 23 с.

90.Самойлович, М.П. Совершенствование гибридомной технологии и создание моноклональных антител для систем иммуноанализа: автореферат дис...докт. биол. наук : 14.00.36 / Самойлович Марина Платоновна. - Санкт-Петербург, 2006. - 37 с.

91.Свешников, П.Г. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию / П.Г. Свешников, В.В. Малайцев, И.М. Богданова, О.Н.Солопова. - Издательство МГУ. Москва, 2006 // Internet. -http://www.hybridoma.ru/glavi.htm.

92.Сизова, Е.В. Изучение влияния гипоксии на антигенные свойства и фаголизабельность холерных вибрионов / Е.В. Сизова, И .Я. Черепахина, В.В. Балахнова и др. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону, 2013. - Вып. 26. - С.162 - 168.

93.Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. - М., 1985. - 358 с.

94.Сорокииа, Е.В. Некоторые особенности врожденного иммунитета у больных на ранних стадиях болезни Лайма / Е.В. Сорокина, Н.К.Ахматова, С.А. Сходова // Матер. V Ежегодного Всерос. Конгресса по инф. болезням. - М., 2013. - С. 375.

95. Сорокина, Е.В. Роль сигнальных молекул в распознавании герпесвирусной инфекции, выступающей в роли триггерного фактора у больных хронической крапивницей / Е.В. Сорокина, Н.К. Ахматова, Н.П.Уткина // Матер. V Ежегодного Всерос. Конгресса по инф. болезням. -М., 2013.-С. 375-376.

96.Старовойтова, Т.А. Латексная агглютинация с видеоцифровой регистрацией: повышение диагностической значимости традиционного метода / Т.А. Старовойтова, H.A. Стериополо, В.В. Зайко, Ю.Ю. Венгеров // Клин. лаб. диагностика. - 2012. - №2. - С. 7 - 13.

97.Сырова, H.A. Культивирование гибридом - продуцентов диагностически значимых моноклональных антител к Francisella tylarensis / H.A. Сырова, И.В. Терехова, Н.Е. Терешкина и др. // Биотехнология. - 2012. - №2. -С.66 - 72.

98.Сырова, H.A. Получение, характеристика и биотехнологические аспекты применения поли- и моноклональных антител к антигенам Vibrio cholerae Ol Инаба и Огава: автореф. дис...канд. биол. наук : 03.00.07, 03.00.23 / Сырова Наталия Алексеевна. - Саратов, 2005. - 23 с.

99.Телесманич, Н.Р. Конструирование антилипазного иммуноглобулинового полимерного диагностикума для выявления штаммов холерных вибрионов эльтор, обладающих гемолитической и липазной активностью / Н.Р.Телесманич, Ю.М. Ломов, В.В. Агафонова // Журн. микробиол. - 2006. -№1.-С. 57-60.

100. Телесманич, Н.Р. Серологическое исследование экспериментальных холерных полимерных антигенных диагностикумов / Н.Р. Телесманич,

Е.А. Меньшикова, B.B. Агафонова и др. // Журн. микробиол. - 2013. - №3. -С. 79-83.

101. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров,

A.П.Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. - М.: Высш. шк., 1991. -288с.: ил.

102. Терешкина, Н.Е. Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли- и моноклональных антител: автореф. дис... канд. мед. наук : 03.00.07 / Терешкина Наталия Евгеньевна. - Саратов, 2004. - 23 с.

103. Терешкина, Н.Е. Конструирование и медицинские испытания моноклональной дот-иммуноферментной тест-ситемы для детекции туляремийного микроба «Диатул-М» // Н.Е. Терешкина, И.В. Терехова, H.A. Сырова и др. // Пробл. особо опас. инф. - Саратов, 2013. - Вып. 2. -С. 42-45.

104. Ткаченко, В.В. Липополисахариды холерного вибриона и некоторых энтеробактерий / В.В. Ткаченко // Журн. микробиол - 1982.- №9.-С.20-28.

105. Учебно-методические материалы по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по курсу биотехнологии иммунологические и генетические методы: учебное пособие / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.И. Молофеева, Е.А. Корнеев. - Ульяновск, 2005 // Internet. -http://rudocs.exdat.com/docs/index-54944.html.

106. Федорова, В.А. Анализ эпитопной специфичности липополисахарида Vibrio cholerae 0139 серовара с помощью моноклональных антител /

B.А.Федорова, О.В. Громова, З.А. Девдариани и др. // Природ.-очаг. особо-опасн. инф. на юге России, их профилакт. и лаб. диагност.: Сб. науч. тр., посвящ. 100-лет. Астрахан. противочум. станции. - Астрахань: Волга, 2001. - С. 257 - 258.

107. Федорова, В.А. Конструирование экспериментальных иммуноферментных тест-систем с использованием моноклональных антител к V. cholerae 0139 / В.А. Федорова, Н.Е. Терешкина, H.A. Сырова

и др. // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ.о об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. - М., 2007. - Т.З. - С. 89.

108. Федорова, В.А. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с ипользованием поли- и моноклональных антител: автореф. дис...докт. мед. наук : 03.00.07, 14.00.36 / Федорова Валентина Анатольевна. -Саратов, 2004. - 41 с.

109. Фельдшерова, A.A. Высокоэффективная иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для выявления антигенов бруцелл / A.A. Фельдшерова, Д.А. Эльгорт, М.В. Коноплева и др. // Журн. микробиол. -2007. - №1. - С. 52 - 57.

110. Хлынцева, А.Е. Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвы: автореф. дис... канд. мед. наук : 03.02.03 и 03.01.06 / Хлынцева Анна Евгеньевна. -Оболенск, 2012. - 22 с.

111. Хомяков, А.Е. Моноклональные антитела к анатоксину Vibrio cholerae, перспектива их применения в разработке иммунохроматографических тест-систем / А.Е. Хомяков, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин, И.А. Дятлов // -Биол. безопас. в современ. мире. - Оболенск, 2009. - С. 151 - 153.

112. Чемисова, О.С. Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae 0139 различного происхождения с использованием моноклональных антител: автореф. дис... канд. биол. наук : 03.00.07 / Чемисова Ольга Сергеевна. - Ростов-на-Дону, 2007. - 22с.

113. Черепахина, И.Я. Антигенная изменчивость холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры: дис... докт. мед. наук : 03.00.07 / Черепахина Ирина Яковлевна. - Ростов-на-Дону, 2000. - 352 с.

114. Черепахина, И.Я. Некоторые экологические аспекты распространения атипичных по антигенной структуре вибрионов эльтор в период седьмой пандемии холеры / И.Я. Черепахина, JI.C. Подосинникова, О.И. Помухина и др. // Пробл. мед. и экол. биотехнол.: Сб. тез., докл. Юбил. науч. конф.,

посвящ. 25-лет. ГНЦ прикладн. микробил. и биотехнол. - Оболенск, 1999. -С. 149.

115. Чобану, JI.M. Иммуноферментный метод выявления Са2+ АТФазы саркоплазматичеекого ретикулума — нового биологического маркера острого инфаркта миокарда / JI.M. Чобану, С.И. Сырбу, И.М. Попович и др. // Клин. лаб. диагностика. - 2013. - №5. - С. 39 - 42.

116. Шиленко, И.В. Разработка иммунохроматографии с люминесцентной детекцией для выявления возбудителей особо опасных заболеваний / И.В.Шиленко, С.Н. Скопинская, С.П. Ярков, В.Н. Злобин // Международ, медико-санитар. правила и реализац. глобальной стратегии борьбы с инф. бол. в госуд.-участ. СНГ: Матер. VIII Межгосуд. науч.-практ. конф. госуд.-участ. СНГ. - Саратов, 2007. - С. 316 - 318.

117. Яковлева, Д.А. Использование рН-чувствительных иммобилизованных моноклональных антител для оптимизации иммуноферментного сэндвич-метода определения HBsAg вируса гепатита В / Д.А. Яковлева,

A.Д.Дмитриев, Д.А. Дмитриев и др. // Журн. микробиол. - 2010. - С.85-89.

118. Ярков, С.П. Комлект для выявления возбудителей особо опасных заболеваний и токсинов люминесцентным иммунохроматографическим анализом / С.П. Ярков, И.В. Шиленко, С.Н. Скопинская, В.Н. Злобин // Пробл. особо опас. инф. - Саратов, 2008. - Вып. 96. - С. 46 — 49.

119. Яровая, JI.M. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы / Яровая JI.M., Алешкин

B.А. // Журн. микробиол. - 1991. -№ 3. - С. 73 - 78.

120. Adams, L.B. Detection of Vibrio cholerae with monoclonal antibodies specific for serovar 01 lipopolysaccharide / L.B. Adams, M.C. Henk, R.J.Siebeling // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26, № 9. - P. 1801 - 1809.

121. Alvarez, G. Relationship between the effects of stress induced by human bile juice and acid treatment in Vibrio cholera / G. Alvarez, N. Heredia, S. Garcia // J. Food Prot. - 2003 - Vol. 66, №12 - P. 2283 - 2288.

a.

122. Antezak, D.F. Monoclonal antibodys: technology and potential use / D.F.Antezak // J. Amer Vet. Med. Assoc. - 1982. - Vol. 181, №10. - P. 1005 -1010.

123. Castillo, L. Development of highly specific monoclonal antibodies for the diagnosis of Vibrio cholerae 01 / L. Castillo, D. Castillo, W. Silva et al. // Hybridoma. - 1995. - Vol. 14, № 3. - P. 271 - 278.

124. Chatterjee, A. Effect of fatty acids and cholesterol present in bile on expression of virulence factors and motility of Vibrio cholera / A. Chatterjee, P.K. Dutta, R. Chowdhury // Infect. Immun. - 2007. - Vol.75, №4. - P. 1946 -1953.

125. Colwell, R.R. Development and evaluation of a rapid, simple, sensitive, monoclonal antibody-based co-agglutination test for direct detection of Vibrio cholerae 01 / R.R. Colwell, J.A. Hasan, A. Huq et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 1992. - Vol. 76, № 3. - P. 215 - 219.

126. Fazekas de St. Production of monoclonal antibodies: strategi and tactica / Fazekas de St., S. Groth // J. Immunol. Meth. - 1980. - Vol. 35. - P. 1 - 21.

127. Gearing, A.D. Use a single shot intrasplenic immunization for production of monoclonal antibodyies specific for human Ig M / A.D. Gearing, R. Thoupe, L.Spitz // J. Immunol. Meth. - 1985. - Vol. 76, № 2. - P. 337 - 343.

128. Goding, J.M. Antibody production by hybridomas / J.M. Goding // J.Immunol. Meth. - 1980. - №39. - P. 285 - 308.

129. Gustafsson, B. Detection and characterization of lipopolysaccharide antigens in V. cholerae 01 / B. Gustafsson // Stockholm. - 1985. - 41 p.

130. Gustafsson, B. Immunological characterization of V. cholerae Ol lipopolysaccharide, O-side chan and core with monoclonal antibodies / B.Gustafsson, T. Holme // Infect. Immun. - 1985. - Vol. 49, №2. - P. 275 -280.

131. Gustafsson, B. Monoclonal antibodies against group- and type-specific lipopolysaccharide antigens of Vibrio cholerae 0:1 / B. Gustafsson, T. Holme // J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 18, № 3. - P. 480 - 485.

132. Gustafsson, B. Monoclonal antibodies against Vibrio cholerae lipopolysaccharide / B. Gustafsson, A. Rosen, T. Holme // Infect. Immun. -1982. - Vol. 38, № 2. - P. 449 - 454.

133. Gustafsson, B. Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assays for identification and serotyping of Vibrio cholerae 01 / Gustafsson B. // J. Clin. Microbiol. - 1984. - Vol. 20, №6. - P. 1180 - 1185.

134. Hasan, J.A. Cholera DFA: an improved direct fluorescent monoclonal antibody staining kit for rapid detection and enumeration of Vibrio cholerae 01 / J.A. Hasan, D. Bernstein, A. Huq et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 1994. -Vol. 120, № 1 - 2. - P. 143 - 148.

135. Hisatsune, K. O-antigenic lipopolysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal, a new epidemic strain for recent cholera in the Indian subcontinent / K.Hisatsune, S. Kondo, Y. Isshiki et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1993.-Vol. 196, №3.-P. 1309- 1315.

136. Hung, D.T. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholera in a ToxT - independent manner / D.T. Hung, J.J. Mekalanos // Proc. Narl. Acad. Sci. - 2005. - Vol. 102, №8. - P. 3028 - 3033.

137. Kohler, G. Continious cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler, C. Milstein // Nature. - 1975. - Vol. 256. -P. 495.

138. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature - 1970. - Vol. 227, №5259. -P.680-685.

139. Mangold, D. Hybridoma production by elektrofusion / D. Mangold, J.Shumann, A. Stelzner // Allergie and Immunol. - 1987. - Vol. 33. - P. 63 -64.

140. Mascola, J.R. The Role of Antibodies in HIV Vaccines / J.R. Mascola, D.C.Montefiori // Annual Review Immunology. - 2010. - Vol. 28. - P. 413 -

L—Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication / S. Massey, T.Banerjee, A.H. Pande et al. // J. Mol. Biol. - 2009. - Vol. 393, №5. - P. 1083 - 1096.

142. Mohin, B. Hybrid cell line from immunoglobulin-producing mouse myeloma and a nonproducing mouse lymphoma / B. Mohin, K. Fan // Sciens. -1971.-Vol. 171.-P. 75-177.

143. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reactions on gels / O. Ouchterlony // Acta path microbiol. Scand. - 1949. - Vol. 49. - P.5007 - 5017.

144. Qadri, F. Evaluation of the monoclonal antibody-based kit Bengal SMART for rapid detection of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal in stool samples /

F. Qadri, J. Hasan, J. Hossain et al. // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 33. -P.732 - 734.

145. Qadri, F. Production, characterization and application of monoclonal antibodies to Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal / F. Qadri, T. Azim, A.Chowdhury et al. // Clin, and Diagn. Immunol. - 1994. - Vol. 1. - P. 51 - 54.

146. Ramamurthy, T. Comparison of the sensitivity & specificity of a polyclonal versus monoclonal capture antibody based Bead ELISA for direct detection of cholera toxin from stool specimens / T. Ramamurthy, S.K. Bhattacharya,

G.B.Nair, Y. Takeda // Indian. J. Med. Res. - 1996. - Vol. 104. - P. 125 - 128.

147. Reading, C.L. Theory and methods for immunization in culture and monoclonal antibody production / C.L. Reading // J. Immunol. Meth. - 1982. -Vol. 53, №3.-P. 261-291.

148. Reik, L.M. A simple non-chromatographic purification procedure for monoclonal antibodies / L.M. Reik, S.L. Maines //J. Immunol. Meth. - 1987. -Vol. 100.-P.123.

149. Robb, M. Isolation of hybridoma cell lines and characterization of monoclonal antibodies against cholera enterotoxin and its subunits / M. Robb, J.C. Nichols, S.K. Whoriskey, J.R. Murphy // Infect.Immun. - 1982. - Vol. 38, № l.-P. 267-272.

150. Sincovics, J.G. Discovery of the hybridoma principle in 1968 - 69 immortalization of the specific antibody - producing cell by fusion with a lymphoma cell / J.G. Sincovics // J. Med. - 1985. - Vol. 16, №5 - 6. - P. 509 -524.

151. Spitz, M. Intrasplenic primary immunization for the production of monoclonal antibodyies / M. Spitz, L. Spitz, K. Thore, E. Engni // J. Immunol. Meth. - 1984. - Vol. 70, №1. - P. 39 - 43.

152. Supawat, K. A monoclonal antibody-based dot-blot ELISA diagnostic kit for the detection of Vibrio cholerae 01 in stools of diarrheic patients and household contacts / K. Supawat, S. Huttayananont, M. Kusum et al. // Asian. Pac. J. Allergy Immunol. - 1994. - Vol. 12, № 2. - P. 155-159.

153. Towbin, H. Immunoblotting and dot immunobinding - Current status and outlook / H. Towbin, J. Gordon // J. Immunol. Methods. - 1984. - Vol. 72. -P.313 -340.

154. Tuteja, U. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA / U. Tuteja, S. Kumar, J. Shukla et al. // J. Med. Microbiol. - 2007. -Vol. 56, Pt 10. - P. 1340 - 1345.

155. Underwood, P.A. Hazards of the limiting-dilution method of cloning hybridomas / P.A. Underwood, P.A. Bean // J. Immunol. Meth. - 1988. -Vol.107.-P. 119-128.

156. Yu, C.Y. Dry-reagent gold nanoparticle-based lateral flow biosensor for the simultaneous detection of Vibrio cholerae serogroups 01 and 0139 / C.Y. Yu, G.Y. Ang, A.L. Chua et al. // J. Microbiol. Methods. - 2011. - Vol. 86, №3. - P. 277-282.