Разработка новых генетически кодируемых флуоресцентных кальциевых индикаторов для визуализации активности нейронов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Барыкина Наталья Викторовна

• Барыкина Наталья Викторовна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Барыкина Наталья Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль ионов кальция и кальциевый ток в нейронах

1.2. Кальций-связывающие белки

1.3. Кальциевые индикаторы

1.3.1. Химические кальциевые индикаторы

1.3.2. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы

1.3.2.1. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы на основе FRET

Индикаторы на основе белка кальмодулина

Индикаторы на основе белка тропонин С

1.3.2.2. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы, состоящие из одного флуоресцентного белка

Семейства кальциевых индикаторов camgaroo и pericam

Семейство кальциевых индикаторов Case

Семейство GCaMP-подобных кальциевых индикаторов

Генетически кодируемые кальциевые индикаторы на основе одного флуоресцентного белка с испусканием в красной области спектра

1.3.2.3. Фотоконвертируемые и фотоактивируемые кальциевые индикаторы

GR-GECO

CaMPARI

1.3.2.4. Генетически кодируемые биолюминесцентные кальциевые индикаторы

1.3.2.5. Кальциевые индикаторы для мониторинга изменений концентрации ионов Са2+ в ЭР

Индикаторы на основе FRET

CatchER

CEPIA

GCaMPer

LAR-GECO

GAP - биолюминесцентный индикатор

1.4. Механизм действия генетически кодируемых кальциевых индикаторов

1.5. Сродство генетически кодируемых индикаторов к ионам Са2+, кинетика, динамический диапазон, селективность

1.6. Взаимодействие генетически кодируемых кальциевых индикаторов с белками клетки

1.7. Визуализация токов ионов Са2+ в беспозвоночных и рыбах in vivo

2+

1.8. Визуализация токов ионов Са в млекопитающих in vivo

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Амплификация фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле и очистка

2.2.2. Сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР с перекрывающимися фрагментами

2.2.3. Создание библиотек случайных мутантов

2.2.4. Трансформация бактериальных клеток

2.2.5. Скрининг библиотек

2.2.6. Очистка белков и их характеристика

2.2.6.1. Определение коэффициента экстинкции и квантового выхода

2.2.6.2. Определение констант диссоциации

2.2.6.3. Определение зависимости флуоресценции индикаторов от рН

2.2.6.4. Определение времени фотовыгорания

2.2.6.5. Определение времени созревания

2.2.6.6. Флуориметрия остановленного потока

2.2.7. Создание конструкций для временной трансфекции культур эукариотических клеток

2.2.8. Культивирование и трансфекция культур клеток

2.2.9. Наработка и выделение аденоассоциированных вирусных частиц

2.2.10. Флуоресцентная микроскопия

2.2.11. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания

2.2.12. Выделение, трансдукция, трансфекция и визуализация нейрональных культур

2.2.13. Стимуляция нейрональных культур с помощью электрического поля

2.2.14. Электрофизиологические эксперименты

2.2.15. Временная экспрессия индикатора FGCaMP в эмбрионах рыб Danio rerio

2.2.16. Визуализация кальциевых токов в эмбрионах Danio rerio с помощью индикатора FGCaMP

2.2.17. Визуализация нейронов зрительной коры (V1), экспрессирующих кальциевый индикатор NTnC in vivo, с помощью двухфотонного микроскопа

2.2.18. Визуализация нейронов зрительной коры и гиппокампа, экспрессирующих кальциевые индикаторы NTnC и iYTnC2 in vivo, с помощью минимикроскопа nVista HD

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка генетически кодируемого кальциевого индикатора на основе тропонина C из Opsanus tau и флуоресцентного белка mNeonGreen

3.2. Характеристика кальциевого индикатора NTnC in vitro

3.3. Ответ кальциевого индикатора NTnC на добавление внешнего кальция к культуре клеток HeLa

3.4. Визуализация спонтанной активности в культуре нейронов с помощью кальциевого индикатора NTnC

3.5. Изучение электрофизиологических свойств кальциевого индикатора NTnC в диссоциированной культуре нейронов с помощью метода локальной фиксации потенциала

3.6. Визуализация активности нейронов зрительной коры бодрствующей мыши с помощью двухфотонной микроскопии и кальциевого индикатора NTnC

3.7. Визуализация нейронов зрительной коры, экспрессирующих кальциевый индикатор NTnC in vivo, с помощью минимикроскопа nVista

3.8. Разработка улучшенной версии NTnC-подобного кальциевого индикатора на основе желтого флуоресцентного белка

3.9. Характеристика кальциевого индикатора iYTnC2 in vitro

3.10. Ответ кальциевого индикатора iYTnC2 на добавление внешнего кальция к культуре клеток HeLa

3.11. Визуализация спонтанной активности в диссоциированной культуре нейронов с помощью кальциевого индикатора iYTnC2

3.12. Изучение электрофизиологических свойств кальциевого индикатора iYTnC2 в диссоциированной культуре нейронов с помощью метода локальной фиксации потенциала

3.13. Визуализация активности нейронов гиппокампа свободноподвижной мыши с помощью минимикроскопа nVista и кальциевого индикатора iYTnC2

3.14. Разработка генетически кодируемого кальциевого индикатора на основе кальмодулинов и киназ грибов

3.15. Характеристика кальциевого индикатора FGCaMP in vitro

3.16. Экспрессия кальциевого индикатора FGCaMP в культуре клеток HeLa

3.17. Визуализация спонтанной активности в культуре нейронов с помощью кальциевого индикатора FGCaMP

3.18. Изучение электрофизиологических свойств кальциевого индикатора FGCaMP в диссоциированной культуре нейронов с помощью метода локальной фиксации потенциала или с помощью внешнего электрического поля

3.19. Визуализация активности нейронов с помощью генетически кодируемого кальциевого индикатора FGCaMP в личинке Danio rerio in vivo

3.20. Анализ кристаллической структуры индикатора FGCaMP, структурно-направленная оптимизация его Са2+-связывающих доменов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГККИ - генетически кодируемые кальциевые индикаторы

ПД - потенциал действия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА - этилендиокси-бис-(этиленнитрило)тетрауксусная кислота

ЭР/СР - эндоплазматический/саркоплазматический ретикулум

AMPA - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота

APV - 2R-амино-5-фосфонопентаноат

BFP - голубой флуоресцентный белок (blue fluorescent protein)

BRET - биолюминесцентный резонансный перенос энергии (bioluminescence-based

resonance energy transfer)

CaM - кальмодулин (calmodulin)

CFP - циановый флуоресцентный белок (cyan fluorescent protein) CNQX - 6-циано-2,3-дигидрокси-7-нитрохиноксалин

cpFP - циркулярно пермутированный флуоресцентный белок (circularly permuted fluorescent protein)

DMEM - модифицированная по методу Дульбекко минимальная среда Игла (Dulbecco's modified Eagle's medium) DNQX - 6,7-динитрокинаксолин-2,3-диона

DPBS - фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (Dulbecco's phosphate buffered saline)

dNTP - 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты

ESPT - перенос протона в возбужденном состоянии (excited state proton transfer) FBS - бычья эмбриональная сыворотка (fetal bovine serum)

FRAP - восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (fluorescence recovery after photobleaching)

FRET - ферстеровский резонансный перенос энергии (Förster resonance energy transfer)

GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein)

HBS - буферный раствор с HEPES (HEPES buffered saline)

HEK293T - линия клеток человеческой эмбриональной почки 293Т

HeLa - линия клеток раковой опухоли шейки матки пациентки Henrietta Lacks

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (4-(2-hydroxyethyl)-

1-piperazineethanesulfonic acid)

iGluR - ионотропные глутаматные рецепторы

IP3R - рецепторы инозитол трифосфата LB - среда lysogeny broth

LTD - долговременная депрессия (long term depression)

LTP - долговременная потенциация (long term potentiation)

MEM - среда Игла (minimum essential medium)

MLCK - киназа легкой цепи миозина (myosin light-chain kinase)

nAChR - никотиновые ацетилхолиновые рецепторы

NCX - натриево-кальциевый ионообменник

NMDA - N-метил-О-аспартат

PA-GFP - фотоактивируемый зеленый флуоресцентный белок (photoactivatable green fluorescent protein)

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор (phosphate buffered saline) PMCA - кальциевая АТФаза плазматической мембраны QY - квантовый выход (quantum yield)

RFP - красный флуоресцентный белок (red fluorescent protein) RyR - рианодиновые рецепторы

SERCA - кальциевая АТФаза саркоплазматического ретикулума SOB - среда super optimal broth

SOC - среда super optimal broth with catabolic repressor ТАЕ-буфер - трис-ацетатный буфер с ЭДТА TRPC - каналы транзиторного рецепторного потенциала Tn - тропонин

VGCC - потенциал управляемые кальциевые каналы (voltage-gated calcium channels) YC - индикатор семейства «желтый хамелеон» (yellow cameleon) YFP - желтый флуоресцентный белок (yellow fluorescent protein) 4АР - 4-аминопиридин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка новых генетически кодируемых флуоресцентных кальциевых индикаторов для визуализации активности нейронов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Ключевой задачей науки о мозге - нейробиологии -является понимание того, как мозг кодирует, обрабатывает и хранит информацию на клеточном уровне. Нейроны в мозге животных тесно связаны друг с другом и с глиальными клетками. Связи между нейронами объединяют нейроны в функциональные группы, обрабатывающие информацию и, в конечном счете, определяющие поведение животного. Одна из актуальных проблем современной нейробиологии - разработка инструментов для исследования связей между нейронами в живом организме. Разработка этих инструментов позволяет пролить свет на взаимосвязи и роль нервных клеток в таких процессах, как пластичность, сенсомоторная интеграция, память и обучение.

В настоящее время существует достаточно широкий набор подходов, позволяющих наблюдать за функционированием мозга in vivo, но каждый из них обладает помимо преимуществ и рядом недостатков. Так, метод «patch clamp» [1], [2] и стимуляции клеток металлическими электродами [3], [4], [5] позволяют получить детальный электрический сигнал от активных нейронов, однако количество одновременно записываемых клеток является основным лимитирующим фактором данных подходов. Применение мультиэлектродных матриц позволяет одновременно записывать электрический сигнал нескольких десятков нейронов с разрешением близким к клеточному [6], однако при данном подходе практически отсутствует информация о положении и типе наблюдаемой клетки. Оптическая съемка нейронов, окрашенных ацетоксиметиловым эфиром, позволяет одновременно записывать несколько клеток с высоким пространственным разрешением [7], [8]. Недостатком данного метода является остаточная флуоресценция внеклеточного пространства, связывающего краситель, а также отсутствие генетического контроля [7]. Кроме того, молекулярные красители не подходят для длительных съемок мозга живых организмов [9]. Известно, что молекулярные красители, а также методы, использующие электроды и другие инвазивные подходы, могут оказывать негативное влияние на состояние исследуемых клеток, затрудняя наблюдение за одной и той же клеточной популяцией в течение длительного времени [10], [11]. Решением данной проблемы стала разработка генетически кодируемых индикаторов.

Генетически кодируемые индикаторы состоят из флуоресцентного белка и сенсорной части. Принцип их действия состоит в изменении спектральных свойств флуоресцентной части при связывании различных молекул сенсорной частью или при изменении определенных параметров клетки. С помощью таких индикаторов, во-первых, можно генетически пометить одну определенную популяцию клеток. Во-вторых, генетически кодируемые индикаторы, стабильно экспрессирующиеся в клетках

животных, позволяют в течение длительного времени наблюдать за изменением различных параметров в процессе обучения, развития или старения животного.

Известно, что в процессе активности мозга происходит существенное увеличение концентрации ионов кальция в цитоплазме нейронов. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы (ГККИ) позволяют наблюдать за изменением концентрации ионов кальция в нейроне и, соответственно, исследовать активность мозга in vivo.

Несмотря на широкое разнообразие разработанных к настоящему времени ГККИ на основе одного флуоресцентного белка, их Са2+-связывающие части ограничены полноразмерным кальмодулином из позвоночных животных (костистых рыб, птиц и млекопитающих). Это, во-первых, может ограничивать ключевые свойства индикаторов, такие как размер молекулы, влияющий на количество нарабатываемых индикаторов в клетке и на эффективность их упаковки в вирусные частицы для доставки в клетки, количество связываемых ионов кальция, динамику взаимодействия и сродство индикаторов к ионам кальция. Во-вторых, основным недостатком кальмодулина из позвоночных является наличие у него белков-партнеров в нейронах млекопитающих, что приводит к уменьшению динамического диапазона индикаторов на основе кальмодулина in vivo, а также к нарушению нормального функционирования нейрона. Один из путей преодоления этих ограничений - использование кальмодулинов из других организмов, последовательность которых отличается от последовательности кальмодулинов позвоночных, что может улучшить ключевые характеристики индикаторов и уменьшить вероятность их связывания с белками в клетках млекопитающих. Другой путь - использование Са2+-связывающего белка тропонина С из мышечной ткани, который не обладает белками-партнерами в нейроне.

Для регистрации быстрой динамики кальциевой активности нейронов необходима разработка кальциевых индикаторов с повышенной яркостью. Использование новых ярких GFP-подобных флуоресцентных белков в составе кальциевых индикаторов может значительно улучшить их яркость. Степень разработанности темы. Все ранее разработанные кальциевые индикаторы, в состав которых входит белок тропонин С, состоят из двух флуоресцентных белков, и механизм их действия основан на переносе энергии FRET. Такие ГККИ требуют сложного оборудования для детекции флуоресцентного сигнала белков донора и акцептора. Кроме того, одновременное использование флуоресцентных маркеров других цветов в этом случае ограничено. Размер таких индикаторов примерно на 100 аминокислотных остатков (а.о.) больше, чем у широко используемых индикаторов на основе одного флуоресцентного белка. В этой связи перспективным направлением

является разработка ГККИ с новым дизайном на основе тропонина С и одного флуоресцентного белка.

Все разработанные на настоящий момент ГККИ состоят из Са2+-связывающих белков, кальмодулина или тропонина С, из позвоночных животных. Последовательность белка кальмодулина идентична у всех позвоночных животных, поэтому разнообразие ключевых свойств кальциевых индикаторов на его основе ограничено. Поиск Са2+-связывающих белков с новыми свойствами из других организмов позволил бы преодолеть вышеупомянутые ограничения. Цель работы заключалась в разработке новых генетически кодируемых кальциевых индикаторов на основе одного зеленого флуоресцентного белка и Са2+-связывающих белков тропонина С и кальмодулина из грибов. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1) методом направленной молекулярной эволюции разработать генетически кодируемые кальциевые индикаторы на основе тропонина С и флуоресцентных белков mNeonGreen и EYFP; 2) охарактеризовать индикаторы на основе тропонина С in vitro и in vivo; 3) разработать генетически кодируемый кальциевый индикатор на основе кальмодулина и киназы из грибов; 4) охарактеризовать разработанный индикатор in vitro и в модели рыбы Danio rerio in vivo; 5) выявить позиции в последовательностях кальмодулина и киназы из грибов, ответственные за сродство разработанного индикатора к ионам Са2+. Научная новизна работы. В первой части работы были получены новые генетически кодируемые кальциевые индикаторы NTnC и iYTnC2 с уникальным дизайном, впервые включающие два Са2+-связывающих мотива из белка тропонина С и один флуоресцентный белок. В отличие от широко используемых индикаторов семейства GCaMP, полученные нами индикаторы не имеют белков-партнеров в нейронах и связывают два иона кальция, а не четыре, что уменьшает влияние NTnC и iYTnC2 на внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Впервые в качестве флуоресцентной части кальциевый индикатор NTnC содержит флуоресцентный белок mNeonGreen, который обеспечивает NTnC повышенную яркость и рН-стабильность. NTnC обладает обратным фенотипом, то есть при связывании ионов кальция интенсивность его флуоресценции уменьшается. На основе анализа полученной в работе кристаллической структуры NTnC создан мутант NTnC с блокированным связыванием ионов кальция, с помощью которого была доказана специфичность реакции NTnC на ионы Са2+ в раковых клетках и в нейронах мыши. Экспрессия разработанного индикатора NTnC в культуре нейронов и мозге мыши показала, что он подходит для мониторинга активности нейронов in vivo. На основе NTnC путем замены флуоресцентного белка mNeonGreen на EYFP был создан индикатор с обратным фенотипом, названный iYTnC2. По сравнению с NTnC iYTnC2 обладает увеличенным динамическим

диапазоном и более быстрой скоростью диссоциации ионов Са2+ in vitro. Индикатор iYTnC2 был охарактеризован in vitro, в культуре клеток HeLa, в культуре нейронов и в гиппокампе свободноподвижной мыши in vivo.

Во второй части работы был разработан новый генетически кодируемый

2+

кальциевый индикатор FGCaMP, в состав которого впервые входят Са -связывающий белок кальмодулин и М13-пептид из грибов рода Aspergillus, последовательность которых отличается от последовательности аналогичных белков позвоночных, и флуоресцентный белок EGFP. Полученный индикатор был охарактеризован in vitro и in vivo: он отличается рациометрическим ответом на изменение концентрации ионов Са2+, быстрой кинетикой диссоциации ионов Са2+ и высокой фотостабильностью. С помощью анализа полученной в работе кристаллической структуры индикатора FGCaMP были найдены аминокислотные остатки в Са -связывающем белке

кальмодулине и М13-пептиде из грибов рода Aspergillus, замена которых приводит к

2+

увеличению сродства FGCaMP к ионам Са . Было показано, что в клетках млекопитающих FGCaMP обладает повышенной мобильностью по сравнению с другими широко используемыми кальциевыми индикаторами, что говорит в пользу того, что FGCaMP не взаимодействует с эндогенными белками клетки. Индикатор FGCaMP успешно использовали для визуализации спонтанной активности в культуре нейронов мыши, а также для визуализации спонтанной и вызванной активности нейронов в мозге личинок Danio rerio in vivo.

Теоретическая и практическая значимость. Разработанные кальциевые индикаторы могут быть использованы не только для визуализации кальциевой активности нейронов и изучения работы мозга различных живых организмах, но и для мониторинга изменений концентрации ионов кальция в других клетках, например, раковых HeLa и стволовых HEK.

Предложенные оригинальные подходы по разработке и оптимизации свойств кальциевых индикаторов являются универсальными и могут быть использованы для разработки индикаторов на другие низкомолекулярные вещества.

Анализ кристаллических структур полученных нами кальциевых индикаторов, а также полученные на их основе мутанты позволят в дальнейшем разрабатывать новые ГККИ с улучшенными характеристиками. Положения, выносимые на защиту.

1. Предложенный оригинальный подход по использованию С-концевого домена тропонина С и одного флуоресцентного белка mNeonGreen позволяет разработать новый генетически кодируемый кальциевый индикатор NTnC, применимый для визуализации активности нейронов мозга.

2. Замена флуоресцентного белка mNeonGreen в индикаторе NTnC на EYFP приводит к получению NTnC-подобного кальциевого индикатора iYTnC2 с большим динамическим диапазоном и увеличенной скоростью диссоциации ионов кальция.

3. Предложенный оригинальный подход по использованию кальмодулина и киназы из грибов Aspergillus niger и Aspergillus fumigatus позволяет разработать новый рациометрический генетически кодируемый кальциевый индикатор FGCaMP для визуализации активности нейронов мозга.

4. Замена ключевых аминокислотных остатков в позициях T3, L4, H5, I8, D9 и T10 киназы и D78, T79 и N97 кальмодулина, найденных с помощью анализа кристаллической структуры FGCaMP, влияет на контраст и сродство индикатора FGCaMP к ионам кальция.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертации были доложены на следующих научных конференциях: «Imaging the Brain», 2016, Warsaw, Poland; «V Съезд биохимиков России», 2016, Москва, Россия; «XIV Курчатовская междисциплинарная молодежная научная школа», 2016, Москва, Россия; «XV Курчатовская междисциплинарная молодежная научная школа», 2017, Москва, Россия; 60-я научная конференция МФТИ, 2017, Москва, Россия; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 2018, Москва, Россия; FENS, 2018, Berlin, Germany. По материалам работы опубликовано 3 статьи в международных рецензируемых научных журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, приложения и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 177 страницах и содержит 77 рисунков, 8 таблиц и 205 библиографических ссылок. Вклад автора в представленную работу. В основу диссертации положены результаты, полученные непосредственно автором или при его участии. Автором были проведены анализ литературы по теме работы, постановка задач работы, планирование, подготовка и проведение экспериментов, обработка и интерпретация полученных результатов, подготовка публикаций по теме диссертации и представление работы на научных конференциях. Эксперименты по флуориметрии остановленного потока были выполнены совместно с А. Варижук в ФКНЦ физико-химической медицины. Электрофизиологические эксперименты были выполнены совместно с А. Малышевым в ИВНД РАН. Эксперименты по FRAP были выполнены совместно с А. Богородским в МФТИ. Эксперименты по экспрессии индикаторов NTnC и iYTnC2 в мозге мыши были выполнены совместно с М. Рощной и В. Сотсковым на базе НИЦ «Курчатовский Институт». Эксперименты по экспрессии индикатора FGCaMP в личинках Danio rerio были выполнены совместно с К. Петкевичем в Массачусетском Технологическом Институте.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль ионов кальция и кальциевый ток в нейронах

Ионы Са2+ требуются нейрональным клеткам для осуществления процессов, нехарактерных для большинства остальных клеток эукариотичекого организма. Один из этих процессов - выделение нейротрансмиттеров - вариант секреции, присущий нейронам. Нейротрансмиттеры - вещества, передающие сигналы от терминалей аксона к другим нейронам или клеткам через синапсы. Они упакованы в синаптические везикулы, которые сливаются с пресинаптической мембраной терминаля аксона, выбрасывая содержимое в синаптическую щель. Нейротрансмиттеры связываются со специфическими рецепторами на постсинаптической мембране следующего нейрона. Роль ионов Са2+ заключается в том, что они запускают слияние синаптических везикул с пресинаптической плазматической мембраной в терминалях аксонов. На синаптичеких везикулах располагается белок синаптотагмин, содержащий два цитоплазматических Са2+-связывающих домена: при связывании с ними ионов Са2+ синаптотагмин переходит в пресинаптическую мембрану, способствуя выбросу содержимого синаптической везикулы в синаптическую щель [12].

Кроме того, ионы Са2+ играют большую роль в таких процессах, как долговременная потенциация (LTP - long term potentiation) и долговременная депрессия (LTD - long term depression), которые лежат в основе формирования долговременной памяти и пластичности мозга. LTP - это усиление синаптической передачи, продолжающееся длительное время после стимуляции. Синапсы могут регулировать свою силу, обеспечивая тем самым пластичность нейронов и способность животного адаптироваться к меняющимся условиям внешней среды. В настоящее время большинство нейрофизиологов считают, что именно LTP лежит в основе механизмов обучения и памяти - процессов, напрямую связанных с изменениями силы синапсов. LTP была впервые обнаружена в нейронах гиппокампа, а затем и в нейронах других отделов мозга [13]. Долговременная депрессия (LTD) - процесс, противоположный долговременной потенциации. LTD - непрерывное ослабление силы синапса, которое возникает после сильной синаптической стимуляции или длительной слабой стимуляции в зависимости от участка мозга. LTP и LTD - два процесса, действующие в кооперации и регулирующие синаптическую пластичность нейронов.

Как было сказано выше, ионы Са2+ участвуют в синаптической передаче (вид секреции, который ведет к выделению нейротрансмиттеров), в процессе обучения, формирования и консолидации памяти, то есть при переходе кратковременной памяти в

долговременную. В покое в большинстве нейронов концентрация ионов Са2+

поддерживается на уровне 50-100 нМ, а во время электрической активности

2+

концентрация ионов Са может увеличиваться в 10-100 раз [14], [15]. На рисунке 1.1 представлены основные источники ионов Са2+ в нейроне.

Концентрация ионов Ca2+ в цитозоле клетки определяется балансом между притоком и оттоком кальция, а также обменом кальция с внутриклеточными органеллами. Кроме того, существуют белки, связывающие кальций (кальмодулин, тропонин, парвальбумин, кальбиндин, кальретинин и др.). Они играют роль кальциевых буферов и определяют динамику свободных ионов Ca2+ внутри нейрона. Только свободные ионы Ca2+ являются активными и влияют на функционирование нервной системы.

В регуляции концентрации кальция внутри клетки также принимают участие кальциевые каналы. Кальциевые каналы традиционно делят на три группы в зависимости от механизма их действия: потенциал-зависимые кальциевые каналы, рецептор-зависимые кальциевые каналы (ионотропные рецепторы (iGluRs) и метаботропные рецепторы (mGluRs)) и кальциевые каналы, осуществляющие выход ионов Са2+ из внутриклеточных депо. Два основных типа ионотропных глутаматных рецепторов - альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазоловые рецепторы, чувствительные к пропионовой кислоте (AMPAR), и №метил^-аспартатные рецепторы (NMDAR) (Рис. 1.1).

Выход кальция из внутриклеточных источников, в основном, из эндоплазматического или саркоплазматического ретикулума (ЭР/СР), осуществляется с помощью рецепторов инозитолтрифосфата и рианодиновых рецепторов [16]. Инозитолтрифосфат вырабатывается в нейроне, например, при активации метаботропных глутаматных рецепторов (mGluR). Высокий уровень ионов Ca2+ внутри ЭР/СР поддерживается с помощью сарко-эндоплазматической кальциевой АТФазы

(SERCA), которая транспортирует ионы Са из цитозоля в люмен ЭР/СР. Кроме ЭР,

2+

митохондрии также важны для гомеостаза ионов Са2+ в нейронах. Митохондрии могут играть роль кальциевого буфера, закачивая кальций во время повышения его уровня в цитозоле через кальциевый унипортер и затем медленно откачивая его обратно в цитозоль через натриево-кальциевый обменник. Существуют также каналы, не входящие в состав внутриклеточных депо ионов Са2+, однако тесно с ними взаимодействующие: каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRPC - transient receptor potential type C channels) и кальциевые каналы, регулируемые арахидоновой кислотой.

1.2. Кальций-связывающие белки

В нервной системе экспрессируется несколько кальций-связывающих белков.

2+

Они отличаются по локализации в нейронах и сродству к ионам Са . Функционально

их можно разделить на две группы: буферы Са2+, которые регулируют

продолжительность и распространение Са2+ сигналов, и индикаторы Са2+, которые

2+

переводят изменения концентрации ионов Са в специфические сигналы [12].

Рисунок 1.1. Кальциевые токи в нейроне. Указаны основные компартменты клетки: ядро, митохондрия, эндоплазматический ретикулум (ЭР). Ток ионов Са2+ в цитоплазму осуществляется с помощью рецепторов а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPAR), №метил^-аспартатных рецепторов (NMDAR), потенциал зависимых кальциевых каналов (VGCC), никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (пЛ^Я), каналов транзиторного рецепторного потенциала (ТЯРС). Выход ионов Са2+ из внутриклеточных органелл происходит через инозитол трифосфатные рецепторы (ГР3К) и рианодиновые рецепторы (ЯуЯ). Инозитол трифосфат (1Р3) поступает в клетку через метаботропные глутаматные рецепторы (mGluR). Выход ионов Са2+ из цитоплазмы происходит через кальциевую АТФазу плазматической мембраны (РМСЛ), натриево-кальциевый ионообменник ^СХ), кальциевую АТФазу саркоплазматического ретикулума (БЕЯСЛ), а также унипортер митохондрий. Приведено из [15] с изменениями.

^ 2+ и Наиболее известный Са -связывающий белок - кальмодулин (СаМ) - состоит из

двух глобулярных доменов, соединенных подвижной петлей. Каждый домен содержит

по два так называемых ЕБ-мотива (1-4), каждый из которых связывает один ион Са2+

(Рис. 1.2) и состоит из 12 аминокислотных остатков (а.о.). Изменения в концентрации

ионов Са внутри клетки приводят к перераспределению СаМ и конформационным

изменениям внутри белка [17]. Известно, что ион Са2+ хелатируется семью атомами

кислорода, расположенными в шести аминокислотных остатках EF-мотивов в позициях 1 (+x), 3 (+у), 5 (+z), 7 (-у), 9 (-x) и 12 которые образуют пятиугольник вокруг иона Са2+ [18] (Рис. 1.3).

Рисунок 1.2. Структура СаМ, связанного с 4 ионами Са2+ (РББ: 1PRW). N- и ^домены обозначены зеленым и синим цветом, соответственно, 4 иона Са - белым цветом.

СО ЕРЗ

ЕР4

2+

Рисунок 1.3. Модель связывания иона Са с шестью а.о. в ЕР1 СаМ. NH группы координирующих а.о. выделены синим, атомы кислорода - красным, ион Са2+ - циановым, а координирующая молекула воды -красным цветом [19].

Другие Са2+-связывающие белки, в структуру которых входит EF-мотив - это тропонин кальбиндин D-28k (CB-D28k), кальретинин (CR) и парвальбумин (PV). Все они, включая СаМ, при связывании ионов Са подвергаются конформационным изменениям в консервативных доменах, что позволяет им взаимодействовать с другими белками, участвующими в регуляции концентрации ионов Са в клетке. CаМ, например, присутствует в мозге в достаточно высоких концентрациях (до 100 мкМ) и выполняет множество функций в нейронах, в частности, контролирует действие глутаматных рецепторов, ионных каналов и NO синтазы [12]. Одна из важнейших функций CаМ - контроль потенциал-зависимых каналов [20]. Основные белки-мишени CаМ - Са2+СаМ

-зависимые киназы (CаМК) и фосфатаза кальцинейрина.Таким образом, Са -связывающие белки, такие как CаМ, действуют не просто как хелаторы ионов Са2+, а регулируют передачу кальциевого сигнала на другие субстраты. Основные белки-мишени CаМ - Са2+СаМ

-зависимые киназы ^аМК) и фосфатаза

кальцинейрина.

1.3. Кальциевые индикаторы

Ионы Са2+ выполняют важную роль в нейронах, и в связи с этим существует сложная система для регуляции внутриклеточной концентрации Са2+, и разработка подходов для прижизненной визуализации ионов Са2+ необходима для понимания как механизмов функционирования отдельных нейронов на уровне молекул, так и работы нерной системы на уровне ансамблей нейронов. Кальциевые индикаторы могут служить инструментом для визуализации ионов Са2+. В настоящее время существует три основных вида кальциевых индикаторов: химические и флуоресцентные и биолюминесцентные генетически кодируемые.

1.3.1. Химические кальциевые индикаторы

Химические кальциевые индикаторы - это небольшие молекулы, способные хелатировать ионы Са2+. Химические кальциевые индикаторы представлены, например,

таким химическим веществом как арсеназо III - красителем, чей спектр поглощения

2+

меняется при связывании ионов Са [21]. Акварин и арсеназо III использовали в ранних исследованиях регуляции кальций-зависимых процессов в нейронах, однако их применение осложнялось трудностями на этапе доставки красителя в клетки. Настоящий прорыв произошел после создания более чувствительных химических флуоресцентных кальциевых индикаторов группой Р. Цена [22]. Эти индикаторы состояли из высокоселективного кальциевого хелатора (например, ЭГТЛ или ВЛРТЛ) и флуоресцентного хромофора. Первое поколение химических индикаторов было представлено такими веществами, как дшп-2, Шга-2, тёо-1 и йио-3. Quin-2 был первым химическим индикатором из этой группы, который использовали в биологических экспериментах [23], [24]. Он возбуждается при освещении ультрафиолетом (339 нм). К сожалению, он оказался недостаточно ярким, и его необходимо использовать в высоких концентрациях.

Другой индикатор из этой группы, Шга-2 [25] (Рис. 1.4), превзошел дшп-2 по

своим характеристикам и получил большую популярность среди нейробиологов. Бига-2

возбуждается ультрафиолетом (350/380 нм), а пик его испускания находится между 505

2+

и 520 нм [26]. Связывание ионов Са приводит к внутримолекулярным конформационным изменениям внутри индикатора, в результате чего меняется интенсивность испускаемой флуоресценции. Бига-2 имеет преимущества при однофотонной визуализации динамики ионов Са2+, так как позволяет использовать две длины волны возбуждения и, соответственно, определять концентрацию ионов кальция в интересующем нейроне не зависимо от концентрации красителя. Кроме того, Шга-2

может использоваться в двухфотонной микроскопии. Однако из-за широкого спектра поглощения свойство рациометричности Гига-2 невозможно использовать в двухфотонной микроскопии.

Рисунок 1.4. Строение химического кальциевого индикатора на примере fura-2

[12].

Со временем свойства синтетических индикаторов улучшались, и появлялись новые кальциевые индикаторы с широкими спектрами возбуждения и сродства к ионам Са . Одними из наиболее популярных химических кальциевых красителей в настоящее время являются Oregon Green BAPTA и fluo-4 [27]. Их удалось использовать для получения изображения динамики ионов Ca2+ in vivo [7]. Еще одним преимуществом химических индикаторов является их существование как в мембрано-растворимом, так и в мембрано-нерастворимом виде. Это позволяет использовать разные методики для их внесения в клетки и ткани. Наконец, большое разнообразие химических индикаторов с разным сродством к ионам Ca2+ и разными спектральными свойствами позволяет использовать их одновременно в одной клетке.

1.3.2. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Барыкина Наталья Викторовна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Liu B. H., Li P., Li Y. T., Sun Y. J., Yanagawa Y., Obata K., Zhang L. I., Tao H. W. Visual receptive field structure of cortical inhibitory neurons revealed by two-photon imaging guided recording // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience.

- 2009. - V. 29. - No. 34. - P. 10520-32.

2. Crochet S., Poulet J. F., Kremer Y., Petersen C. C. Synaptic mechanisms underlying sparse coding of active touch // Neuron. - 2011. - V. 69. - No. 6. - P. 1160-75.

3. Hubel D. H., Wiesel T. N. Receptive fields of single neurones in the cat's striate cortex // The Journal of physiology. - 1959. - V. 148. - P. 574-91.

4. Reid R. C., Victor J. D., Shapley R. M. The use of m-sequences in the analysis of visual neurons: linear receptive field properties // Visual neuroscience. - 1997. - V. 14. - No. 6. - P. 1015-27.

5. Mante V., Sussillo D., Shenoy K. V., Newsome W. T. Context-dependent computation by recurrent dynamics in prefrontal cortex // Nature. - 2013. - V. 503. - No. 7474. - P. 78-84.

6. Buzsaki G. Large-scale recording of neuronal ensembles // Nature neuroscience. - 2004. -V. 7. - No. 5. - P. 446-51.

7. Stosiek C., Garaschuk O., Holthoff K., Konnerth A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - V. 100. - No. 12. - P. 7319-24.

8. Helmchen F., Denk W. Deep tissue two-photon microscopy // Nature methods. - 2005. -V. 2. - No. 12. - P. 932-40.

9. Aramuni G., Griesbeck O. Chronic calcium imaging in neuronal development and disease // Experimental neurology. - 2013. - V. 242. - P. 50-6.

10. Polikov V. S., Tresco P. A., Reichert W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes // Journal of neuroscience methods. - 2005. - V. 148. - No. 1. -P. 1-18.

11. Dombeck D. A., Harvey C. D., Tian L., Looger L. L., Tank D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation // Nature neuroscience.

- 2010. - V. 13. - No. 11. - P. 1433-40.

12. Brini M., Cali T., Ottolini D., Carafoli E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction // Cellular and molecular life sciences : CMLS. - 2014. - V. 71. - No. 15. - P. 2787-814.

13. Bliss T. V., Lomo T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path // The Journal of physiology. - 1973. - V. 232. - No. 2. - P. 331-56.

14. Berridge M. J., Lipp P., Bootman M. D. The versatility and universality of calcium signalling // Nature reviews. Molecular cell biology. - 2000. - V. 1. - No. 1. - P. 11-21.

15. Grienberger C., Konnerth A. Imaging calcium in neurons // Neuron. - 2012. - V. 73. -No. 5. - P. 862-85.

16. Berridge M. J. Neuronal calcium signaling // Neuron. - 1998. - V. 21. - No. 1. - P. 13-26.

17. Chin D., Means A. R. Calmodulin: a prototypical calcium sensor // Trends in cell biology.

- 2000. - V. 10. - No. 8. - P. 322-8.

18. Gifford J. L., Walsh M. P., Vogel H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs // The Biochemical journal. - 2007. - V. 405.

- No. 2. - P. 199-221.

19. Drmota Prebil S., Slapsak U., Pavsic M., Ilc G., Puz V., de Almeida Ribeiro E., Anrather D., Hartl M., Backman L., Plavec J., Lenarcic B., Djinovic-Carugo K. Structure and calcium-

binding studies of calmodulin-like domain of human non-muscle alpha-actinin-1 // Scientific reports. - 2016. - V. 6. - P. 27383.

20. Catterall W. A., Few A. P. Calcium channel regulation and presynaptic plasticity // Neuron. - 2008. - V. 59. - No. 6. - P. 882-901.

21. Brown J. E., Cohen L. B., De Weer P., Pinto L. H., Ross W. N., Salzberg B. M. Rapid changes in intracellular free calcium concentration. Detection by metallochromic indicator dyes in squid giant axon // Biophysical journal. - 1975. - V. 15. - No. 11. - P. 1155-60.

22. Tsien R. Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures // Biochemistry. - 1980.

- V. 19. - No. 11. - P. 2396-404.

23. Pozzan T., Arslan P., Tsien R. Y., Rink T. J. Anti-immunoglobulin, cytoplasmic free calcium, and capping in B lymphocytes // The Journal of cell biology. - 1982. - V. 94. - No. 2. - P. 335-40.

24. Tsien R. Y., Pozzan T., Rink T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator // The Journal of cell biology. - 1982. - V. 94. - No. 2. - P. 325-34.

25. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // The Journal of biological chemistry. - 1985. - V. 260. -No. 6. - P. 3440-50.

26. Tsien R. Y. Fluorescent probes of cell signaling // Annual review of neuroscience. - 1989.

- V. 12. - P. 227-53.

27. Gee K. R., Brown K. A., Chen W. N., Bishop-Stewart J., Gray D., Johnson I. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes // Cell calcium. - 2000. -V. 27. - No. 2. - P. 97-106.

28. Jares-Erijman E. A., Jovin T. M. FRET imaging // Nature biotechnology. - 2003. - V. 21.

- No. 11. - P. 1387-95.

29. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J. M., Adams J. A., Ikura M., Tsien R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin // Nature.

- 1997. - V. 388. - No. 6645. - P. 882-7.

30. Persechini A., Lynch J. A., Romoser V. A. Novel fluorescent indicator proteins for monitoring free intracellular Ca2+ // Cell calcium. - 1997. - V. 22. - No. 3. - P. 209-16.

31. Romoser V. A., Hinkle P. M., Persechini A. Detection in living cells of Ca2+-dependent changes in the fluorescence emission of an indicator composed of two green fluorescent protein variants linked by a calmodulin-binding sequence. A new class of fluorescent indicators // The Journal of biological chemistry. - 1997. - V. 272. - No. 20. - P. 13270-4.

32. Delagrave S., Hawtin R. E., Silva C. M., Yang M. M., Youvan D. C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein // Bio/technology. - 1995. - V. 13. - No. 2. - P. 151-4.

33. Nagai T., Yamada S., Tominaga T., Ichikawa M., Miyawaki A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. -V. 101. - No. 29. - P. 10554-9.

34. Heim R., Cubitt A. B., Tsien R. Y. Improved green fluorescence // Nature. - 1995. - V. 373. - No. 6516. - P. 663-4.

35. Horikawa K., Yamada Y., Matsuda T., Kobayashi K., Hashimoto M., Matsu-ura T., Miyawaki A., Michikawa T., Mikoshiba K., Nagai T. Spontaneous network activity visualized by ultrasensitive Ca(2+) indicators, yellow Cameleon-Nano // Nature methods. -2010. - V. 7. - No. 9. - P. 729-32.

36. Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R., Tsien R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1999. - V. 96. - No. 5. - P. 2135-40.

37. Griesbeck O., Baird G. S., Campbell R. E., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications // The Journal of biological chemistry. - 2001. - V. 276. - No. 31. - P. 29188-94.

38. Nagai T., Ibata K., Park E. S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications // Nature biotechnology. - 2002. - V. 20. - No. 1. - P. 87-90.

39. Palmer A. E., Jin C., Reed J. C., Tsien R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. -V. 101. - No. 50. - P. 17404-9.

40. Lutcke H., Murayama M., Hahn T., Margolis D. J., Astori S., Zum Alten Borgloh S. M., Gobel W., Yang Y., Tang W., Kugler S., Sprengel R., Nagai T., Miyawaki A., Larkum M. E., Helmchen F., Hasan M. T. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice // Frontiers in neural circuits. -2010. - V. 4. - P. 9.

41. Whitaker M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium // Methods in cell biology. - 2010. - V. 99. - P. 153-82.

42. Truong K., Sawano A., Mizuno H., Hama H., Tong K. I., Mal T. K., Miyawaki A., Ikura M. FRET-based in vivo Ca2+ imaging by a new calmodulin-GFP fusion molecule // Nature structural biology. - 2001. - V. 8. - No. 12. - P. 1069-73.

43. Yang X., Xu P., Xu T. A new pair for inter- and intra-molecular FRET measurement // Biochemical and biophysical research communications. - 2005. - V. 330. - No. 3. - P. 91420.

44. Hasan M. T., Friedrich R. W., Euler T., Larkum M. E., Giese G., Both M., Duebel J., Waters J., Bujard H., Griesbeck O., Tsien R. Y., Nagai T., Miyawaki A., Denk W. Functional fluorescent Ca2+ indicator proteins in transgenic mice under TET control // PLoS biology. -2004. - V. 2. - No. 6. - P. e163.

45. Jurado L. A., Chockalingam P. S., Jarrett H. W. Apocalmodulin // Physiological reviews.

- 1999. - V. 79. - No. 3. - P. 661-82.

46. Filatov V. L., Katrukha A. G., Bulargina T. V., Gusev N. B. Troponin: structure, properties, and mechanism of functioning // Biochemistry. Biokhimiia. - 1999. - V. 64. - No. 9. - P. 969-85.

47. Heim N., Griesbeck O. Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin C and green fluorescent protein // The Journal of biological chemistry. - 2004. -V. 279. - No. 14. - P. 14280-6.

48. Mank M., Reiff D. F., Heim N., Friedrich M. W., Borst A., Griesbeck O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change // Biophysical journal. - 2006. - V. 90. - No. 5. - P. 1790-6.

49. Mank M., Santos A. F., Direnberger S., Mrsic-Flogel T. D., Hofer S. B., Stein V., Hendel T., Reiff D. F., Levelt C., Borst A., Bonhoeffer T., Hubener M., Griesbeck O. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging // Nature methods. - 2008.

- V. 5. - No. 9. - P. 805-11.

50. Thestrup T., Litzlbauer J., Bartholomaus I., Mues M., Russo L., Dana H., Kovalchuk Y., Liang Y., Kalamakis G., Laukat Y., Becker S., Witte G., Geiger A., Allen T., Rome L. C., Chen T. W., Kim D. S., Garaschuk O., Griesinger C., Griesbeck O. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes // Nature methods. - 2014. - V. 11. - No. 2. - P. 175-82.

51. Porumb T., Yau P., Harvey T. S., Ikura M. A calmodulin-target peptide hybrid molecule with unique calcium-binding properties // Protein engineering. - 1994. - V. 7. - No. 1. - P. 109-15.

52. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1999. - V. 96. - No. 20. - P. 11241-6.

53. Zou J., Hofer A. M., Lurtz M. M., Gadda G., Ellis A. L., Chen N., Huang Y., Holder A., Ye Y., Louis C. F., Welshhans K., Rehder V., Yang J. J. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations // Biochemistry. - 2007. - V. 46. - No. 43. - P. 12275-88.

54. Nagai T., Sawano A., Park E. S., Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+ // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2001. - V. 98. - No. 6. - P. 3197-202.

55. Souslova E. A., Belousov V. V., Lock J. G., Stromblad S., Kasparov S., Bolshakov A. P., Pinelis V. G., Labas Y. A., Lukyanov S., Mayr L. M., Chudakov D. M. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range // BMC biotechnology. - 2007. -V. 7. - P. 37.

56. Nakai J., Ohkura M., Imoto K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein // Nature biotechnology. - 2001. - V. 19. - No. 2. - P. 137-41.

57. Reiff D. F., Ihring A., Guerrero G., Isacoff E. Y., Joesch M., Nakai J., Borst A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. - 2005. - V. 25. - No. 19.

- P. 4766-78.

58. Kahn-Kirby A. H., Dantzker J. L., Apicella A. J., Schafer W. R., Browse J., Bargmann C. I., Watts J. L. Specific polyunsaturated fatty acids drive TRPV-dependent sensory signaling in vivo // Cell. - 2004. - V. 119. - No. 6. - P. 889-900.

59. Ji G., Feldman M. E., Deng K. Y., Greene K. S., Wilson J., Lee J. C., Johnston R. C., Rishniw M., Tallini Y., Zhang J., Wier W. G., Blaustein M. P., Xin H. B., Nakai J., Kotlikoff M. I. Ca2+-sensing transgenic mice: postsynaptic signaling in smooth muscle // The Journal of biological chemistry. - 2004. - V. 279. - No. 20. - P. 21461-8.

60. Ohkura M., Matsuzaki M., Kasai H., Imoto K., Nakai J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines // Analytical chemistry. -2005. - V. 77. - No. 18. - P. 5861-9.

61. Tallini Y. N., Ohkura M., Choi B. R., Ji G., Imoto K., Doran R., Lee J., Plan P., Wilson J., Xin H. B., Sanbe A., Gulick J., Mathai J., Robbins J., Salama G., Nakai J., Kotlikoff M. I. Imaging cellular signals in the heart in vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2006. - V. 103. - No. 12. - P. 4753-8.

62. Diez-Garcia J., Matsushita S., Mutoh H., Nakai J., Ohkura M., Yokoyama J., Dimitrov D., Knopfel T. Activation of cerebellar parallel fibers monitored in transgenic mice expressing a fluorescent Ca2+ indicator protein // The European journal of neuroscience. - 2005. - V. 22.

- No. 3. - P. 627-35.

63. Akerboom J., Rivera J. D., Guilbe M. M., Malave E. C., Hernandez H. H., Tian L., Hires S. A., Marvin J. S., Looger L. L., Schreiter E. R. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design // The Journal of biological chemistry. - 2009. - V. 284. - No. 10. - P. 6455-64.

64. Wang Q., Shui B., Kotlikoff M. I., Sondermann H. Structural basis for calcium sensing by GCaMP2 // Structure. - 2008. - V. 16. - No. 12. - P. 1817-27.

65. Tian L., Hires S. A., Mao T., Huber D., Chiappe M. E., Chalasani S. H., Petreanu L., Akerboom J., McKinney S. A., Schreiter E. R., Bargmann C. I., Jayaraman V., Svoboda K., Looger L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators // Nature methods. - 2009. - V. 6. - No. 12. - P. 875-81.

66. Huber D., Gutnisky D. A., Peron S., O'Connor D. H., Wiegert J. S., Tian L., Oertner T. G., Looger L. L., Svoboda K. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning // Nature. - 2012. - V. 484. - No. 7395. - P. 473-8.

67. Akerboom J., Chen T. W., Wardill T. J., Tian L., Marvin J. S., Mutlu S., Calderon N. C., Esposti F., Borghuis B. G., Sun X. R., Gordus A., Orger M. B., Portugues R., Engert F., Macklin J. J., Filosa A., Aggarwal A., Kerr R. A., Takagi R., Kracun S., Shigetomi E., Khakh

B. S., Baier H., Lagnado L., Wang S. S., Bargmann C. I., Kimmel B. E., Jayaraman V., Svoboda K., Kim D. S., Schreiter E. R., Looger L. L. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. - 2012. - V. 32. - No. 40. - P. 13819-40.

68. Chen T. W., Wardill T. J., Sun Y., Pulver S. R., Renninger S. L., Baohan A., Schreiter E. R., Kerr R. A., Orger M. B., Jayaraman V., Looger L. L., Svoboda K., Kim D. S. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity // Nature. - 2013. - V. 499. -No. 7458. - P. 295-300.

69. Broussard G. J., Liang R., Tian L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators // Frontiers in molecular neuroscience. - 2014. - V. 7. - P. 97.

70. Dana H., Chen T. W., Hu A., Shields B. C., Guo C., Looger L. L., Kim D. S., Svoboda K. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo // PloS one. - 2014. - V. 9. - No. 9. - P. e108697.

71. Sadakane O., Masamizu Y., Watakabe A., Terada S., Ohtsuka M., Takaji M., Mizukami H., Ozawa K., Kawasaki H., Matsuzaki M., Yamamori T. Long-Term Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Populations with Subcellular Resolution in Adult Non-human Primates // Cell reports. - 2015. - V. 13. - No. 9. - P. 1989-99.

72. Ohkura M., Sasaki T., Sadakari J., Gengyo-Ando K., Kagawa-Nagamura Y., Kobayashi

C., Ikegaya Y., Nakai J. Genetically encoded green fluorescent Ca2+ indicators with improved detectability for neuronal Ca2+ signals // PloS one. - 2012. - V. 7. - No. 12. - P. e51286.

73. Badura A., Sun X. R., Giovannucci A., Lynch L. A., Wang S. S. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity // Neurophotonics. - 2014. - V. 1. - No. 2. - P. 025008.

74. Helassa N., Zhang X. H., Conte I., Scaringi J., Esposito E., Bradley J., Carter T., Ogden

D., Morad M., Torok K. Fast-Response Calmodulin-Based Fluorescent Indicators Reveal Rapid Intracellular Calcium Dynamics // Scientific reports. - 2015. - V. 5. - P. 15978.

75. Zhao Y., Araki S., Wu J., Teramoto T., Chang Y. F., Nakano M., Abdelfattah A. S., Fujiwara M., Ishihara T., Nagai T., Campbell R. E. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators // Science. - 2011. - V. 333. - No. 6051. - P. 1888-91.

76. Zhao Y., Abdelfattah A. S., Ruangkittisakul A., Ballanyi K., Campbell R. E., Harrison D. J. Microfluidic cell sorter-aided directed evolution of a protein-based calcium ion indicator with an inverted fluorescent response // Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. - 2014. - V. 6. - No. 7. - P. 714-25.

77. Cho J. H., Swanson C. J., Chen J., Li A., Lippert L. G., Boye S. E., Rose K., Sivaramakrishnan S., Chuong C. M., Chow R. H. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators // ACS chemical biology. - 2017. - V. 12. - No. 4. -P. 1066-1074.

78. Ast C., Foret J., Oltrogge L. M., De Michele R., Kleist T. J., Ho C. H., Frommer W. B. Ratiometric Matryoshka biosensors from a nested cassette of green- and orange-emitting fluorescent proteins // Nature communications. - 2017. - V. 8. - No. 1. - P. 431.

79. Svoboda K., Block S. M. Biological applications of optical forces // Annual review of biophysics and biomolecular structure. - 1994. - V. 23. - P. 247-85.

80. Nagel G., Szellas T., Huhn W., Kateriya S., Adeishvili N., Berthold P., Ollig D., Hegemann P., Bamberg E. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - V. 100. - No. 24. - P. 13940-5.

81. Chow B. Y., Han X., Dobry A. S., Qian X., Chuong A. S., Li M., Henninger M. A., Belfort G. M., Lin Y., Monahan P. E., Boyden E. S. High-performance genetically targetable

optical neural silencing by light-driven proton pumps // Nature. - 2010. - V. 463. - No. 7277.

- P. 98-102.

82. Zhang F., Wang L. P., Brauner M., Liewald J. F., Kay K., Watzke N., Wood P. G., Bamberg E., Nagel G., Gottschalk A., Deisseroth K. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry // Nature. - 2007. - V. 446. - No. 7136. - P. 633-9.

83. Akerboom J., Carreras Calderon N., Tian L., Wabnig S., Prigge M., Tolo J., Gordus A., Orger M. B., Severi K. E., Macklin J. J., Patel R., Pulver S. R., Wardill T. J., Fischer E., Schuler C., Chen T. W., Sarkisyan K. S., Marvin J. S., Bargmann C. I., Kim D. S., Kugler S., Lagnado L., Hegemann P., Gottschalk A., Schreiter E. R., Looger L. L. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics // Frontiers in molecular neuroscience. - 2013. - V. 6. - P. 2.

84. Kredel S., Oswald F., Nienhaus K., Deuschle K., Rocker C., Wolff M., Heilker R., Nienhaus G. U., Wiedenmann J. mRuby, a bright monomeric red fluorescent protein for labeling of subcellular structures // PLoS One. - 2009. - V. 4. - No. 2. - P. e4391.

85. Wu J., Prole D. L., Shen Y., Lin Z., Gnanasekaran A., Liu Y., Chen L., Zhou H., Chen S. R., Usachev Y. M., Taylor C. W., Campbell R. E. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum // The Biochemical journal. -2014. - V. 464. - No. 1. - P. 13-22.

86. Ohkura M., Sasaki T., Kobayashi C., Ikegaya Y., Nakai J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials // PloS one. - 2012. - V. 7. - No. 7. - P. e39933.

87. Inoue M., Takeuchi A., Horigane S., Ohkura M., Gengyo-Ando K., Fujii H., Kamijo S., Takemoto-Kimura S., Kano M., Nakai J., Kitamura K., Bito H. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2 // Nature methods. - 2015. - V. 12. - No. 1. -P. 64-70.

88. Shaner N. C., Lin M. Z., McKeown M. R., Steinbach P. A., Hazelwood K. L., Davidson M. W., Tsien R. Y. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins // Nat. Methods. - 2008. - V. 5. - No. 6. - P. 545-51.

89. Wu J., Liu L., Matsuda T., Zhao Y., Rebane A., Drobizhev M., Chang Y. F., Araki S., Arai Y., March K., Hughes T. E., Sagou K., Miyata T., Nagai T., Li W. H., Campbell R. E. Improved orange and red Ca(2)+/- indicators and photophysical considerations for optogenetic applications // ACS chemical neuroscience. - 2013. - V. 4. - No. 6. - P. 963-72.

90. Dana H., Mohar B., Sun Y., Narayan S., Gordus A., Hasseman J. P., Tsegaye G., Holt G. T., Hu A., Walpita D., Patel R., Macklin J. J., Bargmann C. I., Ahrens M. B., Schreiter E. R., Jayaraman V., Looger L. L., Svoboda K., Kim D. S. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity // eLife. - 2016. - V. 5.

91. Carlson H. J., Campbell R. E. Circular permutated red fluorescent proteins and calcium ion indicators based on mCherry // Protein engineering, design & selection : PEDS. - 2013. -V. 26. - No. 12. - P. 763-72.

92. Wang L., Jackson W. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2004. - V. 101.

- No. 48. - P. 16745-9.

93. Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans B. N., Palmer A. E., Tsien R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein // Nat. Biotechnol. - 2004. - V. 22. - No. 12. - P. 1567-72.

94. Cai D., Cohen K. B., Luo T., Lichtman J. W., Sanes J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox // Nature methods. - 2013. - V. 10. - No. 6. - P. 540-7.

95. Shemiakina, II, Ermakova G. V., Cranfill P. J., Baird M. A., Evans R. A., Souslova E. A., Staroverov D. B., Gorokhovatsky A. Y., Putintseva E. V., Gorodnicheva T. V., Chepurnykh T. V., Strukova L., Lukyanov S., Zaraisky A. G., Davidson M. W., Chudakov D. M., Shcherbo D. A monomeric red fluorescent protein with low cytotoxicity // Nature communications. - 2012. - V. 3. - P. 1204.

96. Piatkevich K. D., Malashkevich V. N., Almo S. C., Verkhusha V. V. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift // J. Am. Chem. Soc. - 2010. - V. 132. - No. 31. - P. 10762-70.

97. Piatkevich K. D., Hulit J., Subach O. M., Wu B., Abdulla A., Segall J. E., Verkhusha V. V. Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2010. - V. 107. - No. 12. - P. 5369-74.

98. Wu J., Abdelfattah A. S., Miraucourt L. S., Kutsarova E., Ruangkittisakul A., Zhou H., Ballanyi K., Wicks G., Drobizhev M., Rebane A., Ruthazer E. S., Campbell R. E. A long Stokes shift red fluorescent Ca(2+) indicator protein for two-photon and ratiometric imaging // Nature communications. - 2014. - V. 5. - P. 5262.

99. Hoi H., Matsuda T., Nagai T., Campbell R. E. Highlightable Ca2+ indicators for live cell imaging // Journal of the American Chemical Society. - 2013. - V. 135. - No. 1. - P. 46-9.

100. Patterson G. H., Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells // Science. - 2002. - V. 297. - No. 5588. - P. 1873-7.

101. Subach F. V., Patterson G. H., Manley S., Gillette J. M., Lippincott-Schwartz J., Verkhusha V. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. // Nat. Methods. - 2009. - V. 6. - No. 2. - P. 153-9.

102. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H., Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2002. - V. 99. - No. 20. - P. 12651-6.

103. Fosque B. F., Sun Y., Dana H., Yang C. T., Ohyama T., Tadross M. R., Patel R., Zlatic M., Kim D. S., Ahrens M. B., Jayaraman V., Looger L. L., Schreiter E. R. Neural circuits. Labeling of active neural circuits in vivo with designed calcium integrators // Science. - 2015.

- V. 347. - No. 6223. - P. 755-60.

104. McEvoy A. L., Hoi H., Bates M., Platonova E., Cranfill P. J., Baird M. A., Davidson M. W., Ewers H., Liphardt J., Campbell R. E. mMaple: a photoconvertible fluorescent protein for use in multiple imaging modalities // PloS one. - 2012. - V. 7. - No. 12. - P. e51314.

105. Hoi H., Shaner N. C., Davidson M. W., Cairo C. W., Wang J., Campbell R. E. A monomeric photoconvertible fluorescent protein for imaging of dynamic protein localization // J. Mol. Biol. - 2010. - V. 401. - No. 5. - P. 776-91.

106. Berlin S., Carroll E. C., Newman Z. L., Okada H. O., Quinn C. M., Kallman B., Rockwell N. C., Martin S. S., Lagarias J. C., Isacoff E. Y. Photoactivatable genetically encoded calcium indicators for targeted neuronal imaging // Nature methods. - 2015. - V. 12.

- No. 9. - P. 852-8.

107. Wiedenmann J., Ivanchenko S., Oswald F., Schmitt F., Rocker C., Salih A., Spindler K. D., Nienhaus G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2004. - V. 101. - No. 45. - P. 15905-10.

108. Grosjean Y., Rytz R., Farine J. P., Abuin L., Cortot J., Jefferis G. S., Benton R. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila // Nature. -2011. - V. 478. - No. 7368. - P. 236-40.

109. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // Journal of cellular and comparative physiology. - 1962. - V. 59. - P. 223-39.

110. Ashley C. C., Ridgway E. B. Simultaneous recording of membrane potential, calcium transient and tension in single muscle fibers // Nature. - 1968. - V. 219. - No. 5159. - P. 1168-9.

111. Ohmiya Y., Hirano T. Shining the light: the mechanism of the bioluminescence reaction of calcium-binding photoproteins // Chemistry & biology. - 1996. - V. 3. - No. 5. - P. 33747.

112. Shimomura O., Kishi Y., Inouye S. The relative rate of aequorin regeneration from apoaequorin and coelenterazine analogues // The Biochemical journal. - 1993. - V. 296 ( Pt 3). - P. 549-51.

113. Chiesa A., Rapizzi E., Tosello V., Pinton P., de Virgilio M., Fogarty K. E., Rizzuto R. Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signalling // The Biochemical journal. - 2001. - V. 355. - No. Pt 1. - P. 1-12.

114. Rizzuto R., Brini M., Pozzan T. Intracellular targeting of the photoprotein aequorin: A new approach for measuring, in living cells, Ca(2+) concentrations in defined cellular compartments // Cytotechnology. - 1993. - V. 11. - No. Suppl 1. - P. S44-6.

115. Rizzuto R., Brini M., Pozzan T. Targeting recombinant aequorin to specific intracellular organelles // Methods in cell biology. - 1994. - V. 40. - P. 339-58.

116. Brini M., Marsault R., Bastianutto C., Pozzan T., Rizzuto R. Nuclear targeting of aequorin. A new approach for measuring nuclear Ca2+ concentration in intact cells // Cell calcium. - 1994. - V. 16. - No. 4. - P. 259-68.

117. Brini M., Pasti L., Bastianutto C., Murgia M., Pozzan T., Rizzuto R. Targeting of aequorin for calcium monitoring in intracellular compartments // Journal of bioluminescence and chemiluminescence. - 1994. - V. 9. - No. 3. - P. 177-84.

118. Shimomura O. Cause of spectral variation in the luminescence of semisynthetic aequorins // The Biochemical journal. - 1995. - V. 306 ( Pt 2). - P. 537-43.

119. Montero M., Brini M., Marsault R., Alvarez J., Sitia R., Pozzan T., Rizzuto R. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells // The EMBO journal. - 1995. - V. 14. - No. 22. - P. 5467-75.

120. Rogers K. L., Picaud S., Roncali E., Boisgard R., Colasante C., Stinnakre J., Tavitian B., Brulet P. Non-invasive in vivo imaging of calcium signaling in mice // PloS one. - 2007. - V. 2. - No. 10. - P. e974.

121. Baubet V., Le Mouellic H., Campbell A. K., Lucas-Meunier E., Fossier P., Brulet P. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2000. - V. 97. - No. 13. - P. 7260-5.

122. Morise H., Shimomura O., Johnson F. H., Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea // Biochemistry. - 1974. - V. 13. - No. 12. - P. 2656-62.

123. Gorokhovatsky A. Y., Marchenkov V. V., Rudenko N. V., Ivashina T. V., Ksenzenko V. N., Burkhardt N., Semisotnov G. V., Vinokurov L. M., Alakhov Y. B. Fusion of Aequorea victoria GFP and aequorin provides their Ca(2+)-induced interaction that results in red shift of GFP absorption and efficient bioluminescence energy transfer // Biochemical and biophysical research communications. - 2004. - V. 320. - No. 3. - P. 703-11.

124. Saito K., Hatsugai N., Horikawa K., Kobayashi K., Matsu-Ura T., Mikoshiba K., Nagai T. Auto-luminescent genetically-encoded ratiometric indicator for real-time Ca2+ imaging at the single cell level // PloS one. - 2010. - V. 5. - No. 4. - P. e9935.

125. Saito K., Chang Y. F., Horikawa K., Hatsugai N., Higuchi Y., Hashida M., Yoshida Y., Matsuda T., Arai Y., Nagai T. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging // Nature communications. - 2012. - V. 3. - P. 1262.

126. Curie T., Rogers K. L., Colasante C., Brulet P. Red-shifted aequorin-based bioluminescent reporters for in vivo imaging of Ca2 signaling // Molecular imaging. - 2007. -V. 6. - No. 1. - P. 30-42.

127. Bakayan A., Vaquero C. F., Picazo F., Llopis J. Red fluorescent protein-aequorin fusions as improved bioluminescent Ca2+ reporters in single cells and mice // PloS one. - 2011. - V. 6. - No. 5. - P. e19520.

128. Takai A., Nakano M., Saito K., Haruno R., Watanabe T. M., Ohyanagi T., Jin T., Okada Y., Nagai T. Expanded palette of Nano-lanterns for real-time multicolor luminescence imaging // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2015. - V. 112. - No. 14. - P. 4352-6.

129. Llano I., Gonzalez J., Caputo C., Lai F. A., Blayney L. M., Tan Y. P., Marty A. Presynaptic calcium stores underlie large-amplitude miniature IPSCs and spontaneous calcium transients // Nature neuroscience. - 2000. - V. 3. - No. 12. - P. 1256-65.

130. Rose C. R., Konnerth A. Stores not just for storage. intracellular calcium release and synaptic plasticity // Neuron. - 2001. - V. 31. - No. 4. - P. 519-22.

131. Hong K., Nishiyama M., Henley J., Tessier-Lavigne M., Poo M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1 // Nature. - 2000. - V. 403. - No. 6765. - P. 93-8.

132. Hardingham G. E., Arnold F. J., Bading H. Nuclear calcium signaling controls CREB-mediated gene expression triggered by synaptic activity // Nature neuroscience. - 2001. - V. 4. - No. 3. - P. 261-7.

133. Suzuki J., Kanemaru K., Ishii K., Ohkura M., Okubo Y., Iino M. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA // Nature communications. - 2014. - V. 5. - P. 4153.

134. Suzuki J., Kanemaru K., Iino M. Genetically Encoded Fluorescent Indicators for Organellar Calcium Imaging // Biophysical journal. - 2016. - V. 111. - No. 6. - P. 1119-31.

135. Palmer A. E., Giacomello M., Kortemme T., Hires S. A., Lev-Ram V., Baker D., Tsien R. Y. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs // Chemistry & biology. - 2006. - V. 13. - No. 5. - P. 521-30.

136. Tang S., Wong H. C., Wang Z. M., Huang Y., Zou J., Zhuo Y., Pennati A., Gadda G., Delbono O., Yang J. J. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - V. 108. - No. 39. - P. 16265-70.

137. Wu X., Reid R. E. Conservative D133E mutation of calmodulin site IV drastically alters calcium binding and phosphodiesterase regulation // Biochemistry. - 1997. - V. 36. - No. 12. - P. 3608-16.

138. Henderson M. J., Baldwin H. A., Werley C. A., Boccardo S., Whitaker L. R., Yan X., Holt G. T., Schreiter E. R., Looger L. L., Cohen A. E., Kim D. S., Harvey B. K. A Low Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for Imaging the Endoplasmic Reticulum Calcium Store // PloS one. - 2015. - V. 10. - No. 10. - P. e0139273.

139. Manjarres I. M., Chamero P., Domingo B., Molina F., Llopis J., Alonso M. T., Garcia-Sancho J. Red and green aequorins for simultaneous monitoring of Ca2+ signals from two different organelles // Pflugers Archiv : European journal of physiology. - 2008. - V. 455. -No. 5. - P. 961-70.

140. Rodriguez-Garcia A., Rojo-Ruiz J., Navas-Navarro P., Aulestia F. J., Gallego-Sandin S., Garcia-Sancho J., Alonso M. T. GAP, an aequorin-based fluorescent indicator for imaging Ca2+ in organelles // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2014. - V. 111. - No. 7. - P. 2584-9.

141. Rodriguez-Prados M., Rojo-Ruiz J., Aulestia F. J., Garcia-Sancho J., Alonso M. T. A new low-Ca(2)(+) affinity GAP indicator to monitor high Ca(2)(+) in organelles by luminescence // Cell calcium. - 2015. - V. 58. - No. 6. - P. 558-64.

142. Navas-Navarro P., Rojo-Ruiz J., Rodriguez-Prados M., Ganfornina M. D., Looger L. L., Alonso M. T., Garcia-Sancho J. GFP-Aequorin Protein Sensor for Ex Vivo and In Vivo Imaging of Ca(2+) Dynamics in High-Ca(2+) Organelles // Cell chemical biology. - 2016. -V. 23. - No. 6. - P. 738-45.

143. Malli R., Eroglu E., Waldeck-Weiermair M., Graier W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca(2+) Imaging In Vivo // Cell chemical biology. - 2016. - V. 23. - No. 6. - P. 641-3.

144. Tsien R. Y. The green fluorescent protein // Annu Rev Biochem. - 1998. - V. 67. - P. 509-44.

145. Chattoraj M., King B. A., Bublitz G. U., Boxer S. G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer // Proc Natl Acad Sci U S A. -1996. - V. 93. - No. 16. - P. 8362-7.

146. Scharnagl C., Raupp-Kossmann R., Fischer S. F. Molecular basis for pH sensitivity and proton transfer in green fluorescent protein: protonation and conformational substates from electrostatic calculations // Biophysical journal. - 1999. - V. 77. - No. 4. - P. 1839-57.

147. Brejc K., Sixma T. K., Kitts P. A., Kain S. R., Tsien R. Y., Ormo M., Remington S. J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1997. - V. 94. - No. 6. - P. 2306-11.

148. Yasuda R., Nimchinsky E. A., Scheuss V., Pologruto T. A., Oertner T. G., Sabatini B. L., Svoboda K. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments // Science's STKE : signal transduction knowledge environment. - 2004. - V. 2004. - No. 219.

- P. pl5.

149. Tian L., Hires S. A., Looger L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators // Cold Spring Harbor protocols. - 2012. - V. 2012. - No. 6. - P. 647-56.

150. Perez Koldenkova V., Nagai T. Genetically encoded Ca(2+) indicators: properties and evaluation // Biochimica et biophysica acta. - 2013. - V. 1833. - No. 7. - P. 1787-97.

151. Steinmetz N. A., Buetfering C., Lecoq J., Lee C. R., Peters A. J., Jacobs E. A. K., Coen P., Ollerenshaw D. R., Valley M. T., de Vries S. E. J., Garrett M., Zhuang J., Groblewski P. A., Manavi S., Miles J., White C., Lee E., Griffin F., Larkin J. D., Roll K., Cross S., Nguyen T. V., Larsen R., Pendergraft J., Daigle T., Tasic B., Thompson C. L., Waters J., Olsen S., Margolis D. J., Zeng H., Hausser M., Carandini M., Harris K. D. Aberrant Cortical Activity in Multiple GCaMP6-Expressing Transgenic Mouse Lines // eNeuro. - 2017. - V. 4. - No. 5.

152. Yang Y., Liu N., He Y., Liu Y., Ge L., Zou L., Song S., Xiong W., Liu X. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP // Nature communications. - 2018. - V. 9. - No. 1. - P. 1504.

153. Wang J. W., Wong A. M., Flores J., Vosshall L. B., Axel R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain // Cell. - 2003. - V. 112. -No. 2. - P. 271-82.

154. Liu L., Yermolaieva O., Johnson W. A., Abboud F. M., Welsh M. J. Identification and function of thermosensory neurons in Drosophila larvae // Nature neuroscience. - 2003. - V. 6. - No. 3. - P. 267-73.

155. Gordon S., Dickinson M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2006. - V. 103. - No. 11. - P. 4311-5.

156. Guerrero G., Reiff D. F., Agarwal G., Ball R. W., Borst A., Goodman C. S., Isacoff E. Y. Heterogeneity in synaptic transmission along a Drosophila larval motor axon // Nature neuroscience. - 2005. - V. 8. - No. 9. - P. 1188-96.

157. Garaschuk O., Griesbeck O., Konnerth A. Troponin C-based biosensors: a new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system // Cell calcium. - 2007. - V. 42. - No. 4-5. - P. 351-61.

158. Fletcher M. L., Masurkar A. V., Xing J., Imamura F., Xiong W., Nagayama S., Mutoh H., Greer C. A., Knopfel T., Chen W. R. Optical imaging of postsynaptic odor representation in the glomerular layer of the mouse olfactory bulb // Journal of neurophysiology. - 2009. -V. 102. - No. 2. - P. 817-30.

159. Issa J. B., Haeffele B. D., Agarwal A., Bergles D. E., Young E. D., Yue D. T. Multiscale optical Ca2+ imaging of tonal organization in mouse auditory cortex // Neuron. - 2014. - V. 83. - No. 4. - P. 944-59.

160. Sullivan M. R., Nimmerjahn A., Sarkisov D. V., Helmchen F., Wang S. S. In vivo calcium imaging of circuit activity in cerebellar cortex // Journal of neurophysiology. - 2005.

- V. 94. - No. 2. - P. 1636-44.

161. Petreanu L., Gutnisky D. A., Huber D., Xu N. L., O'Connor D. H., Tian L., Looger L., Svoboda K. Activity in motor-sensory projections reveals distributed coding in somatosensation // Nature. - 2012. - V. 489. - No. 7415. - P. 299-303.

162. Glickfeld L. L., Andermann M. L., Bonin V., Reid R. C. Cortico-cortical projections in mouse visual cortex are functionally target specific // Nature neuroscience. - 2013. - V. 16. -No. 2. - P. 219-26.

163. Margolis D. J., Lutcke H., Schulz K., Haiss F., Weber B., Kugler S., Hasan M. T., Helmchen F. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation // Nature neuroscience. - 2012. - V. 15. - No. 11. - P. 1539-46.

164. Ziv Y., Burns L. D., Cocker E. D., Hamel E. O., Ghosh K. K., Kitch L. J., El Gamal A., Schnitzer M. J. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes // Nature neuroscience. - 2013. - V. 16. - No. 3. - P. 264-6.

165. Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K., Pease L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. - 1989. - V. 77. - No. 1. -P. 51-9.

166. Patterson G., Day R. N., Piston D. Fluorescent protein spectra // Journal of cell science. -2001. - V. 114. - No. Pt 5. - P. 837-8.

167. Subach O. M., Cranfill P. J., Davidson M. W., Verkhusha V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore // PloS one. - 2011. - V. 6. - No. 12. - P. e28674.

168. Barykina N. V., Subach O. M., Doronin D. A., Sotskov V. P., Roshchina M. A., Kunitsyna T. A., Malyshev A. Y., Smirnov I. V., Azieva A. M., Sokolov I. S., Piatkevich K. D., Burtsev M. S., Varizhuk A. M., Pozmogova G. E., Anokhin K. V., Subach F. V., Enikolopov G. N. A new design for a green calcium indicator with a smaller size and a reduced number of calcium-binding sites // Scientific reports. - 2016. - V. 6. - P. 34447.

169. Subach O. M., Gundorov I. S., Yoshimura M., Subach F. V., Zhang J., Gruenwald D., Souslova E. A., Chudakov D. M., Verkhusha V. V. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe // Chem. Biol. - 2008. - V. 15. - No. 10. - P. 1116-24.

170. Shaner N. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins // Nat Methods. - 2005. - V. 2. - No. 12. - P. 905-9.

171. Subedi A., Macurak M., Gee S. T., Monge E., Goll M. G., Potter C. J., Parsons M. J., Halpern M. E. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis // Methods. - 2014. - V. 66. - No. 3. - P. 433-40.

172. McClure C., Cole K. L., Wulff P., Klugmann M., Murray A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors // Journal of visualized experiments : JoVE. -2011. - No. 57. - P. e3348.

173. Encinas J. M., Vaahtokari A., Enikolopov G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2006. - V. 103. - No. 21. - P. 8233-8.

174. Jiang M., Chen G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures // Nature protocols. - 2006. - V. 1. - No. 2. - P. 695-700.

175. Kimura Y., Satou C., Higashijima S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord // Development. - 2008. -V. 135. - No. 18. - P. 3001-5.

176. Kwan K. M., Fujimoto E., Grabher C., Mangum B. D., Hardy M. E., Campbell D. S., Parant J. M., Yost H. J., Kanki J. P., Chien C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs // Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. - 2007. - V. 236. - No. 11. -P. 3088-99.

177. Fisher S., Grice E. A., Vinton R. M., Bessling S. L., Urasaki A., Kawakami K., McCallion A. S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish // Nature protocols. - 2006. - V. 1. - No. 3. -P. 1297-305.

178. Panier T., Romano S. A., Olive R., Pietri T., Sumbre G., Candelier R., Debregeas G. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy // Frontiers in neural circuits. - 2013. - V. 7. - P. 65.

179. Renaud O., Herbomel P., Kissa K. Studying cell behavior in whole zebrafish embryos by confocal live imaging: application to hematopoietic stem cells // Nature protocols. - 2011. -V. 6. - No. 12. - P. 1897-904.

180. Holtmaat A., Bonhoeffer T., Chow D. K., Chuckowree J., De Paola V., Hofer S. B., Hubener M., Keck T., Knott G., Lee W. C., Mostany R., Mrsic-Flogel T. D., Nedivi E., Portera-Cailliau C., Svoboda K., Trachtenberg J. T., Wilbrecht L. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window // Nature protocols. -2009. - V. 4. - No. 8. - P. 1128-44.

181. Peirce J. W. Generating Stimuli for Neuroscience Using PsychoPy // Frontiers in neuroinformatics. - 2008. - V. 2. - P. 10.

182. Horikawa K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators // The journal of medical investigation : JMI. - 2015. - V. 62. - No. 1-2. - P. 24-8.

183. Nagai T., Horikawa K., Saito K., Matsuda T. Genetically encoded Ca(2+) indicators; expanded affinity range, color hue and compatibility with optogenetics // Frontiers in molecular neuroscience. - 2014. - V. 7. - P. 90.

184. Subach F. V., Patterson G. H., Renz M., Lippincott-Schwartz J., Verkhusha V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells // J. Am. Chem. Soc. - 2010. - V. 132. - No. 18. - P. 6481-91.

185. Shaner N. C., Lambert G. G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P. J., Baird M. A., Sell B. R., Allen J. R., Day R. N., Israelsson M., Davidson M. W., Wang J. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum // Nature methods. - 2013. - V. 10. - No. 5. - P. 407-9.

186. Ormo M., Cubitt A. B., Kallio K., Gross L. A., Tsien R. Y., Remington S. J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science. - 1996. - V. 273. -No. 5280. - P. 1392-5.

187. Zhao Y., Bushey D., Schreiter E. R., Harrison D. J., Wong A. M., Campbell R. E. Inverse-response Ca(2+) indicators for optogenetic visualization of neuronal inhibition // Scientific reports. - 2018. - V. 8. - No. 1. - P. 11758.

188. Hara-Kuge S., Nishihara T., Matsuda T., Kitazono T., Teramoto T., Nagai T., Ishihara T. An improved inverse-type Ca2+ indicator can detect putative neuronal inhibition in Caenorhabditis elegans by increasing signal intensity upon Ca2+ decrease // PloS one. - 2018. - V. 13. - No. 4. - P. e0194707.

189. Subach F. V., Piatkevich K. D., Verkhusha V. V. Directed molecular evolution to design advanced red fluorescent proteins // Nature methods. - 2011. - V. 8. - No. 12. - P. 1019-26.

190. Li Y., Tsien R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity // Nature neuroscience. - 2012. - V. 15. - No. 7. -P. 1047-53.

191. Zapata-Hommer O., Griesbeck O. Efficiently folding and circularly permuted variants of the Sapphire mutant of GFP // BMC Biotechnol. - 2003. - V. 3. - P. 5.

192. Chesler M., Kaila K. Modulation of pH by neuronal activity // Trends in neurosciences. -1992. - V. 15. - No. 10. - P. 396-402.

193. Xiong Z. Q., Saggau P., Stringer J. L. Activity-dependent intracellular acidification correlates with the duration of seizure activity // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. - 2000. - V. 20. - No. 4. - P. 1290-6.

194. Li-Smerin Y., Levitan E. S., Johnson J. W. Free intracellular Mg(2+) concentration and inhibition of NMDA responses in cultured rat neurons // The Journal of physiology. - 2001. -V. 533. - No. Pt 3. - P. 729-43.

195. Maravall M., Mainen Z. F., Sabatini B. L., Svoboda K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing // Biophysical journal. - 2000. - V. 78. - No. 5. - P. 2655-67.

196. Ormo M., Cubitt A. B., Kallio K., Gross L. A., Tsien R. Y., Remington S. J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein.[see comment] // Science. - 1996. - V. 273. - No. 5280. - P. 1392-5.

197. Frankland P. W., Bontempi B. The organization of recent and remote memories // Nature reviews. Neuroscience. - 2005. - V. 6. - No. 2. - P. 119-30.

198. O'Keefe J., Dostrovsky J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat // Brain research. - 1971. - V. 34. - No. 1. - P. 171-5.

199. Niwa H., Inouye S., Hirano T., Matsuno T., Kojima S., Kubota M., Ohashi M., Tsuji F. I. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1996. - V. 93. - No. 24. - P. 13617-22.

200. Ding J., Luo A. F., Hu L., Wang D., Shao F. Structural basis of the ultrasensitive calcium indicator GCaMP6 // Science China. Life sciences. - 2014.

201. Tricoire L., Tsuzuki K., Courjean O., Gibelin N., Bourout G., Rossier J., Lambolez B. Calcium dependence of aequorin bioluminescence dissected by random mutagenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2006. -V. 103. - No. 25. - P. 9500-5.

202. Kendall J. M., Sala-Newby G., Ghalaut V., Dormer R. L., Campbell A. K. Engineering the CA(2+)-activated photoprotein aequorin with reduced affinity for calcium // Biochemical and biophysical research communications. - 1992. - V. 187. - No. 2. - P. 1091-7.

203. Brain K. L., Bennett M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition // The Journal of physiology. - 1997. - V. 502 ( Pt 3). - P. 521-36.

204. Svoboda K., Denk W., Kleinfeld D., Tank D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons // Nature. - 1997. - V. 385. - No. 6612. - P. 161-5.

205. Matsuda T., Horikawa K., Saito K., Nagai T. Highlighted Ca(2)(+) imaging with a genetically encoded 'caged' indicator // Scientific reports. - 2013. - V. 3. - P. 1398.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне благодарит:

Федора Васильевича Субача за возможность работать над интересной темой исследования, за поддержку и помощь в планировании экспериментов, интерпретации и формулировании результатов;

Коллектив лаборатории стволовых клеток мозга МФТИ и в особенности Оксану Михайловну Субач и Даниила Доронина;

Сотрудников НИЦ «Курчатовский Институт» Ирину Юрьевну Зарайскую, Марину Рощину, Татьяну Куницыну, Владимира Сотскова, Алену Николаеву, Дмитрия Корженевского, Константина Бойко, Татьяну Владимировну Ракитину и Евгению Александровну Булыгину;

Сотрудников лаборатории перспективных исследований мембранных белков МФТИ Андрея Богородского и Валентина Борщевского;

Анну Варижук из отдела молекулярной биологии и генетики ФНКЦ физико-химической медицины и Алексея Юрьевича Малышева из лаборатории клеточной нейробиологии обучения ИВНД и НФ РАН;

Сотрудников Массачусетского технологического института Эрику Юнг и Кирилла Петкевича;

Уважаемых оппонентов Марину Борисовну Готтих, Александра Павловича Савицкого и Александра Сергеевича Мишина;

Друзей и родных за поддержку, понимание и терпение.