Разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ-активности препаратов на клеточных и тканевых моделях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат медицинских наук Киселева, Яна Юрьевна

• Киселева, Яна Юрьевна
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Киселева, Яна Юрьевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Патогенез ВИЧ-инфекциии в лимфоидной ткани

1.2. Препараты, используемые для лечения ВИЧ-инфекции

1.3. Развитие устойчивости к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты

3.1. Получение мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы. Изучение их фенотипических и генотипических свойств

3.2. Исследование перекрестной устойчивости мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток

3.3. Подавление различных штаммов ВИЧ-1 новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови

3.4. Исследование анти-ВИЧ активности НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов в культуре лимфоидной ткани человека

3.5. Разработка экспериментальной системы для оценки постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Список используемых сокращений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ-активности препаратов на клеточных и тканевых моделях»

Актуальность исследования

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, AIDS) - это первое ретровирусное заболевание, которое быстро распространилось по всему миру, приобретя характер пандемии. Впервые СПИД описан у гомосексуалистов в США в 1981 году [144, 186, 236]. Два года спустя в лабораториях L.Montagnier [12] и R.Gallo [90] был идентифицирован возбудитель СПИДа - ретровирус человека, первоначально названный, соответственно, LAV (Lymphoadenopathy-associated virus) и HTLV-III. Сейчас он известен как вирус иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1). Несмотря на то, что более 20 лет научные ресурсы всего мира направлены на борьбу с этим заболеванием и, начиная с 1996 года, благодаря применению высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), заболеваемость СПИДом значительно сократилась, число ВИЧ-инфицированных продолжает расти. В 2004 году общее число людей, являющихся носителями ВИЧ, возросло и достигло самого высокого уровня в истории: по оценкам экспертов 39,4 миллиона (35,9^44,3 миллиона) человек живут с этим вирусом. Эта цифра включает 4,9 (4,3-6,4) миллиона человек, инфицированных ВИЧ в 2004 году. За прошедший год глобальная эпидемия СПИДа унесла жизни 3,5 миллиона человек [299].

Надежда врачей на то, что с помощью ВААРТ удастся излечить ВИЧ-инфицированных больных, столкнулась с уникальными патогенетическими особенностями ВИЧ-инфекции, не позволяющими ни иммунной системе, ни применяемым в настоящее время анти-ВИЧ препаратам обеспечить полную элиминацию вируса из организма.

ВИЧ поражает самую сердцевину иммунной системы — CD4+ Т-лимфоциты, постепенно на протяжении многих лет уничтожая иммунокомпетентные клетки.

ВИЧ характеризуется высокой генетической и антигенной изменчивостью. Изоляты ВИЧ, полученные от одного и того же больного, но из разных отделов организма, а также выделенные на разных стадиях заболевания, отличаются по нуклеотидным последовательностям и антигенным свойствам. Кроме того, различные субтипы ВИЧ превалируют в различных географических областях. Все это осложняет создание вакцин против СПИДа и иммунотерапию.

Неспособность обратной транскриптазы ВИЧ контролировать стабильность генома, высокая скорость репликации вируса в условиях применения специфической противовирусной терапии приводит к отбору и неизбежному накоплению мутантных штаммов со сниженной чувствительностью к анти-ВИЧ препаратам.

Хотя все стадии жизненного цикла ВИЧ-1 являются потенциальными мишенями для антиретровирусной терапии, сейчас в клинической практике используют только три класса соединений: ингибиторы проникновения, ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы. Причем, ко всем применяемым в настоящее время препаратам обнаружены резистентные мутанты ВИЧ-1. Поэтому очень важно, чтобы новые препараты были активны не только против 'диких' штаммов, но и против резистентных штаммов ВИЧ-1. Этого можно добиться путем создания препаратов, действующих на 'новые' мишени вирусного цикла, либо, если препарат направлен на 'старые' мишени, необходимым этапом должно быть тестирование его активности против резистентных мутантов ВИЧ-1.

Поскольку одной из задач нашей лаборатории является поиск новых перспективных антиретровирусных препаратов, мы были заинтересованы, в частности, в получении мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, изучении их фенотипических и генотипических свойств и исследовании перекрестной устойчивости мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.

Важной особенностью ВИЧ-инфекции является наличие штаммов ВИЧ-1, использующих различные ко-рецепторы - CXCR4 и CCR5 - для проникновения в клетки (штаммы Х4 и R5, соответственно) и поражающих различные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов [17, 219]. Поэтому необходим поиск лекарств, которые будут эффективны против штаммов ВИЧ-1 различной тропности.

Ключевые патофизиологические процессы ВИЧ-инфекции происходят в лимфоидной ткани [74, 118, 225], что требует разработки специальных подходов для тестирования препаратов на лимфоидной ткани ex vivo. В настоящее время для тестирования анти-ВИЧ препаратов используются либо лимфобластоидные и моноцитарные перевиваемые культуры клеток человека, либо первичные культуры стимулированных мопонуклеарных (МКПК), лимфоцитарных или моноцитарных клеток периферической крови здоровых доноров, пермиссивных для репликации ВИЧ-1. Но у данных систем есть недостатки, которые ограничивают их применение. В частности, метаболизм природных пуклеотидов, как в перевиваемых культурах Т-лимфоцитов человека, так и в стимулированных мононуклеарных клетках периферической крови усилен [85, 97, 200]. По-видимому, это связано с тем, что в данных системах нарушены природные взаимодействия, которые существуют между иммуннокомпетентными клетками и их окружением in vivo. Например, стимуляция МКПК фитогемагглютинином значительно меняет экспрессию CCR5 и CXCR4 ко-рецепторов на поверхности лимфоцитов [17, 325]. Основой вышеперечисленных in vitro моделей являются изолированные клетки периферической крови человека. Между тем, хорошо известно, что на долю периферической крови приходится менее 2% всех лимфоцитов организма [315], и изменения в периферической крови при ВИЧ-инфекции являются лишь отражением ключевых патофизиологических процессов, происходящих в лимфоидной ткани, которая содержит подавляющее большинство - 98% лимфоцитов организма человека и является основной мишенью для ВИЧ. Поэтому использование культуры лимфоидной ткани человека, в которой сохранена архитектоника ткани, стромальное окружение иммунокомпетентных клеток, обеспечивющее взаимодействие между антигенами, хемокинами, факторами роста, лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками, позволило бы проводить более адекватное тестирование новых препаратов с целью оценки их перспективности.

Наиболее труднопреодолимым препятствием в борьбе с ВИЧ-инфекцией является наличие многолетнего латентного резервуара инфекции в лимфоидной ткани. По последним оценкам ВИЧ интегрируется в геном и существует в виде стабильной латентной формы провируса в покоящихся CD4+ Т-лимфоцитах памяти в течение периода сравнимого с человеческой жизнью [277]. В такой форме вирус не чувствителен к ВААРТ и может быть активирован при активации Т-клеток памяти в ответ на специфический патоген [13, 39, 119].

Таким образом, сложные особенности патогенеза ВИЧ-инфекции требуют создания новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов.

Цель и задачи исследования

Целью нашего исследования была разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов in vitro, в том числе на лимфоидной ткани в соответствии с современными представлениями о патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к пуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.

2. Изучить фенотипические и генотипические свойства, полученных мутантов.

3. Исследовать перекрестную устойчивость мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4.

4. Оценить подавление AZT-устойчивых мутантов ВИЧ-1 и штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.

5. Исследовать активность НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов против штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам в культуре лимфоидной ткани человека.

6. Разработать экспериментальную систему для оценки анти-ВИЧ активности постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.'

Научная новизна работы

Впервые получен мутант ВИЧ-1, устойчивый к фосфонату d4T.

Впервые проведено сравнительное исследование развития устойчивости к нуклеозидным аналогам и их фосфонатным производным.

Впервые показано, что резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и достигает более высокого уровня, чем к их фосфонатным производным.

Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.

Впервые проведено исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений - анионной поликарбоксилатной матрицы и ее производных, модифицированных адамантаном и норборненом.

Впервые показано эффективное ингибирование комплексными адамантан- и нонборнен- содержащими мембранотропными соединениями репродукции Х4 штаммов LAI.04 и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов в культуре клеток человека МТ-4.

Впервые показана возможность использования культуры лимфоидной ткани миндалин человека для оценки анти-ВИЧ активности противоретровирусных препаратов.

Впервые проведено тестирование новых препаратов - микробицида, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы UC781 и неконкурентного ингибитора обратной транскриптазы ниглизина в первичной культуре лимфоидной ткани миндалин человека. Показано, что эти препараты эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1, при этом R5 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 вирус.

Впервые разработана экспериментальная система для исследования препаратов, действующих на постинтеграционные стадии вирусной репликации в лимфоидной ткани человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным.

2. Фосфонатное производное d4T с высокой эффективностью подавляет репродукцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.

3. Комплексные адамантан- и нонборнен- содержащие мембранотроппые соединения эффективно ингибируют репродукцию штаммов LAI.04 (CXCR-4-тропный вариант) и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов ВИЧ в культуре клеток человека МТ-4.

4. Культура лимфоидной ткани миндалин человека является адекватной системой для оценки анти-ВИЧ активности перспективных противоретровирусных препаратов.

5. Препараты UC781 и ниглизин эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1 в культуре лимфоидной ткани миндалин человека.

6. Разработана экспериментальная система, перспективная для оценки препаратов, направленных на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.

Практическая значимость работы

Созданная коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (AZT, Н-phAZT, ddl, d4T, phd4T) может быть использована для оценки эффективности новых препаратов против резистентных мутантов.

Использование в качестве экспериментальной модели культуры лимфоидной ткани миндалин человека позволит тестировать перспективные соединения в условиях, приближенных к in vivo.

Разработанная экспериментальная система позволит оценивать препараты, направленные на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации. Апробация работы

Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых (Вектор, Кольцово, 2001); 8 и 9 международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, Россия, 2000, 2001); IX International conference "New informational technology in medicine and ecology" (Гурзуф, Украина, 2001); XII International congress of virology (Paris, France, 2002), XV International round table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids" (Leuvev, Belgium, 2002), I Международном Симпозиуме "Стресс и экстремальные состояния" и Сателлитном Симпозиуме "Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия". (Кара-Даг, Украина, 2002); 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, (Paris, France, 2003), симпозиуме "Интегративная медицина" (Кара-Даг, Украина, 2003); международной конференции "Microbicides 2004" (Лондон, Великобритания, 2004); международном симпозиуме "Keystone symposia on HIV Pathogenesis" (Банф, Канада, 2005).

Публикации

По материалам диссертации имеется 17 печатных работ, в том числе 6 статей в отечественных и зарубежных журналах, 11 тезизов на международных конференциях.

Личный вклад соискателя заключается в проведении основной части экспериментов - по селекции и изучению фенотипических свойств AZT-, H-phAZT-, ddl-резистентных мутантов, в исследовании анти-ВИЧ активности мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови, в изучении анти-ВИЧ активности НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов в культуре лимфоидной ткани человека, и в разработке экспериментальной системы для оценки постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.

Результаты по селекции AZT-, H-phAZT-, ddl-, d4T- и phd4T- резистентных мутантов, получены в соавторстве и при непосредственной помощи О.А. Плясуновой. Результаты по анализу нуклеотидных и аминокислотных замен в гене pol получены сотрудником нашей лаборатории Н.М Гашниковой.

Автор благодарит О.А. Плясунову, П.М. Кузину и С.А. Сафонову за обучение методам безопасной работы с инфекционным материалом, освоение вирусологических и культуральных методов и неоценимую помощь при проведении экспериментов. Н.М Гашникову за сотрудничество по анализу нуклеотидных и аминокислотных замен в гене pol. А.Г. Покровского за научное консультирование.

Автор благодарит сотрудников Лаборатории Клеточной и Молекулярной Биофизики (NICHD, USA) - J.-Ch. Grivel, Y. Ito за приобретенные навыки работы с первичной культурой миндалин человека, а также помощь в освоении методов флуоцитометрии и ПЦР в реальном времени.

Автор благодарит Н.Г.Перминову, И.В.Тимофеева и А.В.Сербина за любезно предоставленную возможность исследования новых мембранотропных соединений и за научное консультирование.

Автор благодарит Dr. R. Shattock за любезно предоставленный препарат UC781.

Автор благодарит Dr. B.Berkhout и A.T.Das за любезно предоставленную возможность работы с досксициклин-зависимой вирусной конструкцией HIV-rtRT и за научное консультирование.

За научное руководство работой автор выражает особую благодарность О.А. Плясуновой и Л.Б. Марголису.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Киселева, Яна Юрьевна

выводы

1. Создана коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы - AZT, d4T, ddl, H-phAZT, phd4T. Показано, что все отобранные мутанты эффективно реплицируются в чувствительных клетках и проявляют цитопатические свойства. В гене pol наряду с классическими резистентными мутациями впервые выявлены и описаны новые мутации.

2. Впервые установлено, что резистентность ВИЧ-1 к нуклеозидным аналогам развивается значительно быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным (KPazt=160,8 и КРн-рилгт = 7,8; KPd4T=70 и KPphd4t-14,8). Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T, a H-phAZT - резистентных к d4T и ddl.

3. Установлено, что AZT-резистентпые мутанты обладают высокой перекрестной устойчивостью к H-phAZT и умеренной - к d4T; р1^4Т-резистентный мутант -умеренной устойчивостью к d4T и незначительной - к AZT. Для d4T- и ddl-устойчивых мутантов кросс-резистентность не выявлена. Впервые показано, что II-pliAZT- устойчивый мутант обладает низкой перекрестной устойчивостью к AZT.

4. Сравнительное исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 выявило высокую эффективность иигибирования репликации штаммов Х4, а также AZT-устойчивых мутантов комплексными мембранотроппыми соединениями, модифицированными адамантаном и норборненом, по сравнению с исходной анионной поликарбоксилатной матрицей. Показано, что бициклическое производное норборнеиа As504 избирательно эффективно против штамма X4lai 04 в первичной культуре МКПК.

5. Впервые показано, что препараты AZT, H-phAZT, ddl высоко активны против Х4 и R5 вирусов в культуре лимфоидной ткани ex vivo. В этой системе эффективность ddl в против Х4 вируса в 40 раз выше, чем против R5 вируса.

6. Впервые ex vivo в культуре лимфоидной ткани показано, что ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы UC781 эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1. R5 ВИЧ-1 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 ВИЧ-1. Краткой преинкубации ткани с UC781 достаточно для предотвращения репликации ВИЧ-1 в течение, по крайней мере, 12 дней.

7. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать препараты, ингибирующие постинтеграционные стадии вирусной репликации. В данной экспериментальной системе было показано, что продуктивная инфекция CD4+ Т-лимфоцитов приводит к их массовой гибели, в то время как латентно зараженные и незараженные CD4+ Т-лимфоциты не погибают.

Список используемых сокращений ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия ГК - глицирризииовая кислота

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный калониестимулирующий фактор

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КР — кратность резистентности

ИП — ингибиторы протеазы

МКПК - мононуклеарпые клетки периферической крови

НзИОТ - нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

НтИОТ - нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы

ННИОТ - ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

ОТ - обратная транскриптаза

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТАМ - тимидин-ассоциированные мутации

ФГА - фитогемагглютинин

ЦНС - центральная нервная система

AZT - 3'-azido-2',3'- dideoxythymidin

AZT-MP - 3'-azido-2',3'- dideoxythymidine-5' - monophosphate AZT-TP - 3'-azido-2',3'- dideoxythymidine-5' - triphosphate CD - cluster of differentiation

CC50 - цитотоксическая концентрация, на 50% снижающая жизнеспособность клеток dATP - 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate ddA-TP - 2',3'-dideoxyadenosine 5' - triphosphate ddl - 2',3'-dideoxyinosine dNTP - deoxyribonucleotide triphosphate ddN - дидезоксинуклеозиды ddNTP - дидезоксинуклеозидтрифосфат d4T - 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine- 5'-diphosphate d4T-DP - 2',3 '-didehydro-2',3 '-dideoxythymidine d4T-TP - 2,,3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine - 5' - triphosphate

IC50 - 50% ингибирующая концентрация

IC90 - 90% ингибирующая концентрация

FDA - Food and Drug Administration

MlP-la - macrophage inflammatory protein la

MIP-1J3 - macrophage inflammatory protein 1P

MNR - множественная резистентность к нуклеозидным аналогам

NSI - non-syncytium-inducing

R5 - штамм ВИЧ-1, тропный к ко-рецептору CCR5

RANTES - regulated on activation, normal T cell expressed and secreted

SI - syncytium-inducing

X4 -штамм ВИЧ-1, тропный к ко-рецептору CXCR4

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Киселева, Яна Юрьевна, 2005 год

1. Adkins J.C., Peters D.H., Faulds D., Zalcitabine. An update of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and clinical efficacy in the management of HIV infection // Drugs.- 1997.- 53(6).- P. 1054-1080.

2. Ahluwalia G.S., Gao W.Y., Mitsuya H., Johns D.G., 2',3'-Didehydro-3'-deoxythymidine: regulation of its metabolic activation by modulators of thymidine-5'-triphosphate biosynthesis //Mol Pharmacol.- 1996.- 50(1).- P. 160-165.

3. Armstrong J.A., Home R., Follicular dendritic cells and virus-like particles in AIDS-related lymphadenopathy // Lancet.- 1984,- 2(8399).- P. 370-372.

4. August E.M., Marongiu M.E., Lin T.S., Prusoff W.H., Initial studies on the cellular pharmacology of 3'-deoxythymidin-2'-ene (d4T): a potent and selective inhibitor of human immunodeficiency virus // Biochem Pharmacol.- 1988.- 37(23).- P. 4419-4422.

5. Back N.K., Nijhuis M., Keulen W., et al., Reduced replication of ЗТС-resistant HIV-1 variants in primary cells due to a processivity defect of the reverse transcriptase enzyme // Embo J.- 1996,- 15(15).- P. 4040-4049.

6. Balzarini J., Naesens L., Verbeken E., et al., Preclinical studies on thiocarboxanilide UC-781 as a virucidal agent//Aids.- 1998.- 12(10).-P. 1129-1138.

7. Barnard J., Borkow G., Parniak M.A., The thiocarboxanilide nonnucleoside UC781 is a tight-binding inhibitor of HIV-1 reverse transcriptase // Biochemistry.- 1997.- 36(25).- P. 7786-7792.

8. Barre-Sinoussi F., Chermann J.C., Rey F., et al., Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) // Science.-1983.- 220(4599).-P. 868-871.

9. Belmonte L., Bare P., de Bracco M.M., Ruibal-Ares B.H., Reservoirs of HIV replication after successful combined antiretroviral treatment // Curr Med Chem.- 2003.- 10(4).- P. 303-312.

10. Berkhout В., Verhoef К., Marzio G., et al., Conditional virus replication as an approach to a safe live attenuated human immunodeficiency virus vaccine // J Neurovirol.- 2002.- 8 Suppl2.-P. 134-137.

11. Blankson J.N., Persaud D., Siliciano R.F., The challenge of viral reservoirs in HIV-1 infection // Annu Rev Med.- 2002,- 53,- P. 557-593.

12. Bleul C.C., Wu L., Hoxie J.A., et al., The HIV eoreceptors CXCR4 and CCR5 are differentially expressed and regulated on human T lymphocytes // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1997,- 94(5).- P. 1925-1930.

13. Borrow P., Lewicki H., Hahn B.H., et al., Vims-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection//J Virol.- 1994.- 68(9).- P. 6103-6110.

14. Boucher C.A., O'Sullivan E., Mulder J.W., et al., Ordered appearance of zidovudine resistance mutations during treatment of 18 human immunodeficiency virus-positive subjects // J Infect Dis.- 1992,- 165(1).- P. 105-110.

15. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H., Selective excision of AZTMP by drug-resistant human immunodeficiency virus reverse transcriptase // J Virol.- 2001.-75(10).-P. 4832-4842.

16. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H., The Ml 84V mutation reduces the selective excision of zidovudine 5'-monophosphate (AZTMP) by the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 // J Virol.- 2002.- 76(7).- P. 3248-3256.

17. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H., Nucleoside analog resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involves ATP-mediated excision // J Virol.- 2002.- 76(18).- P. 9143-9151.

18. Bukrinsky M.I., Stanwick T.L., Dempsey M.P., Stevenson M., Quiescent T lymphocytes as an inducible virus reservoir in HIV-1 infection // Science.- 1991,- 254(5030).- P. 423427.

19. Burstein M.E., Serbin A.V., Khakhulina T.V., et al., Inhibition of HIV-1 replication by newly developed adamantane-containing polyanionic agents // Antiviral Res.- 1999.-41(3).-P. 135-144.

20. Carr A., Cooper D.A., Adverse effects of antiretroviral therapy // Lancet.- 2000.-356(9239).-P. 1423-1430.

21. Carr A., Workman C., Smith D.E., et al., Abacavir substitution for nucleoside analogs in patients with HIV lipoatrophy: a randomized trial // Jama.- 2002.- 288(2).- P. 207-215.33