Разработка нового метода крупномасштабного поиска гипометилированных регуляторных участков в геномах эукариот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Баскаев Константин Константинович

• Баскаев Константин Константинович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Баскаев Константин Константинович

2.1. Актуальность темы

2.2. Цель и задачи исследования

2.3. Научная новизна и практическая значимость

2.4. Научные публикации по итогам диссертационной работы

2.4.1. Статьи по теме диссертации

2.4.2. Тезисы научных конференций по теме диссертации

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. «МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОСНОВАНИЯ В ДНК»

3.1. Модифицированные основания в ДНК бактерий и их вирусов

3.1.1. Модифицированные основания в ДНК бактерий

3.1.2. Модифицированные основания в ДНК бактериофагов

3.2. Модифицированные основания в геноме эукариот

3.2.1. Метилированные основания в геноме высших эукариот

3.2.2. Импринтинг и инактивация Х-хромосомы

3.2.3. Гипермодифицированные основания в геноме млекопитающих

3.2.4. Простейшие: модифицированные и гипермодифицированные основания

3.2.5. Наличие метиладенина в геноме эукариот

3.3. Заключение

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. «РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОИСКА ГИПОМЕТИЛИРОВАННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКОВ В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ»

4.1. Материалы и методы

4.1.1. Оборудование

4.1.2. Расходные материалы

4.1.3. Выделение и очистка ДНК

4.1.4. Олигонуклеотидные праймеры и суппрессионные адапторы

4.1.5. Молекулярное клонирование, скрининг библиотек

4.1.6. Бактериальные штаммы. Трансформация и культивирование

4.1.7. Эндонуклеазы рестрикции, рестрикция и лигирование

4.1.8. Полимеразная цепная реакция

4.1.9. Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН)

4.1.10. Бисульфитная конверсия

4.1.11. Электрофорез в агарозном геле

4.1.12. Секвенирование

4.2. Теоретические основы метода

4.3. Выбор мобильных элементов

4.4. Получение пилотных клонотек

4.5. Применение nMETR для поиска гипометилированных последовательностей в геномной ДНК рака мочевого пузыря

4.6. Крупномасштабное секвенирование nMETR-библиотек

4.7. Бисульфитное секвенирование

4.8. Заключение

4.9. Экспериментальный анализ специфичной для человека открытой рамки считывания с11отр2

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

Л. Олигонуклеотидные праймеры и супрессионные адаптеры для nMETR

Б. Олигонуклеотидные праймеры для ДНК, подвергавшейся бисульфитной конверсии

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И САЙТЫ ОТЖИГА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ

2. Введение

В начале 21 в. частной компанией «Celera Genomics» под руководством Крейга Вентера и Национальным Центром Исследований Человеческого Генома в Национальной Организации Здравоохранения США (NIH), возглавляемого Френсисом Коллинзом был завершен масштабный и амбициозный проект «Геном человека» (Human Genome Project, HGP). Датой окончания проекта, стоившего 3 миллиарда долларов и продолжавшегося 12 лет можно назвать дату публикации итоговых заявлений в авторитетных изданиях Cell и Nature [1; 2]. Нуклеотидная последовательность человеческого генома опубликована для публичного доступа и плодами этой кропотливой работы может воспользоваться все научное сообщество. Успешное внедрение технологий секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing, NGS) и постоянное снижение стоимости определения нуклеотидных последовательностей позволило полностью секвенировать множество геномов [3]. Существуют базы данных, содержащие полные или частичные последовательности геномов приматов, птиц, рыб, грибов и эубактерий, секвенированы геномы различных архей. Свободный доступ и последующая публикация геномной последовательности человека является важной вехой в изучении жизни в ее генетическом разнообразии [1]. Следует ометить, что знание того, что представляет из себя геном конкретного организма не дает ответа на вопрос каким образом наследственная информация реализуется в процессе его жизнедеятельности. В настоящее время внимание научного сообщества сместилось с поиска и определения новых генов на их экспрессию и функционирование [4].

Важная роль в определении того, как реализуется генетическая информация принадлежит эпигенетике, которая рассматривает модификации, затрагивающие функциональную активность генов, не меняя при этом нуклеотидной последовательности ДНК и устойчиво наследующиеся в ряду клеточных поколений [5]. Эпигенетические модификации делятся на два типа - метилирование ДНК и модификация гистонов [6]. Функциональное состояние гена, хромосомы или даже целого генома будет определяться распределением модифицированных оснований и гистонов по геномной ДНК. Существует тесная связь между этими двумя модификациями [7].

Метилирование ДНК влияет на функционирование многих клеточных систем, участвует в регуляции репликации, транскрипции, рекомбинации и репарации. Каталитическая модификация оснований как в РНК, так и в ДНК происходит во всех главных надцарствах живого, включая некоторые виды вирусов [8].

Некоторые их этих модификаций, такие как метилирование, тиоуридинилирование и псевдоуридинилирование оснований в рРНК и тРНК присутствуют практически во всех живых формах и необходимы для выживания. Как правило, модификация оснований в ДНК менее разнообразна и имеет меньшую частоту, чем другие модификации нуклеиновых кислот (модификации РНК). Меньшее разнообразие и относительно небольшая представленность модификаций ДНК, возможно, является следствием ограничений, возникающих из-за двуцепочечной структуры ДНК и защиты генетического материала от потенциального мутагенного воздействия таких модификаций. Тем не менее, модификации ДНК предоставляют дополнительный «информационный слой» (эпигенетическую информацию) к информации, которую можно закодировать четырьмя буквами генетического кода. Как результат, у относительно небольшого набора модификаций ДНК появились в процессе эволюции и

распространились среди всех отделов живого важные биологические функции [9].

Модифицированное основание Организм Доля в ДНК, %

5-метилцитозин, 5mC Высшие эукариоты

Бактериофаги 0,2-0,5

Динофлагелляты

Грибы

Бактерии 0,3-2

5-гидроксиметилцитозин, 5-ROH2CCyt (R1=H, R2=aGlc, R3=ßGlc, R4=ßGlc-aGlc) Фаги Escherichia coli T2, T4, T0

ß-D-глюкозил-гидроксиметилурацил, 5hmU Trypanosoma brucei 0,4

№-метиладенин Tetrahymena 0,8-2,5

Динофлагелляты

Бактерии 0,3-3

Фаги (T2, T4) 0,5-2

a-путрестцинилтимин, a-Put Фаг Pseudomonas acidovorans 9W14

N6-кабрамоиметиладенин Фаг E. coli Mu

Таблица 1. Различные природные химические модификации оснований в ДНК и их представленность (По данным [8]).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка нового метода крупномасштабного поиска гипометилированных регуляторных участков в геномах эукариот»

2.1. Актуальность темы

Эпигенетика — быстро развивающаяся область молекулярной биологии, пытающаяся ответить на вопрос «Как работает геном?». Тогда как каждая содержащая ядро клетка человеческого организма, за исключением лимфоцитов, несет один и тот же набор генов, разные гены в разных клетках экспрессируются в разное время, что и является одной из причин разнообразия клеток и тканей человеческого организма. Помимо критической роли в нормальном развитии живых организмов, эпигенетические изменения сопровождают (или являются причиной) таких патологических процессов как онкогенез и старение.

Метилирование геномной ДНК является важной частью эпигенетических процессов. До настоящего времени главным методом изучения статуса метилирования генома позвоночных животных является секвенирование ДНК, подвергнувшейся реакции бисульфитной конверсии. В случае полногеномных исследований за бисульфитной конверсией может следовать использование техник секвенирования следующего поколения (англ. Next Generation Sequencing, NGS) или анализ реакционных смесей на микрочипах. Помимо этого, для получения метилированных последовательностей из смеси фрагментов геномной ДНК может быть использована аффинная хроматография. Однако, для анализа большого объема получающихся данных требуются методы контроля, позволяющие исключить ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Идеальный контроль должен соответствовать следующим критериям:

- содержать достаточный объем данных для полногеномного исследования

- покрывать большое количество разнообразных локусов на разных хромосомах и в разных областях каждой хромосомы

- быть достаточно дешевым, хорошо воспроизводимым и не требовать длительного времени на каждый эксперимент.

Помимо этого, важно не просто получить нужную информацию, но и оценить её достоверность. Таким образом, актуальным представляется создание такого «контрольного метода». В работе показано, что метод имеет и самостоятельную практическую ценность, в том числе за счет таких преимуществ, как удобство, простота и небольшая длительность выполнения эксперимента.

2.2. Цель и задачи исследования

Цель данной работы - разработка нового метода крупномасштабного поиска гипометилированных регуляторных участков в геномах эукариот nMETR (англ. non-Methylated Tag Recovery). При разработке метода основной упор делался на универсальность и наибольшее разнообразие покрываемых локусов человеческого генома.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

- получить с помощью nMETR пилотные клонотеки на основе геномной ДНК человека

- получить с помощью nMETR ампликоны, содержащие последовательности гипометилированных локусов генома

- осуществить биоинформатический анализ полученных последовательностей, а картировать местоположение обнаруженных гипометилированные последовательности в человеческом геноме

Помимо указанных задач, прямо следующих из цели исследования, в работу включена глава, посвященная экспериментальному анализу открытой рамки считывания d1orf72. Эта задача возникла в процессе анализа результатов одного из пилотных экспериментов и дополнительно иллюстрирует потенциал nMETR как источника новой информации.

2.3. Научная новизна и практическая значимость

Метод, разработанный в рамках данной работы является оригинальным, дешевым и быстрым спсобом поиска гипометилированных последовательностей в геномной ДНК любого эукариотического организма с CG-метилированием и мобильными элементами в геноме. Метод прост и универсален, он может служить для быстрого обнаружения эпигенетических маркеров одновременно для большого количества тканей и образцов, имеет большой потенциал использования для определения различий в метилировании геномов клеток в норме и при различных патологиях или использоваться в качестве контрольного.

В ходе выполнения работы получены 6589 нуклеотидных последовательности несущие информацию о 1113 локусах человеческого генома, из которых 711 (64%) из них находились в окрестности CpG-островков (200 п. о. ) . Данные результаты получены с помощью специализированной программы "PostParser", написанной в нашей лаборатории.

В процессе разработки nMETR автором было показано, что предсказанная ранее открытая рамка считывания белка c11orf72 специфична для генома человека и отсутствует в ДНК других высших приматов. Выявление и структурно-функциональный анализ подобных «новых» последовательностей генома человека представляется актуальной задачей. Также, впервые проведен системный анализ транскрипционной активности c11orf72 в различных тканях человека.

2.4. Научные публикации по итогам диссертационной работы

Научные результаты, полученные в ходе подготовки работы изложены в 4-х статьях в рецензируемых научных журналах и должены на 2-х конференциях.

2.4.1. Статьи по теме диссертации

1). Baskaev K. nMETR: technique for facile recovery of hypomethylation genomic tags. / K. Baskaev, A. Garazha, N. Gaifullin, M. V. Suntsova, A. A. Zabolotneva, A. A. Buzdin // Gene - 2012. - Т. 498 - № 1 - 75-80с.

2). Баскаев К. К. Эволюционно недавние группы генетических мобильных элементов в геноме человека / К. К. Баскаев, А. А. Буздин // Вавиловский журнал генетики и селекции -2011. - Т. 15 - № 2 - 313-322с.

3). Баскаев К. К. Эволюционно недавние вставки мобильных элементов и их вклад в структуру генома человека / К. К. Баскаев, А. А. Буздин // Журнал Общей Биологии - 2012. - Т. 73 - № 1 - 3-20с.

4). Баскаев К. К. Экспериментальный анализ специфичной для человека открытой рамки считывания c11orf72 / К. К. Баскаев, Р. В. Холоденко, Г. В. Малахова, Н. М. Гайфуллин, Е. В. Корзенева, М. В. Сунцова, А. А. Буздин // Биоорганическая Химия - 2013. - Т. 39 - № 2 -151-158с.

2.4.2. Тезисы научных конференций по теме диссертации

1). Баскаев К. К. , Буздин А. А. Новый метод широкомасштабного поиска гипометилированных последовательностей генома // Международная научная конференция по

биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященную 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова. Москва, 2009.

2). Баскаев К. К. , Буздин А. А. Новый метод широкомасштабного поиска гипометилированных последовательностей генома // Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины. Москва, 2010.

3. Обзор литературы. «Модифицированные основания в

ДНК»

В настоящем обзоре литературы рассматриваются природные химические модификации нуклеиновых кислот и их функциональная роль, с акцентом на новую информацию о модифицированных основаниях в геномной ДНК эукариот.

В ДНК различных организмов, как про-, так и эукариот, были обнаружены модифицированные и сверхмодифицированные основания, называемые минорными. Впервые присутствие модифицированного основания (5-метилцитозина) в бактериальном геноме было выявлено в 1925 году [10]. Позже, в конце 40-х - начале 50-х годов XX века, также было показано наличие 5-метилцитозина в геномной ДНК эукариотического организма [11]. Модификации, приводящие к образованию минорных оснований происходят энзиматически, то есть являются естественными для ДНК организма, в отличие от воздействия различных алкилирующих и гликозилирующих агентов. Заместители модифицированных оснований могут быть простыми, как например метильные или гидроксильные группы, а могут быть более крупными, как сахара [8].

Рисунок 1. 1) 5-метилцитозин, 2) №-метилцитозин и 3) №-метиладенин

Три вида оснований встречаются в живой природе наиболее часто: 5-метилцитозин, №-метиладенин и К4-метилцитозин (Рис. 1), которые образуются путем пострепликативной модификации ДНК ферментами ДНК-метилтрансферазами [12; 13], другие модифицированные основания могут включаться в ДНК как пострепликативно, так и корепликативно.

3.1. Модифицированные основания в ДНК бактерий и их

вирусов

Бактериальные эпигенетические системы, главным образом основаны на ДНК-белковом взаимодействии и обычно составлены из ДНК-метилазы и белка или белков, с сайтом связывания, перекрывающимся с таргетной последовательностью метилазы и блокирующими метилирование. Метилирование же данной последовательности, в свою очередь, может препятствовать связыванию белка с ДНК. Таким образом, последовательность ДНК, с которой связывается белок может находиться в одном из двух возможных состояниях: метилированном или неметилированном [14].

Тогда как наиболее распространенным модифицированным основанием в ДНК высших эукариот является 5-метилцитозин (5тС), в генетическом материале прокариот обнаруживается как 5тС, так и другие метилированные основания: К-4-метилцитозин (4тС) и К-6-метиладенин (К6Л). Ниже будут рассмотрены функции минорных оснований прокариот, дан краткий обзор минорных оснований в ДНК бактериофагов.

3.1.1. Модифицированные основания в ДНК бактерий.

В геноме Escherichia coli содержатся два метилированных основания: 5mC и N6A, составляя, соответственно, 1 и 2% от общего числа C и A. В ДНК прокариот модифицированные основания, как 5mC, так и N6A зачастую являются частью системы рестрикции-модификации, защищающей ДНК клетки-хозяина от ферментов, называемых эндонуклеазами рестрикции. Феномен рестрикции и модификации впервые был открыт в начале 1950-х. Было обнаружено, что некоторые штаммы бактерий ингибировали ("restrict", [15]) размножение вирусов, предварительно выращенных на других штаммах. Эффект был вызван эндонуклеазами, специфичными к определенной последовательности ДНК с образованием нескольких дискретных фрагментов ДНК после гидролиза [16]. К настоящему моменту известно, что эндонуклеазы рестрикции широко распространены среди прокариот [17], кроме того, эти ферменты нашли чрезвычайно широкое применение в генной инженерии и ДНК-диагностике [ 18].

Системы рестрикции-модификации совмещают активности эндодезоксирибонуклеазы (ENase) и ДНК-метилтрансферазы (MTase). Ферменты взаимодействуют со специфичными последовательностями ДНК, обычно насчитывающими от четырех до восьми нуклеотидов. Эти

последовательности могут быть непрерывными или прерываться, симметричными или асимметричными, уникальными или вырожденными. Обычно ферменты РМ-систем узнают двуцепочечную ДНК. Модификации, катализируемые метилтрансферазами, представляют собой присоединение метильных групп к одному нуклеотиду каждой цепи в узнаваемой последовательности [19]. Метилтрансферазы, метилирующие цитозин в положение C5 называются эндоциклическими, в отличие от метилтрансфераз экзоциклических, метилирующих аденин и цитозин в положениях N6 и N4 соответственно [20]. В качестве донора метильных групп и необходимого кофактора служит S-аденозил-метионин.

Первоначально системы рестрикции/модификации относили к одному из трёх классических типов - I, II или III. В первом и третьем типе метилазная и эндонуклеазная активность совмещена в одной полипептидной цепи, а во втором - метилаза и эндонуклеаза -это два разных полипептида. Эндонуклеазы III типа расщепляют ДНК на удалении от сайта метилирования, а эндонуклеазы типов I и II, наоборот, расщепляют ее в окрестности сайта метилирования. Затем, в 2000 году основы номенклатуры РМ-систем были пересмотрены, и был выделен IV тип систем РМ, эндонуклеазы которого расщепляют модифицированные (метилированные, гидроксиметилированные и глюкозил-гидроксиметилированные основания) [17].

Любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку потенциально опасна и полностью расщепляется, если только не защищена (см. раздел «Модифицированные основания в ДНК бактериофагов») или не происходит из бактериальной клетки, имеющей аналогичную РМ-систему. Потому активность эндонуклеаз рестрикции выше, чем соответствующих им метилаз. Однако, расщепление неметилированной ДНК - это потенциально смертельное для бактериальной клетки событие, потому в целях его предотвращения используются различные системы регуляции, так или иначе «задерживающие» появление в цитоплазме эндонуклеазной активности. Подробное рассмотрение данных механизмов выходит за рамки данного обзора, более детальное их описание можно найти в работе [14].

Метилирование бактериальной ДНК не исчерпывается только метилазами систем рестрикции-модификации. Так, помимо метилтрансфераз, участвующих в системе рестрикции-модификации существуют и т. н. «одиночные» или «орфанные» («orphan») метилтрансферазы, по всей видимости, ведущие своё происхождение от ферментов систем рестрикции-модификации (РМ), но не имеют «парного» фермента-эндонуклеазы. Эти ферменты называются Dam, Dcm и CcrM, метилирование которых может происходить как в контексте, так и вне контекста РМ. Dam и Dcm метилируют, соответственно, аденин в последовательностях 5'-GATC-3' и второго цитозина в последовательностях 5'-CCWGG-3', где W - A или T, а CcrM 5'-GANTC-3', где N - любой нуклеотид [14]. Следует упомянуть, что Dam-метилирование

встречаются преимущественно у гамма-протеобактерий и у некоторых археобактерий, тогда как CcrM распространена среди альфа-протеобактерий [21; 22].

Dam-метилаза E. coli участвует во множестве клеточных процессов - от мистмэтч репарации до экспрессии генов и контроля сегрегации бактериальных хромосом. Аналоги Dam обнаружены в Salmonella spp. [23], Haemophilus influenza [24] и других грамотрицательных бактериях. Dam-метилаза весьма процессивна, так, в клетках кишечной палочки находится всего по нескольку молекул этого фермента, тогда как в геномной ДНК обнаруживается примерно 19000 последовательностей GATC последовательностей [25].

Метилирование аденина напрямую влияет на связывание определенных белков с ДНК. Так, рестриктаза DpnI расщепляет последовательность 5'-GATC-3' только в том случае, если аденин в составе данного тетрануклеотида метилирован, но не расщепляет неметилированные последовательности, тогда как MboI связывается и расщепляет ту же последовательность только тогда, когда аденин в ее составе неметилирован [26]. Предполагается, что отсутствие водородной связи между метилированным аденином и тимином позволяет различать метилированные и неметилированные последовательности (метилированные последовательности более лабильны, кроме того, метильная группа оказывается в большой бороздке ДНК и создавать стерические затруднения для связывания белков) как это, например, показано для рестриктазы EcoRV, которая расщепляет неметилированную последовательность 5'-GATATC-3', но не расщепляет эту же последовательность с двумя метилированными аденинами [27]. Другим примером подобного специфичного связывания является компонент системы мистмэтч-репарации MutH, расщепляющий неметилированную дочернюю цепь в гемиметилированной последовательности GATC и сама Dam-метилаза, которая с равной эффективностью связывает как неметилированную, так и гемиметилированную цепь, но быстро диссоциирует, если таргетная последовательность полностью метилирована [26].

Обычно последовательность 5' -GATC-3' метилирована в обеих цепях, а гемиметелированное состояние возникает только в реплицируемой ДНК и существует от половины до трех минут при выращивании кишечной палочки при 30° C. Таким образом, только что синтезированная цепь может узнаваться белками системы репарации, так как аденины в ее составе не являются метилированными. Если же дочерняя цепь метилирована, то она уже не является субстратом белков системы репарации и ошибки в ее составе не исправляются. Таким образом, метилирование аденина в составе последовательности 5'-GATC-3'достаточно для пострепликативной мистмэтч-репарации. Гемиметилированный дуплекс расщепляется компонентом системы репарации MutH, при этом разрывается связь в неметилированной ДНК между гуанином и аденином, после чего образуется одноцепочечная брешь, могущая достигать размера 1 т. п. о. Затем полимераза заполняет разрыв и дуплекс ДНК восстанавливается [28]. В

отсутствии Dam фермент MutH не может отличить материнскую цепь от дочерней и с равной вероятностью расщепляет одну из двух цепей, что может приводить к закреплению мистмэтчей в качестве мутаций при внесении изменений в материнскую цепь [29].

Экспрессия некоторых генов кишечной палочки, а также инсерции ее вирусов и траспозонов зависят от метилирования аденина в составе сайтов Dam-метилазы. Например, штаммы, мутантные по dam гену показывают увеличение частоты инсерций TnlD в 10-20 раз, а ISlO в 100 раз, а частоту делеций и других геномных перестроек, связанных с TnlO, в 200 раз или больше. Помимо этого, гемиметилированные GATC-сайты используются транспозонами для контроля количества инсерций последовательностей IS3, IS 10, IS50 и IS903 и бактериальных траспозонов Tn5, Tn10 и Tn 903 [30-32]. Примером может служить регуляция транспозиции IS 10: в первом случае GATC-сайт расположен внутри -10 модуля промотора гена транспозазы. Полное метилирование этого сайта затрудняет связывание РНК-полимеразы с промотором и уменьшает транскрипцию tpn. Второй аналогичный сайт находится около внутреннего конца IS 10 и его полное метилирование полностью блокирует связывание транспозазы. Следует заметить, что IS 10, метилированный по значащей цепи в примерно 330 раз более активен, чем метилированный по незначащей и примерно в 1000 раз более активен, чем полностью метилированный IS 10-элемент. Данный механизм оставляет мобильным элементам бактерий только небольшой на транспозицию между репликацией и полным метилированием геномной ДНК [33].

Многие промоторы, содержащие сайты метилирования Dam в области -10 или -35, показывают различия в экспрессии в штаммах, мутантных по гену dam. Так, уровень 3-галактозидазы, при экспрессии фьюжна генов glnS-lacZ в три раза выше в мутантах dam' в сравнении с диким типом. Напротив, экспрессия гена dnaA уменьшается в штаммах, содержащих мутацию dam [34].

Несмотря на почти полное метилирование Dam своих сайтов-мишеней, существуют и важные исключения: (i) в точке начала репликации E. coli oriC, (ii) в промоторе гена dnaA, (iii) возможно, дополнительные сайты, с которыми связывается белок SeqA, имеющий сродство к кластерам двух или более гемиметилированных GATC, расположенных на расстоянии одного-двух витков спирали ДНК [35]. OriC содержит кластер из 13 сайтов Dam-метилазы, которые после присоединения SeqA блокируются им и остаются в гемиметилированном состоянии, кроме того SeqA предотвращает связывание с точкой начала репликации белка DnaA (контролирует инициацию репликации). Существуют предположения, что тетрамеры SeqA, связывающиеся с другими GATC-сайтами может служить в качестве организатора своего рода хромосомных доменов [36]. Механизм сегрегации реплицированных бактериальных хромосом включает присоединение последовательности начала репликации к клеточной оболочке и

последующему росту мембраны между сайтами присоединения. Используя измерения in vitro было показано, что гемиметилированный oriC, содержащий 11 сайтов метилирования GATC, связывается с мембраной E. Coil, однако ни полностью метилированные, ни полностью деметилированные сайты начала репликации с мембраной не связываются [37]. Таким образом гемиметилированная последовательность oriC функционирует аналогично центромере, а Dam-метилирование регулирует событие, происходящее один раз за клеточное поколение.

Некоторые неметилированные GATC-сайты стабильно передаются по наследству в различных клеточных поколениях. Данный феномен был обозначен как «паттерны метилирования» и впервые был обнаружен у патогенных штаммов кишечной палочки, вызывающих пиелонефрит в опероне, кодирующем белки Pap-пиля (pyelonephritis-associated pilus или pap). Соответствующий сайт, проксимальный по отношению к промотору pap метилирован в случае фенотипа E. Coil, связанного с уропатогенностью (uropathogenic Escherichia coli, UPEC), и неметилирован, если бактерия патогенности не проявляет [38]. Неметилированные GATC-сайты зачастую находятся в составе регуляторных последовательностей, связывающих, к примеру, cAMP-CAP (белок-активатор катаболизма в комплексе с циклическим AMP) и других регуляторных факторов, и, таким образом, стимулироваться факторами внешней среды. Так, GATC-сайт, расположенный в регуляторной области оперона car, контролирующей синтез карбамоилфосфатсинтетазы, защищен от Dam-метилирования. Данный оперон отвечает за анаболизм аргинина и пиримидина, и, как оказалось, метилирование указанного сайта связано с недостатком пиримидина. Кроме того, обнаружено, что факторы CarP и IHF действительно связываются с регуляторной областью carAB и защищают соответствующий GATC-сайт от метилирвания. Другим примером является последовательность GATC, находящаяся в позиции -102 по отношению к точке начала транскрипции гена flhD оперонаflh (данный оперон отвечает за синтез бактериального жгутика). Белковым фактором, защищающим указанный GATC от метилирования является CAP [39; 40].

Орфанная метилаза CcrM изначально была обнаружена в Caulobacter crescentus и играет важную роль в регуляции клеточного цикла этой бактерии [41]. CcrM обладает высокой специфичностью по отношению к гемиметилированной ДНК и обладает высокой процессивностью [42]. Caulobacter crescentus является бактерией с двумя разными видами клеток: в результате ассиметричного деления образуются «членистые» («stalked») и «роящиеся» («swarmer») клетки, которые не способны делиться. Для прохождение клеточного деления «роящиеся» клетки дифференцируются в «членистые», при этом важным условием репликации бактериальной хромосомы и деления является полное метилирование сайтов 5'-GANTC-3' вблизи точки начала репликации Caulobacter (Cori) [43].

Значение Dcm-метилирования (несмотря на то, что оно было открыто в начале 70-х годов прошлого века [44]) остается не до конца проясненным. Как уже было упомянуто выше, Dcm присоединяет метильную группу ко второму цитозину последовательности 5'-CCWGG-3', метилирование различных участков геномной ДНК E. coli является консервативным.

Высокоэффективная жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией показала, что в геномной ДНК 162 штаммов кишечной палочки метилировано от 0,86 до 1,3% всего цитозина. Предполагается, что метилирование цитозина в кишечной палочки может влиять на транскрипцию [45]. Данная точка зрения подтверждается и другими известными фактами. Так, ген lexA, имеющий жизненно важное значение для кишечной палочки и принимающий участие в ответе на повреждение ДНК, содержит в составе своего промотора сайт узнавания Dcm, однако же изменение уровня экспрессии гена lexA при изменении количества Dcm-метилазы в клетке не показано [46]. Это и подобные наблюдения были проверены путем анализа 1864 промоторов в полностью секвенированном геноме штамма E. coli K-12 MG1655, во многих случаях они оказались ассоциированы с последовательностью 5-'CCWGG-3'. При этом почти 200 промоторов несли в своем составе один сайт узнавания Dcm, семнадцать - две таких последовательности, а два - три последовательности, причём распределение сайтов узнавания отличалось от случайного. Промоторы, в которых находились последовательности, чаще всего относились к генам, ответственным за клеточный транспорт и метаболизм аминокислот, трансляцию и транскрипцию. Помимо этого, авторами было показано, что в стационарной фазе транскрипция генов рибосомальных субъединиц rplC и rpsJ снижается в присутствии Dcm, а в их составе наличествуют сразу три последовательности, являющиеся сайтами метилирования указанной метилазы. Со ссылкой на неопубликованные данные, авторы [45] заявляют об усилении транскрипции данных генов в присутствии ингибитора метилирования 5-азацитидина. Таким образом, можно считать, что Dcm-метилирование цитозина служит для «тонкой настройки» синтеза белка в стационарной фазе роста.

Наличие гена dcm не является жизненно необходимым: штаммы E. coli с делетированным, иным образом поврежденным или полностью удаленным dcm, жизнеспособны, как, например, штамм E. coli B, который используется для изучения некоторых нечетных фагов [47]. Некоторые сайты узнавания Dcm-метилазы остаются неметилированными даже в dcm+ штаммах кишечной палочки, что может быть связанно с особенностями топологии ДНК в этих областях. 5'-метилцитозин имеет тенденцию спонтанно дезаминироваться до тимина. Потому положение гена dcm, в составе оперона с геном vsr, продукт которого необходим для репарации T-G мистмэтчей, уравновешивает мутагенный потенциал 5mC. Ген vsr лежит ниже гена dcm и имеет с ним общие 7 кодонов. Есть основания полагать, что Dcm

необходим для удаления таких мистмэтчей, но в литературе пока не предложено механизмов их взаимодействия (название гена vsr и соответствующего продукта Vcr является аббревиатурой, расшифровывающейся как «мистмэтч-репарация коротких фрагментов» или «very short patch repair»). Последовательности, которые метилирует Dcm, являются «горячими точками мутагенеза» [48]. Показано, что потеря плазмиды с геном метилтрансферазы и соответствующей ей рестриктазы EcoRII чаще происходит в штаммах dcm+, чем в dcm- [49].

Кроме 5mC в генетическом материале прокариот обнаруживается №-метилцитозин (m4C). В отличие от 5mC, 4mC не подвергается спонтанному дезаминированию, что может объяснять его преимущественное присутствие в геноме термофильных бактерий [12]. N4-метилцитозин обнаружен только у прокариот [9], где, как и 5-метилцитозин, является компонентом системы рестрикции-модификации [50; 51].

3.1.2. Модифицированные основания в ДНК бактериофагов

Рассматривая модифицированные основания, включенные в ДНК вириусов, следует отметить тот факт, что первое сверхмодифицированное основание ДНК, 5-гидроксиметилцитозин (hmC), было обнаружено в ДНК бактериофага [52].

На протяжении длительного времени считалось, что бактерии и их бактериофаги коэволюционировали, осуществляя своего рода «гонку вооружений» [53]. Примером такой коэволюции может служить противостояние фагов и защитных механизмов клетки-хозяина. «Исключение» фагов (phage exclusion) может происходить различными путями, в том числе с помощью механизма рестрикции-модификации, позволяющем деградировать фаговую ДНК и не требующим смерти бактериальной клекти [17]. Чтобы избежать воздействия системы рестрикции-модификации Т-четные фаги Myoviridae защищают свою ДНК с помощью различных модификаций. Генетический материал данных фагов может содержит метилированный аденин, а цитозин полностью замещается на гидроксиметилцитозин (hmC), который, в свою очередь, может подвергаться дальнейшей модификации с образованием глюкозилированного гидроксиметилцитозина (glc-hmC) [54]. Тем не менее, в штамме E. coli CT596 были обнаружены гены gmrS и gmrD, продукты которых GmrS (36 kDa) и GmrD (27 KDa), образуют комплекс GMR, являющийся эндонуклеазой IV типа, специфично расщепляющую ДНК различных фагов (T4, T2, T6), содержащую глюкозилированный гидроксиметилцитозин. Показано, что GMR деградирует как a-glu-HMC T4, так и P-glu-HMC, содержащиеся в ДНК фага T4 с образованием фрагментов около 4 т. п. о. При этом деградации генетического материала, содержащего немодифицированный цитозин или

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Баскаев Константин Константинович, 2015 год

7. Список литературы

1. Lander E. S., Linton L. M. M., Birren B., Nusbaum C., Zody M. C. C., Baldwin J., Devon K., Dewar K., Doyle M., FitzHugh W., others, Funke R., Gage D., Harris K., Heaford A., Howland J., Kann L., Lehoczky J., LeVine R., McEwan P., McKernan K., Meldrim J., Mesirov J. P., Miranda C., Morris W., Naylor J., Raymond C., Rosetti M., Santos R., Sheridan A., Sougnez C., Stange-Thomann N., Stojanovic N., Subramanian A., Wyman D., Rogers J., Sulston J., Ainscough R., Beck S., Bentley D., Burton J., Clee C., Carter N., Coulson A., Deadman R., Deloukas P., Dunham A., Dunham I., Durbin R., French L., Grafham D., Gregory S., Hubbard T., Humphray S., Hunt A., Jones M., Lloyd

C., McMurray A., Matthews L., Mercer S., Milne S., Mullikin J. C., Mungall A., Plumb R., Ross M., Shownkeen R., Sims S., Waterston R. H., Wilson R. K., Hillier L. W., McPherson J. D., Marra M. A., Mardis E. R., Fulton L. A., Chinwalla A. T., Pepin K. H., Gish W. R., Chissoe S. L., Wendl M. C., Delehaunty K. D., Miner T. L., Delehaunty A., Kramer J. B., Cook L. L., Fulton R. S., Johnson D. L., Minx P. J., Clifton S. W., Hawkins T., Branscomb E., Predki P., Richardson P., Wenning S., Slezak T., Doggett N., Cheng J. F., Olsen A., Lucas S., Elkin C., Uberbacher E., Frazier M., Gibbs R. A., Muzny

D. M., Scherer S. E., Bouck J. B., Sodergren E. J., Worley K. C., Rives C. M., Gorrell J. H., Metzker M. L., Naylor S. L., Kucherlapati R. S., Nelson D. L., Weinstock G. M., Sakaki Y., Fujiyama A., Hattori M., Yada T., Toyoda A., Itoh T., Kawagoe C., Watanabe H., Totoki Y., Taylor T., Weissenbach J., Heilig R., Saurin W., Artiguenave F., Brottier P., Bruls T., Pelletier E., Robert C., Wincker P., Smith D. R., Doucette-Stamm L., Rubenfield M., Weinstock K., Lee H. M., Dubois J., Rosenthal A., Platzer M., Nyakatura G., Taudien S., Rump A., Yang H., Yu J., Wang J., Huang G., Gu J., Hood L., Rowen L., Madan A., Qin S., Davis R. W., Federspiel N. A., Abola A. P., Proctor M. J., Myers R. M., Schmutz J., Dickson M., Grimwood J., Cox D. R., Olson M. V., Kaul R., Shimizu N., Kawasaki K., Minoshima S., Evans G. A., Athanasiou M., Schultz R., Roe B. A., Chen F., Pan H., Ramser J., Lehrach H., Reinhardt R., McCombie W. R., de la Bastide M., Dedhia N., Blocker H., Hornischer K., Nordsiek G., Agarwala R., Aravind L., Bailey J. A., Bateman A., Batzoglou S., Birney

E., Bork P., Brown D. G., Burge C. B., Cerutti L., Chen H. C., Church D., Clamp M., Copley R. R., Doerks T., Eddy S. R., Eichler E. E., Furey T. S., Galagan J., Gilbert J. G., Harmon C., Hayashizaki Y., Haussler D., Hermjakob H., Hokamp K., Jang W., Johnson L. S., Jones T. A., Kasif S., Kaspryzk A., Kennedy S., Kent W. J., Kitts P., Koonin E. V., Korf I., Kulp D., Lancet D., Lowe T. M., McLysaght A., Mikkelsen T., Moran J. V., Mulder N., Pollara V. J., Ponting C. P., Schuler G., Schultz J., Slater G., Smit A. F., Stupka E., Szustakowski J., Thierry-Mieg D., Thierry-Mieg J., Wagner L., Wallis J., Wheeler R., Williams A., Wolf Y. I., Wolfe K. H., Yang S. P., Yeh R. F., Collins F., Guyer M. S., Peterson J., Felsenfeld A., Wetterstrand K. A., Patrinos A., Morgan M. J., de Jong P., Catanese J. J., Osoegawa K., Shizuya H., Choi S., Chen Y. J. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. - 2001. - T. 409. - C. 860-921.

2. Venter J. C., Adams M. D., Myers E. W., Li P. W., Mural R. J., Sutton G. G., Smith H. O., Yandell M., Evans C. A., Holt R. A., Gocayne J. D., Amanatides P., Ballew R. M., Huson D. H., Wortman J. R., Zhang Q., Kodira C. D., Zheng X. H., Chen L., Skupski M., Subramanian G., Thomas P. D., Zhang J., Gabor Miklos G. L., Nelson C., Broder S., Clark A. G., Nadeau J., McKusick V. A., Zinder N., Levine A. J., Roberts R. J., Simon M., Slayman C., Hunkapiller M., Bolanos R., Delcher A., Dew I., Fasulo D., Flanigan M., Florea L., Halpern A., Hannenhalli S., Kravitz S., Levy S., Mobarry C., Reinert K., Remington K., Abu-Threideh J., Beasley E., Biddick K., Bonazzi V., Brandon R., Cargill M., Chandramouliswaran I., Charlab R., Chaturvedi K., Deng Z., Di Francesco V., Dunn P., Eilbeck K., Evangelista C., Gabrielian A. E., Gan W., Ge W., Gong F., Gu Z., Guan P., Heiman T. J., Higgins M. E., Ji R. R., Ke Z., Ketchum K. A., Lai Z., Lei Y., Li Z., Li J., Liang Y., Lin X., Lu F., Merkulov G. V., Milshina N., Moore H. M., Naik A. K., Narayan V. A., Neelam B., Nusskern D., Rusch D. B., Salzberg S., Shao W., Shue B., Sun J., Wang Z., Wang A., Wang X., Wang J., Wei M., Wides R., Xiao C., Yan C., Yao A., Ye J., Zhan M., Zhang W., Zhang H., Zhao Q., Zheng L., Zhong

F., Zhong W., Zhu S., Zhao S., Gilbert D., Baumhueter S., Spier G., Carter C., Cravchik A., Woodage

T., Ali F., An H., Awe A., Baldwin D., Baden H., Barnstead M., Barrow I., Beeson K., Busam D., Carver A., Center A., Cheng M. L., Curry L., Danaher S., Davenport L., Desilets R., Dietz S., Dodson K., Doup L., Ferriera S., Garg N., Gluecksmann A., Hart B., Haynes J., Haynes C., Heiner C., Hladun S., Hostin D., Houck J., Howland T., Ibegwam C., Johnson J., Kalush F., Kline L., Koduru S., Love A., Mann F., May D., McCawley S., McIntosh T., McMullen I., Moy M., Moy L., Murphy B., Nelson K., Pfannkoch C., Pratts E., Puri V., Qureshi H., Reardon M., Rodriguez R., Rogers Y. H., Romblad

D., Ruhfel B., Scott R., Sitter C., Smallwood M., Stewart E., Strong R., Suh E., Thomas R., Tint N. N., Tse S., Vech C., Wang G., Wetter J., Williams S., Williams M., Windsor S., Winn-Deen E., Wolfe K., Zaveri J., Zaveri K., Abril J. F., Guigo R., Campbell M. J., Sjolander K. V., Karlak B., Kejariwal A., Mi H., Lazareva B., Hatton T., Narechania A., Diemer K., Muruganujan A., Guo N., Sato S., Bafna V., Istrail S., Lippert R., Schwartz R., Walenz B., Yooseph S., Allen D., Basu A., Baxendale J., Blick L., Caminha M., Carnes-Stine J., Caulk P., Chiang Y. H., Coyne M., Dahlke C., Mays A., Dombroski M., Donnelly M., Ely D., Esparham S., Fosler C., Gire H., Glanowski S., Glasser K., Glodek A., Gorokhov M., Graham K., Gropman B., Harris M., Heil J., Henderson S., Hoover J., Jennings D., Jordan C., Jordan J., Kasha J., Kagan L., Kraft C., Levitsky A., Lewis M., Liu X., Lopez J., Ma D., Majoros W., McDaniel J., Murphy S., Newman M., Nguyen T., Nguyen N., Nodell M., Pan S., Peck J., Peterson M., Rowe W., Sanders R., Scott J., Simpson M., Smith T., Sprague A., Stockwell T., Turner R., Venter

E., Wang M., Wen M., Wu D., Wu M., Xia A., Zandieh A., Zhu X. The sequence of the human genome // Science. - 2001. - T. 291. - C. 1304-1351.

3. Schuster S. C. Next-generation sequencing transforms today's biology // Nature methods. -2008. - T. 5. - C. 16-18.

4. Novik K. L., Nimmrich I., Genc B., Maier S., Piepenbrock C., Olek A., Beck S. Epigenomics: genome-wide study of methylation phenomena // Current issues in molecular biology. -2002. - T. 4. - C. 111-128.

5. Wu C., Morris J. R. Genes, genetics, and epigenetics: a correspondence // Science. - 2001.

- T. 293. - C. 1103-1105.

6. Bernstein B. E., Meissner A., Lander E. S. The mammalian epigenome // Cell. - 2007. - T. 128. - C. 669-681.

7. Strahl B. D., Allis C. D. The language of covalent histone modifications // Nature. - 2000.

- T. 403. - C. 41-45.

8. Gommers-Ampt J. H., Borst P. Hypermodified bases in DNA // The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 1995. - T. 9.

- C. 1034-1042.

9. Iyer L. M., Abhiman S., Aravind L. Natural history of eukaryotic DNA methylation systems // Progress in molecular biology and translational science. - 2011. - T. 101. - C. 25-104.

10. Johnson T. B., Coghill R. D. Researches on Pyrimidines. C111. The Discovery of 5-methyl-cytosine in Tuberculinic acid, the Nucleic Acid of the Tubercle Bacillus. // Journal of American Chemical Society. - 1925. - T. 47. - C. 2838-2844.

11. Hotchkiss R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography // The Journal of biological chemistry. - 1948. - T. 175. - C. 315-332.

12. Ehrlich M., Gama-Sosa M. A., Carreira L. H., Ljungdahl L. G., Kuo K. C., Gehrke C. W. DNA methylation in thermophilic bacteria: N4-methylcytosine, 5-methylcytosine, and N6-methyladenine // Nucleic acids research. - 1985. - T. 13. - C. 1399-1412.

13. Doskocil J., Sormova Z. The Occurrence of 5-Methylcytosine in Bacterial Deoxyribonucleic Acids // Biochimica et biophysica acta. - 1965. - T. 95. - C. 513-515.

14. Casadesus J., Low D. Epigenetic gene regulation in the bacterial world // Microbiol Mol Biol Rev. - 2006. - T. 70. - C. 830-856.

15. Kelly Jr. T. J., Smith H. O. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. II // Journal of molecular biology. - 1970. - T. 51. - C. 393-409.

16. Smith H. O. Nucleotide sequence specificity of restriction endonucleases // Science. -1979. - T. 205. - C. 455-462.

17. Roberts R. J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences // Gene. - 1978. - T. 4. - C. 183-194.

18. Nathans D., Smith H. O. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of dna molecules // Annual review of biochemistry. - 1975. - T. 44. - C. 273-293.

19. Пахомова М. В. №-диметиламинопурин в ДНК некоторых видов водорослей // Доклады Академии Наук СССР. - 1974. - T. 214. - C. 1202-1205.

20. Bheemanaik S., Reddy Y. V., Rao D. N. Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases // The Biochemical journal. - 2006. - T. 399. - C. 177-190.

21. Lodwick D., Ross H. N., Harris J. E., Almond J. W., Grant W. D. dam methylation in the archaebacteria // Journal of general microbiology. - 1986. - T. 132. - C. 3055-3059.

22. Barbeyron T., Kean K., Forterre P. DNA adenine methylation of GATC sequences appeared recently in the Escherichia coli lineage // Journal of bacteriology. - 1984. - T. 160. - C. 586590.

23. Torreblanca J., Casadesus J. DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium and a novel dam-regulated locus // Genetics. - 1996. - T. 144. - C. 15-26.

24. Piekarowicz A., Bujnicki J. Cloning of the Dam methyltransferase gene from Haemophilus influenzae bacteriophage HP1 // Acta Microbiol Pol. - 1999. - T. 48. - C. 123-129.

25. Barras F., Marinus M. G. The great GATC: DNA methylation in E. coli // Trends in genetics : TIG. - 1989. - T. 5. - C. 139-143.

26. Youderian P., Vershon A., Bouvier S., Sauer R. T., Susskind M. M. Changing the DNA-binding specificity of a repressor // Cell. - 1983. - T. 35. - C. 777-783.

27. Zahran M., Daidone I., Smith J. C., Imhof P. Mechanism of DNA recognition by the restriction enzyme EcoRV // Journal of molecular biology. - 2010. - T. 401. - C. 415-432.

28. Kunkel T. A., Erie D. A. DNA mismatch repair // Annual review of biochemistry. - 2005. - T. 74. - C. 681-710.

29. Marinus M. G. Methylation of DNA // Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology / Neidhardt F. C. и др. - Washington DC: ASM, 1996. - C. 782-791.

30. Dodson K. W., Berg D. E. Factors affecting transposition activity of IS50 and Tn5 ends // Gene. - 1989. - T. 76. - C. 207-213.

31. Reznikoff W. S. The Tn5 transposon // Annual review of microbiology. - 1993. - T. 47. -C. 945-963.

32. Yin J. C., Krebs M. P., Reznikoff W. S. Effect of dam methylation on Tn5 transposition // Journal of molecular biology. - 1988. - T. 199. - C. 35-45.

33. Roberts D., Hoopes B. C., McClure W. R., Kleckner N. IS10 transposition is regulated by DNA adenine methylation // Cell. - 1985. - T. 43. - C. 117-130.

34. Plumbridge J., Soll D. The effect of dam methylation on the expression of glnS in E. coli // Biochimie. - 1987. - T. 69. - C. 539-541.

35. Correnti J., Munster V., Chan T., Woude M. Dam-dependent phase variation of Ag43 in Escherichia coli is altered in a seqA mutant // Molecular microbiology. - 2002. - T. 44. - C. 521-532.

36. Harel J., Daigle F., Forget C., Tessier M. C., Crost C., Martin C. Phase variation of F165(1) (Prs-like) fimbriae from Escherichia coli causing septicaemia in animals // Can J Microbiol. -2000. - T. 46. - C. 1101-1107.

37. Ogden G. B., Pratt M. J., Schaechter M. The replicative origin of the E. coli chromosome binds to cell membranes only when hemimethylated // Cell. - 1988. - T. 54. - C. 127-135.

38. Blyn L. B., Braaten B. A., Low D. A. Regulation of pap pilin phase variation by a mechanism involving differential dam methylation states // The EMBO journal. - 1990. - T. 9. - C. 4045-4054.

39. Charlier D., Gigot D., Huysveld N., Roovers M., Pierard A., Glansdorff N. Pyrimidine regulation of the Escherichia coli and Salmonella typhimurium carAB operons: CarP and integration host factor (IHF) modulate the methylation status of a GATC site present in the control region // Journal of molecular biology. - 1995. - T. 250. - C. 383-391.

40. Wang M. X., Church G. M. A whole genome approach to in vivo DNA-protein interactions in E. coli // Nature. - 1992. - T. 360. - C. 606-610.

41. Zweiger G., Marczynski G., Shapiro L. A Caulobacter DNA methyltransferase that functions only in the predivisional cell // Journal of molecular biology. - 1994. - T. 235. - C. 472-485.

42. Berdis A. J., Lee I., Coward J. K., Stephens C., Wright R., Shapiro L., Benkovic S. J. A cell cycle-regulated adenine DNA methyltransferase from Caulobacter crescentus processively methylates GANTC sites on hemimethylated DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1998. - T. 95. - C. 2874-2879.

43. Marczynski G. T., Shapiro L. Control of chromosome replication in caulobacter crescentus // Annual review of microbiology. - 2002. - T. 56. - C. 625-656.

44. Marinus M. G., Morris N. R. Isolation of deoxyribonucleic acid methylase mutants of Escherichia coli K-12 // Journal of bacteriology. - 1973. - T. 114. - C. 1143-1150.

45. Militello K. T., Simon R. D., Qureshi M., Maines R., VanHorne M. L., Hennick S. M., Jayakar S. K., Pounder S. Conservation of Dcm-mediated cytosine DNA methylation in Escherichia coli // FEMS Microbiol Lett. - 2012. - T. 328. - C. 78-85.

46. Palmer B. R., Marinus M. G. The dam and dcm strains of Escherichia coli--a review // Gene. - 1994. - T. 143. - C. 1-12.

47. Daegelen P., Studier F. W., Lenski R. E., Cure S., Kim J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3) // Journal of molecular biology. - 2009. - T. 394. - C. 634-643.

48. Lieb M., Bhagwat A. S. Very short patch repair: reducing the cost of cytosine methylation // Molecular microbiology. - 1996. - T. 20. - C. 467-473.

49. Takahashi N., Naito Y., Handa N., Kobayashi I. A DNA methyltransferase can protect the genome from postdisturbance attack by a restriction-modification gene complex // Journal of bacteriology. - 2002. - T. 184. - C. 6100-6108.

50. Janulaitis A., Klimasauskas S., Petrusyte M., Butkus V. Cytosine modification in DNA by Bcnl methylase yields N4-methylcytosine // FEBS letters. - 1983. - T. 161. - C. 131-134.

51. Adams G. M., Blumenthal R. M. The PvulI DNA (cytosine-N4)-methyltransferase comprises two trypsin-defined domains, each of which binds a molecule of S-adenosyl-L-methionine // Biochemistry. - 1997. - T. 36. - C. 8284-8292.

52. Wyatt G. R., Cohen S. S. The bases of the nucleic acids of some bacterial and animal viruses: the occurrence of 5-hydroxymethylcytosine // The Biochemical journal. - 1953. - T. 55. - C. 774-782.

53. Rocha E. P., Danchin A., Viari A. Evolutionary role of restriction/modification systems as revealed by comparative genome analysis // Genome Res. - 2001. - T. 11. - C. 946-958.

54. Carlson K., Hattman S., Raleigh E. A. Restriction and Modification // Molcular Biology of bacteriophage T4 / K. C. - Washington, D. C.: Cold Spring Harbor Library Press, American Society for Molecular Biology, DC, 1994. - C. 369-381.

55. Bair C. L., Black L. W. A type IV modification dependent restriction nuclease that targets glucosylated hydroxymethyl cytosine modified DNAs // Journal of molecular biology. - 2007. - T. 366. - C. 768-778.

56. Swinton D., Hattman S., Crain P. F., Cheng C. S., Smith D. L., McCloskey J. A. Purification and characterization of the unusual deoxynucleoside, alpha-N-(9-beta-D-2'-deoxyribofuranosylpurin-6-yl)glycinamide, specified by the phage Mu modification function // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1983. - T. 80. -C. 7400-7404.

57. Toussaint A. The DNA modification function of temperate phage Mu-1 // Virology. -1976. - T. 70. - C. 17-27.

58. Ehrlich M., Ehrlich K. C. A novel, highly modified, bacteriophage DNA in which thymine is partly replaced by a phosphoglucuronate moiety covalently bound to 5-(4',5'-dihydroxypentyl)uracil // The Journal of biological chemistry. - 1981. - T. 256. - C. 9966-9972.

59. Lehman I. R., Pratt E. A. On the structure of the glucosylated hydroxymethylcytosine nucleotides of coliphages T2, T4, and T6 // The Journal of biological chemistry. - 1960. - T. 235. - C. 3254-3259.

60. Hemphill H. E., Whiteley H. R. Bacteriophages of Bacillus subtilis // Bacteriological reviews. - 1975. - T. 39. - C. 257-315.

61. Huang L. H., Farnet C. M., Ehrlich K. C., Ehrlich M. Digestion of highly modified bacteriophage DNA by restriction endonucleases // Nucleic acids research. - 1982. - T. 10. - C. 15791591.

62. Revel H. R., Luria S. E. DNA-glucosylation in T-even phage: genetic determination and role in phagehost interaction // Annual review of genetics. - 1970. - T. 4. - C. 177-192.

63. Warren R. A. Modified bases in bacteriophage DNAs // Annual review of microbiology. -1980. - T. 34. - C. 137-158.

64. Scraba D. G., Bradley R. D., Leyritz-Wills M., Warren R. A. Bacteriophage phi W-14: the contribution of covalently bound putrescine to DNA packing in the phage head // Virology. - 1983. -T. 124. - C. 152-160.

65. Arnold H. P., Ziese U., Zillig W. SNDV, a novel virus of the extremely thermophilic and acidophilic archaeon Sulfolobus // Virology. - 2000. - T. 272. - C. 409-416.

66. Baranyi U., Klein R., Lubitz W., Kruger D. H., Witte A. The archaeal halophilic virus-encoded Dam-like methyltransferase M. phiCh1-I methylates adenine residues and complements dam mutants in the low salt environment of Escherichia coli // Molecular microbiology. - 2000. - T. 35. -C. 1168-1179.

67. Magrini V., Salmi D., Thomas D., Herbert S. K., Hartzell P. L., Youderian P. Temperate Myxococcus xanthus phage Mx8 encodes a DNA adenine methylase, Mox // Journal of bacteriology. -1997. - T. 179. - C. 4254-4263.

68. Balganesh T. S., Reiners L., Lauster R., Noyer-Weidner M., Wilke K., Trautner T. A. Construction and use of chimeric SPR/phi 3T DNA methyltransferases in the definition of sequence recognizing enzyme regions // The EMBO journal. - 1987. - T. 6. - C. 3543-3549.

69. Behrens B., Noyer-Weidner M., Pawlek B., Lauster R., Balganesh T. S., Trautner T. A. Organization of multispecific DNA methyltransferases encoded by temperate Bacillus subtilis phages // The EMBO journal. - 1987. - T. 6. - C. 1137-1142.

70. Wilke K., Rauhut E., Noyer-Weidner M., Lauster R., Pawlek B., Behrens B., Trautner T. A. Sequential order of target-recognizing domains in multispecific DNA-methyltransferases // The EMBO journal. - 1988. - T. 7. - C. 2601-2609.

71. Gowher H., Leismann O., Jeltsch A. DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine // The EMBO journal. - 2000. - T. 19. - C. 6918-6923.

72. Hung M. S., Karthikeyan N., Huang B., Koo H. C., Kiger J., Shen C. J. Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltransferases // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1999. - T. 96. - C. 11940-11945.

73. Tweedie S., Charlton J., Clark V., Bird A. Methylation of genomes and genes at the invertebrate-vertebrate boundary // Molecular and cellular biology. - 1997. - T. 17. - C. 1469-1475.

74. Eick D., Fritz H. J., Doerfler W. Quantitative determination of 5-methylcytosine in DNA by reverse-phase high-performance liquid chromatography // Analytical biochemistry. - 1983. - T. 135. - C. 165-171.

75. Santi D. V., Garrett C. E., Barr P. J. On the mechanism of inhibition of DNA-cytosine methyltransferases by cytosine analogs // Cell. - 1983. - T. 33. - C. 9-10.

76. Goll M. G., Bestor T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases // Annual review of biochemistry. - 2005. - T. 74. - C. 481-514.

77. Bird A. P. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes & development. -2002. - T. 16. - C. 6-21.

78. Clark S. J., Harrison J., Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells // Nature genetics. - 1995. - T. 10. - C. 20-27.

79. Lorincz M. C., Groudine M. C(m)C(a/t)GG methylation: a new epigenetic mark in mammalian DNA? // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2001. - T. 98. - C. 10034-10036.

80. Woodcock D. M., Lawler C. B., Linsenmeyer M. E., Doherty J. P., Warren W. D. Asymmetric methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human L1 retrotransposon // The Journal of biological chemistry. - 1997. - T. 272. - C. 7810-7816.

81. Haines T. R., Rodenhiser D. I., Ainsworth P. J. Allele-specific non-CpG methylation of the Nf1 gene during early mouse development // Developmental biology. - 2001. - T. 240. - C. 585598.

82. Ramsahoye B. H., Biniszkiewicz D., Lyko F., Clark V., Bird A. P., Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2000. - T. 97. -C. 5237-5242.

83. Li E., Bestor T. H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality // Cell. - 1992. - T. 69. - C. 915-926.

84. Jackson-Grusby L., Beard C., Possemato R., Tudor M., Fambrough D., Csankovszki G., Dausman J., Lee P., Wilson C., Lander E., Jaenisch R. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation // Nature genetics. - 2001. - T. 27. - C. 31-39.

85. Gardiner-Garden M., Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes // Journal of molecular biology. - 1987. - T. 196. - C. 261-282.

86. Takai D., Jones P. A. Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2002. -T. 99. - C. 3740-3745.

87. Blelloch R., Wang Z., Meissner A., Pollard S., Smith A., Jaenisch R. Reprogramming efficiency following somatic cell nuclear transfer is influenced by the differentiation and methylation state of the donor nucleus // Stem Cells. - 2006. - T. 24. - C. 2007-2013.

88. Bruniquel D., Schwartz R. H. Selective, stable demethylation of the interleukin-2 gene enhances transcription by an active process // Nat Immunol. - 2003. - T. 4. - C. 235-240.

89. Hattori N., Nishino K., Ko Y. G., Ohgane J., Tanaka S., Shiota K. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // The Journal of biological chemistry. - 2004. - T. 279. - C. 17063-17069.

90. Bird A. P., Taggart M. H., Nicholls R. D., Higgs D. R. Non-methylated CpG-rich islands at the human alpha-globin locus: implications for evolution of the alpha-globin pseudogene // The EMBO journal. - 1987. - T. 6. - C. 999-1004.

91. Bird A. P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation // Nature. - 1986. - T. 321. - C. 209-213.

92. McKeon C., Ohkubo H., Pastan I., de Crombrugghe B. Unusual methylation pattern of the alpha 2 (l) collagen gene // Cell. - 1982. - T. 29. - C. 203-210.

93. Voo K. S., Carlone D. L., Jacobsen B. M., Flodin A., Skalnik D. G. Cloning of a mammalian transcriptional activator that binds unmethylated CpG motifs and shares a CXXC domain with DNA methyltransferase, human trithorax, and methyl-CpG binding domain protein 1 // Molecular and cellular biology. - 2000. - T. 20. - C. 2108-2121.

94. Ehrlich M., Gama-Sosa M. A., Huang L. H., Midgett R. M., Kuo K. C., McCune R. A., Gehrke C. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells // Nucleic acids research. - 1982. - T. 10. - C. 2709-2721.

95. Bestor T. H. The DNA methyltransferases of mammals // Human molecular genetics. -2000. - T. 9. - C. 2395-2402.

96. Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. Demethylation of the zygotic paternal genome // Nature. - 2000. - T. 403. - C. 501-502.

97. Wu S. C., Zhang Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome // Nature reviews. Molecular cell biology. - 2010. - T. 11. - C. 607-620.

98. Inoue A., Zhang Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos // Science. - 2011. - T. 334. - C. 194.

99. Nakamura T., Arai Y., Umehara H., Masuhara M., Kimura T., Taniguchi H., Sekimoto T., Ikawa M., Yoneda Y., Okabe M., Tanaka S., Shiota K., Nakano T. PGC7/Stella protects against DNA demethylation in early embryogenesis // Nat Cell Biol. - 2007. - T. 9. - C. 64-71.

100. Hajkova P., Erhardt S., Lane N., Haaf T., El-Maarri O., Reik W., Walter J., Surani M. A. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells // Mech Dev. - 2002. - T. 117. - C. 15-23.

101. Wu H., Zhang Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation // Genes & development. - 2011. - T. 25. - C. 2436-2452.

102. Martinowich K., Hattori D., Wu H., Fouse S., He F., Hu Y., Fan G., Sun Y. E. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation // Science. -2003. - T. 302. - C. 890-893.

103. Macleod D., Clark V. H., Bird A. Absence of genome-wide changes in DNA methylation during development of the zebrafish // Nature genetics. - 1999. - T. 23. - C. 139-140.

104. Baylin S. B., Herman J. G. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics // Trends in genetics : TIG. - 2000. - T. 16. - C. 168-174.

105. Issa J. P. CpG-island methylation in aging and cancer // Current topics in microbiology and immunology. - 2000. - T. 249. - C. 101-118.

106. Jones P. A., Wolkowicz M. J., Rideout 3rd W. M., Gonzales F. A., Marziasz C. M., Coetzee G. A., Tapscott S. J. De novo methylation of the MyoD1 CpG island during the establishment of immortal cell lines // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1990. - T. 87. - C. 6117-6121.

107. Jones P. A., Baylin S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer // Nature reviews. Genetics. - 2002. - T. 3. - C. 415-428.

108. Pradhan S., Bacolla A., Wells R. D., Roberts R. J. Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expression, purification, and comparison of de novo and maintenance methylation // The Journal of biological chemistry. - 1999. - T. 274. - C. 33002-33010.

109. Sato T., Kano I., Fukuda M., Yoshida Y., Sasaki T. Angiocardiographic findings and morphogenesis of criss-cross heart with situs solitus, concordant artrioventricular relationships and L-transposition // Tohoku J Exp Med. - 1976. - T. 119. - C. 377-384.

110. Stoger R., Kajimura T. M., Brown W. T., Laird C. D. Epigenetic variation illustrated by DNA methylation patterns of the fragile-X gene FMR1 // Human molecular genetics. - 1997. - T. 6. -C. 1791-1801.

111. Hark A. T., Schoenherr C. J., Katz D. J., Ingram R. S., Levorse J. M., Tilghman S. M. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus // Nature. -2000. - T. 405. - C. 486-489.

112. Bell A. C., West A. G., Felsenfeld G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators // Cell. - 1999. - T. 98. - C. 387-396.

113. Holmgren C., Kanduri C., Dell G., Ward A., Mukhopadhya R., Kanduri M., Lobanenkov V., Ohlsson R. CpG methylation regulates the Igf2/H19 insulator // Curr Biol. - 2001. - T. 11. - C. 1128-1130.

114. Hendrich B., Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins // Molecular and cellular biology. - 1998. - T. 18. - C. 6538-6547.

115. Prokhortchouk A., Hendrich B., Jorgensen H., Ruzov A., Wilm M., Georgiev G., Bird A., Prokhortchouk E. The p120 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor // Genes & development. - 2001. - T. 15. - C. 1613-1618.

116. Liu W. M., Chu W. M., Choudary P. V., Schmid C. W. Cell stress and translational inhibitors transiently increase the abundance of mammalian SINE transcripts // Nucleic acids research. - 1995. - T. 23. - C. 1758-1765.

117. Walsh C. P., Chaillet J. R., Bestor T. H. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation // Nature genetics. - 1998. - T. 20. - C. 116-117.

118. Chu W. M., Ballard R., Carpick B. W., Williams B. R., Schmid C. W. Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR // Molecular and cellular biology. - 1998. - T. 18. - C. 58-68.

119. Barlow D. P. Genomic imprinting: a mammalian epigenetic discovery model // Annual review of genetics. - 2011. - T. 45. - C. 379-403.

120. Bartolomei M. S. Genomic imprinting: employing and avoiding epigenetic processes // Genes & development. - 2009. - T. 23. - C. 2124-2133.

121. Abramowitz L. K., Bartolomei M. S. Genomic imprinting: recognition and marking of imprinted loci // Curr Opin Genet Dev. - 2012. - T. 22. - C. 72-78.

122. Cirio M. C., Martel J., Mann M., Toppings M., Bartolomei M., Trasler J., Chaillet J. R. DNA methyltransferase 1o functions during preimplantation development to preclude a profound level of epigenetic variation // Developmental biology. - 2008. - T. 324. - C. 139-150.

123. Nagano T., Mitchell J. A., Sanz L. A., Pauler F. M., Ferguson-Smith A. C., Feil R., Fraser P. The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin // Science. - 2008. - T. 322. - C. 1717-1720.

124. Lyon M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.) // Nature. - 1961. - T. 190. - C. 372-373.

125. Rastan S. Non-random X-chromosome inactivation in mouse X-autosome translocation embryos--location of the inactivation centre // J Embryol Exp Morphol. - 1983. - T. 78. - C. 1-22.

126. Ng K., Pullirsch D., Leeb M., Wutz A. Xist and the order of silencing // EMBO Rep. -2007. - T. 8. - C. 34-39.

127. Panning B., Dausman J., Jaenisch R. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization // Cell. - 1997. - T. 90. - C. 907-916.

128. Barr M. L., Carr D. H. Correlations between sex chromatin and sex chromosomes // Acta Cytol. - 1962. - T. 6. - C. 34-45.

129. Takagi N. Differentiation of X chromosomes in early female mouse embryos // Exp Cell Res. - 1974. - T. 86. - C. 127-135.

130. Jeppesen P., Turner B. M. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression // Cell. -1993. - T. 74. - C. 281-289.

131. Lock L. F., Melton D. W., Caskey C. T., Martin G. R. Methylation of the mouse hprt gene differs on the active and inactive X chromosomes // Molecular and cellular biology. - 1986. - T. 6. - C. 914-924.

132. Lock L. F., Takagi N., Martin G. R. Methylation of the Hprt gene on the inactive X occurs after chromosome inactivation // Cell. - 1987. - T. 48. - C. 39-46.

133. Barr H., Hermann A., Berger J., Tsai H. H., Adie K., Prokhortchouk A., Hendrich B., Bird A. Mbd2 contributes to DNA methylation-directed repression of the Xist gene // Molecular and cellular biology. - 2007. - T. 27. - C. 3750-3757.

134. Okano M., Bell D. W., Haber D. A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development // Cell. - 1999. - T. 99. - C. 247257.

135. Ito S., Shen L., Dai Q., Wu S. C., Collins L. B., Swenberg J. A., He C., Zhang Y. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine // Science. - 2011. - T. 333. - C. 1300-1303.

136. Tahiliani M., Koh K. P., Shen Y., Pastor W. A., Bandukwala H., Brudno Y., Agarwal S., Iyer L. M., Liu D. R., Aravind L., Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 // Science. - 2009. - T. 324. - C. 930-935.

137. Kriaucionis S., Heintz N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain // Science. - 2009. - T. 324. - C. 929-930.

138. Jin S. G., Wu X., Li A. X., Pfeifer G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain // Nucleic acids research. - 2011. - T. 39. - C. 5015-5024.

139. Iyer L. M., Tahiliani M., Rao A., Aravind L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids // Cell Cycle. - 2009.

- T. 8. - C. 1698-1710.

140. Ono R., Taki T., Taketani T., Taniwaki M., Kobayashi H., Hayashi Y. LCX, leukemia-associated protein with a CXXC domain, is fused to MLL in acute myeloid leukemia with trilineage dysplasia having t(10;11)(q22;q23) // Cancer Res. - 2002. - T. 62. - C. 4075-4080.

141. Smiley J. A., Kundracik M., Landfried D. A., Barnes Sr. V. R., Axhemi A. A. Genes of the thymidine salvage pathway: thymine-7-hydroxylase from a Rhodotorula glutinis cDNA library and iso-orotate decarboxylase from Neurospora crassa // Biochimica et biophysica acta. - 2005. - T. 1723.

- C. 256-264.

142. Inoue A., Matoba S., Zhang Y. Transcriptional activation of transposable elements in mouse zygotes is independent of Tet3-mediated 5-methylcytosine oxidation // Cell Res. - 2012. - T. 22. - C. 1640-1649.

143. Frauer C., Hoffmann T., Bultmann S., Casa V., Cardoso M. C., Antes I., Leonhardt H. Recognition of 5-hydroxymethylcytosine by the Uhrf1 SRA domain // PLoS One. - 2011. - T. 6. - C. e21306.

144. Jin S. G., Kadam S., Pfeifer G. P. Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine // Nucleic acids research.

- 2010. - T. 38. - C. e125.

145. Maiti A., Drohat A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: potential implications for active demethylation of CpG sites // The Journal of biological chemistry. - 2011. - T. 286. - C. 35334-35338.

146. Cortazar D., Kunz C., Selfridge J., Lettieri T., Saito Y., MacDougall E., Wirz A., Schuermann D., Jacobs A. L., Siegrist F., Steinacher R., Jiricny J., Bird A., Schar P. Embryonic lethal phenotype reveals a function of TDG in maintaining epigenetic stability // Nature. - 2011. - T. 470. -C. 419-423.

147. Cortellino S., Xu J., Sannai M., Moore R., Caretti E., Cigliano A., Le Coz M., Devarajan K., Wessels A., Soprano D., Abramowitz L. K., Bartolomei M. S., Rambow F., Bassi M. R., Bruno T., Fanciulli M., Renner C., Klein-Szanto A. J., Matsumoto Y., Kobi D., Davidson I., Alberti C., Larue L., Bellacosa A. Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demethylation by linked deamination-base excision repair // Cell. - 2011. - T. 146. - C. 67-79.

148. He Y. F., Li B. Z., Li Z., Liu P., Wang Y., Tang Q., Ding J., Jia Y., Chen Z., Li L., Sun Y., Li X., Dai Q., Song C. X., Zhang K., He C., Xu G. L. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA // Science. - 2011. - T. 333. - C. 13031307.

149. Globisch D., Munzel M., Muller M., Michalakis S., Wagner M., Koch S., Bruckl T., Biel M., Carell T. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates // PLoS One. - 2010. - T. 5. - C. e15367.

150. Guo J. U., Su Y., Zhong C., Ming G. L., Song H. Hydroxylation of 5-methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the adult brain // Cell. - 2011. - T. 145. - C. 423-434.

151. Chen C. C., Wang K. Y., Shen C. K. The mammalian de novo DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B are also DNA 5-hydroxymethylcytosine dehydroxymethylases // The Journal of biological chemistry. - 2012. - T. 287. - C. 33116-33121.

152. Iqbal K., Jin S. G., Pfeifer G. P., Szabo P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - T. 108. - C. 3642-3647.

153. Wossidlo M., Nakamura T., Lepikhov K., Marques C. J., Zakhartchenko V., Boiani M., Arand J., Nakano T., Reik W., Walter J. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming // Nat Commun. - 2011. - T. 2. - C. 241.

154. Gu T. P., Guo F., Yang H., Wu H. P., Xu G. F., Liu W., Xie Z. G., Shi L., He X., Jin S. G., Iqbal K., Shi Y. G., Deng Z., Szabo P. E., Pfeifer G. P., Li J., Xu G. L. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes // Nature. - 2011. - T. 477. - C. 606-610.

155. Ito S., D'Alessio A. C., Taranova O. V., Hong K., Sowers L. C., Zhang Y. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification // Nature.

- 2010. - T. 466. - C. 1129-1133.

156. Wu H., Zhang Y. Tet1 and 5-hydroxymethylation: a genome-wide view in mouse embryonic stem cells // Cell Cycle. - 2011. - T. 10. - C. 2428-2436.

157. Dawlaty M. M., Ganz K., Powell B. E., Hu Y. C., Markoulaki S., Cheng A. W., Gao Q., Kim J., Choi S. W., Page D. C., Jaenisch R. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development // Cell Stem Cell. - 2011. - T. 9. - C. 166-175.

158. Song C. X., Szulwach K. E., Fu Y., Dai Q., Yi C., Li X., Li Y., Chen C. H., Zhang W., Jian X., Wang J., Zhang L., Looney T. J., Zhang B., Godley L. A., Hicks L. M., Lahn B. T., Jin P., He C. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine // Nat Biotechnol. - 2011. - T. 29. - C. 68-72.

159. Lauth M. R., Spear B. B., Heumann J., Prescott D. M. DNA of ciliated protozoa: DNA sequence diminution during macronuclear development of Oxytricha // Cell. - 1976. - T. 7. - C. 6774.

160. Williams K., Doak T. G., Herrick G. Developmental precise excision of Oxytricha trifallax telomere-bearing elements and formation of circles closed by a copy of the flanking target duplication // The EMBO journal. - 1993. - T. 12. - C. 4593-4601.

161. Prescott D. M. The DNA of ciliated protozoa // Microbiological reviews. - 1994. - T. 58. - C. 233-267.

162. Dawson D., Buckley B., Cartinhour S., Myers R., Herrick G. Elimination of germ-line tandemly repeated sequences from the somatic genome of the ciliate Oxytricha fallax // Chromosoma.

- 1984. - T. 90. - C. 289-294.

163. Bracht J. R., Perlman D. H., Landweber L. F. Cytosine methylation and hydroxymethylation mark DNA for elimination in Oxytricha trifallax // Genome Biol. - 2012. - T. 13.

- C. R99.

164. Rae P. M. Hydroxymethyluracil in eukaryote DNA: a natural feature of the pyrrophyta (dinoflagellates) // Science. - 1976. - T. 194. - C. 1062-1064.

165. Yoder J. A., Walsh C. P., Bestor T. H. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites // Trends in genetics : TIG. - 1997. - T. 13. - C. 335-340.

166. Зайцева Г. Н., Колесников А. А., Яценко И. А., Кирнос М. Д., Ванюшин Б. Ф. О первичной структуре ДНК кинетопласта Critbidia oncopelti // Доклады Академии Наук СССР. -1974. - T. 219. - C. 243-245.

167. Ammermann D., Steinbruck G., Baur R., Wohlert H. Methylated bases in the DNA of the ciliate Stylonychia mytilus // European journal of cell biology. - 1981. - T. 24. - C. 154-156.

168. Cummings D. J., Tait A., Goddard J. M. Methylated bases in DNA from Paramecium aurelia // Biochimica et biophysica acta. - 1974. - T. 374. - C. 1-11.

169. Gutierrez J. C., Callejas S., Borniquel S., Martin-Gonzalez A. DNA methylation in ciliates: implications in differentiation processes // International microbiology : the official journal of the Spanish Society for Microbiology. - 2000. - T. 3. - C. 139-146.

170. Hattman S., Kenny C., Berger L., Pratt K. Comparative study of DNA methylation in three unicellular eucaryotes // Journal of bacteriology. - 1978. - T. 135. - C. 1156-1157.

171. Nelson M., Burbank D. E., Van Etten J. L. Chlorella viruses encode multiple DNA methyltransferases // Biological chemistry. - 1998. - T. 379. - C. 423-428.

172. Pratt K., Hattman S. Deoxyribonucleic acid methylation and chromatin organization in Tetrahymena thermophila // Molecular and cellular biology. - 1981. - T. 1. - C. 600-608.

173. Rae P. M., Spear B. B. Macronuclear DNA of the hypotrichous ciliate Oxytricha fallax // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1978. - T. 75. -C. 4992-4996.

174. Rogers S. D., Rogers M. E., Saunders G., Holt G. Isolation of mutants sensitive to 2-aminopurine and alkylating agents and evidence for the role of DNA methylation in Penicillium chrysogenum // Current genetics. - 1986. - T. 10. - C. 557-560.

175. Rojas M. V., Galanti N. DNA methylation in Trypanosoma cruzi // FEBS letters. - 1990.

- T. 263. - C. 113-116.

176. Gorovsky M. A., Hattman S., Pleger G. L. (6N)methyl adenine in the nuclear DNA of a eucaryote, Tetrahymena pyriformis // The Journal of cell biology. - 1973. - T. 56. - C. 697-701.

177. Bromberg S., Pratt K., Hattman S. Sequence specificity of DNA adenine methylase in the protozoan Tetrahymena thermophila // Journal of bacteriology. - 1982. - T. 150. - C. 993-996.

178. Harrison G. S., Findly R. C., Karrer K. M. Site-specific methylation of adenine in the nuclear genome of a eucaryote, Tetrahymena thermophila // Molecular and cellular biology. - 1986. -T. 6. - C. 2364-2370.

179. Karrer K. M., VanNuland T. A. Position effect takes precedence over target sequence in determination of adenine methylation patterns in the nuclear genome of a eukaryote, Tetrahymena thermophila // Nucleic acids research. - 1998. - T. 26. - C. 4566-4573.

180. Zhu C. M., Henney Jr. H. R. DNA methylation pattern during the encystment of Physarum flavicomum // Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire. - 1990. - T. 68. - C. 944-948.

181. Ванюшин Б. Ф., Кадырова Д. Х., Каримов Х. Х., Белозёрский А. Н. Минорные основания в ДНК высших растений // Биохимия. - 1971. - T. 36. - C. 1251-1258.

182. Kirnos M. D., Alexandrushkina N. I., Zagorskaya G., II K., Vanyushin B. F. Superproduction of heavy minicircular mitochondrial DNA in aging wheat coleoptiles // FEBS letters.

- 1992. - T. 298. - C. 109-112.

183. Pintor-Toro J. A. Adenine methylation in zein genes // Biochemical and biophysical research communications. - 1987. - T. 147. - C. 1082-1087.

184. Ashapkin V. V., Kutueva L. I., Vanyushin B. F. The gene for domains rearranged methyltransferase (DRM2) in Arabidopsis thaliana plants is methylated at both cytosine and adenine residues // FEBS letters. - 2002. - T. 532. - C. 367-372.

185. Fedoreyeva L. I., Vanyushin B. F. N(6)-Adenine DNA-methyltransferase in wheat seedlings // FEBS letters. - 2002. - T. 514. - C. 305-308.

186. van Blokland R., Ross S., Corrado G., Scollan C., Meyer P. Developmental abnormalities associated with deoxyadenosine methylation in transgenic tobacco // The Plant journal : for cell and molecular biology. - 1998. - T. 15. - C. 543-551.

187. Graham M. W., Larkin P. J. Adenine methylation at dam sites increases transient gene expression in plant cells // Transgenic research. - 1995. - T. 4. - C. 324-331.

188. Sugimoto K., Takeda S., Hirochika H. Transcriptional activation mediated by binding of a plant GATA-type zinc finger protein AGP1 to the AG-motif (AGATCCAA) of the wound-inducible Myb gene NtMyb2 // The Plant journal : for cell and molecular biology. - 2003. - T. 36. - C. 550-564.

189. Мазин А. Л., Ванюшин Б. Ф. Включение цитокинина (6-бензиламинопурина) в ДНК простейшего Tetrahymena pyriformis // Известия АН СССР: серия биологическая. - 1986. -T. Январь-Фев. - C. 122-125.

190. Vanyushin B. F. Replicative DNA methylation in animals and higher plants // Current topics in microbiology and immunology. - 1984. - T. 108. - C. 99-114.

191. Ngernprasirtsiri J., Akazawa T. Modulation of DNA methylation and gene expression in cultured sycamore cells treated by hypomethylating base analog // European journal of biochemistry / FEBS. - 1990. - T. 194. - C. 513-520.

192. Rogers S. W., Rogers J. C. The importance of DNA methylation for stability of foreign DNA in barley // Plant molecular biology. - 1992. - T. 18. - C. 945-961.

193. Fedoreyeva L. I., Sobolev D. E., Vanyushin B. F. Wheat endonuclease WEN1 dependent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status // Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society. - 2007. - T. 2. - C. 50-53.

194. Kay P. H., Pereira E., Marlow S. A., Turbett G., Mitchell C. A., Jacobsen P. F., Holliday R., Papadimitriou J. M. Evidence for adenine methylation within the mouse myogenic gene Myo-D1 // Gene. - 1994. - T. 151. - C. 89-95.

195. Reyes E. M., Camacho-Arroyo I., Nava G., Cerbon M. A. Differential methylation in steroid 5 alpha-reductase isozyme genes in epididymis, testis, and liver of the adult rat // Journal of andrology. - 1997. - T. 18. - C. 372-377.

196. Ratel D., Ravanat J. L., Berger F., Wion D. N6-methyladenine: the other methylated base of DNA // BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. -2006. - T. 28. - C. 309-315.

197. Charles M. P., Ravanat J. L., Adamski D., D'Orazi G., Cadet J., Favier A., Berger F., Wion D. N(6)-Methyldeoxyadenosine, a nucleoside commonly found in prokaryotes, induces C2C12 myogenic differentiation // Biochemical and biophysical research communications. - 2004. - T. 314. -C. 476-482.

198. Adams R. L., McKay E. L., Craig L. M., Burdon R. H. Methylation of mosquito DNA // Biochimica et biophysica acta. - 1979. - T. 563. - C. 72-81.

199. Tronche F., Rollier A., Bach I., Weiss M. C., Yaniv M. The rat albumin promoter: cooperation with upstream elements is required when binding of APF/HNF1 to the proximal element is partially impaired by mutation or bacterial methylation // Molecular and cellular biology. - 1989. - T. 9. - C. 4759-4766.

200. Knebel D., Doerfler W. N6-methyldeoxyadenosine residues at specific sites decrease the activity of the E1A promoter of adenovirus type 12 DNA // Journal of molecular biology. - 1986. - T. 189. - C. 371-375.

201. Truss M., Bartsch J., Chalepakis G., Beato M. Artificial steroid hormone response element generated by dam-methylation // Nucleic acids research. - 1992. - T. 20. - C. 1483-1486.

202. Bulanenkova S. S., Kozlova A. A., Kotova E. S., Snezhkov E. V., Azhikina T. L., Akopov S. B., Nikolaev L. G., Sverdlov E. D. Dam methylase accessibility as an instrument for analysis of mammalian chromatin structure // Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society. - 2011. - T. 6. - C. 1078-1084.

203. Azhikina T., Gainetdinov I., Skvortsova Y., Sverdlov E. Methylation-free site patterns along a 1-Mb locus on Chr19 in cancerous and normal cells are similar. A new fast approach for analyzing unmethylated CCGG sites distribution // Mol Genet Genomics. - 2006. - T. 275. - C. 615622.

204. Cooper D. N., Mort M., Stenson P. D., Ball E. V., Chuzhanova N. A. Methylation-mediated deamination of 5-methylcytosine appears to give rise to mutations causing human inherited disease in CpNpG trinucleotides, as well as in CpG dinucleotides // Hum Genomics. - 2010. - T. 4. -C. 406-410.

205. Schumann G. G., Gogvadze E. V., Osanai-Futahashi M., Kuroki A., Munk C., Fujiwara H., Ivics Z., Buzdin A. A. Unique functions of repetitive transcriptomes // Int Rev Cell Mol Biol. -2010. - T. 285. - C. 115-188.

206. Cordaux R., Batzer M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution // Nature reviews. Genetics. - 2009. - T. 10. - C. 691-703.

207. Gogvadze E., Buzdin A. Retroelements and their impact on genome evolution and functioning // Cell Mol Life Sci. - 2009. - T. 66. - C. 3727-3742.

208. Boissinot S., Davis J., Entezam A., Petrov D., Furano A. V. Fitness cost of LINE-1 (L1) activity in humans // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2006. - T. 103. - C. 9590-9594.

209. Brouha B., Schustak J., Badge R. M., Lutz-Prigge S., Farley A. H., Moran J. V., Kazazian Jr. H. H. Hot L1s account for the bulk of retrotransposition in the human population // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. - T. 100. -C. 5280-5285.

210. Vinogradova T. V., Leppik L. P., Nikolaev L. G., Akopov S. B., Kleiman A. M., Senyuta N. B., Sverdlov E. D. Solitary human endogenous retroviruses-K LTRs retain transcriptional activity in vivo, the mode of which is different in different cell types // Virology. - 2001. - T. 290. - C. 83-90.

211. Kazazian Jr. H. H. Genetics. L1 retrotransposons shape the mammalian genome // Science. - 2000. - T. 289. - C. 1152-1153.

212. Buzdin A., Ustyugova S., Khodosevich K., Mamedov I., Lebedev Y., Hunsmann G., Sverdlov E. Human-specific subfamilies of HERV-K (HML-2) long terminal repeats: three master genes were active simultaneously during branching of hominoid lineages // Genomics. - 2003. - T. 81.

- C. 149-156.

213. Author. PostParser. - 2011. - URL: http://www.postparser.net.

214. Moskalev E. A., Zavgorodnij M. G., Majorova S. P., Vorobjev I. A., Jandaghi P., Bure I. V., Hoheisel J. D. Correction of PCR-bias in quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression // Nucleic acids research. - 2011. - T. 39. - C. e77.

215. Herlyn H., Zischler H. Primate genomes // Genome Dyn. - 2006. - T. 2. - C. 17-32.

216. Буздин А. А. Функциональный анализ вставок эндогенных ретровирусов в контексте эволюции генома человека // Биоорганическая Химия. - 2010. - T. 36. - C. 38-46.

217. Hahn Y., Lee B. Identification of nine human-specific frameshift mutations by comparative analysis of the human and the chimpanzee genome sequences // Bioinformatics. - 2005. -T. 21 Suppl 1. - C. i186-94.

218. Leister D. Tandem and segmental gene duplication and recombination in the evolution of plant disease resistance gene // Trends in genetics : TIG. - 2004. - T. 20. - C. 116-122.

219. Begun D. J., Lindfors H. A., Kern A. D., Jones C. D. Evidence for de novo evolution of testis-expressed genes in the Drosophila yakuba/Drosophila erecta clade // Genetics. - 2007. - T. 176.

- C. 1131-1137.

220. Cai J., Zhao R., Jiang H., Wang W. De novo origination of a new protein-coding gene in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. - 2008. - T. 179. - C. 487-496.

221. Santos F. R., Pandya A., Kayser M., Mitchell R. J., Liu A., Singh L., Destro-Bisol G., Novelletto A., Qamar R., Mehdi S. Q., Adhikari R., de Knijff P., Tyler-Smith C. A polymorphic L1 retroposon insertion in the centromere of the human Y chromosome // Human molecular genetics. -2000. - T. 9. - C. 421-430.

222. Jurka J., Smith T. A fundamental division in the Alu family of repeated sequences // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1988. - T. 85. -C. 4775-4778.

8. Благодарности

Автору хотелось бы выразить благодарность своему научному руководителю Антону Александровичу Буздину и другим коллегам из группы геномного анализа сигнальных систем клетки.

Работа выполнялась при поддержке грантов в рамках программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и грантом Президента Российской Федерации (480. 2010. 4) и грантом РФФИ (10-04-00593-а).

Приложение 1. Использованные олигонуклеотиды

A. Олигонуклеотидные праймеры и супрессионные адаптеры

для nMETR

Супрессионный адаптор Na21St19: 1§^а§с§1§аа§ас§аса§аа১§с§1§§;1§с§§а§§§с§§1 Подложка к адаптору StH: асс§ссйсс§сассас§ссй Олигонуклеотидные праймеры для иМЕТЯ: Ш21: tgtagcgtgaagacgacagaa

Alu1for: ১1с§а§§с1§са§^а§сс§1 Alu2for: с§а§§йсса§;1§а§сс§;1§а L1 Ta1d-rev2: §§ааа1§са§ааа1;сассс§;1 L1 Ta1d-rev3: асс1са§#§§ааа1§са§ааа1;сасс LTRHsfor830: сс1сса1а1§й§аас§й§ LTR5'endfor: §§§§саасссасссйаса

Локус Внешние праймеры Внутренние праймеры

Прямой праймер Обратный праймер Прямой праймер Обратный праймер

2(^11. 21 СТТОСОТТТТСОСАОСОТСТ ОТТСОСТТТТОСОАСОСТОТ ТТТОТТТТТТТСОСТАТТТТАОТА ТТТОТТТТТТТОООТАТТТТАОТА

22qlЗ. 2 АОАТТТСОСТААОАТСОТСАОАТ ССТАСТААСТСССААТСССААТ ТСАОТСТАТААТААОТТСТТТАОААСО ТОАОТОТАТААТААСТТОТТТАОААОО

2(^11. 21 ТТОСАОСТТТТАОСОТСОТТС ССТААСАТААССТСССТСААТАААС ТТТТТОАОАООТТТТТТТООАОА ТТТТТОАСАОСТТТТТТТОСАОА

19с[13. 11 ТТОТТТТТООАОАТТТАТТТОАТО АТАТСАААСАСТАСААСААТСССАТ ТООАОАТТТАТТТОАТОСООА ТСОАСАТТТАТТТОАТСОСОА

19р13. 3 АОСООТТОСАТАТТТТОСТОА ССАСАСТСАААССССАСААТАС ТАОТТСОТТСОСОСТОТТСА ТАСТТОСТТОСОСОТСТТОА

16q22. 1 ТТТТАОТТТСОСГААТАОАСТОАСАТ СТААСТТСАТТТАСААТСАСТТССА АОАСАОСОТАТАТТТТАТСТТОАСА АСАОАСОСТАТАТТТТАТОТТСАОА

Щ24. 11 ОТТСОТТАТСТТТТОСГООАТО АСАТСАТТСТТССТТАСТТАСТТССТ ОСГТАОСТТТАОАСТТТАТАОСТАОТТ СОТТАСОТТТАСАОТТТАТАСОТАСТТ

12q22 ОСГАТОТСТТТОСОСТАОТСАТ АССААСАСТАТААААСТАСССААТ ТТТОТТТТТТТОООТАТТТТАОТА ТТТСТТТТТТТОСОТАТТТТАСТА

6с^21 ОТАТТАСТАОТСТТТАААОТТСТТОСТ ТТТАТТАСААСТАССТСАСАТТСАСТ ТОАОТОТАТААТААСТТОТТТАОААОО ТОАСТОТАТААТААСТТОТТТАСААОС

Зq25.2 ТОСОТСОАТСТТОАТАСОСТ ССТААТАТСАСТАСТСССТААТТТСА ТТТТТОАОАООТТТТТТТООАОА ТТТТТОАСАОСТТТТТТТОСАОА

Таблица 1. Список олигонуклеотидных праймеров для амплификации последовательностьей ДНК, подвергнувшейся бисульфитной консверсии.

Приложение 2. Последовательности мобильных элементов и сайты отжига олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе

1 Консенсусная последовательность LITald ([221])

Показаны 400 п. о. с 5' - конца (-) - цепи мобильного элемента (общая длина полной консенсусной последовательности составляет 5403 п. о.).

Gggggaggagccaagatggccgaataggaacagctccggtctacagctcccagcgtgagcgacgcagaagacgggtgatttctg catttccaactgaggt (acgggtgatttctgcatttcc - L1Ta1d-rev2; ggtgatttctgcatttcc aactgaggt - L1Ta1d-rev3) accaggttcatctcactggggagtgccagacagtgggcgcaggacagtgggtgcagcgcaccgtgcgtgagccgaagcagggcgaggcatcg cctcacccgggaagcgcaaggggtcagggaattccctttcctagtcaaagaaaggggtgacagacggcacctggaaaatcgggtcactcccgcc ctaatactgcgcttttccgacgggcttaaaaaacggcgcaccaggagattatatcccgcacctggctcggagggtcctacgcccacggagtctcgct gattgctagcacagcagtcc. . . (нижеследующие 5 т. п. о. удалены, так как их наличие или отсутствие для nMETR непринципиально).

2. Консенсусная последовательност HERV-K LTR (968 п. о., [212]) tgtggggaaaagcaagagagatcagattgttactgtgtctgtgtagaaagaagtagacataggagactccattttgttatgtactaagaaa

aattcttctgccttgagattctgttaatctataaccttacccccaaccccgtgctctctgaaacrtgtgctgtgtcaactcagagttraatggattaagggcg

gtgcargatgtgctttgttaaacagatgcttgaaggcagcatgctccttaagagtcatcaccactccctaatctcaagtacccagggacacaaaaactg

cggaaggccgcagggacctctgcctaggaaagccaggtattgtccaaggtttctccccatgtgatagtctgaaatatggcctcgtgggaagggaaa

gacctgaccgtcccccagcccgacacccgtaaagggtctgtgctgaggaggattagtaaaagaggaaggaatgcctcttgcagttgagacaagag

gaaggcatctgtctcctgcctgtccctgggcaatggaatgtctcggtataaaacccgattgtatgctccatctactgagatagggaaaaaccgccttag

ggctggaggtgggacctgcgggcagcaatactgctttgtaaagcattgagatgtttatgtgtatgcatatctaaaagcacagcacttaatcctttacattg

tctatgatgcaaagacctttgttcacgtgtttgtctgctgaccctctccccacaattgtcttgtgaccctgacacatccccctcttcgagaaacacccaca

gatgatcaataaatactaagggaactcagaggctggcgggatcctccatatgctgaacgctg(LTRHsfor830)gttccccgggtccccttattt

ctttctctatactttgtctctgtgtctttttcttttccaaatctctcgtcccaccttacgagaaacacccacaggtgtgtaggggcaacccacccctaca(L

TR5'endfor)

3. Консенсусная последовательность Alu1 (290 п. о., [222]) Ggccgggcgcggtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcgggaggatcacttgagcccaggagttcgagac

cagcctgggcaacatagtgaaaccccgtctctacaaaaaatacaaaaattagccgggcgtggtggcgcgcgcctgtagtcccagctactcgggag gctgaggcaggaggatcgcttgagcccgggaggtcgaggctgcagtgagccgtga (aggtcgaggctgcagtgagccgt - Alu 1 for; cgaggctgcagtgagccgtga - Alu2for) tcgcgccactgcactccagcctgggcgacagagcgagaccctgtctcaaaaaaaa