Разработка нового класса остеоиндуктивных костно-пластических материалов на основе отверждаемых гидрогелей для применения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии (экспериментальное исследование) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.14, доктор наук Васильев Андрей Вячеславович

• Васильев Андрей Вячеславович
• доктор наук
• 2021

Оглавление диссертации доктор наук Васильев Андрей Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая и практическая значимость исследования

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация работы

Публикации

Внедрение результатов работы

Объём и структура работы

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Требования к костно-пластическим материалам

1.1.1 Физико-механические свойства

1.1.2 Биологические свойства

1.2 Классификация костно-пластических материалов

1.3 Виды активированных материалов

1.4 Тканеинженерные конструкции

1.5 Ген-активированные остеопластические материалы

1.6 Костно-пластические материалы с факторами роста

1.7 Факторы роста, индуцирующие остеогенез

1.8 Костные морфогенетические белки

1.8.1 Способы получения BMP-2

1.8.2 Механизм действия костного морфогенетического белка-2 (ВМР-2)

1.8.3 Методы включения и доставки BMP-2

1.9 Матрицы-носители для BMP

1.9.1 Костные цементы

1.9.2 Ксеногенные костно-пластические материалы

1.9.3 Гидрогели

1.9.4 Модификаторы прочностных свойств коллагена и хитозана

1.10 Опыт разработки и исследования материалов для восстановления костной ткани в отделениях хирургической стоматологии ЦНИИС и ЧЛХ

1.11 Резюме

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Получение материалов и их компонентов

2.1.1 Приготовление растворов BMP-2

2.1.2 Получение высокопористых полилактидных гранул

2.1.3 Хитозановые гранулы

2.1.4 Получение компонентов и композиции материала на основе отверждаемого хитозанового гидрогеля

2.1.5 Получение материалов на основе коллагенового гидрогеля

2.1.6 Группа сравнения

2.2 Исследование физико-механических свойств

2.2.1 Исследование модификаторов прочностных свойств

2.2.2 Органолептическая оценка прочностных свойств

2.3 Анализ кинетики высвобождения остеоиндуктора из компонентов проектируемых материалов

2.4 Исследование на клеточных культурах in vitro

2.4.1 Получение и характеризация клеточных культур

2.4.2 Оценка цитотоксичности

2.4.3 Изучение клеточной адгезии

2.4.4 Сканирующая электронная микроскопия

2.4.5 Темнопольная микроскопия

2.4.6 Оценка остеоиндуктивного потенциала BMP-2

2.5 Исследования биологических свойств in vivo

2.5.1 Исследование на крысах

2.5.2 Гистология

2.5.3 Морфометрия

2.6 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Оценка остеоиндуктивных свойств rhBMP-2 и подбор его оптимальной концентрации

3.1.1 Цитосовместимость компонентов, используемых в комбинации с BMP-2 для определения его эффективности

3.1.2 Эффективность BMP-2 in vitro

3.1.3 Эффективность BMP-2 на модели эктопического остеогенеза in vivo

3.2 Высокопористые полилактидные гранулы

3.2.1 Физико-механические свойства

3.2.2 Цитосовместимость высокопористых полилактидных гранул

3.2.3 Способность удерживать BMP-2

3.2.4 Оценка in vivo остеоиндуктивных и воспалительных свойств полилактидных гранул, импрегнированных rhBMP-2

3.3 Гранулы из хитозана

3.3.1 Кинетика высвобождения rhBMP-2 из хитозановых гранул

3.3.2 Цитосовместимость хитозановых гранул

3.3.3 Клеточная адгезия

3.4 Наполнители и матрицы-носители для BMP-2 в виде ординарных костно-пластических материалов на основе ГАП

3.4.1 Цитотоксичность и клеточная адгезия in vitro

3.4.2 Способность удерживать BMP-2 и индуцировать орто- и эктопический остеогенез in vivo

3.5 Материалы на основе хитозанового гидрогеля

3.5.1 Физико-механические свойства

3.5.2 Оценка цитосовместимости хитозановых гидрогелей

3.5.3 Остеоиндуктивные свойства композиции на основе отверждаемого хитозанового гидрогеля и высокопористых полилактидных гранул, импрегнированных rhBMP-2

3.5.4 Увеличение концентрации BMP-2 с целью повышения эффективности материала

3.5.5 Общий вид итоговой композиции на основе хитозанового гидрогеля

3.6 Материалы на основе коллагенового гидрогеля

3.6.1 Физико-механические свойства

3.6.2 Цитотоксичность и клеточная адгезия

3.6.3 Высвобождение rhBMP-2 из коллаген-фибронектинового гидрогеля

3.6.4 Эффективность коллаген-фибронектинового гидрогеля in vivo

3.7 Модификация прочностных свойств коллагенового гидрогеля с помощью наполнителей

3.7.1 Наполнение ординарным костно-пластическим материалом на основе гидроксиапатита и трикальцийфосфата

3.7.2 Наполнение высокопористыми полилактидными гранулами

3.7.3 Вид итоговой композиции материала на основе коллагенового гидрогеля

3.8 Группа сравнения: Индост-гель

3.8.1 Реологические свойства Индост-гель

3.8.2 Цитотоксичность и клеточная адгезия in vitro

3.8.3 Эффективность Индост-гелъ при подкожной и внутрикостной

имплантации in vivo

4 ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Сравнение полученных материалов между собой

4.2 Сравнение полученных материалов с костно-пластическими материалами других классов

4.3 Перспективы применения разработанных костно-пластических материалов в стоматологии нового поколения

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6 ВЫВОДЫ

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

211

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка нового класса остеоиндуктивных костно-пластических материалов на основе отверждаемых гидрогелей для применения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии (экспериментальное исследование)»

Актуальность темы исследования

Ежегодно число проводимых костно-пластических операций растет в среднем на 14,4% в России и 13% в США и составляет около 2,2 млн операций [Fonseca, 2018; Кулаков и др., 2017; Benzel, Francis, 2012]. В стоматологии наблюдается самый интенсивный рост потребления костно-пластических материалов, который связывают с увеличением количества проводимых дентальных имплантаций. Так, более половины всех дентальных имплантаций сопровождаются костной пластикой [Cha et al., 2016; Кулаков и др., 2017; Globe Newswire, 2019]. Распространение заболеваний пародонта, требующих использования костно-пластических материалов к настоящему времени снижается в Европе, но растёт в Африке и Азии [Globe Newswire, 2019]. В среднем в мире количество всех стоматологических пациентов, которые имеют генерализованный пародонтит средней и тяжёлой степени растёт с возрастом и составляет более половины всех случаев для средней возрастной группы, 35-44 лет [Nazir, 2017; Микляев и др., 2017; Prathypaty et al., 2019]. В связи с этим в стоматологии существует растущая потребность в разработке более эффективных костнопластических материалов, способных восполнить утраченную костную ткань. К костно-пластическим материалам предъявляют требования, связанные с биологическими свойствами, такими как остеоиндукция, остеокондукция, биорезорбция, биосовместимость, а также связанные с удобством их применения врачом.

Простота применения костно-пластического материала заключается прежде всего в удобных манипуляционных свойствах и отсутствии необходимости использования вспомогательных армирующих и барьерных материалов, инструментов и дополнительного персонала [Lakshmiganthan et al., 2012; Deshmukh et al., 2014; Uehara et al., 2015; Jeng, Chiang, 2020]. Существующие препараты

костно-пластических материалов по консистенции представляют собой костную крошку, цемент, пасту, губку и пластилин. Наиболее удобной для моделирования субстанцией является пластилин. Однако пластилин проигрывает цементам по способности отверждаться в ране и не обеспечивает надлежащую стабильность смоделированной формы [Педаченко, Кущаев, 2001; AbdelRazek, Elsadek, Elsadek, 2017]. Кроме того, в отличие от костной крошки у существующих зарегистрированных препаратов в форме пластилина поверхность представляет собой сплошную структуру, что не позволяет врастать в толщу материала сосудам и обеспечивать эффективную резорбцию материала с образованием костной ткани во всей его толще [Verne et al., 2015]. Наиболее привлекательной формой, которая ещё не была зарегистрирована можно назвать отверждаемый биосовместимый и биорезорбируемый пластилин, обладающий способностью формировать поры для врастания сосудов и миграции клеток.

Биологические свойства костно-пластического материала прежде всего связаны с остеоиндукцией - способностью стимулировать образование костной ткани. В качестве остеоиндукторов могут применяться генетические конструкции (вирусы и плазмиды) и вещества с белково-пептидной структурой (факторы роста), действие которых направлено на рецепторы, активирующие дифференцировку клеток в остеогенном направлении. Генетические конструкции в современных препаратах не используются в связи с определёнными трудностями, которые пока не решены в этой отрасли науки в целом. В связи с этим наиболее безопасным и эффективным на настоящий момент следует считать использование факторов роста, среди которых наибольшей эффективностью обладает BMP-2 - инъекция даже его малых доз под кожу способна индуцировать эктопический неоостеогенез [Triplett et al., 2009; Hout van et al., 2011; Деев, Дробышев, Бозо, 2015]. Однако внесение чистого BMP-2 в костную рану не имеет высокой эффективности: в первые сутки после операции происходит воспаление, которое препятствует действию самого BMP-2, после чего последовательно развиваются процессы миграции и пролиферации остеогенных предшественников, и только затем возникает необходимость запуска дифференцировки [Li et al., 2014; Elgali et al.,

2017; Egri, Eczacioglu, 2017]. К настоящему времени за рубежом существует ряд лицензированных для клинического применения материалов, содержащих факторы роста, однако в эти материалы не заложена способность своевременно создавать пик концентрации остеоиндуктора к началу фазы активной дифференцировки клеток.

Проблема своевременной доставки остеоиндуктора может быть решена двумя способами [Whang, Goldstick, Healy, 2000; Leknes et al., 2008]. Первый заключается в конкурентном вытеснении индуктора из центров связывания с матрицей-носителем. Примером такого подхода служит коллаген с осаждённым на его поверхности rhBMP-2. При добавлении фибронектина плазмы крови к коллагеновому гидрогелю rhBMP-2 начинает медленно вытесняться в течение 5-7 сут [Осидак, 2014]. Также следует отметить высочайшую биосовместимость материалов на основе высокоочищенного коллагена: они не проявляют иммуногенных свойств, не обладают цитотоксичностью, а продукты их метаболизма используются при синтезе собственной костной ткани [Di Lullo et al., 2002; Осидак и др., 2012]. В результате этого матрицы на основе коллаген-фибронектиновых гидрогелей можно назвать перспективными с точки зрения проектирования активированных костно-пластических материалов.

Второй подход заключается в инкапсулировании остеоиндуктора. Для этой задачи лучше всего подходят биоразлагаемые полимеры. Их синтетическая природа подразумевает полный контроль над процессом их получения, что позволяет добиться прогнозируемой динамики биодеградации, и как следствие, высвобождения заключённых в них веществ [Boyan et al., 1999; Shue, Yufeng, Mony, 2012; Whang, Goldstick, Healy, 2000]. Существуют различные технологии, в том числе апробированные в нашей стране, включения BMP-2 с сохранением его биологических свойств в гранулы полилактида или его сополимеров [Egri, Eczacioglu, 2017; Minaeva et al., 2019; Волков и др., 2014]. Для улучшения остеокондуктивных свойств - врастания сосудов и миграции клеток - в полилактидных материалах могут быть сформированы поры [Chen et al., 2019; Бухарова, 2014]. В процессе биодеградации полилактиды закисляют среду, что

негативно сказывается на неоостеогенезе из-за возникающего в зоне их имплантации воспаления [Hutmacher, 2000; Voges et al., 2002; Shue, Yufeng, Mony, 2012]. Для решения этой задачи можно использовать композицию из гетерогенных полимеров, которая позволит усиливать положительные свойства одного полимера и нивелировать негативные эффекты другого. Для придания матрице материала уникальных манипуляционных свойств и способности термоотверждаться наилучшим образом подходит хитозановый гель, представляющий собой смесь хитозана и бета-глицерофосфата. Изменение соотношения его компонентов позволяет добиться термоотверждения после внесения в рану при 37оС. [Berger et al., 2005; Cho et al., 2008; Fabiano, Bizzarri, Zambito, 2017]. Однако биодеградация хитозанового геля в слабощелочной среде организма вызывает определённые сложности: для повышения её эффективности хитозановому гелю требуется акцепция протонов. В связи с этим использование композиции полилактида и хитозанового геля выглядит очень перспективным [Yar et al., 2015]. Композиция из полилактида и хитозана позволила бы создать матрицу материала, обладающую способностью к термоотверждению с образованием пор, биодеградации без воспаления и программируемым высвобождением остеоиндукторов. Коммерческие аналоги материала с такими свойствами в настоящее время не существуют, в связи с чем его разработка является перспективным направлением, позволяющим решить актуальные проблемы практической медицины.

Таким образом, композиции на основе хитозана, полилактида и коллагена, насыщенные rhBMP-2 имеют потенциал для получения костно-пластических материалов с уникальной комбинацией свойств, то есть нового класса костнопластических материалов.

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время не представлены костно-пластические материалы, которые сочетали бы удобные манипуляционные свойства, были способны к

отверждению, удержанию смоделированной формы, биорезорбции с последующим замещением костной тканью за счёт выраженных остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств. В области двух выбранных нами концепций существует определённый задел, необходимый для разработки нового класса термотропных и остеоиндуктивных биорезорбируемых костнопластических материалов, основанных на использовании термотропных коллагеновых и хитозановых гидрогелей с полилактидными наполнителями.

Эффективность остеоиндуктора BMP-2 подтверждена многочисленными исследованиями. На сегодняшний день за рубежом зарегистрированы костнопластические материалы для клинического применения, содержащие BMP-2. Показания к их применению связаны с использованием в спинальной хирургии и травматологии и в меньшей степени учитывают потребности стоматологов [Epstein, 2011; Lin et al., 2016; Кузнецова и др., 2019]. Кроме того, концентрация BMP-2 в них существенно выше физиологической [McKay, Peckham, Badura, 2007]. Поиск оптимальной минимальной концентрации данного остеоиндуктора не дает однозначных результатов, так как эффективность белка может варьировать в зависимости от происхождения BMP-2, его материала-носителя, а также от животной модели, на которой проводится эксперимент [Gothard et al., 2014; Gibbs et al., 2016]. В конечной композиции разрабатываемых костно-пластических материалов все эти особенности должны быть учтены и исследованы.

Ранее особенности репаративного остеогенеза под действием композиции на основе хитозанового гидрогеля и высокопористых полилактидных гранул, импрегнированных BMP-2, не были изучены. Однако существуют исследования, посвященные оценке влияния отдельных компонентов и их отдельных свойств. Так, была показана термотропная гелезация растворов хитозана при добавлении в их состав ß-глицерофосфата, зависимая от пропорций и химических свойств компонентов [Ahmadi et al., 2015; Qin et al., 2018; Zhou et al., 2015] Существуют данные in vitro и in vivo о биологических свойствах таких гелей [Molinaro et al., 2002; Ji et al., 2010; Ngoenkam et al., 2010]. Есть исследования об успешном использовании хитозанового гидрогеля в качестве матрицы для доставки факторов

роста для регенерации костной ткани [Chenite et al., 2000; Song et al., 2016; Min et al., 2019]. Что касается полилактидных материалов, то они широко используются для тканевой инженерии и инженерии костной ткани, в частности [Бухарова, 2014]. Существует огромное количество исследований физико-механических и биосовместимых свойствах различных материалов, построенных на их основе [Xiao et al., 2012; Бухарова, 2014]. В некоторых исследованиях были определены особенности кинетики высвобождения BMP-2 из материалов на основе полилактида [Chang et al., 2007; Schliephake et al., 2007]. In vivo применение полилактида в сочетании с BMP-2 впервые отмечено ещё в 1989 г [Lovell et al., 1989]. Материалы на основе полилактидов могут служить биосовместимыми матрицами для доставки факторов роста, которые стимулируют экто- и ортотопический остеогенез при подкожной, внутримышечной и внутрикостной имплантации [Saitoh et al., 1994; Schliephake et al., 2008; Gruber et al., 2009]. Тем не менее задача разработки костно-пластического материала на основе термотропного хитозанового гидрогеля и высокопористых полилактидных гранул, способных пролонгировано высвобождать BMP-2, ещё не была поставлена.

Коллагеновый гель широко используется в качестве основы для костнопластических материалов. Большинство существующих и разрабатываемых материалов на его основе, применяются в стоматологии для заполнения костных дефектов пародонта [Kosen et al., 2012; Iviglia, Kargozar, Baino, 2019; Edelmayer et al., 2020]. Прочностные свойства коллагеновых гидрогелей в составе этих материалов часто улучшаются добавлением кальцийсодержащих наполнителей в виде кристаллов гидроксиапатита или ß-глицерофосфата [Wang et al., 2006; Sheikh et al., 2015]. Существует опробованная in vitro технология импрегнации и пролонгированного высвобождения BMP-2 из состава коллагенового гидрогеля, основанная на конкурентном связывании фибронектина с коллагеном [Осидак, 2014]. Однако эта технология ещё не была изучена in vivo, в том числе в составе композиции с модификаторами прочностных свойств типа полилактидных гранул, гидроксиапатита или ß-глицерофосфата, и не поставлена задача получения костнопластического материала нового поколения на её основе, способного

одновременно удовлетворять таким условиям, как удобные манипуляционные свойства, способность к отверждению после внесения в рану и индукции остеогенеза.

Таким образом, выбранное направление по получению нового класса костно-пластических материалов на основе отверждаемых гидрогелей и BMP-2, сочетающих высокие остеоиндуктивные, биосовместимые и манипуляционные свойства и направленное на удовлетворение основных потребностей стоматологов при проведении костных пластик, является перспективным и требует проведения комплексных исследований in vitro и in vivo по оценке биологических и физико-механических свойств.

Цель исследования

Разработать композиции костно-пластических материалов нового класса на основе отверждаемых гидрогелей и ВМР-2, сочетающих высокие остеоиндуктивные, биосовместимые и манипуляционные свойства для стоматологии и челюстно- лицевой хирургии.

Задачи исследования

1. Получить композиции материалов нового поколения на основе хитозанового геля и полилактида, а также коллаген-фибронектинового геля, обладающие необходимыми для использования в стоматологии остеоиндуктивными, биосовместимыми и манипуляционными свойствами.

2. Изучить физико-механические и реологические свойства композиций проектируемых материалов на основе хитозанового и коллагенового гидрогелей в зависимости от времени, нагревания и степени наполнения

модификаторами прочностных свойств и определить лучшие по манипуляционным свойствам композиции с точки зрения удовлетворения потребностей стоматологии.

3. Оценить способность компонентов материалов пролонгированно высвобождать остеоиндуктор BMP-2 из компонентов проектируемых материалов.

4. На культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из пульпы зуба, исследовать цитотоксичность и способность поддержания клеточной адгезии материалов и их компонентов и подобрать наиболее цитосовместимые компоненты.

5. В эксперименте in vivo на модели эктопического остеогенеза при подкожной имплантации исследовать биосовместимость и остеоиндуктивные свойства компонентов и композиций проектируемых костно-пластических материалов на основе коллагенового и хитозанового гидрогелей.

6. Исследовать in vivo способности композиции геля на основе хитозана и высокопористых полилактидных гранул, импрегнированных rhBMP-2, индуцировать эктопический и ортотопический остеогенез in vivo на моделях подкожной имплантации и имплантации в область критического дефекта теменных костей у крыс.

7. Исследовать in vivo остеоиндуктивные способности композиции на основе коллагена с высокопористыми полилактидными гранулами 12 масс.%, импрегнированными rhBMP-2, стимулировать образование костной ткани при ортотопическом и эктопическом остеогенезе на моделях подкожной имплантации и имплантации в область критического дефекта теменных костей у крыс.

8. Оценить остеоиндуктивные способности композиции на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, где rhBMP-2 импрегнирован непосредственно в гель, в зависимости от типа наполнителя: высокопористых полилактидных гранул или смеси гидроксиапатита с Р-трикальцийфосфатом.

9. На основе проведённых исследований определить наиболее перспективные для стоматологии композиции полученных костно-пластических материалов нового поколения.

Научная новизна исследования

Впервые получены композиции материалов нового поколения, сочетающие удобные манипуляционные свойства, биосовместимость, способность к термоотверждению и эффективной индукции остеогенеза.

Впервые исследовано воздействие свободных аминогрупп хитозана на цитотоксичность и лейкоцитарную инфильтрацию in vitro и in vivo и предложен способ устранения этого недостатка с помощью реацетилирования хитозана. Показана эволюция биосовместимых и прочностных свойств хитозан-глицерофосфатных гидрогелей в зависимости от степени реацетилирования хитозана.

Впервые произведена сравнительная оценка эффективности различных дозировок rhBMP-2 in vitro и in vivo и оценена кинетика высвобождения rhBMP-2 из матриц-носителей на основе хитозана, полилактидов, коллаген-фибронектинового геля, гидроксиапатита и исследованы цитосовместимость и остеоиндуктивные свойства этих матриц-носителей.

Впервые показано воздействие объёма, пористости, молекулярной массы и типа изомера полилактидных наполнителей на физико-механические свойства в составе отверждаемых гидрогелей на основе коллагена и хитозана in vivo.

Впервые произведено комплексное исследование физико-механических и биологических свойств in vitro и in vivo композиции на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного rhBMP-2, в том числе с использованием наполнителей в виде высокопористых полилактидных гранул и смеси гидроксиапатита с ß-трикальцийфосфатом.

Впервые произведено комплексное исследование физико-механических и биологических свойств in vitro и in vivo композиции на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненного высокопористыми полилактидными гранулами, импрегнированными rhBMP-2.

Впервые произведено сравнение эффективности разработанных композиций костно-пластических материалов нового поколения in vivo на моделях орто- и эктопического остеогенеза у крыс, а также клеточных культурах ММСК и произведено сравнение физико-механических свойств, что в сумме позволило дать оценку перспективе полученных композиций в стоматологии.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Теоретические данные, полученные в результате выполненного исследования, вносят существенный вклад в проектирование костно-пластических материалов. Методы реализации отверждаемой матрицы на основе гидрогеля, способной к пролонгированному высвобождению белка, могут быть использованы в других отраслях биологии и медицины при проектировании имплантируемых материалов для регенеративной медицины.

Практическая значимость работы заключается в возможности использования полученных композиций моделируемых, отверждаемых, биосовместимых, биорезорбируемых и остеоиндуктивных костно-пластических материалов нового поколения в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии после прохождения этапов лицензирования.

Методология и методы исследования

Структура исследования включала два логических этапа. Первый этап заключался в исследовании физико-механических и реологических свойств материалов и их компонентов. Второй этап заключался в in vitro исследовании биологических свойств на клеточных линиях и оценке in vivo способности компонентов и композиций проектируемых материалов стимулировать эктопический и ортотопический остеогенез, а также вызывать воспаление.

На первом этапе получали компоненты и композиции проектируемых материалов и исследовали их физико-механические и реологические свойства (сжатие, растяжение, упругость, вязкость и т. п.). Также на первом этапе исследования оценивали кинетику высвобождения остеоиндуктора rhBMP-2 из компонентов проектируемого материала иммунохимическим методом (ИФА).

Далее in vitro оценивали цитосовместимость на клеточных культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) с помощью MTT-теста и оценивали адгезию клеток с помощью витальной флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Эффективную концентрацию в зависимости от происхождения rhBMP-2, способную индуцировать остеогенную дифференцировку ММСК, оценивали с помощью методов молекулярной биологии и культуральных методов (экспрессия маркеров остеогенной дифференцировки: РТ-ПЦР; экспрессия ферментов: кинетический колориметрический тест; выявление минерализованного матрикса окрашиванием ализариновым красным и т.п.).

На этапе in vivo при подкожной, внутримышечной и внутрикостной имплантации крысам оценивали способность компонентов и композиций проектируемых материалов стимулировать эктопический и ортотопический остеогенез, а также воспаление. Для этого были использованы модели подкожной и внутримышечной имплантации и модель критического дефекта теменных костей.

Некроптаты из зон имплантации подвергали гистологическому и в ряде случаев иммуногистохимическому исследованию с последующей морфометрией.

Все числовые данные, полученные в ходе экспериментов, анализировали с помощью статистических методов.

При выборе последовательности и объёма исследований для каждого компонента и вариации разрабатываемых материалов руководствовались результатами, полученными на предыдущих этапах исследований.

Положения, выносимые на защиту

Получены композиции материалов нового поколения, которые сочетают удобные манипуляционные свойства, биосовместимость, способность к термоотверждению и эффективной индукции остеогенеза.

Минимально эффективная дозировка rhBMP-2 для стимуляции остеогенеза составляет 10мкг/мл: она способна индуцировать эктопический остеогенез in vivo и способна стимулировать остеогенную дифференцировку культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

Как высокопористые полилактидные гранулы, так и коллаген-фибронектиновый гидрогель способны пролонгированно высвобождать rhBMP-2 более 3 сут, т. е. к фазе начала активной остеогенной дифференцировки при регенерации костной ткани. Хитозановый гидрогель и гранулы хитозана неспособны удерживать основную массу rhBMP-2 более 1 сут.

По упругим свойствам высокопористые полилактидные материалы на основе L-изомеров молочной кислоты превосходят материалы на основе D,L-изомеров, обладая удовлетворительной цитосовместимостью.

Коллаген-фибронектиновые и хитозан-глицерофосфатные гели способны к термоотверждению при температуре плюс 37оС, т. е. внутренней среды организма, и их физико-механические свойства позволяют в достаточной мере сопротивляться деформирующей силе мягких тканей.

Аминогруппы хитозана оказывают цитотоксическое воздействие и стимулируют лейкоцитарную инфильтрацию. Реацетилирование хитозана снижает количество свободных аминогрупп и повышает биосовместимость термотропных хитозан-глицерофосфатных гидрогелей. Реацетилированный до 39 DD% хитозан в комбинации с высокопористыми полилактидными гранулами наилучшим образом повышает биосовместимость композиции.

Коллагеновый и коллаген-фибронектиновый гидрогели являются цито- и биосовместимыми компонентами: их использование не сопровождается клеточной гибелью in vitro и воспалением in vivo. Насыщение коллаген-фибронектинового гидрогеля высокопористыми полилактидными гранулами и смесью гидроксиапатита с Р-трикальцийфосфатом также не вызывает клеточной гибели и воспаления.

Экто- и ортотопический остеогенез может быть индуцирован полученными композициями костно-пластических материалов нового поколения: (1) на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненного 12 масс.% высокопористых (98%) полилактидных гранул, импрегнированных rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл; (2, 3) на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл и наполненная 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул или наполненная 35 масс.% смеси гидроксиапатита с Р-трикальцийфосфатом; (4) на основе коллагенового гидрогеля, наполненного высокопористыми полилактидными гранулами 12 масс.%, импрегнированными rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл.

По сумме физико-механических, органолептических и биологических свойств наиболее перспективными для использования в стоматологии являются две композиции: первая - композиция на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненная 12 масс.% высокопористых (98%) полилактидных гранул, импрегнированных rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл; вторая - композиция на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированная rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл и наполненная 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность результатов обусловлена достаточным количеством групп и выборок и подтверждена адекватно применёнными статистическими методами и последовательностью методологии исследования.

Материалы диссертации были доложены на Всероссийской конференции с международным участием «StemCellBio 2016: фундаментальная наука, как основа клеточных технологий» (СПб, 2016); Сеченовском Международном Биомедицинском Саммите (SIBS) (Москва, 2017, 2018, 2019); Конгресс по регенеративной медицине (Москва, 2017); Саммите FEBS: Biochemistry & Molecular biology. (Прага, 2018); VII Бакеевской всероссийской с международным участием конференции «Макромолекулярные нанообъекты и полимерные нанокомпозиты» (Москва, 2018); 23-я международной Пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2019); XXI ежегодном научном форуме «Стоматология 2019» (Москва, 2019); IV Национального конгресс по регенеративной медицине (Москва, 2019).

Апробация диссертации проведена 23 сентября 2020 года на совместном заседании сотрудников структурных подразделений ФГБУ НМИЦ «Центрального научно-исследовательского института стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России: отдел хирургической стоматологии, отделение клинической и экспериментальной имплантологии, отдел общей патологии, рентгенологическое отделение, отделение челюстно-лицевой хирургии; и ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова»: лаборатория генетики стволовых клеток, лаборатория мутагенеза, лаборатория редактирования генома, научно-клинический отдел муковисцидоза, лаборатория молекулярной биологии.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Васильев Андрей Вячеславович, 2021 год

материала

В качестве меры, повышающей биологическую эффективность разрабатываемого материала на основе термотропного хитозанового гидрогеля и высокопористых полилактидных гранул, была рассмотрена возможность увеличения концентрации остеоиндуктора гИБМР-2. Для этого по используемой ранее технологии в состав включали гИБМР-2 в концентрации 50 мкг на 1 мл материала, что в 5 раз превышало установленную минимально эффективную концентрацию. Материал имплантировали в область критического дефекта теменных костей крыс и на 28 сутки, к моменту окончания первичного остеогенеза, анализировали гистологические срезы области имплантации.

Объём новообразованной костной ткани при имплантации композиции на основе на основе термотропного хитозанового гидрогеля и высокопористых полилактидных гранул, импрегнированных гИБМР-2 в концентрации 50 мкг/мл, существенно превышал размеры дефекта и выталкивал материал за его пределы. Объём костной ткани относительно объёма материала (ЫЪ.Аг.%) составлял (64 ± 4)%. В толще костного регенерата определялись лакуны,

содержащие костный мозг, что демонстрирует дозазависимый эффект ВМР-2: чем больше остеоиндуктора, тем интенсивней неоостеогенез.

Однако настолько интенсивный неоостеогенез приводит к существенному превышению объёма изначально заданной с помощью материала формы дефекта: объём костной ткани относительно объёма исходного дефекта превышал 106%. Так, полученный эффект можно описать как гиперостоз и характеризовать как нежелательный. В связи с эти в качестве наиболее эффективной и безопасной дозировке гЪВМР-2 было решено выбрать 10 мкг/кг.

3.5.5 Общий вид итоговой композиции на основе хитозанового гидрогеля

Среди всех исследуемых вариаций композиций наилучшие результаты показал материал на основе термотропного гидрогеля из порошка реацетилированного хитозана (39 ВБ%) и 50% раствора Р-глицерофосфата, наполненного высокопористыми (98%) полилактидными гранулами (12 масс.%), импрегнированными гЪВМР-2 (10 мкг/мл). Он обладал высокой биосовместимостью и выраженными остеоиндуктивными свойствами. Кроме того, материал обладал удобными манипуляционными и пластическими свойствами: легко моделировался и удерживал заданную форму после отверждения (Рисунок А.89).

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения разработанной композиции в качестве остеопатического материала для восполнения костных дефектов в челюстно-лицевой области.

З.б Материалы на основе коллагенового гидрогеля

В качестве альтернативы материалу на основе отверждаемого хитозанового гидрогеля и высокопористых полилактидных гранул, описанного в предыдущей главе, был рассмотрен материал на основе коллагенового гидрогеля. Главным достоинством коллагена является его биосовместимость и популярность, как основы для биорезорбируемых имплантационных материалов. Кроме того, гели на основе коллагена, как и хитозана, способны к отверждению. Коллаген был рассмотрен в качестве альтернативы хитозану в составе композиционного моделируемого и отверждаемого остеоиндуктивного материала.

3.6.1 Физико-механические свойства

Способность к растворению и гелезации в воде коллагена зависит от pH окружающей среды, температуры и наличия сшивающих агентов [Marelli et al., 2015; Pal, Suresh, 2017]. То есть коллаген можно рассматривать как основу проектируемого костно-пластического материала, способную отверждаться после внесения в рану. Добавление небольшого количества фибронектина позволяет обеспечивать пролонгированное высвобождение BMP-2 [Осидак и др., 2014]. В связи с этим были исследованы реологические свойства 5% коллаген-фибронектинового гидрогеля через 15 мин после инкубации в бикарбонатном буферном растворе.

Было показано, что у коллаген-фибронектинового гидрогеля после отверждения в условиях, приближенным ко внутренней среде организма, модуль накопления превышает модуль потерь во всём диапазоне сжатия материала. При этом во всём диапазоне наблюдается линейное уменьшение разницы этих модулей. Полученные данные говорят о том, что гель после инкубации в условиях, приближенных ко внутренней среде организма по температуре и pH, сохраняет

свойства твёрдого тела и способен сопротивляться нагрузке мягких тканей (Рисунок A.90) [Кобелев и др., 2012].

Органолептические мануальные исследовании коллаген-фибронектинового гидрогеля также показали его с лучшей стороны. Так, гель после отверждения на ощупь напоминал очень мягкую резину. Однако способность удерживать заданную форму до отверждения оставалась неудовлетворительной, что не позволяло моделировать из него геометрические фигуры узнаваемой формы, типа параллелепипед, пирамида, шар и пр. В таком виде перспектива использования материала в стоматологии ограничивается закрытием многостеночных костных дефектов в пародонтологии и при удалении кистообразных новообразований внутри костей. В связи с этим материал был исследован in vitro и in vivo как есть, после чего производилась подборка модификаторов его прочностных свойств, позволяющих повысить удобство моделирования (данные представлены в главе 3.7).

3.6.2 Цитотоксичность и клеточная адгезия

Материал на основе высокоочищенного гидрогеля коллагена показал высокую биосовместимость in vitro при исследовании на клеточных культурах. Так, МТТ-тест не выявил статистически значимых изменений в относительной жизнеспособности ММСК из жировой ткани после 1, 4, 7 сут инкубации в присутствии гидрогеля на основе коллагена и высокоочищенного коллагена и фибронектина, (Рисунок A.91). На всех сроках наблюдения во всех повторах исследуемый высокоочищенный коллагеновый гидрогель способствовал клеточной адгезии (Рисунок A.92) [Васильев и др., 2019а].

3.6.3 Высвобождение rhBMP-2 из коллаген-фибронектинового гидрогеля

По данным ИФА коллаген-фибронектиновый гидрогель обеспечивал максимальный пик высвобождения rhBMP-2 c 4 по 6 сутки: общее количество белка, высвободившегося в этом интервале, составило (17 ± 7)% (Рисунок A.93). При этом потери при высвобождении составили (47 ± 12)%, что статистически значимо отличалось от контрольных значений (p = 0,03) [Васильев и др., 2019а, Vasilyev et al., 2019].

Таким образом, использование фибронектина позволило получить гель, который способен самостоятельно обеспечивать пролонгированное высвобождение BMP-2 без необходимости использования дополнительных контейнеров для доставки.

3.6.4 Эффективность коллаген-фибронектинового гидрогеля in vivo

При подкожной имплантации коллаген-фибронектиновых гидрогелей, содержащих rhBMP-2, на 28 сут эксперимента была показана способность стимулировать образование костной ткани. Так, на гистологических срезах по периферии материала наблюдалось врастание кровеносных микрососудов. Сосуды сопровождались участками первичного остеогенеза, а именно, минерализованным матриксом новообразованной костной ткани, который выглядел тёмно-фиолетовым при окраске гематоксилином и эозином и тёмно-синим при окраске по Массону с анилиновым синим (Рисунок A.94).

При внутрикостной имплантации в критический дефект теменных костей крыс после имплантации материалов наблюдали скопление новообразованной костной ткани, окружающие имплантированный коллагеновый материал. Следов значимой лейкоцитарной и лимфоцитарной инфильтрации выявлено не было. Только на отдельных препаратах в редких полях зрения были выявлены единичные

плазматические клетки и лимфоциты, выходящие из полнокровных сосудов (Рисунок А.96).

При морфометрическом анализе серийных гистологических срезов наблюдалось статистически значимое различие в относительной объёмной площади новообразованной костной ткани между внутримышечной и подкожной имплантацией. Основа проектируемого материала в виде коллаген-фибронектинового гидрогеля, содержащего гЪВМР-2 была способна индуцировать выраженный остеогенез у крыс, спустя 28 сут замещаясь новообразованной костной тканью на (8 ± 4)% своего объёма при подкожной имплантации в области холки, на (17 ± 10)% - при внутримышечной имплантации в трёхглавую мышцу бедра и на (26 ± 11)% - при внутрикостной имплантации в критический дефект теменных костей (Рисунок А.97) [Васильев и др., 2019в].

3.7 Модификация прочностных свойств коллагенового гидрогеля с

помощью наполнителей

3.7.1 Наполнение ординарным костно-пластическимматериалом на основе

гидроксиапатита и трикальцийфосфата

Материалы на основе гидроксиапатита и трикальцийфосфата являются самыми распространёнными среди ординарных костно-пластических материалов. Существуют как материалы содержащие отдельно гидроксиапатит или трикальцийфосфат, среди которых наиболее известными в России представителями следует назвать Вю-Обб и Трикафор, так и комбинированные, такие как Индост Гранулы, содержащие 30-50% гидроксиапатита и 50-70% трикальцийфосфата.

В качестве модификатора прочностных свойств нами был выбран материал Индост Гранулы по ряду причин. Во-первых, гранулы Индоста имеют более

разнородную структуру, размер которых находится в пределах 0,25 - 2 мм, что теоретически позволяет лучше наполнить объём геля. Во-вторых, Индост Гель представляет комбинацию гидроксиапатита и трикальцийфосфата, что даёт возможность оценить воздействие этих компонентов в комплексе. Во-вторых, этот материал производится в России и обладает в несколько раз более низкой ценой по сравнению с импортными аналогами при этом существенно не уступая им в цитосовместимости и клинической эффективности, что повышает перспективу его использования в качестве сырья для производства разрабатываемого материала.

3.7.1.1 Физико-механические свойства

Полученные композиции на основе 5% коллаген-фибронектинового гидрогеля с различным содержанием смеси ГАП с Р-глицерофосфатом («Индост Гранулы», Полистом, Россия) были исследованы на сжатие. Механические характеристики полученных образцов исследовали испытанием на сжатие на испытательной машине 1ш1гоп. Скорость деформации 50%/мин. Образцы имели цилиндрическую форму диаметром от 4,4 до 4,6 мм и высотой от 4 до 5 мм. Модуль упругости определяли по тангенсу угла наклона касательной к кривой в диапазоне 0-10 % деформации.

Для системы на основе 5% коллаген-фибронектинового гидрогеля с различным содержанием смеси ГАП с Р-глицерофосфатом модуль упругости существенно возрастал с увеличением количества гранул (Рисунок А.98). При этом на кривой деформации отчетливо наблюдали потерю связанности при 30% деформации из-за нарушения адгезии гранул к матрице. Эти данные также были подтверждены при органолептическом исследовании: когда из композиций моделировали различные формы с помощью шпателя и пальцев материал с 50% наполнением гранул рассыпался в руке при сжатии, что затрудняло работу с ним.

По этой причине для дальнейших исследований была выбрана композиция с 35% наполнением.

3.7.1.2 Исследование in vivo

На модели подкожной имплантации в области холки крысам была оценена биосовместимость материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, насыщенного материалом Индост -гранулы. Было показано, что исследуемая композиция спустя 28 сут после подкожной имплантации с периферии прорастала соединительной тканью и сосудами (Рисунок A.99). На периферии коллаген замещался соединительной тканью. Гигантские клетки инородных тел в большом количестве окружали гранулы Индоста. В отдельных полях зрения определялись единичные плазматические клетки, лимфоциты и лейкоциты. В целом картина регенерации соответствовала картине регенерации в области имплантации трикальцийфосфата или гидроксиапатита [Гурин, 2009b]. Центр композиции к 28 сут не подвергался резорбции и миграция клеток в эту область не определялась (Рисунок A.99).

При имплантации в область критического дефекта картина регенерации в области материала соответствовала таковой при подкожной имплантации. Так, материал с периферии прорастал соединительной тканью и сосудами, а гранулы материала по периферии были окружены многочисленными клетками инородных тел (Рисунок A.100). Образование костной ткани в небольшом количестве происходило от краёв материнской костной ткани, что свидетельствует об отсутствии остеоиндуктивных свойств исследуемой композиции.

Для обеспечения остеоиндуктивных свойств в состав композиции коллаген-фибронектинового гидрогеля был включён BMP-2 в концентрации 10 мкг/мл, после чего добавлена смесь ГАП с Р-глицерофосфатом «Индост-гранулы». В результате импрегнации композиции BMP-2 удалось индуцировать неоостеогенез в толще

материала и по его периферии. Так, в области врастания кровеносных сосудов наблюдали замещение коллагеновой матрицы композиции на молодую пластинчатую костную ткань, которая составляла (25 ± 7)% от объема имплантированного материала (№.Аг.%) (Рисунок А. 101).

3.7.2 Наполнение высокопористыми полилактидными гранулами

3.7.2.1 Физико-механические свойства

Для получения высокопрочных гидрогелей на основе коллагена был применен подход наполнения пористыми гидрофобными полилактидными гранулами растворов коллагена с последующим гелеобразованием, связанным с изменением рН раствора. Такой подход давал возможность моделирования материала в ране с последующим формированием более высокомодульного гидрогеля.

На оптических фотография видно (Рисунок А.102), что с увеличением концентрации гранул происходит их уплотнение. При этом уже при 1 масс.% гранул наблюдаются их зацепления, что и определяет повышение механических характеристик.

На микрофотографиях отчетливо наблюдаелась взаимодействие гранул с гидрогелевой матрицей полимера, при этом сохраняется пористость гранул (Рисунок А.103).

Для системы на основе 5% коллаген-фибронектинового гидрогеля с различным содержанием высокопористых полилактидных гранул наблюдался продолжительный линейный участок упругой деформации и плавное увеличение напряжения при больших деформациях, связанное с уплотнением материала при сжатии (Рисунок А.104). Однако аналогично модулю упругости, напряжение при 50% деформации возрастало до 20 масс.% наполнения. Резкое падение напряжения

было связано с частичным разрушением материала из-за нарушения непрерывности фазы геля, который играл роль связующего компонента системы.

При сравнении систем с максимальным наполнением до начала разрушения материала при 50 % сжатии можно видеть, что наибольшее напряжение показывает система с высокопористыми полилактидными гранулами по сравнению с гранулами Индоста.

Таким образом, наполнение пористыми полилактидными гранулами коллагенового гидрогеля приводит к увеличению модуля упругости системы при сохранении эластичности, что позволяет их использовать в широком диапазоне нагрузок. Было показано, что при применении такого подхода модуль упругости коллагенового гидрогеля растет с 80 кПа до 400-600 кПа при доле высокопористых полилактидных гранул 12-15%, и до 1,8 Мпа при наполнении 20-25% гранул. Данные модули упругости находятся в диапазоне прочностных свойств от соединительной до хрящевой тканей. Важно отметить, что повышение прочности в данном случае сопровождается снижением плотности материала, то есть ростом пористости.

Высокопористые полилактидные гранулы во время приготовления образцов деформируются и содержат воздушные полости, что делает невозможным расчёт их объёмной доли в геле. Так, на графике ниже видно, что практическая плотность превышает теоретическую, что подтверждает факт сминания гранул (Рисунок A.105). С другой стороны, снижение плотности ниже 1,0 г/см3 по мере насыщения геля гранулами подтверждает факт неполного смачивания гранул и наличия в них заполненных воздухом полостей.

3.7.2.2 Исследование in vivo

При подкожной имплантации композиции на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, наполненного высокопористыми полилактидными

гранулами было показано, что исследуемая композиция к 28 сут с периферии прорастала соединительной тканью и сосудами (Рисунок А.106). На периферии коллаген замещался соединительной тканью. Гигантские клетки инородных тел окружали высокопористые полилактидные гранулы. В отдельных полях зрения определялись единичные плазматические клетки, лимфоциты. В целом картина регенерации соответствовала картине регенерации в области имплантации полилактидов и их сополимеров. Центр композиции к 28 сут не подвергался резорбции и миграция клеток в эту область не определялась (Рисунок А. 106). Очаги неоостеогенеза не были выявлены, что говорит об отсутствии остеоиндуктивных свойств исследуемой композиции без ВМР-2.

Как нами ранее было показано, и высокопористые полилактидные гранулы и коллаген-фибронектиновый гель обладают способностью пролонгировано высвобождать ВМР-2. В связи с этим в качестве носителя ВМР-2 поочерёдно были использованы оба компонента. В первом случае ВМР-2 импрегнировали в высокопористые полилактидные гранулы, после чего наполняли ими коллагеновый гель. Фибронектин при этом не использовали, так в нём не было необходимости: как было показано ранее, его функция связана с удержанием ВМР-2. Во втором случае ВМР-2 импрегнировали в коллаген-фибронектиновый гидрогель, после чего наполняли его высокопористыми полилактидными гранулами.

При подкожной имплантации в обоих вариантах удалось индуцировать неоостеогенез. Однако объём и структура новообразованной костной ткани различались. Так, у композиции, где ВМР-2 импрегнировали в высокопористые полилактидные гранулы очаги неоостеогенеза, представленные молодой пластинчатой костной тканью, окружали гранулы и прорастали в них, образуя центры аппозиционного роста (Рисунок А.107). У композиции, где ВМР-2 импрегнировали в коллаген-фибронектиновый гидрогель наблюдали очаги неоостеогенеза в области по периферии границ геля. Новообразованная пластинчатая костная ткань при этом образовывала «корочку» на поверхности материала (Рисунок А.108). При этом очаги новообразованной костной ткани в толще материала наблюдалось редко. Это свидетельствует о том, что

напластования костной ткани по периферии материала могли служить барьером, препятствующим резорбции и врастанию сосудов внутрь материала.

При имплантации в область критического дефекта теменных костей у крыс объём новообразованной костной ткани превышал объём новообразованной костной ткани при подкожной имплантации. При этом структура костных регенератов, а именно обрастание костной ткани вокруг полилактидных гранул с гКВМР-2 и образование «корочки» костной ткани вокруг материала, где ВМР-2 импрегнировали в коллаген-фибронектиновый гидрогель сохранялась (Рисунок А.109, Рисунок А. 110). Объём костной ткани, где ВМР-2 импрегнировали в коллаген-фибронектиновый гидрогель, составлял (61 ± 15)% против (23 ± 8)%, где ВМР-2 помещали в полилактидные гранулы. Как было показано на предыдущих этапах при импрегнации ВМР-2 в высокопористые полилактидные гранулы происходят более высокие потери белка (см. раздел 3.2.3 и 3.6.3). Это объясняет различия в эффективности остеоиндукции.

Также можно отметить, что в случае использования композиции на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля импрегнированного ВМР-2 использование полилактидных гранул способствовало образованию существенно большего костной ткани по сравнению с композицией, где в качестве наполнителя использовали ГАП с Р-глицерофосфатом «Индост-гранулы». Разница была более чем в 2 раза в пользу композиции с полилактидным наполнителем: (61 ± 15)% против (25 ± 7)%. Вероятная причина этого, как было показано ранее при исследовании гранул ГАП (Вю-Обб), связана с адсорбцией и избыточной ретенцией ВМР-2 к поверхности кальций-фосфатных материалов (см. раздел 3.4.2).

3.7.3 Вид итоговой композиции материала на основе коллагенового гидрогеля

Наилучшими свойствами обладал материал на основе коллагенового гидрогеля, насыщенного 12% высокопористыми полилактидными гранулами с ВМР-2 в концентрации 10 мкг/мл.

3.8 Группа сравнения: Индост-гель

В качестве группы сравнения был использован материал Индост-гель (Полистом, Россия). Он состоит из коллагенового геля, наполненного смесью ГАП и Р-глицерофосфата. Материал Индост-гель производится в России и среди отечественных материалов по композиции и свойствам наиболее приближен к разрабатываемым основам для костно-пластических материалов.

3.8.1 Реологические свойства Индост-гель

Реологические свойства Индост-гель и органолептическая оценка на предмет моделируемости выявила ряд недостатков. Так, утрата материалом свойств твёрдого тела наблюдалось после 1% деформации. Моделирование формы с помощью материала Индост-гель также было затруднено. Материал не удерживал заданную форму. Однако в процессе имплантации материала крысам было отмечено, что при взаимодействии с кровью материал начинал уплотняться: такой эффект, по всей видимости, был связан с утратой растворимости коллагена в буферных системах крови с приблизительно нейтральным водородным показателем (рН). То есть материал подходит для использования для заполнения многостеночных дефектов, но не годится для ситуаций, где от материала требуется удерживать заданную форму.

3.8.2 Цитотоксичность и клеточная адгезия in vitro

По данным МТТ-теста культивирование ММСК в присутствии исследуемых материалов показало отсутствие статистически значимого негативного влияния на относительную выживаемость клеток (Рисунок A.113). Кроме того, к концу 7 сут было отмечено статистически значимое увеличение относительной выживаемости ММСК, культивируемых в присутствии «Индост гель» (p=0,006).

Индост-гель способствовал клеточной адгезии. С первых сут эксперимента клетки распластывались и равномерно распределялись по поверхности материалов, изменяя свою форму с полигональной до вытянутой веретеновидной к 7 сут. Однако в отдельных участках наблюдалось ошаривания клеток, что было связано с неоднородной структурой материала: участки с гидрогелем коллагена за счёт избыточного набухания поверхностных слоёв способствовали миграции клеток внутрь материала и их взвешенному нахождению в неплотной среде. Такая картина не наблюдалась, где гель визуально имел более плотную консистенцию или в области, где под клетками оказывались частицы ГАП или ß-глицерофосфата.

3.8.3 Эффективность Индост-гель при подкожной и внутрикостной

имплантации in vivo

При подкожной имплантации Индост-гель не провоцировал острого экссудативного воспаления. Пространства, содержащие коллагеновый гель, прорастали сосудами и клетками. Гранулы ß-глицерофосфата, в отличие от ГАП, определялись в большинстве полей зрения и составляли подавляющий объём от всего минерального наполнителя (Рисунок A.115). Они были окружены огромным количеством гигантских клеток инородных тел или многоядерных макрофагов, которые составляли (156 ± 15) на 1 мм2. То есть количество многоядерных

макрофагов было почти в 2 раза больше, чем при имплантации высокопористых полилактидных гранул или в 4-5 раз больше, чем при имплантации ГАП Вю-Обб. В отдельных полях зрения вокруг и внутри материала Индост-гель наблюдалось скопление лимфоцитов и плазматических клеток, что свидетельствует о наличии слабовыраженного хронического воспаления. Такого эффекта не было обнаружено в разработанном и исследованном на предыдущем этапе материале на основе высокоочищенного коллагенового геля и смеси ГАП и Р-глицерофосфата - Индост-гранулы. Это свидетельствует о том, что, по всей видимости, причина такого воспаления связана с недостаточной очисткой коллагена в материале Индост-гель (см. раздел 3.7.1).

При внутрикостной имплантации в критический дефект теменных костей крыс материал Индост-гель не способствовал индукции неоостеогенеза. Новообразованная костная ткань была выявлена только по краям дефекта и отсутствовала в центре (Рисунок А.116). Это свидетельствовало о том, что материал Индост-гель не обладает остеоиндуктивными свойствами. В результате объём костной ткани, образованной при использовании материала Индост-гель, составил (4,2 ± 1,7)% (Рисунок А.58). Интересной особенностью заживления критического дефекта было то, что центр дефекта зарастал фиброзной тканью с небольшим содержанием остатка материала, в то время как основная масса материала Индост-гель инкапсулировалась, ошаривалась и смещалась кверху относительно дефекта (Рисунок А.58). Эта тенденция была выявлена на всех исследуемых некропсиях и гистопрепаратах. Это могло быть связано с тем, что при нагревании, взаимодействии с буферными системами организма и гелезации основы в виде раствора коллагена происходит его сжатие и уплотнение за счёт вытеснения воды. Картина резорбции материала при этом не отличалась от подкожного введения: вокруг гранул Р-глицерофосфата наблюдалось многочисленное скопление гигантских клеток инородных тел.

140

4 ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Сравнение полученных материалов между собой

В результате работы были получены варианты различных композиций, которые можно отнести к новому классу костно-пластических материалов, единовременно сочетающих такие качества как биосовместимость, остеоиндуктивные и -кондуктивные свойства, способность к биорезорбции, моделируемость, способность удерживать заданную форму после внесения в рану за счёт отверждения.

В таблице ниже приведены суммарные данные по таким важным характеристикам полученных композиций, как физико-механические свойства и способность заполнять костной тканью критический по размеру дефект кости, то есть тот дефект, который не может регенерировать полностью самостоятельно (Таблица А.12). И по этим данным можно видеть, что наиболее выгодными свойствами обладают две композиции. Первая, композиция на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненная 12 масс.% высокопористых (98%) полилактидных гранул, импрегнированных гЪВМР-2 в концентрации 10 мкг/мл. Вторая, композиция на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированная гЪВМР-2 в концентрации 10 мкг/мл и наполненная 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул. Их использование через 28 позволяет заместить более половины от их объёма, а стало быть и более половины от объема дефекта, костной тканью.

Материал на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля изначально обладал лучшими прочностными свойствами. Однако, как было показано, за счёт избыточного количества аминогрупп провоцировал клеточную гибель и острое экссудативное воспаление. Закрытие аминогрупп с помощью реацетилирования хитозана снизило его цитотоксические и провоспалительные свойства. Но, с другой стороны, способность к отверждению также была снижена за счёт снижения

аминогрупп, с которыми взаимодействует гелезующий агент Р-глицерофосфат. Тем не менее высокие остеоиндуктивные свойства готовой композиции на основе геля из реацетилированного хитозана с высокопористыми полилактидными гранулами позволяют рассматривать её как альтернативу композиции на основе коллаген-фибронектинового геля с таким же наполнителем (Рисунок A.11).

Что касается использования композиции на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, где в качестве наполнителя использовали ГАП с Р-глицерофосфатом «Индост-гранулы», то вероятная причина сравнительно более малого объёма новообразованной костной ткани могла быть связана с связана с адсорбцией и избыточной ретенцией BMP-2 к поверхности кальций-фосфатных материалов [Hanseler et al., 2015; Huh et al., 2015]. Широко представленные коммерческие ординарные костно-пластические кальций- и фосфат-содержащие материалы типа Bio-Oss, Индост-гранулы и пр. могли бы использоваться врачом отдельно для самостоятельного доведения коллаген-фибронектинового гидрогеля до нужной наполненности и консистенции. Однако факт их негативного действия на BMP-2 требует использования его высоких дозировок, что потенциально существенно увеличивает стоимость итоговой композиции, либо делает её менее безопасной. Результат негативного взаимодействия на BMP-2 материалов из ГАП был также продемонстрирован в работе других авторов при проведении синус-лифтинга [Kao et al., 2012]. На этом фоне высокопористые коллагеновые гранулы выглядят более выигрышно: за счёт проникновения нитей коллагена в их поры они увеличивают его вязкость и являясь более упругими существенно улучшают манипуляционные и моделированные свойства материала, при этом принципиально не отличаясь по жёсткости. Кроме того, пористость полилактидных гранул даёт итоговой композиции лучшие остеокондуктивные свойства, которые в том числе определяются способностью сосудов прорастать и прогениторных клеток мигрировать внутрь материала. Этого также позволяет достичь высокая пористость полилактидных гранул.

Интересно, что использование только полилактидных гранул не даёт такого прироста костной ткани, как в случае с их комбинацией с гелями хитозана или

коллагена. Этот эффект связан с тем, что гели обволакивают гранулы хитозана и не дают им слёживаться, что позволяет прогениторным клеткам мигрировать в толщу материала и под действием высвободившегося из гранул ВМР-2 образовывать костную ткань. Слёживание и обволакивание полилактидных гранул хорошо видно по микрофотографиям, представленным в соответствующих разделах (Рисунок А.49, Рисунок А.87, Рисунок А.109, Рисунок А. 110).

Высокие остеоиндуктивные способности высокопористых полилактидных гранул связаны с их способностью пролонгировано высвобождать ВМР-2 (Таблица А.13). Как было показано, высвобождение ВМР-2 происходит равномерно и достигает своего пика к 6 суткам, то есть белок продолжает высвобождаться после фазы послеоперационного воспаления к началу фазы активной дифференцировки клеток [Ы е1 а1., 2014]. Эта способность позволила высокопористым полилактидным гранулам обеспечить индукцию неоостеогенеза даже малыми дозами ВМР-2. Поскольку хитозановый гель не обладает способностью удержания ВМР-2 высокопористые полилактидные гранулы были использованы в качестве основного носителя остеоиндуктора и наполнителя для него. Хитозановые гранулы сшитые глутаровым альдегидом и отличающиеся большей твёрдостью и меньшей растворимостью по сравнению с несшитыми также рассматривались в качестве наполнителя для хитозанового геля. Их использование должно было уменьшить перечень сырья и оборудования для производства материала на основе хитозана и, теоретически, снизить сложность и стоимость его производства. Однако их высокая цитотоксичность слабые контейнерные свойства не позволили этого сделать (Таблица А.13).

При сравнении композиций на основе коллаген-фибронектинового и коллагенового гидрогеля с добавлением высокопористых полилактидных гранул, где в первом случае гКВМР-2 был включён в состав геля, а во втором случае в состав гранул, были получены разные результаты по количеству новообразованной костной ткани. Так, разница между первой и второй композицией была более чем в 2 раза в пользу первой. Самая очевидная причина этого была связана с тем, что потери гЪВМР-2 при импрегнации в коллаген-фибронектиновый гель были

меньше. Даже незначительная разница в концентрации BMP-2 могла оказать существенное влияние, т. к. для импрегнации использовалась, как было показано в эксперименте in vivo и in vitro, минимально эффективная концентрация rhBMP-2 -10 мкг/мл. Что интересно, учитывая уровень потерь при включении в полилактидные гранулы и коллаген-фибронектиновый гидрогель rhBMP-2 всё равно оказывал своё действие. Хотя в эксперименте in vivo на ММСК и in vitro на модели эктопического остеогенеза на крысах дозировки 6 мкг/мл и ниже не индуцировали остеогенную дифференцировку и образование костной ткани. Всё это подтверждает успех выбранной тактики при постановке задач исследования: повысить безопасность материала и его эффективность за счёт обеспечения пролонгированного высвобождения малых доз BMP-2.

4.2 Сравнение полученных материалов с костно-пластическими

материалами других классов

Среди отверждаемых костно-пластических материалов наилучшими прочностными показателями обладают костные цементы. С ними и будет произведено сравнение. Модуль прочности при сжатии для ПММА цементов составляет в среднем 32-56 МПа и для кальций-фосфатных цементов 1-10 МПа. При этом данный показатель для кортикальной находится в пределах 90-190 МПа и для губчатой кости 10-20 МПа [Lindahl, Lindgren, 1967; Dunham et al., 2005; Havaldar, Pilli, Putti, 2014]. Модули упругости для этого класса материалов также достаточно высокие и лучшим образом характеризуют их свойства и показания к применению (Таблица A. 14).

Полученные в ходе настоящей работы и наиболее успешные по сумме характеристик композиции на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля и на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, наполненные 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул уступают цементам по модулю упругости почти на 1-2 порядка (Таблица A. 12, Таблица A.14). Ненаполненные гели обладали

ещё более худшими показателями и уступали цементам почти на 3 порядка. Как можно видеть, использование высокопористых полилактидных гранул в качестве наполнителя, который придавал материалу твёрдости, было оправдано. Полилактиды по сравнению с хитозановыми гранулами деградируют с образованием цитосовместимых метаболитов и характеризуются большей механической прочностью [Jiao, Liu, Zhou, 2007; Silva da et al., 2018]. Для получения полилактидных гранул была использована технология сублимационной сушки. Эта методика достаточно проста в применении и позволяет создавать материалы c заранее заданной пористостью без воздействия высоких температур и химических агентов, что позволяет сохранить высокую активность остеоиндуктора [Annabi et al., 2010; Emami et al., 2018].

Полученных материалы уступают по прочностным свойствам костной ткани и костным цементам, однако это компенсировано более удобными манипуляционными свойствами. Стоматологу важнее иметь материал, которым удобно пользоваться, можно восполнить сложный по форме дефект и который бы резорбировался, замещаясь костной тканью, и не вызывал воспаления. И здесь полученные в ходе настоящей работы композиции на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля и на основе коллаген-фибронектинового гидрогелей, наполненных 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул, показывают себя с лучшей стороны. Так, в отличие от ПММА цемента разработанные материалы способны к биорезорбции. В отличие от кальцийфосфатных цементов (КФЦ) они не боятся размывания до отверждения при внесении в рану [Barinov, Komlev, 2011]. По сравнению со всеми цементами обладают остеоиндуктивными свойствами и скоростью биорезорбции, достаточной для своевременного замещения костной тканью [C. Chow, 2009; Kalteis et al., 2004]. Что касается сравнения с аутогенной костной тканью, то в отличие от неё разработанные материалы не требуют дополнительной травмы при формировании донорской зоны и не требуют дополнительных армирующих и фиксирующих конструкций типа титановых сеток и винтов [Laurie et al., 1984;

Атп^оп е1 а1., 1996; БаккаБ е1 а1., 2017]. Достижения в области остеоиндуктивных свойств разработанных композиций требуют наибольшего внимания.

***

Важнейшее свойство разработанных материалов заключается в остеоиндуктивной способности, которая достигается за счёт пролонгированного высвобождения малых доз BMP-2. Для проведения операций спондилодеза и синус-лифтинга FDA в составе костно-пластического материала «Infuse Bone Graft» (Medtronic, США) была одобрена концентрация BMP-2 равная 1,5 мг/мл, что существенно выше физиологической, т.к. в организме на один грамм кости приходится 2 нг BMP-2, что почти на 6 порядков меньше [Rengachary, 2002]. В нашем исследовании в качестве остеоиндуктора был использован rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл, что на 3 порядка больше, чем есть в костной ткани, но на 2-3 порядка меньше, чем в Infuse Bone Graft. Это позволяет поместить разработанные настоящей диссертационной работе материалы посередине между существующими коммерческими материалами и аутогенной костной тканью.

Что касается сравнения эффективности, то при внутрикостной имплантации в критический дефект теменных костей крыс аутогенной костной стружки происходит образование костной ткани в объёме (8,9 ± 4,3)% [Kubota et al., 2017]. Это почти в 5 раз меньше, чем для полученных в настоящей работе композиций, где объём новообразованной костной ткани составил (56 ± 25)% и (61 ± 15)%. Результаты сравнения с Infuse Bone Graft имеют противоречивый характер. Так, в одном из исследований при использовании Infuse Bone Graft с терапевтической дозировкой rhBMP-2 1,5 мг/мл к концу 28 сут происходит заполнение критического дефекта теменной кости новообразованной костной тканью равное приблизительно (11,5 ± 1,5)%, что существенно ниже, чем случае с разработанными материалами. Заниженный результат мог быть связан с тремя обстоятельствами. Во-первых, исследование проводили на мышах, а не на крысах, в результате чего могли сказаться межвидовые различия животных. Во-вторых, используемая дозировка могла быть не недостаточной, а избыточной, что в связи с рецепторным

механизмом действия могло перегружать рецептор и оказывать антагонистическое действие. В-третьих, для оценки использовали микро-КТ с сегментацией по пороговым значением рентгеноконтрастности, что приводило к отсечению остеоида и слабоминерализованной костной ткани, преуменьшая реальный объём костной ткани. Это косвенно подтверждает другое исследование. Там в области критического дефекта теменных костей крыс, при использовании компонентов Infuse Bone Graft, состоящих из коллагеновой губки, смоченной rhBMP-2 в меньшей концентрации 1,25 и 2,50 мкг/мл, происходило образование кости в объеме (99,4 ± 1,8)% [Pelaez et al., 2014]. При использовании на порядок больших концентраций авторы исследования не отмечали значимого увеличения костной ткани в регенерате. Данные о высокой остеогенной эффективности коллагеновой губки с rhBMP-2 были получены при рентгенологическом и гистологическом исследовании и описывали заполнение дефекта костью в целом, но не процентный объём имеено костной ткани. Помимо этого, при внимательном рассмотрении представленных в статье гистологических микрофотографий было выявлено, что авторы вычисляли объём регенерата, относительно объёма исходного дефекта. При этом также учитывался избыточный рост костной ткани за пределы дефекта, что привело к завышению результатов, приближая их к 100%. В нашем исследовании при использовании концентрации 50 мкг/мл в составе композиции хитозанового геля с полилактидными гранулами происходило образование костной ткани в размере более 106%, относительно объёма костного дефекта, что составляло (64 ± 4)% относительно объёма имплантированного материала. Такой результат был связан с избыточным разрастанием костной ткани и выталкиванием материала за пределы дефекта.

Следует отметить, по данным литературы данные по поводу эффективной дозы BMP-2 различаются в зависимости от вида животного, марки использованного реактива и локализации дефекта. Так, эффективной дозировкой BMP-2 для крупных животных является от 1,6 до 1500 мкг/мл. При ёё применении объем новообразованной костной ткани превышает объем костного дефекта в 1,2-21 раз. В то же время у мелких животных концентрация BMP-2 от 2 до 4000

мкг/мл приводила к образованию костной ткани в объеме, превышающем объем костного дефекта в 1,1 - 50 раз [Gothard et al., 2014]. Чуть более поздние и более методически выверенные исследования, чем представленные в этом литературном обзоре сведения показывают более узкие рамки эффективных дозировок rhBMP-2, выделенного из E.Colli. Так, по данным одного из исследований, полная регенерация критического дефекта теменных костей крыс происходила под действием 5 и 10 мкг/мл BMP-2, которым пропитывали мембрану полилактид-ко-гликолида. Образовавшаяся костная ткань при применении 10 мкг/мл по плотности была схожа с губчатой костью, а при использовании 5 мкг/мл - с кортикальной костью [Ono et al., 2013]. В другом исследовании было показано, что регенерация костного дефекта происходит при применении большей концентрации BMP-2 - 50 мкг/мл, в то время как при использовании 5 мкг/мл эффективной остеоиндукции не происходило [Mumcuoglu et al., 2018]. Что касается крупных лабораторных животных, то на собаках породы Бигль BMP-2 в концентрации 10 мкг/мл способствовал регенерации до 75% площади сформированного костного дефекта [Choi et al., 2016]. Таким образом, исходя из литературных данных, использованную настоящей работе концентрацию BMP-2 порядка 10 мкг/мл можно назвать оптимальной: она приводит не только к образованию эктопических очагов остеогенеза при подкожной имплантации, но и к заполнению новообразованной костной тканью критического костного дефекта теменных костей крыс, что также подтверждено другими исследованиями [Jung et al., 2011; Kim et al., 2011].

Таким образом при идентичной методике подсчёта и экспериментальной модели полученные в результате настоящей работы материалы обладают преимуществом по остеоиндуктивным свойствам относительно существующего материала «Infuse Bone Graft» - одного из первых и самого популярного за рубежом материала, активированного rhBMP-2.

Что касается других материалов, содержащих BMP-2, например InductOs (Medtronic BioPharma B.V., Нидерланды), Novosis (Daewoong, Корея) Cowell BMP, (Cowellmedi, Корея), то они появились несколько лет назад. При этом некоторые из них были начали производится позже, чем началось настоящее диссертационное

исследование. В связи с этим информации в доступных и независимых источниках о результатах их экспериментальных исследований очень мало и проводить сравнение с этими препаратами пока преждевременно. Кроме того, показания к применению пока только одного из них, материала Cowell BMP, заявлено производителем для стоматологии: аугментация лунок после удаления зубов, операция синус-лифтинг, покрытие поверхности дентальных имплантатов, восстановление дефектов костной ткани в ЧЛО (см. раздел 1.7).

В костной ткани, как было подробно показано в главе «Обзор литературы» существует большое количество других остеоиндукторов, которые потенцируют действие друг друга. Использование остеоиндуктора одного типа с одной стороны менее эффективно, с другой даёт возможность зарегистрировать препарат. На настоящий момент лицензировать материал, содержащий более 10 наименований биоактивных веществ, является практически непосильной задачей [Федеральный закон "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" 21.11.2011 N 323 (ред. от 31.07.2020), 2020]. Если рассматривать действие других прямых и опосредованных остеоиндукторов, например BMP-7 или VEGF по отдельности, то по своей эффективности они проигрывают BMP-2 [Gothard et al., 2014]. Что касается готовых препаратов, то они имеют неоднозначную репутацию. Так, препарат Stryker OP-1, содержащий BMP-7, по информации с сайта FDA по состоянию на начало 2020 года лишён лицензии и не может быть использован в клинике по причине выявленных подлогов в результатах доклинических исследований. Препараты, содержащие VEGF, могут быть небезопасными: рост сосудов, помимо того, что создаёт благоприятную среду для костной ткани, может быть причиной возникновения опухолей [Rak et al., 2000].

Таким образом, использование BMP-2 за счёт пролонгированного его высвобождения при неизменной эффективности - является важнейшим достижением настоящей диссертационной работы. Известно, что в первые дни после хирургического вмешательства наблюдаются процессы воспаления, которые снижают на эффективность остеоиндуктора [Huang et al., 2014]. По этой причине

пролонгация высвобождения rhBMP-2 на срок до 6 сут способствовала более эффективной остеоиндукции.

Способность материала индуцировать неоостеогенез была оценена на моделях экто- и ортотопического остеогенеза у крыс линии Wistar. Модель эктопического остеогенеза при подкожной имплантации однозначно продемонстрировала способность материала индуцировать остеогенез. Так, в месте, где нет условий для аутоиндукции и микроокружения для остеогенной дифференцировки, материалы продемонстрировали способность к образованию костной ткани. Модель ортотопического остеогенеза в виде критического дефекта теменных костей демонстрировала способность материала замещать костные дефекты, не способные к полной самостоятельной регенерации. Эта модель имитировала клинические ситуации, в которых требуется восполнить костные дефекты черепа, когда материал контактирует с собственной костной тканью. Срок 28 сут был выбран не случайно. Он соответствует окончанию первичного остеогенеза у крыс. То есть при в этот период образуется основная масса кости, которая в последующем реструктурируется на этапе вторичного остеогенеза и превращается в кортикальную и губчатую кость.

Отдельного внимания требуют результаты, связанные с получением основы термотропного хитозанового гидрогеля. По данным литературы, хитозан характеризуется высокой биосовместимостью, разлагается с образованием безопасных метаболитов, имеет структурное сходство с гликозаминогликанами и обладает антимикробной активностью [Pang et al., 2017; Кузнецова и др., 2017]. За счёт акцепции ионов водорода из окружающей среды, его деградация ускоряется. Эти данные изначально наилучшим образом вписывались в концепцию будущего материала. Однако в ходе исследования возникали проблемы с цитосовместимостью хитозана. Как позже было выяснено, существуют противоречивые данные о влиянии степени деацетилирования хитозана на адгезию и пролиферацию клеток. Так, в нескольких исследованиях in vitro было показано, что хитозаны с высокой степенью деацетилирования способствуют повышению прикреплению клеток к их поверхности [Hsu et al., 2004; Seda Tigli, Karake?ili,

Gümü§derelioglu, 2007]. В то же время другая группа учёных получила данные об отсутствии влияния степени деацетилирования на биосовместимость хитозановых пленок в экспериментах на клеточной линии фибробластов [Hamilton et al., 2006]. Данный результат мог быть связан с тем, что в исследовании были использованы хитозаны различных прозводителей с разными химическими характеристиками, в том числе длиной полимерной цепи. Для исключения многофакторного воздействия нами был использован один образец хитозана и проведено его реацетилирование. Это позволило в экспериментах in vitro и in vivo показать строгую корреляцию между токсическими свойствами хитозана и степенью его деацетилирования. Чем выше была степень деацетилирования, тем ниже была относительная выживаемость клеток in vitro и большая лейкоцитарная инфильтрация отмечалась в области имплантации материала in vivo. Позже были найдены результаты исследований других научных коллективов, подтверждающие эти результаты. Так, в одном из исследований на клеточных линиях карциномы легкого и мочевого пузыря человека in vitro было показано, что хитозан с высокой степенью деацетилирования обладает выраженным цитотоксическим эффектом [Huang et al., 2016]. В другом эксперименте in vivo воспаление чаще наблюдались у крыс, которым подкожно имплантировали пленки на основе хитозана с высокой степень деацетилирования [Jeong et al., 2017].

Хитозановые гидрогели образуются за счет химических или физических взаимодействий. Химическое сшивание реализуется за счет использования низкомолекулярных сшивающих и фоточувствительных агентов, взаимодействия активированных функциональных групп двух полимеров или ферментативных реакций. Физические взаимодействия происходит за счет ионных, полиэлектролитных, гидрофобных ассоциаций и интерполимерных комплектов. [Bhattarai, Gunn, Zhang, 2010]. В настоящем диссертационном исследовании был применён Р-глицерофосфат, который за счет гидрофобного взаимодействия с цепями хитозана формировал гидрогель, способный к отверждению при плюс 37оС.

Р-глицерофосфат способствует остеогенной дифференцировке и является компонентом остеогенных сред. Он является источником фосфатов для

гидроксиапатита и индуцирует экспрессию генов отвечающих за остеогенез, в том числе гена BMP-2 [Langenbach, Handschel, 2013]. В связи с этим использование ß-глицерофосфата для отверждения хитозановых гелей должно быть полностью безопасным [Supper et al., 2014]. Однако, как нами было показано, дозировки ß-глицерофосфата более 100 мкг/мл оказывают цитотоксическое воздействие, что требует внимательного учёта концентраций этого гелезующего агента.

В исследовании Han и соавт. (2004) отмечено, что активная деградация хитозанового гидрогеля протекает в течение 12 дней. С 12 по 57 сутки процесс идет более медленно. Всего за период до 50 сут отмечается резорбция около 75% объема имплантированного хитозанового гидрогеля. Что касается полилактидных гранул, то их резорбция протекает более медленно и зависит от плотности, длинны полимера, и вида пространственного изомера [Agrawal, Niederauer, Athanasiou, 1995; Bergsma et al., 1995; Heidemann et al., 2003; Humberto Valencia, 2019]. Так, резорбция материалов из полилактида происходит в период от 6 мес до 10 лет. Как было показано в нашем исследовании, хитозановый гидрогель со степенью деацетилирования хитозана 39% в композиции с 12 % масс. высокопористых полилактидных гранул обладает высокой биосовместимостью, а скорость его биодеградации является оптимальной для замещения костной тканью. Эти данные подтверждаются тем, что при использовании композиции, содержащей rhBMP-2 не происходит выталкивания материала новообразованной костной тканью, а происходит равномерное замещение, происходящее преимущественно в пространстве хитозанового геля по периферии от полилактидных гранул, внутрь которых к 28 сут также начинает врастать костная ткань.

Таким образом, полученные композиции термоотверждаемых материалов на основе хитозанового и коллагенового гидрогелей, обладающие высокими манипуляционными, биосовместимыми и остеоиндуктивными свойствами, благодаря включению в их состав rhBMP 2 и модификаторов прочностных свойств можно считать новым классом костно-пластических материалов. Совокупность их свойств и продемонстрированная эффективность является уникальной.

4.3 Перспективы применения разработанных костно-пластических материалов в стоматологии нового поколения

На настоящий момент потребление костно-пластических материалов в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии занимает второе после ортопедии и травматологии. Согласно отчёту Zion Market Research мировой рынок костнопластических материалов для стоматологии составил примерно 493 миллиона долларов США в 2018 году и, как ожидается, принесет около 931 миллиона долларов США к 2025 году [Globe Newswire, 2019]. В стоматологии наблюдается самый интенсивный рост потребления за последние годы, который связывают с ростом количества проводимых дентальных имплантаций. Так, более половины всех дентальных имплантаций сопровождаются костной пластикой [Cha et al., 2016; Кулаков и др., 2017]. По данным зарубежных исследователей около 77% костных пластик приходится на фронтальный отдел верхней челюсти, среди дефектов дистальных отделов 62% и 32% приходится на верхнюю и нижнюю челюсть соответственно. Операции направленной костной регенерации и открытого синус-лифтинга являются самыми частыми и требуются в более чем в 22% случаев [Cha et al., 2016]. В нашей стране, судя по данным ретроспективного анализа статистических данных ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава России, встречаемость дефектов на верхней и нижней челюстях примерно равна и составляет, 49,3% и 50,7% соответственно [Кулаков и др., 2017]. При этом наблюдается устойчивая тенденция ежегодного роста на 14,4% количества выполненных костнопластических операций, расширяющих показания к использованию метода дентальной имплантации, что соответствует общемировым тенденциям [Cha et al., 2016; Globe Newswire, 2019].

Распространение заболеваний пародонта, требующих использования костно-пластических материалов к настоящему времени снижается в Европе, но растёт в Африке и Азии [Globe Newswire, 2019]. В среднем в мире количество всех стоматологических пациентов, которые имеют генерализованный пародонтит

средней и тяжёлой степени растёт с возрастом и составляет более половины всех случаев для средней возрастной группы, 35-44 лет [Nazir, 2017; Микляев и др., 2017; Prathypaty et al., 2019].

Исходя из этого костно-пластические материалы, используемые в стоматологии, должны удовлетворять по своим свойствам стоматологов прежде всего при лечении описанных выше нозологических форм, то есть соответствующих диагнозам K08.2 Атрофия беззубого альвеолярного края и К05.3 Хронический пародонтит.

В стоматологии основными методами лечения с использованием костнопластических материалов является техника направленной костной регенерации (НКР) [Liu, Kerns, 2014; Бениашвили и др., 2017; Кулаков и др., 2020]. Она заключается в изоляции имплантируемого костно-пластического материала с помощью барьерной мембраны для предотвращения врастания соединительной ткани со стороны десны и создания условий для остеоиндукции и миграции клеток со стороны костного края дефекта [Elgali et al., 2017]. В ряде случаев для применении этой техники, особенно для закрытия вертикальных и протяжённых горизонтальных дефектов используют дополнительные армирующие и фиксирующие конструкции типа титановых сеток, костных блоков, пинов и винтов [Uehara et al., 2015; Deshmukh et al., 2014; Кулаков и др., 2017; Jeng, Chiang, 2020].

Разработанный прототипы костно-пластических материалов нового поколения вносят существенные изменения в концепцию проведения костнопластических операций в стоматологии. Их использование не требует использования техники направленной костной регенерации. Так, полученные на модели эктопического и ортотопического остеогенеза результаты показывают, что разработанные материалы могут быть использованы без барьерных мембран. Было показано, что выраженное остеоиндуктивное действие rhBMP-2 приводит к образованию костной ткани при подкожной имплантации, т. е. в области, где нет костного окружения. Разработанные материалы способны индуцировать остеогенную дифференцировку прогениторных клеток соединительной ткани, что, теоретически, позволяет использовать в качестве клеточного ресурса не только

область, прилежащую к костному краю дефекта, но и область десны, что в целом должно приводить к более эффективной регенерации. Полученные вариации костно-пластических материалов за счёт непрерывной фазы геля по консистенции напоминают пластилин, и обладают высокой пористостью за счёт использования в качестве наполнителя высокопористых полилактидных гранул. Пористость и связанность компонентов материалов, с одной стороны, улучшает миграцию клеток и врастание сосудов, а с другой, препятствует распространению непрерывного фронта эпителия внутрь материала. Таким образом, по сумме вышеописанных свойств полученные композиции костно-пластических материалов нового класса не требуют обязательного применения барьерных мембран.

Что касается армирующих конструкций типа титановой сетки или костных блоков, то по данным физико-механических испытаний разработанные композиции костно-пластических материалов способны отверждаться и сопротивляться деформирующей силе мягких тканей. Эти достоинства позволяют применять их без армирующих конструкций в большинстве случаев проведения НКР. Исключением могут быть дефекты, где нагрузка на материал значительная и требует немедленного восстановления прочности кости. Примером могут служить переломы, участки резекций с нарушением непрерывности кости [Афанасов и др., 2017; Ва1Б1:опе, 2018]. Однако такого рода пластики обычно проводится челюстно-лицевыми хирургами и встречаются существенно реже, чем необходимость в костной пластике при атрофии альвеолярного края или хроническом пародонтите. Отказ от использования армирующих конструкций и барьерных мембран позволяет также отказаться от применения фиксирующих конструкций, типа пинов или винтов.

Часто при проведении НКР в комбинации или вместо костно-пластических материалов используют аутогенную костную ткань, которая служит остеоиндуктивным компонентом. Для этого в стоматологии в основном используют интраоральные донорские участки ретромолярной области или ветви нижней челюсти, скуловой области и костную ткань, полученную при

формировании принимающего ложа для имплантата [Klijn et al., 2010; Gultekin et al., 2016; Sakkas et al., 2017; Ben Achour et al., 2019]. Такие операции сопровождаются дополнительной травмой и по данным одного из исследований осложняются инфицированием донорской зоны в 2,6% и реципиентной зоны в 5,8% от всех случаев операций аутотрансплантации [Sakkas et al., 2017]. Также не редки и неврологические расстройства в виде гиперестезии подбородочного нерва, которые встречаются в 10,5%, снижением чувствительности язычного нерва - в 2,8% и подглазничного нерва - в 2,6% от общего количества аутотрансплантаций кости на верхней и нижней челюсти соответственно [Sakkas et al., 2017]. Возможность этих осложнений показана и в ряде других исследований [Misch, 2015; Idrontino, Valente, 2016]. Что касается композиций полученных материалов на основе коллагеновых и хитозановых гидрогелей c высокопористыми полилактидными гранулами, то за счёт пролонгированного высвобождения BMP-2 они способны самостоятельно индуцировать неоостеогенез. Это избавляет от необходимости использовать аутогенную костную ткань, что должно снижать

травматичность операции костной пластики и связанные с этим осложнения.

***

Таким образом, разработанные в настоящей диссертационной работе костно-пластические материалы нового поколения могут существенно повысить эффективность и простоту выполнения костных пластик в стоматологии за счёт предполагаемого снижения объёма дополнительных манипуляций и использования дополнительных материалов.

156

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные в настоящей диссертационной работе композиции можно отнести к новому классу костно-пластических материалов, которые имеют широкие перспективы в стоматологии. Это связано с уникальной совокупностью их положительных свойств. Они являются биосовместимыми, обладают остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, способны к биорезорбции, моделируются и способны удерживать заданную форму за счёт отверждения, что было продемонстрировано в экспериментах in vivo и in vitro.

За счёт предполагаемого снижения объёма дополнительных манипуляций и материалов полученные композиции могут изменить концепцию проведения костно-пластических операций при восполнении дефицита костной ткани при атрофии альвеолярного гребня и хроническом пародонтите - наиболее часто встречаемых стоматологических диагнозов, требующих использования костнопластических материалов.

Среди разработанных в настоящей диссертационной работе материалов по сумме физико-механических, органолептических и биологических свойств наиболее перспективными для стоматологии можно считать две композиции. Первая - композиция на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненная 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул, импрегнированных 10 мкг/мл rhBMP-2. Вторая - композиция на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированная 10 мкг/мл rhBMP-2 и наполненная 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул. Эти композиции показали способность выраженно индуцировать экто- и ортотопический остеогенез, обладали высокой био- и цитосовместимостью, были способны к термоотверждению при температуре плюс 37оС, т. е. температуре внутренней среды организма, и их физико-механические свойства позволяют в достаточной мере сопротивляться деформирующей силе мягких тканей.

Концепцию использования пролонгированного высвобождения остеоиндуктора можно назвать важнейшим достижением настоящей работы. Как было показано, минимально эффективная дозировка гЬБМР-2 в составе разработанных композиций выраженно индуцировала остеогенез, что приводило к замещению костной тканью около половины объёма материала. Применение малых доз остеоиндуктора, теоретически, повышает безопасность материала за счёт предотвращения таких возможных осложнений, как возникновение гиперостоза и провокация опухолевого роста. На примере композиции, состоящей из высокопористых полилактидных гранул 12 масс.%, импрегнированных гКБМР-2, и геля на основе реацетилированного хитозана (39 DD%) было показано, что повышение дозы гЪБМР-2 приводит к избыточному разрастанию костной ткани и вытеснению за пределы дефекта имплантированного материала.

В ходе работы с помощью подходов клеточной биологии и гистологии охарактеризованы и подобраны оптимальные компоненты и композиции разрабатываемых материалов. Так, за счёт реацетилирования одного образца хитозана было показано, что снижение лейкоцитарной инфильтрации и рост цитосовместимости происходило за счёт снижения количества свободных аминогрупп хитозана. Снижение степени деацетилирования хитозана до 39% и добавление в его состав полилактидных гранул позволяло повысить цитосовместимость материала и предотвратить лейкоцитарную инфильтрацию. Использование L-изомеров для полилактидных гранул является предпочтительным в связи с их высокой цитосовместимостью. Клеточная адгезия к коротким цепям (40 кДа) D,L-изомеров полилактидов является низкой и возрастает до нормальных значений при повышении молекулярной массы до средней (117 кДа). Насыщение коллаген-фибронектинового гидрогеля высокопористыми полилактидными гранулами и смесью гидроксиапатита с Р-трикальцийфосфата также сопровождалось клеточной гибелью и воспалением.

Высокие остеокондуктивные способности материалов были обеспечены пористостью полилактидных наполнителей. Так, использование высокопористых полилактидных гранул в качестве модификаторов прочностных свойств в составе

коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного гЪВЫР-2, приводило к более чем двукратному приросту костной ткани, по сравнению с только коллаген-фибронектиновым гидрогелем или его композиции с гидроксиапатитом и Р-трикальцийфосфатом - наполнителем в виде традиционных кальцийсодержащих костно-пластических материалов.

Высочайшие остеоиндуктивные свойства композиций материалов были подтверждены способностью индуцировать эктопический неоостеогенез при подкожной имплантации, т. е. в условиях, где отсутствует костное окружение. На модели ортотопического остеогенеза при имплантации в критический дефект теменных костей крыс - дефект не способный самостоятельно полностью заместиться костной тканью - было показано, что разработанные композиции способны индуцировать остеогенез в центре дефекта.

Полученные композиции термоотверждаемых материалов на основе хитозанового и коллагенового гидрогелей, обладающие высокими манипуляционными, биосовместимыми и остеоиндуктивными свойствами, благодаря включению в их состав гЬВМР-2 и модификаторов прочностных свойств можно считать новым классом костно-пластических материалов. Совокупность их свойств и продемонстрированная эффективность являются уникальными.

159

6 ВЫВОДЫ

1. Получены композиции термоотверждаемых материалов нового поколения на основе хитозанового и коллагенового гидрогелей, обладающие высокими манипуляционными, биосовместимыми и остеоиндуктивными свойствами, благодаря включению в их состав гЬВМР-2 и модификаторов прочностных свойств.

2. Манипуляционные свойства композиций позволяют моделировать объекты различных форм и удовлетворяют основные потребности стоматологов. Коллаген-фибронектиновые и хитозан-глицерофосфатные гели способны к термоотверждению при температуре 37оС. Композиции на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненные 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул и коллаген-фибронектиновые гидрогели, наполненные 12 масс.% высокопористых (98%) полилактидных гранул или 35 масс.% смеси гидроксиапатита и Р-трикальцийфосфата имеют модуль упругости (99 ± 2), (373 ± 54) и (451 ± 4) кПа соответственно, что делает их способными препятствовать воздействию деформирующих сил мягких тканей организма и по упругости схожи с хрящевой тканью.

3. Высокопористые полилактидные гранулы способны плавно высвобождать (58 ± 9)% импрегнированного гЪБМР-2 в течение 5-6 сут. Удержание гЬВМР-2 в составе коллаген-фибронектинового гидрогеля является наиболее эффективным: пик высвобождения наблюдается на 4-6 сут при общем проценте потерь не высвободившегося гЪБМР-2 (47 ± 12)%. Гидрогель и гранулы на основе хитозана, не обладают способностью длительно удерживать ВМР-2.

4. Коллагеновые и коллаген-фибронектиновые гели способствуют клеточной адгезии и не оказывают цитотоксического эффекта на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из пульпы зуба. Хитозан-глицерофосфатные гели цитосовместимы при использовании хитозана со степенью деацетилирования менее 39,5 Наполнители в виде гидроксиапатита и Р-глицерофосфата, высокопористых полилактидных гранул

также высоко цитосовместимы. Гранулы на основе хитозана, сшитые и несшитые глутаровым альдегидом, обладают выраженным цитотоксическим действием.

5. Коллагеновый и коллаген-фибронектиновый гидрогель, а также хитозан-глицерофосфатный гидрогель со степенью деацетилирования хитозана менее 39,5 DD% являются биосовместимым компонентом: при их использовании не происходит воспаления при подкожной имплантации in vitro. Насыщение коллаген-фибронектинового гидрогеля высокопористыми полилактидными гранулами и смесью гидроксиапатита с Р-трикальцийфосфата также не сопровождается клеточной гибелью и воспалением.

6. Имплантация высокопористых полилактидных гранул и коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированных rhBMP-2 в минимально эффективной дозировке, как отдельно, так и в составе композиций приводит к образованию костной ткани на модели эктопического остеогенеза при подкожной имплантации.

7. Использование геля на основе реацетилированного хитозана (39 DD%) в композиции с 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул, импрегнированными 10 мкг/мл rhBMP-2, стимулирует образование костной ткани при ортотопическом остеогенезе в объёме (56 ± 25)%. Повышение концентрации rhBMP-2 в составе этой композиции до 50 мкг/мл вызывает существенное разрастание костной ткани до (56 ± 25)%, что приводит к увеличению объёма и выталкиванию за пределы дефекта имплантированного материала.

8. Использование геля на основе коллагена в композиции с 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул, импрегнированных 10 мкг/мл rhBMP-2, стимулирует образование костной ткани при ортотопическом остеогенезе в объёме (23 ± 8)% и способно индуцировать эктопический остеогенез.

9. Коллаген-фибронектиновый гидрогель, импрегнированный 10 мкг/мл rhBMP-2, стимулирует образование костной ткани в объёме (26 ± 11)% и при включении в состав 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул или 35 масс.% смеси гидроксиапатита с Р-трикальцийфосфатом - в объёме (61 ± 15)%

и (25 ± 7)% соответственно. Высокие остеоиндуктивные свойства композиций материалов подтверждаются способностью индуцировать эктопический остеогенез.

10. Наиболее перспективными для использования в стоматологии среди полученных композиций костно-пластических материалов нового поколения являются две композиции: первая - композиция на основе хитозан-глицерофосфатного гидрогеля, наполненная 12 масс.% высокопористых (98%) полилактидных гранул, импрегнированных 10 мкг/мл гЪВЫР-2 и - вторая -композиция на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированная 10 мкг/мл гЪВЫР-2 и наполненная 12 масс.% высокопористых полилактидных гранул.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАП - гидроксиапатит. КГА - карбонат гидроксиапатит. КТ - компьютерная томография КФЦ - кальций-фосфатный цемент.

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки.

МТТ - тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум

бромид.

НКР - направленная костная регенерация. ПММА - полиметилметакрилат. СНО - клетки яичников китайского хомячка. СЭМ - сканирующая электронная микроскопия. УФ - ультрафиолет.

BSA - bovine serum albumin (бычий сывороточный альбумин)

DD% - deacetylation degree (степень деацетилирования).

FDA - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов

и медикаментов США.

MCS-AD (ММСК-ЖТ) - ММСК, выделенные из жировой ткани.

PDLLA - полимер на основе право и левовращающих изомеров молочной

кислоты.

PLA - polylactic acid (полимолочная кислота или полилактид).

PLLA - полимер на основе правовращающего изомера молочной кислоты

левовращающий изомер.

rhBMP-2 - recombinant human bone morphogenetic protein 2 (рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок-2). SHED - ММСК из пульпы выпавших молочных зубов. VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста. ю - массовая доля.

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аганов Д.С. Роль цитокиновой системы RANKL/RANK/OPG в регуляции минерального обмена костной ткани / Д.С. Аганов, В.В. Тыренко, Е.Н. Цыган, М.М. Топорков, С.Г. Бологов // Гены и клетки. — 2014. — № 4. — С. 50-52.

2. Алексеева И.С. Клинико-экспериментальное обоснование использования комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани челюстей. / И.С. Алексеева, А.В. Волков, А.А. Кулаков, Д.В. Гольдштейн // Гены и клетки. — №4(11) — 2012. — С. 97-105.

3. Алексеева И.С. Применение комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с дефицитом костной ткани (клинико-экспериментальное исследование): дис. ... д-ра мед. наук: 14.01.14 / И.С. Алексеева. — Москва: ФГУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии," 2013. — 140 с.

4. Афанасов М.В. Методы устранения пострезекционных дефектов нижней челюсти у детей / М.В. Афанасов, А.В. Лопатин, С.А. Ясонов, Т.Ф. Косырева // Российский стоматологический журнал. — 2017. — № 21(1). — С. 49-55.

5. Бениашвили Р.М. Десневая и костная пластика в дентальной имплантологии / Р.М. Бениашвили, А.А. Кулаков, А.Н. Гурин, Л.А. Григорьянц, В.С. Комлев, В.А. Семкин. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2017. — 240 с.

6. Бикбов М.М. Полимерные гели и их применение в офтальмологии. / М.М. Бикбов, И.И. Хуснитдинов, Н.Н. Сигаева, Р.Р. Вильданов // Практическая медицина. — 2017. — № 9(17). — С. 38-42.

7. Бозо И.Я. Разработка и применение ген-активированного остеопластического материала для замещения костных дефектов: дис. ... к-та мед. наук: 03.03.04 / И.Я. Бозо. — Москва: ФГБНУ Институт экспериментальной медицины, 2017. — 191 с.

8. Буркова Н.В. Контакт пленок хитозана с клеточными элементами венозной крови человека т vitro / Н.В. Буркова, О.П. Киричук, С.И. Кузнецов,

B.Е. Юдин, Е.Н. Дресвянина, Е.В. Романчук // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. — 2019. — № 18(1). — С. 34-41.

9. Бухарова Т.Б. Остеогенный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пульпы молочных зубов до и после криоконсервации / Т.Б. Бухарова, Г.Е. Леонов, Е.В. Галицына, А.В. Васильев, И.В. Вахрушев, Е.Б. Вихрова, и др. // Гены и Клетки. — 2016. — № 4. —

C. 43-47.

10. Бухарова Т.Б. Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта: дис. ... к-та биол. наук: 03.03.04 / Т.Б. Бухарова. — 2014. — С. 161.

11. Васильев А.В. Характеристика неоостеогенеза на модели критического дефекта теменных костей крыс с помощью традиционной и трёхмерной морфометрии / А.В. Васильев, А.В. Волков, Г.Б. Большакова, Д.В. Гольдштейн // Гены и клетки. — 2014. — № 4. — С. 121-127.

12. Васильев А.В. Влияние Даларгина на пролиферацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, дермальных фибробластов и клеток остеосаркомы человека т vitro / А.В. Васильев, Т.Б. Бухарова, А.В. Волков, Е.Б. Вихрова, Г.Б. Большакова, Д.В. Гольдштейн // Гены и клетки. — 2015. — № 4. — С. 76-78

13. Васильев А.В. Различия цитосовместимости костно-пластических материалов из ксеногенного гидроксиапатита с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками, полученными из пульпы выпавших молочных зубов и подкожного липоаспирата / А.В. Васильев, О.А.

Зорина, Р.Н. Магомедов, Т.Б. Бухарова, Н.Л. Фатхудинова, Е.О. Осидак, С.П. Домогатский, et al. // Стоматология. — 2018.— № 3. — С. 7-13.

14. Васильев А.В. Сравнение кинетики высвобождения импрегнированного BMP-2 из биополимерных матриц в виде гранул и гидрогелей на основе хитозана, полилактида, полилактогликолида и коллагена / А.В. Васильев, Т.Б. Бухарова, В.С. Кузнецова, Ю.Д. Загоскин, С.А. Минаева, Т.Е. Григорьев и др. // Перспективные материалы. — 2019а. — №4. — С. 1327.

15. Васильев А.В. Повышение биосовместимости хитозановых гидрогелей с перспективой их использования в качестве основы для костно-пластических материалов в стоматологии / А.В. Васильев, В.С. Кузнецова, Т.Б. Бухарова, Ю.Д. Загоскин, Г.Е. Леонов и др. // Стоматология. — 2019б. — №6. — С.12-18.

16. Васильев А.В. Биосовместимость и остеогенные свойства коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного BMP-2 / А.В. Васильев, В.С. Кузнецова, Е.В. Галицына, Т.Б. Бухарова, Е.О. Осидак, и др. // Стоматология. — 2019в. — №6. — С.5-11.

17. Волков А.В. Влияние противовоспалительных препаратов на регенерацию костной ткани при трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток / А.В. Волков, Е.Н. Антонов, А.В. Васильев, Т.Б. Бухарова, Г.К. Эшмотова, В.К. Попов, и др. // Биомедицина, №4. — 2014. — С. 17-24.

18. Гречуха А.М. Применение биоактивного стеклокристаллического материала "Биоситалл-11" для замещения костных дефектов лицевого скелета (экспериментально-клиническое исследование): дис. ... к-та мед. наук: 14.00.21 / А.М. Гречуха. — Москва: ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии», 2009. — 105 с.

19. Гурин А.Н. Сравнительная оценка влияния различных остеопластических материалов на основе фосфатов кальция на заживление костных дефектов: дис. ... к-та мед. наук: 14.00.21 / А.Н. Гурин. — Москва:

ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии», 2009. — 161 с.

20. Деев Р.В. Ординарные и активированные остеопластические материалы / Р.В. Деев, А.Ю. Дробышев, И.Я. Бозо // Вестник травматологии и ортопедии им Н. Н. Приорова. — 2015. — № 1. — С. 51-69.

21. Деев Р.В. Эволюция костнопластических материалов / Р.В. Деев, И.Я. Бозо // Сборник тезисов V Всероссийского симпозиума с международным участием (под ред. проф. Э.Р. Мулдашева). — 2012. — С. 130-132.

22. Егорихина М.Н. Использование компонентов крови в тканевой инженерии / М.Н. Егорихина // Сибирское медицинское обозрение. — 2018. — № 3. — С. 14-23.

23. Егорихина М.Н. Скаффолды как системы доставки биологически активных и лекарственных веществ / М.Н. Егорихина, П.А. Мухина, И.И. Бронникова // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. — 2020. — № 9(1). — С. 92-102.

24. Зайцев В.В. Костные морфогенетические белки (BMP): общая характеристика, перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии / В.В. Зайцев, А.С. Карягина, В.Г. Лунин // Вестник травматологии и ортопедии им Н. Н. Приорова. — 2009. — № 4. — С. 79-84.

25. Иванушко Л.А. Сравнительное изучение иммуномодулирующих свойств хитозана и его производных / Л.А. Иванушко, Т.Ф. Соловьева, Т.С. Запорожец, П.А. Лукьянов, В.И. Горбач, Н.Н. Беседнова // Медицинская иммунология. — 2007. — № 4-5. — С. 397-404.

26. Ильина А.В. Влияние физико-химических параметров на процесс образования гелей на основе хитозана. / А.В. Ильина, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. — 2004. — С. 688-692.

27. Кирилова И.А. Различные виды костно- пластических материалов для восстановления костной структуры / И.А. Кирилова, В.Т. Подорожная, И.П. Ардашев, С.В. Черницов // Политравма. — 2008. — № 4. — P. 60-64.

28. Кобелев А.В. Нелинейные вязкоупругие свойства биологических тканей / А.В. Кобелев, Л.Т. Смолюк, Р.М. Кобелева, Ю.Л. Проценко. — Екатеринбург: РИО УрО РАН. — 2012. — 216 с.

29. Костив Р.Е. Трофические факторы роста костной ткани, их морфогенетическая характеристика и клиническое значение / Р.Е. Костив, С.Г. Калиниченко, Н.Ю. Матвеева // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2017.

— №1. — С. 10-16.

30. Кретов Е.И. Электроспиннинг для дизайна материалов медицинского назначения / Е.И. Кретов, Е.Н. Заполоцкий, А.Р. Таркова, А.А. Прохорихин, А.А. Бойков, Д.У. Малаев // Бюллетень сибирской медицины. — 2020. — № 2(19). — С. 153-162.

31. Кузнецова В.С. Перспективы использования гидрогелей в качестве основы для отверждаемых костно-пластических материалов / Кузнецова В.С., Васильев А.В., Григорьев Т.Е., Загоскин Ю.Д., Чвалун С.Н., Бухарова Т.Б., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А., // Стоматология. — 2017. — № 6. -С. 66-72

32. Кузнецова В.С. Безопасность и эффективность применения морфогенетических белков кости 2 и 7 в стоматологии / В.С. Кузнецова, А.В. Васильев, Т.Б. Бухарова, Д.В. Гольдштейн, А.А. Кулаков // Стоматология. — 2019. — № 1. — С. 64-69

33. Кузнецова В.С. Перспективы использования гидрогелей в качестве основы для отверждаемых костно-пластических материалов / В.С. Кузнецова, А.В. Васильев, Ю.Д. Загоскин, С.Н. Чвалун, Т.Б. Бухарова, Д.В. Гольдштейн, А.А. Кулаков // Стоматология. — 2017. — № 6. — С. 68-74.

34. Кузнецова Д.С. Костные имплантаты на основе скаффолдов и клеточных систем в тканевой инженерии / Кузнецова Д. С., Тимашев П. С., Баграташвили В. Н., Загайнова Е. В. // Современные технологии в медицине.

— 2014. — №4. — С.201-211

35. Кузнецова О.М. Роль фактора роста эндотелия сосудов в развитии ангиогенеза костной ткани : (3) / О.М. Кузнецова, Т.Т. Березов // Вестник

Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. — 2004. — №23. — С. 18-22.

36. Кулаков А.А. Современные подходы к применению метода дентальной имплантации при атрофии и дефектах костной ткани челюстей / А.А. Кулаков, Р.Ш. Гветадзе, Т.В. Брайловская, А.А. Харькова, Л.С. Дзиковицкая // Стоматология. — 2017. — № 1. — С. 43.

37. Кулаков А.А. Увеличение объема альвеолярного отростка в переднем отделе верхней челюсти с применением мембраны на основе титановой нити / А.А. Кулаков, В.А. Бадалян, А.С. Каспаров, З.М. Степанян, В.А. Брутян // Клиническая Стоматология. — 2020. — № 1 (93). — С. 54-58

38. Кулаков А.А. Хирургическая стоматология и челюстно-лицевая хирургия: национальное руководство : Национальное руководство / А.А. Кулаков, Т.Г. Робустова, А.И. Неробеев. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 928 р.

39. Лобзина Н.В. Свойства хитозана и его применение в офтальмологии / Н.В. Лобзина, И.Н. Большаков, В.И. Лазаренко // Сибирское медицинское обозрение. — 2015. — № 5. — С. 5-13.

40. Лосев В.Ф. Применение пористого минералнаполненного полилактида с мезенхимальными стромальными клетками костного мозга для стимуляции остеогенеза (экспериментальное исследование): дис. ... к-та мед. наук: 14.00.21 / В.Ф. Лосев. — Москва: ФГУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии," 2009. — 139 с.

41. Микляев С.В. Изучение качества жизни у пациентов, страдающих хроническими воспалительными заболеваниями пародонта / С.В. Микляев, О.М. Леонова, В.К. Глазьев, А.В. Сущенко, О.И. Олейник // Вестник Тамбовского Университета. Серия: Естественные И Технические Науки. — 2017. — № 1(22). — С. 187-192.

42. Михайловский А.А. Сохранение объема костной ткани челюсти при удалении зубов: дис. ... к-та мед. наук: 14.01.14 / А.А. Михайловский. — Москва: ФГБУ "ЦНИИС и ЧЛХ" Минздрава России, 2015. — 158 с.

43. Мишустина О.Л. Морфогенетическая роль фибронектина в структурных основах гомеостаза / О.Л. Мишустина // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. — 2005. — С. 119-121.

44. Осидак Е.О. Коллаген - биоматериал для доставки факторов роста и регенерации ткани / Е.О. Осидак, М.С. Осидак, М.А. Ахманова, С.П. Домогатский // Российский Химический Журнал. — 2012. — № 5-6. — С. 102-113.

45. Осидак Е.О. Контролируемое высвобождение фактора роста костной ткани гКВМР-2 из коллаген-содержащего имплантируемого материала и его влияние на иммунную систему: дис. ... к-та биол. наук: 14.03.09, 03.01.02 / Е.О. Осидак. — 2014. — 127 с.

46. Осидак Е.О. Регуляция фибронектином плазмы крови связывания фактора роста ВМР-2 с коллагеном / Е.О. Осидак, М.С. Осидак, Д.Е. Сивогривов, Т.С. Портная, Т.М. Грунина, Л.А. Соболева, В.Г. Лунин, et а1. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2014. — № 2. — С. 226-231.

47. Педаченко Е.Г. Современные костные цементы для пункционной вертебропластики / Е.Г. Педаченко, С.В. Кущаев // Украинский нейрохирургический журнал. — 2001. — № 4. — С. 24-31.

48. Полежаев Л.В. Восстановление нерегенерирующих костей черепа у млекопитающих / Л.В. Полежаев // Изв. АН СССР. — 1957. — № 5. — С. 556-571.

49. Полежаев Л.В. Регенерация путем индукции / Л.В. Полежаев. — М.: Медицина, 1977. — 179 с.

50. Преображенский Н.А. Химия биологически активных природных соединений / Н.А. Преображенский, Р.П. Евстигнеева. - М.: Химия, 1976. — 456 с.

51. Рахматуллина Л.Р. Разработка клеточных биоматриц на основе гиалуроновой кислоты / Л.Р. Рахматуллина, Е.С. Барышева, Р.Р. Рахматуллин // Современные наукоемкие технологии. — 2010. — № 2. — Р. 111-112.

52. Серебренникова С.Н. Роль цитокинов в воспалительном процессе (сообщение 2) / С.Н. Серебренникова, И.Ж. Семинский // Сибирский медицинский журнал. — 2008. — № 4. — С. 5-8.

53. Соколова А.И. Зависимость биологических свойств скаффолдов из фиброина шелка и желатина от состава и технологии изготовления / А.И. Соколова, М.М. Боброва, Л.А. Сафонова, О.И. Агапова, М.М. Мойсенович, И.И. Агапов // Современные технологии в медицине. — 2016. — № 8. — № 3.

— С. 6-15.

54. Строкова Н.Г. Современные способы переработки хитинсодержащего сырья / Н.Г. Строкова, А.В. Подкорытова // Труды ВНИРО. — 2018. — Т. 170.

— С. 124-152.

55. Токарева М.И. Гетероциклы природного происхождения в качестве нетоксичных реагентов для сшивки белков и полисахаридов / М.И. Токарева, М.Н. Иванцова, М.А. Миронов // Химия гетероцикличных соединений. — 2017. — № 1. — С. 21-35.

56. Усов А.И. Альгиновые кислоты и альгинаты: методы анализа, определения состава и установления строения / А.И. Усов. — 1999. — С. 10511061.

57. Фатхудинова Н.Л. Перспективы использования коллагенового гидрогеля в качестве основы для отверждаемых и активированных костнопластических материалов / Н.Л. Фатхудинова, А.В. Васильев, Т.Б. Бухарова, Е.О. Осидак, Н.В. Старикова, С.П. Домогатский, Д.В. Гольдштейн, А.А. Кулаков // Стоматология. — 2018. — №6. — С.78-83.

58. Федеральный закон "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" 21.11.2011 N 323. — ред. от 31.07.2020

59. Хмельницкая К.А. Современные представления о клеточно-молекулярных механизмах ангиогенеза / К.А. Хмельницкая, А.Я. Гудкова, Е.В. Шляхто // Ученые записки СПбГМУ им. И.П. Павлова. — 2015. — № 1.

— С. 6-13.

60. Шарапова Н.Е. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo / Н.Е. Шарапова, А.П. Котнова, З.М. Галушкина, Н.В. Лаврова, Н.Н. Полетаева, А.Э. Тухватуллин, и др. // Молекулярная иология. — 2010. — №2 6. — С. 1036-1044.

61. Штильман М.И. Биодеградация полимеров / М.И. Штильман // Журнал Журнал Сибирского федерального университета. Серия: биология. — 2015. — № 2. — С. 113-130.

62. Яценко А.А. Изучение морфологических и биодеградируемых свойств пористого скаффолда желатина для использования в тканевой инженерии легких / А.А. Яценко, В.А. Кушнарев, Д.В. Леонов, Е.М. Устинов, С.С. Целуйко // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. — 2019. — № 72. — С. 66-72

63. AbdelRazek M. Case series of two patients with Fibrocartilaginous Embolism mimicking Transverse Myelitis of the Spinal Cord / M. AbdelRazek, R. Elsadek, L. Elsadek // Journal of Clinical Neuroscience. — 2017. — Vol. 40. — P. 66-68.

64. Abhinand C.S. VEGF-A/VEGFR2 signaling network in endothelial cells relevant to angiogenesis / C.S. Abhinand, R. Raju, S.J. Soumya, P.S. Arya, P.R. Sudhakaran // Journal of Cell Communication and Signaling. — 2016. — Vol. 10(4).

— P. 347-354.

65. Achour A. B. The Influence of Thrust Force on the Vitality of Bone Chips Harvested for Autologous Augmentation during Dental Implantation / A. Ben Achour, C. Petto, H. Meißner, D. Hipp, A. Nestler, G. Lauer, U. Teicher // Materials.

— 2019. — Vol. 12:3695. — [Epub]

66. Agrawal C.M. Fabrication and Characterization of PLA-PGA Orthopedic Implants / C.M. Agrawal, G.G. Niederauer, K.A. Athanasiou // Tissue Engineering.

— 1995. — Vol. 1. — № 3. — P. 241-252.

67. Ahmadi F. Chitosan based hydrogels: characteristics and pharmaceutical applications / F. Ahmadi, Z. Oveisi, S.M. Samani, Z. Amoozgar // Research in Pharmaceutical Sciences. — 2015. — Vol. 10. — P. 1-16.

68. Ahmadi R. Biocompatibility and gelation of chitosan—glycerol phosphate hydrogels / R. Ahmadi, J.D. de Bruijn // Journal of Biomedical Materials Research Part A. — 2008. — Vol. 86A. — № 3. — P. 824-832.

69. AI-Aql Z.S. Molecular Mechanisms Controlling Bone Formation during Fracture Healing and Distraction Osteogenesis / Z.S. AI-Aql, A.S. Alagl, D.T. Graves, L.C. Gerstenfeld, T.A. Einhorn // Journal of Dental Research. — 2008. — Vol. 87. (2). — P. 107-118.

70. Albrektsson T. Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration / T. Albrektsson, C. Johansson // European Spine Journal. — 2001. — Vol. 10 Suppl 2.

— P. S96-101.

71. Ambard A.J. Calcium Phosphate Cement: Review of Mechanical and Biological Properties / A.J. Ambard, L. Mueninghoff // Journal of Prosthodontics.

— 2006. — Vol. 15. — P. 321-328.

72. Ambikanandan M. Applications of polymers in drug delivery / M. Ambikanandan, S. Aliasgar. — Elsevier, 2020. — 650 p.

73. Amin Almasri M.A.J. Dental implantology and biomaterial / M.A.J. Amin Almasri. — Rijeka, Croatia: InTech, 2016. — 200 p.

74. Amoabediny G. The Role of Biodegradable Engineered Scaffold in Tissue Engineering / G. Amoabediny, N. Salehi-Nik, B. Heli // Biomaterials Science and Engineering / ed. R. Pignatello. — InTech, 2011. — 456 p.

75. Andersen T. 3D Cell Culture in Alginate Hydrogels / T. Andersen, P. Auk-Emblem, M. Dornish // Microarrays. — 2015. — Vol. 4(2) — P. 133-161.

76. Annabi N. Controlling the Porosity and Microarchitecture of Hydrogels for Tissue Engineering / N. Annabi, J.W. Nichol, X. Zhong, C. Ji, S. Koshy, A. Khademhosseini, F. Dehghani // Tissue Engineering Part B: Reviews. — 2010. — Vol. 16. — № 4. — P. 371-383.

77. Arrington E.D. Complications of Iliac Crest Bone Graft Harvesting: / E.D. Arrington, W.J. Smith, H.G. Chambers, A.L. Bucknell, N.A. Davino // Clinical Orthopaedics & Related Research. — 1996. — Vol. 329. — P. 300-309.

78. Augst A.D Alginate Hydrogels as Biomaterials / A.D. Augst, H.J. Kong, D.J. Mooney // Macromolecular Bioscience. — 2006. — Vol. 6(8). — P. 623-633.

79. Azuma K.. Anticancer and Anti-Inflammatory Properties of Chitin and Chitosan Oligosaccharides / K. Azuma, T. Osaki, S. Minami, Y. Okamoto // Journal of Functional Biomaterials. — 2015. — Vol. 6 (1) — P. 33-49.

80. Bahney C.S. Cellular biology of fracture healing / C.S. Bahney, R.L. Zondervan, P. Allison, A. Theologis, J.W. Ashley, J. Ahn, T. Miclau, et al. // Journal of Orthopaedic Research. — 2019. — Vol. 37 (1). — P. 35-50.

81. Bahram M. An Introduction to Hydrogels and Some Recent Applications / M. Bahram, N. Mohseni, M. Moghtader // Emerging Concepts in Analysis and Applications of Hydrogels / ed. S.B. Majee. — InTech, 2016. — 256 p.

82. Bai B. Histological Changes of an Injectable rhBMP-2/Calcium Phosphate Cement in Vertebroplasty of Rhesus Monkey: / B. Bai, Z. Yin, Q. Xu, M. Lew, Y. Chen, J. Ye, J. Wu, et al. // Spine. — 2009. — Vol. 34. — Histological Changes of an Injectable rhBMP-2/Calcium Phosphate Cement in Vertebroplasty of Rhesus Monkey. — № 18. — P. 1887-1892.

83. Bandyopadhyay A. Genetic Analysis of the Roles of BMP2, BMP4, and BMP7 in Limb Patterning and Skeletogenesis / A. Bandyopadhyay, K. Tsuji, K. Cox, B.D. Harfe, V. Rosen, C.J. Tabin // PLoS Genetics. — 2006. — Vol. 2(12). — P. e216.

84. Barinov S.M. Calcium phosphate bone cements / S.M. Barinov, V.S. Komlev // Inorganic Materials. — 2011. — Vol. 47(13). — P. 1470-1485.

85. Barralet J.E. Effect of porosity reduction by compaction on compressive strength and microstructure of calcium phosphate cement / J.E. Barralet, T. Gaunt, A.J. Wright, I.R. Gibson, J.C. Knowles // Journal of Biomedical Materials Research. — 2002. — Vol. 63(1). — P. 1-9.

86. Batstone M. Reconstruction of major defects of the jaws / M. Batstone // Australian Dental Journal. — 2018. — Vol. 63. — P. S108-S113.

87. Ben-Nissan B. Advances in calcium phosphate biomaterials : Springer series in biomaterials science and engineering / B. Ben-Nissan 00017. — Berlin: Springer, 2014. — 2. — 547 p.

88. Benzel E.C. Spine surgery: techniques, complication avoidance, and management / E.C. Benzel, T.B. Francis. — Philadelphia, PA: Elsevier/Saunders, 2012. — 1600 p.

89. Berger J. Pseudo-thermosetting chitosan hydrogels for biomedical application / J. Berger, M. Reist, A. Chenite, O. Felt-Baeyens, J.M. Mayer, R. Gurny // International Journal of Pharmaceutics. — 2005. — Vol. 288(2). — P. 197-206.

90. Bergsma J.E. In vivo degradation and biocompatibility study of in vitro pre-degraded as-polymerized polylactide particles / J.E. Bergsma, F.R. Rozema, R.R.M. Bos, G. Boering, W.C. de Bruijn, A.J. Pennings // Biomaterials. — 1995. — Vol. 16(4). — P. 267-274.

91. Bessa P.C. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts) / P.C. Bessa, M. Casal, R.L. Reis // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. — 2008a. — Vol. 2. — P. 1-13.

92. Bessho K. Bone induction by Escherichia coli -derived recombinant human bone morphogenetic protein-2 compared with Chinese hamster ovary cell-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2 / K. Bessho, Y. Konishi, S. Kaihara, K. Fujimura, Y. Okubo, T. Iizuka // British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. — 2000. — Vol. 38(6). — P. 645-649.

93. Bhattarai N. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery / N. Bhattarai, J. Gunn, M. Zhang // Advanced Drug Delivery Reviews. — 2010. — Vol. 62(1). — P. 83-99.

94. Boyan B.D. Potential of porous poly-D,L-lactide-co-glycolide particles as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-2 during osteoinduction in vivo / B.D. Boyan, C.H. Lohmann, a. Somers, G.G. Niederauer, J.M. Wozney,

D.D. Dean, D.L. Carnes, et al. // Journal of Biomedical Materials Research. — 1999.

— Vol. 46. — № 1. — P. 51—59.

95. Bronzino J.D. The biomedical engineering handbook : The electrical engineering handbook series / ed. J.D. Bronzino. — 3rd ed. — Boca Raton: CRC / Taylor & Francis, 2006. — 3 p.

96. Budiraharjo R. Enhancing bioactivity of chitosan film for osteogenesis and wound healing by covalent immobilization of BMP-2 or FGF-2 / R. Budiraharjo, K.G. Neoh, E.-T. Kang // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. — 2013. — Vol. 24(6). — P. 645-662.

97. Bukharova T. B. Effect of Molecular Characteristics and Morphology on Mechanical Performance and Biocompatibility of PLA-Based Spongious Scaffolds / T. B. Bukharova, A.V. Vasilyev, T.E. Grigoriev, G. E. Leonov, Y. D. Zagoskin, et al. // BioNanoScience - 14 August 2018. - Issue 4. - P. 977-983

98. Burstein A.H. Aging of bone tissue: mechanical properties / A.H. Burstein, D.T. Reilly, M. Martens // The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. — 1976. — Vol. 58(1). — P. 82-86.

99. Callis T.E. Bone Morphogenetic Protein Signaling Modulates Myocardin Transactivation of Cardiac Genes / T.E. Callis, D. Cao, D.-Z. Wang // Circulation Research. — 2005. — Vol. 97(10). — P. 992-1000.

100. Campana V. Bone substitutes in orthopaedic surgery: from basic science to clinical practice / V. Campana, G. Milano, E. Pagano, M. Barba, C. Cicione, G. Salonna, W. Lattanzi, et al. // Journal of Materials Science: Materials in Medicine.

— 2014. — Vol. 25(10). — P. 2445-2461.

101. Carragee E.J. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned / E.J. Carragee, E.L. Hurwitz, B.K. Weiner // The Spine Journal. — 2011. — Vol. 11(6).

— p. 471-491.

102. Carreira A.C.O. Bone Morphogenetic Proteins / A.C.O. Carreira, W.F. Zambuzzi, M.C. Rossi, R.A. Filho, M.C. Sogayar, J.M. Granjeiro // Vitamins & Hormones. — Elsevier, 2015. — Vol. 99. — P. 293-322.

103. Carter D.R. The compressive behavior of bone as a two-phase porous structure / D.R. Carter, W.C. Hayes // The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. — 1977. — Vol. 59. (7). — P. 954-962.

104. Catoira M.C. Overview of natural hydrogels for regenerative medicine applications / M.C. Catoira, L. Fusaro, D. Di Francesco, M. Ramella, F. Boccafoschi // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. — 2019. — Vol. 30:115. — [Epub].

105. Cha H.-S. Frequency of bone graft in implant surgery / H.-S. Cha, J.-W. Kim, J.-H. Hwang, K.-M. Ahn // Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery. — 2016. — Vol. 38:19. — 4 p. — [Epub]

106. Chang P.-C. Bone tissue engineering with novel rhBMP2-PLLA composite scaffolds / P.-C. Chang, B.-Y. Liu, C.-M. Liu, H.-H. Chou, M.-H. Ho, H.-C. Liu, D.-M. Wang, et al. // Journal of Biomedical Materials Research Part A. — 2007. — Vol. 81A(4). — P. 771-780.

107. Charoenlarp P. Role of fibroblast growth factors in bone regeneration / P. Charoenlarp, A.K. Rajendran, S. Iseki // Inflammation and Regeneration. — 2017. —37:10. — [Epub]

108. Chen X. 3D printed porous PLA/nHA composite scaffolds with enhanced osteogenesis and osteoconductivity in vivo for bone regeneration / X. Chen., C. Gao, J. Jiang, Y. Wu, P. Zhu, G. Chen // Biomedical Materials. — 2019. — Vol. 14(6).

— P. 065003.

109. Cheng H. Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs): / H. Cheng, W. Jiang, F.M. Phillips, R.C. Haydon, Y. Peng, L. Zhou, H.H. Luu, et al. // The Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. — 2003. — Vol. 85(8). — P. 1544-1552.

110. Cheng S. Cross-linking and film-forming properties of transglutaminase-modified collagen fibers tailored by denaturation temperature / S. Cheng, W. Wang, Y. Li, G. Gao, K. Zhang, J. Zhou, Z. Wu // Food Chemistry. — 2019. — Vol. 271.

— P. 527-535.

111. Cheng S.-L. Msx2 Promotes Osteogenesis and Suppresses Adipogenic Differentiation of Multipotent Mesenchymal Progenitors / S.-L. Cheng, J.-S. Shao, N. Charlton-Kachigian, A.P. Loewy, D.A. Towler // Journal of Biological Chemistry. — 2003. — Vol. 278(46). — P. 45969-45977.

112. Chenite A. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ / A. Chenite, C. Chaput, D. Wang, C. Combes, M.D. Buschmann, C.D. Hoemann, J.C. Leroux, et al. // Biomaterials. — 2000. — Vol. 21(21). — P. 21552161.

113. Chircov C. Grumezescu A.M. Hyaluronic acid-based scaffolds for tissue engineering / C. Chircov, A.M. Grumezescu, L.E. Bejenaru // Romanian Journal of Morphology and Embryology = Revue Roumaine De Morphologie Et Embryologie.

— 2018. — Vol. 59(1). — P. 71-76.

114. Cho M.H. Chitosan gel as an in situ-forming scaffold for rat bone marrow mesenchymal stem cells in vivo / M.H. Cho, K.S. Kim, H.H. Ahn, M.S. Kim, S.H. Kim, G. Khang, B. Lee, et al. // Tissue Engineering. Part A. — 2008. — Vol. 14.

— № 6. — P. 1099-1108.

115. Cho T.-J. Gerstenfeld L.C. Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing / T.-J. Cho, L.C. Gerstenfeld, T.A. Einhorn // Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. — 2002. — Vol. 17(3). — P. 513-520.

116. Choi J.W. Appropriate and Effective Dosage of BMP-2 for the Ideal Regeneration of Calvarial Bone Defects in Beagles: / J.W. Choi, W.S. Jeong, S.J. Yang, E.J. Park, T.S. Oh, K.S. Koh // Plastic and Reconstructive Surgery. — 2016.

— Vol. 138 — P. 64e-72e.

117. Chow L. C. Next generation calcium phosphate-based biomaterials / L. C. Chow // Dental Materials Journal. — 2009. — Vol. 28(1). — P. 1-10.

118. Clark D.P. Biotechnology:Applying the Genetic Revolution / D.P. Clark, N.J. Pazdernik — Elsevier Science, 2010. — 750 p.

119. Cornell C.N. Osteoconductive materials and their role as substitutes for autogenous bone grafts / C.N. Cornell // The Orthopedic Clinics of North America.

— 1999. — Vol. 30(4). — P. 591-598.

120. Cowin S.C. Bone mechanics handbook / ed. S.C. Cowin. — 2nd ed. — Boca Raton, FL: CRC Press, 2001. — 980 p.

121. Curry A.S. Taking cues from the extracellular matrix to design bone-mimetic regenerative scaffolds / A.S. Curry, N.W. Pensa, A.M. Barlow, S.L. Bellis // Matrix Biology. — 2016. — Vols. 52-54. — P. 397-412.

122. Cutright D.E. Degradation rates of polymers and copolymers of polylactic and polyglycolic acids / D.E. Cutright, B. Perez, J.D. Beasley, W.J. Larson, W.R. Posey // Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology. — 1974. — Vol. 37(1). — P. 142-152.

123. Dawson E. Increased Internal Porosity and Surface Area of Hydroxyapatite Accelerates Healing and Compensates for Low Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Concentrations in Critically-Sized Bone Defects / E. Dawson, R. Suzuki, M. Samano, M. Murphy // Applied Sciences. — 2018. — Vol. 8 — P. 1366.

124. Deb S. Orthopaedic bone cements : Woodhead publishing in materials / S. Deb. — Boca Raton, Fla.: CRC Press [u.a.], 2008. — 408 p.

125. Dempster D.W. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: A 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee / D.W. Dempster, J.E. Compston, M.K. Drezner, F.H. Glorieux, J.A. Kanis, H. Malluche, P.J. Meunier, et al. // Journal of Bone and Mineral Research. — 2013. — Vol. 28(1). — P. 2-17.

126. Deshmukh J. Vertical and horizontal ridge augmentation in anterior maxilla using autograft, xenograft and titanium mesh with simultaneous placement of endosseous implants / J. Deshmukh, S. Deshpande, R. Khatri, S. Deshpande, S. Deshpande // Journal of Indian Society of Periodontology. — 2014. — Vol. 18(5).

— P. 661-665.

127. Di Lullo G.A. Mapping the Ligand-binding Sites and Disease-associated Mutations on the Most Abundant Protein in the Human, Type I Collagen / G.A. Di

Lullo, S.M. Sweeney, J. Körkkö, L. Ala-Kokko, J.D. San Antonio // Journal of Biological Chemistry. — 2002. — Vol. 277(6) — P. 4223-4231.

128. Di Pierro P. Transglutaminase-catalyzed preparation of chitosan— ovalbumin films / P. Di Pierro. B. Chico, R. Villalonga, L. Mariniello, P. Masi, R. Porta // Enzyme and Microbial Technology. — 2007. — Vol. 40(3). — P. 437-441.

129. Dimitriou R. Current concepts of molecular aspects of bone healing / R. Dimitriou, E. Tsiridis, P.V. Giannoudis // Injury. — 2005. — Vol. 36(12). — P. 1392-1404.

130. Dominici M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement / M. Dominici, K. Le Blanc, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F. Marini, D. Krause, R. Deans, et al. // Cytotherapy. — 2006. — Vol. 8(4). — P. 315-317.

131. Draenert F.G. BMP-2 and bFGF release and in vitro effect on human osteoblasts after adsorption to bone grafts and biomaterials / F.G. Draenert, A.-L. Nonnenmacher, P.W. Kämmerer, J. Goldschmitt, W. Wagner // Clinical Oral Implants Research. — 2013. — Vol. 24(7). — P. 750-757.

132. Dunham C.E. Mechanical properties of cancellous bone of the distal humerus / C.E. Dunham, S.E. Takaki, J.A. Johnson, C.E. Dunning // Clinical Biomechanics. — 2005. — Vol. 20(8). — P. 834-838.

133. Edelmayer M. Which substances loaded onto collagen scaffolds influence oral tissue regeneration?—an overview of the last 15 years / M. Edelmayer. C. Wehner, C. Ulm, W. Zechner, D. Shafer, H. Agis // Clinical Oral Investigations. — 2020. — P.104-108

134. Egri S. Sequential VEGF and BMP-2 releasing PLA-PEG-PLA scaffolds for bone tissue engineering: I. Design and in vitro tests / S. Egri, N. Eczacioglu // Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. — 2017. — Vol. 45. — P. 321-329.

135. Elgali I. Guided bone regeneration: materials and biological mechanisms revisited / I. Elgali, O. Omar, C. Dahlin, P. Thomsen // European Journal of Oral Sciences. — 2017. — Vol. 125. — P. 315-337.

136. Emam H.A. Stevens M.R. Concepts in Bone Reconstruction for Implant Rehabilitation / H.A. Emam, M.R. Stevens // A Textbook of Advanced Oral and Maxillofacial Surgery / ed. M.H. Kalantar Motamedi. — InTech, 2013. — 404 p.

137. Emami F. Drying Technologies for the Stability and Bioavailability of Biopharmaceuticals / F. Emami, A. Vatanara, E. Park, D. Na // Pharmaceutics. — 2018. — Vol. 10(3) — P. 131.

138. Epstein N. Pros, cons, and costs of INFUSE in spinal surgery / N. Epstein // Surgical Neurology International. — 2011. — 2:10. — [Epub]

139. Erben R.G. Bone-Labeling Techniques / R.G. Erben // Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage / eds. Y.H. An, K.L. Martin. — Totowa, NJ: Humana Press, 2003. — P. 99-117.

140. Evans C.H. Gene delivery to bone / C.H. Evans // Advanced Drug Delivery Reviews. — 2012. — Vol. 64(12). — P. 1331-1340.

141. Fabiano A. Thermosensitive hydrogel based on chitosan and its derivatives containing medicated nanoparticles for transcorneal administration of 5-fluorouracil / A. Fabiano, R. Bizzarri, Y. Zambito // International Journal of Nanomedicine. —

2017. — Vol. 12. — P. 633-643.

142. Farah S. Physical and mechanical properties of PLA, and their functions in widespread applications — A comprehensive review / S. Farah, D.G. Anderson, R. Langer // Advanced Drug Delivery Reviews. — 2016. — Vol. 107. — P. 367-392.

143. Fong D. Chitosan immunomodulatory properties: perspectives on the impact of structural properties and dosage / D. Fong, C.D. Hoemann // Future Science OA.

— 2018. — Vol. 4 (1). — P. FSO225.

144. Fonseca R.J. Oral and maxillofacial surgery / R.J. Fonseca. — Saunders,

2018. — 2696 p.

145. Friedrichs M. BMP signaling balances proliferation and differentiation of muscle satellite cell descendants / M. Friedrichs, F. Wirsdoerfer, S.B. Flohe, S. Schneider, M. Wuelling, A. Vortkamp // BMC Cell Biology. — 2011. — Vol. 12.

— № 26. — 12 p. — [Epub]

146. Frohlich M. Tissue Engineered Bone Grafts: Biological Requirements, Tissue Culture and Clinical Relevance / M. Frohlich, W. Grayson, L. Wan, D. Marolt, M. Drobnic, G. Vunjak- Novakovic // Current Stem Cell Research & Therapy. — 2008. — Vol. 3. (4). — P. 254-264.

147. Gao T. Composites of bone morphogenetic protein (BMP) and type IV collagen, coral-derived coral hydroxyapatite, and tricalcium phosphate ceramics / T. Gao, T.S. Lindholm, A. Marttinen, M.R. Urist // International Orthopaedics. — 1996. — Vol. 20. — № 5. — P. 321-325.

148. Galitsyna E.V. Collagen-based hydrogel functionalized with rhBMP-2 / E.V. Galitsyna, T.B. Bukharova, A.V. Vasilyev, E.O. Osidak, S.P. Domogatsky, D.V. Goldshtein // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. — 2020. — 548 062069.

149. Gardlik R. Vectors and delivery systems in gene therapy / R. Gardlik, R. Palffy, J. Hodosy, J. Lukacs, J. Turna, P. Celec // Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. — 2005. — Vol. 11(4). — P. RA110-121.

150. Garg T. Scaffold: a novel carrier for cell and drug delivery / T. Garg, O. Singh, S. Arora, R. Murthy // Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems.

— 2012. — Vol. 29. — Scaffold. — № 1. — P. 1-63.

151. Gerber H.P. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation / H.P. Gerber, T.H. Vu, A.M. Ryan, J. Kowalski, Z. Werb, N. Ferrara // Nature Medicine. — 1999. — Vol. 5(6).

— P. 623-628.

152. Gerstenfeld L.C. Fracture healing as a post-natal developmental process: Molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation / L.C. Gerstenfeld, D.M. Cullinane, G.L. Barnes, D.T. Graves, T.A. Einhorn // Journal of Cellular Biochemistry. — 2003. — Vol. 88(5). — P. 873-884.

153. Gibbs. D.M.R. A review of hydrogel use in fracture healing and bone regeneration: Hydrogel use in fracture healing and bone regeneration / D.M.R.

Gibbs, C.R.M. Black, J.I. Dawson, R.O.C. Oreffo // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. — 2016. — Vol. 3. — P. 187-198.

154. Gilbert S.F. Developmental biology / S.F. Gilbert 00501. — 6th ed. — Sunderland, Mass: Sinauer Associates, 2000. — 749 p.

155. Gilboa L. Bone morphogenetic protein receptor complexes on the surface of live cells: a new oligomerization mode for serine/threonine kinase receptors / L. Gilboa, A. Nohe, T. Geissendörfer, W. Sebald, Y.I. Henis, P. Knaus // Molecular Biology of the Cell. — 2000. — Vol. 11. — P. 1023-1035.

156. Ginebra M.P. Setting Reaction and Hardening of an Apatitic Calcium Phosphate Cement / M.P. Ginebra, E. Fernandez, E.A.P. De Maeyer, R.M.H. Verbeeck, M.G. Boltong, J. Ginebra, F.C.M. Driessens, et al. // Journal of Dental Research. — 1997. — Vol. 76(4). — P. 905-912.

157. Globe Newswire. Dental Bone Graft Substitutes Market by Material (Demineralized Bone Matrix, Autograft, Allograft, Xenograft, and Synthetic Bone Graft Substitute), by Application (Ridge Augmentation, Socket Preservation, Periodontal Defect Regeneration, Implant Bone Regeneration, Sinus Lift, and Others), by Product (Bio-Oss, Osteograf, Grafton, and Others), and by End-User (Hospitals, Ambulatory Surgical Centers, and Dental Clinics): Global Industry Perspective, Comprehensive Analysis, and Forecast, 2018—2025 / Globe Newswire, New York. — 2019. — [Epub]

158. Glover D.J. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans / D.J. Glover, H.J. Lipps, D.A. Jans // Nature Reviews Genetics. — 2005. — Vol. 6(4). — P. 299-310.

159. Gothard D. Tissue engineered bone using select growth factors: A comprehensive review of animal studies and clinical translation studies in man / D. Gothard, J. Kanczler, H. Rashidi, O. Qutachi, J. Henstock, M. Rotherham, A. El Haj, et al. // European Cells and Materials. — 2014. — Vol. 28. — Tissue engineered bone using select growth factors. — P. 166-208.

160. Gough J.E. Scotchford C.A. Cytotoxicity of glutaraldehyde crosslinked collagen/poly(vinyl alcohol) films is by the mechanism of apoptosis / J.E. Gough,

C.A. Scotchford, S. Downes // Journal of Biomedical Materials Research. — 2002.

— Vol. 61(1). — P. 121-130.

161. Grigoriev T. E. Influence of Molecular Characteristics of Chitosan on Properties of In situ Formed Scaffolds / T. E. Grigoriev, Y. D. Zagoskin, S. I. Belousov, A. V. Vasilyev, T. B. Bukharova, G. E. Leonov, E. V. Galitsyna, D. V. Goldshtein, S. N. Chvalun, A. A. Kulakov, M. A. Paltsev // BioNanoScience

— 21 April 2017 — V.7 (3). — P. 492-495

162. Grover L.M. Biologically mediated resorption of brushite cement in vitro / L.M. Grover, U. Gbureck, A.J. Wright, M. Tremayne, J.E. Barralet // Biomaterials.

— 2006. — Vol. 27. — № 10. — P. 2178-2185.

163. Gruber R. Ectopic bone formation after implantation of a slow release system of polylactid acid and rhBMP-2 / R. Gruber, H.A. Weich, C. Dullin, H. Schliephake // Clinical Oral Implants Research. — 2009. — Vol. 20. — № 1. — P. 24-30.

164. Gultekin B.A. Comparison of Bone Resorption Rates after Intraoral Block Bone and Guided Bone Regeneration Augmentation for the Reconstruction of Horizontally Deficient Maxillary Alveolar Ridges / B.A. Gultekin, E. Bedeloglu, T.E. Kose, E. Mijiritsky // BioMed Research International. — 2016. — Vol. 2016.

— P. 1-9.

165. Hamilton V. Characterization of chitosan films and effects on fibroblast cell attachment and proliferation / V. Hamilton, Y. Yuan, D.A. Rigney, A.D. Puckett, J.L. Ong, Y. Yang, S.H. Elder, et al. // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. — 2006. — Vol. 17(12). — P. 1373-1381.

166. Hanamura H. Solubilized bone morphogenetic protein (BMP) from mouse osteosarcoma and rat demineralized bone matrix / H. Hanamura, Y. Higuchi, M. Nakagawa, H. Iwata, H. Nogami, M.R. Urist // Clinical Orthopaedics and Related Research. — 1980. — Vol. 148. — P. 281-290.

167. Hänseler P. Delivery of BMP-2 by two clinically available apatite materials: In vitro and in vivo comparison: Delivery of rhBMP-2 by Apatite Granules / P. Hänseler M. Ehrbar, A. Kruse, E. Fischer, R. Schibli, C. Ghayor, F.E. Weber //

Journal of Biomedical Materials Research Part A. — 2015. — Vol. 103(2). — P. 628-638.

168. Hapach L.A. Manipulation of in vitro collagen matrix architecture for scaffolds of improved physiological relevance / L.A. Hapach, J.A. VanderBurgh, J.P. Miller, C.A. Reinhart-King // Physical Biology. — 2015. — Vol. 12. — № 6. — 061002.

169. Hasan A. Tissue engineering for artificial organs: regenerative medicine, smart diagnostics and personalized medicine. Volume 2 / ed. A. Hasan. — First edition. — Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2017. — 363 p.

170. Havaldar R. Insights into the effects of tensile and compressive loadings on human femur bone / R. Havaldar, S.C. Pilli, B.B. Putti // Advanced Biomedical Research. — 2014. — Vol. 3. — № 1. — P. 101.

171. Heathman. T.R. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges / T.R. Heathman, A.W. Nienow, M.J. McCall, K. Coopman, B. Kara, C.J. Hewitt // Regenerative Medicine. — 2015. — Vol. 10(1). — P. 49-64.

172. Heidemann W. In-vivo-Untersuchung zur Degradation von Poly-(D,L-)Laktid- und Poly-(L-Laktid-co-Glykolid)-Osteosynthesematerial / W. Heidemann, J.H. Fischer, J. Koebke, C. Bussmann, K.L. Gerlach // Mund-, Kiefer-und Gesichtschirurgie. — 2003. — Vol. 7(5). — P. 283-288.

173. Hench L.L. An Introduction to Bioceramics / L.L. Hench, J. Wilson. — World Scientific, 1993. — 396 p.

174. Hench L.L. Biomaterials, artificial organs and tissue engineering / L.L. Hench. — Cambridge: Woodhead, 2005. — 304 p.

175. Hermanson G.T. / Zero-Length Crosslinkers / G.T. Hermanson // Bioconjugate Techniques. — Elsevier, 2008. — P. 213-233.

176. Holloway J.L. Modulating hydrogel crosslink density and degradation to control bone morphogenetic protein delivery and in vivo bone formation / J.L. Holloway, H. Ma, R. Rai, J.A. Burdick // Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. — 2014. — Vol. 191. — P. 63-70.

177. Honghui W. Preparation, fundamental characteristics and biosafety evalution of compound rhBMP-2/CPC / W. Honghui, S. Chongyi, S. Tiefeng, W. Kaibing, B. Bin, Y. Yuanshu // Journal of Wuhan University of Technology-Mater. Sci. Ed. — 2006. — Vol. 21(2). — P. 116-119.

178. Hsu S. Chitosan as Scaffold Materials: Effects of Molecular Weight and Degree of Deacetylation / S. Hsu, S.W. Whu, C.-L. Tsai, Y.-H. Wu, H.-W. Chen, K.-H. Hsieh // Journal of Polymer Research. — 2004. — Vol. 11(2). — P. 141-147.

179. Hu W. Advances in crosslinking strategies of biomedical hydrogels / W. Hu Z, Wang, Y. Xiao, S. Zhang, J. Wang // Biomaterials Science. — 2019. — Vol. 7(3). — P. 843-855.

180. Huang R.-L. Exaggerated inflammatory environment decreases BMP-2/ACS-induced ectopic bone mass in a rat model: implications for clinical use of BMP-2 / R.-L. Huang, Y. Yuan, J. Tu, G.-M. Zou, Q. Li // Osteoarthritis and Cartilage. — 2014. — Vol. 22. — Exaggerated inflammatory environment decreases BMP-2/ACS-induced ectopic bone mass in a rat model. — № 8. — P. 1186-1196.

181. Huang S. Polydopamine-Assisted Surface Modification for Bone Biosubstitutes / S. Huang, N. Liang, Y. Hu, X. Zhou, N. Abidi // BioMed Research International. — 2016. — Vol. 2016. — P. 2389895.

182. Huber E. Demineralized Bone Matrix as a Carrier for Bone Morphogenetic Protein-2: Burst Release Combined with Long-Term Binding and Osteoinductive Activity Evaluated In Vitro and In Vivo / E. Huber, A.-M. Pobloth, N. Bormann, N. Kolarczik, K. Schmidt-Bleek, H. Schell, P. Schwabe, et al. // Tissue Engineering Part A. — 2017. — Vol. 23. — P. 1321-1330.

183. Huh J.-B. Effect of rhBMP-2 Immobilized Anorganic Bovine Bone Matrix on Bone Regeneration / J.-B. Huh, J.-J. Yang, K.-H. Choi, J. Bae, J.-Y. Lee, S.-E. Kim, S.-W. Shin // International Journal of Molecular Sciences. — 2015. — Vol. 16(7). — P. 16034-16052.

184. Humberto Valencia C. Hydrolytic degradation and in vivo resorption of poly- L -lactic acid-chitosan biomedical devices in the parietal bones of Wistar rats

/ C. Humberto Valencia // Journal of International Medical Research. — 2019. — Vol. 47(4). — P. 1705-1716.

185. Hutmacher D.W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage / D.W. Hutmacher // Biomaterials. — 2000. — Vol. 21(24). — P. 2529—2543.

186. Hyzy S.L. BMP2 induces osteoblast apoptosis in a maturation state and noggin-dependent manner / S.L. Hyzy, R. Olivares-Navarrete, Z. Schwartz, B.D. Boyan // Journal of Cellular Biochemistry. — 2012. — Vol. 113(10). — P. 32363245.

187. Idrontino G. Intraoral and extraoral autologous bone block graft techniques: A review of the recent literature / G. Idrontino, N.A. Valente. — 2016. — Article ID: 030316.

188. Israel D.I. Expression and characterization of bone morphogenetic protein-2 in Chinese hamster ovary cells / D.I. Israel, J. Nove, K.M. Kerns, I.K. Moutsatsos, R.J. Kaufman // Growth Factors (Chur, Switzerland). — 1992. — Vol. 7(2). — P. 139-150.

189. Iviglia G. Biomaterials, Current Strategies, and Novel Nano-Technological Approaches for Periodontal Regeneration / G. Iviglia, S. Kargozar, F. Baino // Journal of Functional Biomaterials. — 2019. — Vol. 10(3). — [Epub]

190. J. Lee. Comparative study of Chinese hamster ovary cell versus escherichia coli-derived bone morphogenetic protein-2 using the critical-size supraalveolar peri-implant defect model / J. Lee, E.N. Lee, J. Yoon, S.-M. Chung, H. Prasad, C. Susin, U.M.E. Wikesjö // Journal of Periodontology. — 2013. — Vol. 84. — № 3. — P. 415-422.