Разработка нацеленных на рецепторы-лектины систем доставки биологически активных молекул тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Лопухов Антон Владимирович
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 136
Оглавление диссертации кандидат наук Лопухов Антон Владимирович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. МАННОЗНЫЙ РЕЦЕПТОР В НАЦЕЛЕННОЙ ДОСТАВКЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ
1.1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МАННОЗНОМ РЕЦЕПТОРЕ
1.1.2. ФУНКЦИИ МАННОЗНОГО РЕЦЕПТОРА
1.1.3. ЛИГАНДЫ МАННОЗНОГО РЕЦЕПТОРА
1.1.4. НАЦЕЛИВАНИЕ НА МАННОЗНЫЙ РЕЦЕПТОР
1.2. Е-СЕЛЕКТИН В НАЦЕЛЕННОЙ ДОСТАВКЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ
1.2.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О Е-СЕЛЕКТИНЕ
1.2.2. ФУНКЦИЯ Е-СЕЛЕКТИНА
1.2.3. НАЦЕЛИВАНИЕ НА Е-СЕЛЕКТИН
1.3. АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР В АДРЕСНОЙ ДОСТАВКЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ
1.3.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОМ РЕЦЕПТОРЕ
1.3.2. ЛИГАНДЫ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА
1.3.3. РОЛЬ ASGPR В ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ
1.3.4. НАЦЕЛИВАНИЕ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
2.1.2. ПЛАЗМИДЫ
2.1.3. КЛЕТКИ
2.1.4. ЖИВОТНЫЕ
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. СИНТЕЗ КАТИОННОГО БЛОК-СОПОЛИМЕРА СОСТАВА PEG-6-PLL
2.2.2. СИНТЕЗ КАТИОННОГО БЛОК-СОПОЛИМЕРА СОСТАВА PEG-6-PASP(DET)
2.2.3. ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ПОЛИМЕРОВ
2.2.4. ФОРМУЛЯЦИЯ ПОЛИПЛЕКСОВ
2.2.5. КОНКУРЕНТНОЕ ВЫТЕСНЕНИЕ БРОМИДА ЭТИДИЯ (ETBR)
2.2.6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
2.2.7. МЕТОД ДИНАМИЧЕСКОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ
2.2.8. АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
2.2.9. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ СШИТЫХ ПОЛИПЛЕКСОВ СОСТАВА PEG-6-PLL/PDNA
2.2.10. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ КАТИОННЫХ БЛОК-СОПОЛИМЕРОВ СОСТАВА PEG-6-PASP(DET)47
2.2.11. ТРАНСФЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СШИТЫХ ПОЛИПЛЕКСОВ PEG-6 -PLL/PDNA
2.2.12. ТРАНСФЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕСШИТЫХ ПОЛИПЛЕКСОВ PEG-ö-PASP(DET)
2.2.13. ФОРМУЛЯЦИЯ ИНТЕРПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОД И PEG-ö-PASP(DET)
2.2.15. ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ИНТЕРПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОД И PEG-6-PASP(DET)
2.2.14. КОВАЛЕНТНАЯ МОДИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛ ФЕРМЕНТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ГИДРОФОБНЫМИ СТРУКТУРАМИ
2.2.15. КОНЪЮГАЦИЯ СШИТЫХ ИНТЕРПОЛИЭЛЕТКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОПОЛИМЕРА PEG-B-PASP(DET) И ФЕРМЕНТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ С НАЦЕЛИВАЮЩИМ НА Е-СЕЛЕКТИН АНТИТЕЛОМ (АНТИ^62Е)
2.2.16. ДОСТАВКА НАЦЕЛЕННЫХ СШИТЫХ ИНТЕРПОЛИЭЛЕТКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОПОЛИМЕРА PEG-B-PASP(DET) И ФЕРМЕНТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В КЛЕТКИ HUVEC С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛИ СИНТЕТИЧЕСКОЙ МИКРОСОСУДИСТОЙ СЕТИ*
2.2.17. ДОСТАВКА НАЦЕЛЕННЫХ СШИТЫХ ИНТЕРПОЛИЭЛЕТКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОПОЛИМЕРА PEG-B-PASP(DET) И ФЕРМЕНТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В КЛЕТКИ СОСУДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЫШИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ИНТРАВИТАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ*
2.2.18. АНАЛИЗ АФФИННОСТИ К РЕЦЕПТОРУ НАЦЕЛЕНЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА
2.2.19. РАСЧЕТ ЗНАЧЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ (LOGP) И ТОПОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛЯРНОЙ ПЛОЩАДИ ПОВЕРХНОСТИ (TOPOLOGICAL POLAR SURFACE AREA, TPSA) ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ - БЕТУЛИНА И ЕГО КОНЪЮГАТОВ*
2.2.20. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ НАЦЕЛЕННЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА ПО ОТНОШЕНИЮ К РЯДУ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР*
2.2.21. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НАЦЕЛЕННЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ С КЛЕТКАМИ ЛИНИЙ HEPG2 И PC-3*
2.2.22. ДОСТАВКА НАЦЕЛЕННЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА in vivo В КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ МЫШИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ИНТРАВИТАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ*
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. РАЗРАБОТКА ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ НАЦЕЛЕННОЙ НА МАННОЗНЫЙ РЕЦЕПТОР ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КЛЕТКИ МАКРОФАГОВ
3.1.1. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ СШИТЫХ НАЦЕЛЕННЫХ НА MMR ПОЛИПЛЕКСОВ СОСТАВА PEG-ö-PLL/ДНК
3.1.2. ТРАНСФЕКЦИЯ МАКРОФАГОВ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА МЫШИ (ВММФ) СШИТЫМИ НАЦЕЛЕННЫМИ НА MMR ПОЛИПЛЕКСАМИ СОСТАВА PEG-ö-PLL/ДНК
3.1.3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НЕСШИТЫХ НАЦЕЛЕННЫХ НА MMR ПОЛИПЛЕКСОВ СОСТАВА PEG-6-PASP(DET)/ДНК
3.1.4. ТРАНСФЕКЦИЯ МАКРОФАГОВ ЛИНИИ IC-21 НЕСШИТЫМИ НАЦЕЛЕННЫМИ НА MMR ПОЛИПЛЕКСАМИ СОСТАВА PEG-6-PASP(DET)/ДНК
3.2. РАЗРАБОТКА ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ НАЦЕЛЕННОЙ НА Е-СЕЛЕКТИН ДОСТАВКИ БЕЛКА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В КЛЕТКИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ
3.2.1. ГИДРОФОБИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ
3.2.2. ФОРМУЛЯЦИЯ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСОВ ФЕРМЕНТА
СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И БЛОК-СОПОЛИМЕРА PEG-PASP(DET)
3.2.3. ДОСТАВКА НАЦЕЛЕННЫХ СШИТЫХ ИНТЕРПОЛИЭЛЕТКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОПОЛИМЕРА PEG-B-PASP(DET) И ФЕРМЕНТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В КЛЕТКИ HUVEC С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛИ СИНТЕТИЧЕСКОЙ МИКРОСОСУДИСТОЙ СЕТИ
3.2.4. ДОСТАВКА НАЦЕЛЕННЫХ СШИТЫХ ИНТЕРПОЛИЭЛЕТКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СОПОЛИМЕРА PEG-ô-PASP(DET) И ФЕРМЕНТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В КЛЕТКИ СОСУДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЫШИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ИНТРАВИТАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ
3.3. СОЗДАНИЕ ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЕЩЕСТВА В ГЕПАТОЦИТЫ
3.3.1. АНАЛИЗ АФФИННОСТИ К РЕЦЕПТОРУ НАЦЕЛЕНЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ПОВЕРХНОСТНОГО ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА
3.3.2. ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ НАЦЕЛЕННЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА ПО ОТНОШЕНИЮ К РЯДУ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
3.3.3. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НАЦЕЛЕННЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ С КЛЕТКАМИ ЛИНИЙ HEPG2 И PC-3
3.3.4. ДОСТАВКА НАЦЕЛЕННЫХ НА АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР КОНЪЮГАТОВ БЕТУЛИНА in vivo В КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ МЫШИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ИНТРАВИТАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ
3.4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ НАЦЕЛИВАНИЯ
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
PEG - полиэтиленгликоль
mPEG - метоксиполиэтиленгликоль
PEG-&-PLL - полиэтиленгликоль-блок-поли-Е-лизин
PEG-b-pAsp(DET) - полиэтиленгликоль-блок-поли(№[М-(2-аминоэтил)-2-
аминоэтил] аспартамид
PEG-PBLA - полиэтиленгликоль-блок-полибензилоксикарбонил-Ь-аспартат СОД - супероксиддисмутаза
ВММФ - bone marrow macrophages, макрофаги из костного мозга (мыши) ASGPR - асиалогликопротеиновый рецептор MMR - маннозный рецептор
CRD - carbohydrate recognition domain, углевод-распознающий домен
MBP-A - манноз-связывающий лектин типа А
MBP-C - манноз-связывающий лектин типа С
GlcNAc - N-ацетилглюкозамин
GalNAc - N-ацетилгалактозамин
Gal - галактоза
Man - манноза
DOTAP - диолеоилтриметиламмонийпропан, ДОТАП SLEX - Sialyl Lewis X SLEa - Sialyl Lewis A
LUV - крупные однослойные везикулы, large unilammelar vesicles PEG-PLA - полиэтиленгликоль-полимолочная кислота FITC - изотиоцианат флуоресцеина TNF-a - фактор некроза опухоли a
Esbp - Е-селектин-связывающий пептид, E-selectin-binding peptide
HPMA - N-(2-гидроксипропил)метакриламид
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
siRNA - small interfering RNA, малая интерферирующая РНК, миРНК
NHS - N-гидроксисукцинимид
EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид IC50 - концентрация полумаксимального ингибирования Fmoc - 9-флуоренилметилхлороформиатная защитная группа DSP - дитиобис(сукцинимидилпропионат)
Lys(Z) - №б-бензилоксикарбонил-Ь-лизин ДТТ - DL-дитиотреитол
BLA - ß-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновая кислота
ДМФА - N,N-диметилформамид, DMF
ДМСО - диметилсульфоксид, DMSO
ТГФ - тетрагидрофуран, THF
DET - диэтилентриамин, ДЕТ
ДИЭА - N,N'-диизопропилэтиламин, DIEA
PMDETA - пентаметилдиэтилентриамин
HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота BSA - бычий сывороточный альбумин
a-D-Man-TEG-N3 - 1 -О-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)-а-й-маннопиранозид
HBBS - Hanks' Balanced Salt Solution, сбалансированный солевой раствор Хэнка
RPMI - Roswell Park Memorial Institute 1640 medium, среда Мемориального института Розуэлл-
Парка
PBS - фосфатно-солевой буфер
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium, модифицированная Дульбекко среда Игла FBS - эмбриональная телячья сыворотка P/S - пенициллин/стрептомицин
M-CSF - колониестимулирующий фактор макрофагов Luc - люцифераза
GFP - зеленый флуоресцентный белок ТФУ - трифторуксусная кислота
МТТ - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия CCK-S - Cell Counting Kit-B, набор для подсчета клеток-S
N/P соотношение - соотношение числа первичных аминогрупп полимера к числу ортоэфирных групп нуклеиновой кислоты
MWCO - molecular weight cut-off, отсечка молекулярной массы
DTSSP - З,З'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат)
ICP-MS - масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
DTPA - диэтилентриаминпентауксусная кислота
PDMS - полидиметисилоксан
Tris - трис(гидроксиметил)аминометан
TPSA - топологическая полярная площадь поверхности
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
EGM - среда для выращивания эндотелиальных клеток
GPC - gel permeation chromatography, гель-проникающая хроматография, ГПХ, эксклюзионная хроматография
АСМ - атомно-силовая микроскопия
Полиплекс - интерполиэлектролитный комплекс между поликатионом и нуклеиновой кислотой (ДНК, РНК)
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Синтез нейтральных неогликолипидов для создания модульных систем доставки нуклеиновых кислот2013 год, кандидат химических наук Иванова, Екатерина Алексеевна
Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени2013 год, кандидат наук Шмендель, Елена Васильевна
Исследование процессов адресной доставки генетического материала в раковые клетки и в опухоли меланомы2013 год, кандидат наук Дурыманов, Михаил Олегович
Многофункциональные наноконструкции для направленного внутриклеточного транспорта терапевтических средств в раковые клетки2021 год, доктор наук Розенкранц Андрей Александрович
Механизмы взаимодействия с клетками противоопухолевых липосом с липофильными пролекарствами2018 год, кандидат наук Алексеева Анна Сергеевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка нацеленных на рецепторы-лектины систем доставки биологически активных молекул»
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Впервые идею нацеленной доставки биологически активных молекул высказал лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине 1908 года Пауль Эрлих, предложивший термин «волшебная пуля», подразумевая препарат, который избирательно воздействовал бы на опухолевые или микробные клетки, не повреждая при этом здоровые ткани. Несмотря на то, что эта мысль была высказана очень давно, даже на сегодняшний день имеются лишь единицы выведенных на рынок терапевтических препаратов такого способа действия.
Для терапевтического воздействия на конкретные ткани или клетки требуется выбор подходящей мишени. Такой мишенью может быть специфический рецептор, экспрессирующийся в определенных клетках, который может также обеспечивать проникновение в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Другим требованием для отбора рецептора является наличие известных лигандов, способных выступать в роли нацеливающей молекулы. Перспективными мишенями, удовлетворяющими этим требованиям, являются рецепторы семейства лектинов. Для исследования в данной работе был отобран ряд потенциальных мишеней-лектинов: маннозный рецептор (MMR), Е-селектин, асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR).
Маннозный рецептор может являться подходящей мишенью для доставки в макрофаги и дендритные клетки, что может быть использовано для терапии широкого спектра патологических состояний: воспаления, онкологических заболеваний (при участии макрофагов, ассоциированных с опухолью), синдрома приобретенного иммунодефицита, и других.
Е-селектин - рецептор клеточной адгезии, экспрессируемый на эндотелиальных клетках, активированных цитокинами. Кроме зон острого и хронического воспаления, рецептор присутствует в областях злокачественных клеток при первичном раке желудка, колоректальном раке, раках груди и шеи, что связывают с активной экспрессией опухолевыми клетками целого ряда сигнальных факторов, стимулирующих появление рецептора. Установлена роль Е-селектина в метастазировании опухолей: он участвует в адгезии опухолевых клеток посредством того же механизма, который задействован в привлечении к месту воспаления клеток иммунной системы.
ASGPR экспрессируется на поверхности гепатоцитов и участвует в процессе эндоцитоза гликопротеинов. Также был обнаружен на поверхности клеток гепатоцеллюлярной карциномы и клеток метастазов колоректального рака.
Степень разработанности темы исследования. В литературе имеются примеры разработки платформ для доставки биологически активных молекул с нацеливанием на
рецепторы-лектины, при этом многие из них имеют существенные недостатки: высокую токсичность, низкую специфичность. Есть примеры работ по оптимизации параметров разрабатываемых платформ, однако единой методологии оценки эффективности нацеливания предложено не было, что затрудняет сравнение результатов различных экспериментов. Лишь несколько препаратов на базе разрабатываемых платформ для нацеленной на рецепторы-лектины доставки биологически активных молекул смогли пройти все стадии клинических испытаний и выведены на рынок, при этом эти препараты предназначены для лечения весьма ограниченного числа заболеваний.
Цели и задачи работы. Целью данной работы стала разработка и изучение систем нацеленной доставки биологически активных молекул на основе рецепторов-лектинов (маннозного рецептора, Е-селектина, ASGPR) и катионного блок-сополимера. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Синтез и характеризация катионных блок-сополимеров состава PEG-é-PLL и PEG-é-pAsp(DET) методом анионной полимеризации с раскрытием цикла.
2. Формирование сшитых нацеленных на маннозный рецептор и ненацеленных комплексов состава PEG-é-PLL/ДНК (полиплексов). Характеризация полученных полиплексов и изучение результативности трансфекции in vitro.
3. Формирование несшитых нацеленных на маннозный рецептор и ненацеленных полиплексов состава PEG-é-pAsp(DET)/,3HK. Характеризация полученных полиплексов и изучение результативности трансфекции in vitro.
4. Получение нацеленных на Е-селектин и ненацеленных сшитых интерполиэлектролитных комплексов состава PEG-é-pAsp(DET)/супероксиддисмутаза(СОД). Характеризация полученных комплексов, изучение эффективности нацеливания комплексов состава PEG-é-pAsp(DET)/СОД in vitro и in vivo.
5. Отбор нацеленных на ASGPR конъюгатов лекарственной молекулы (бетулина) по степени связывания с рецептором. Характеризация отобранных конъюгатов, изучение интернализации и эффективности нацеливания конъюгатов in vitro и in vivo.
6. Сравнительный анализ используемых методов оценки эффективности нацеливания на рецепторы-лектины (маннозный рецептор, Е-селектин, ASGPR).
Научная новизна. Впервые получены и охарактеризованы катионные сополимеры состава пропаргил-PEG-é-PLL и алкин-PEG-é-pAsp(DET), которые могут быть основой ряда платформ для нацеленной доставки биологически активных молекул благодаря возможности лёгкой модификации необходимым нацеливающим фрагментом с помощью реакции азид-алкильного циклоприсоединения, катализируемого Cu(I). Впервые исследована цитотоксичность
сополимеров PEG-é-pAsp(DET) относительно клеточной линии иммортализованных макрофагов IC-21, и показано, что они нетоксичны.
Впервые были получены и охарактеризованы ненацеленные и нацеленные на маннозный рецептор полиплексы состава PEG-é-PLL/ДНК и PEG-é-pAsp(DET)/,nHK, использованные далее для успешной трансфекции макрофагов из костного мозга мыши (ВММФ) и клеточной линии иммортализованных макрофагов IC-21. Впервые была продемонстрирована высокая (более чем в 500 раз) результативность нацеливания на маннозный рецептор при доставке гена в клетки макрофагов IC-21 с помощью полиплексов состава PEG-é-pAsp(DET)/,nHK. Впервые продемонстрирована зависимость эффективности нацеливания от времени инкубирования частиц с клетками.
В работе были получены и охарактеризованы ранее не описанные в литературе комплексы гидрофобизованного фермента супероксиддисмутазы (СОД) и сополимера PEG-é-pAsp(DET), нацеленные на Е-селектин. Впервые продемонстрировано, что эффективность нацеленной доставки возрастает после облучения рентгеновским излучением как in vitro в клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) с использованием модели синтетической микрососудистой сети (в 3 раза по сравнению с доставкой ненацеленных комплексов), так и in vivo в эндотелиальные клетки сосудов головного мозга мыши с использованием метода интравитальной микроскопии.
Определены равновесные константы диссоциации комплексов ASGPR и новых синтетических лигандов - конъюгатов нацеливающего фрагмента N-ацетигалактозамина и бетулина, наилучшее связывание с рецептором продемонстрировали соединения I (Kd = 1.2 ± 0.3 нМ), V (Kd = 0.4 ± 0.1 нМ), VI (Kd = 1.0 ± 0.3 нМ), VIII (Kd = 0.8 ± 0.6 нМ). Впервые исследована интернализация нацеленных конъюгатов бетулина in vitro в клеточных культурах гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, которая в 1.7 раз превосходила таковую в клетках аденокарциномы простаты PC-3. Впервые продемонстрировано в печени мыши in vivo накопление нацеленного конъюгата в цитоплазматических везикулах гепатоцитов, а ненацеленного - на стенках сосудов и внешних сторонах мембраны гепатоцитов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Синтезированные в данной работе катионные блок-сополимеры, способные вступать в реакции азид-алкильного циклоприсоединения, катализируемого Cu(I), являются перспективными материалами для использования в дизайне платформ нацеленной доставки биологически активных молекул, по причине их биосовместимости и низкой токсичности и возможности быть функционализированными нацеливающим фрагментом с помощью биоортогональной «клик»-реакции.
Результаты экспериментов по низкотоксичной направленной на маннозный рецептор трансфекции макрофагов демонстрируют, что нацеленные полиплексы состава являются перспективным инструментом для генотерапии макрофагов и иных моноцитарных клеток. При этом применение катионного блок-сополимера PEG-&-PLL сопровождается процессом сшивки полиплексов с применением сшивающего агента, а применение PEG-^-pAsp(DET) позволяет использовать несшитые полиплексы, что более удобно с практической точки зрения.
Полученные в работе нацеленные на Е-селектин комплексы гидрофобизованного фермента супероксиддисмутазы и сополимера PEG-^-pAsp(DET) показали высокую эффективность и имеют практическую значимость как основа для создания системы доставки.
Отобраны и изучены перспективные терапевтические агенты - нацеленные на ASGPR конъюгаты бетулина. Показано, что нацеленные на ASGPR конъюгаты существенно превосходят по аффинности природные лиганды рецептора, демонстрируя на шесть порядков меньшую равновесную константу диссоциации лиганд-рецепторного комплекса. Экспериментально доказана эффективная интернализация нацеленных конъюгатов бетулина. Полученная платформа может быть использована для создания препаратов для терапии гепатоцеллюлярной карциномы. Разработанный подход может быть использован для создания нацеленных конъюгатов низкомолекулярных соединений для терапии различных видов заболеваний.
Сделанные выводы могут представлять собой теоретические рекомендации к использованию разработанных подходов в решении конкретной задачи создания и характеризации платформ для нацеленной доставки биологически активных молекул.
Положения, выносимые на защиту.
1. Метод синтеза нацеленных катионных блок-сополимеров состава PEG-&-PLL и PEG-&-pAsp(DET) посредством ковалентной конъюгации с алкильной группой полимера с азид-модифицированным нацеливающим фрагментом позволяет получать продукты с высоким выходом.
2. Сшитые полиплексы состава PEG-^-PLL/ДНК имеют близкий к нейтральному заряд поверхности, низкую токсичность по отношению к макрофагам из костного мозга мыши (ВММФ), и эффективность трансфекции культуры ВММФ нацеленными на маннозный рецептор полиплексами превосходит таковую для ненацеленных в 8.2 раза.
3. Эффективность нацеленной на маннозный рецептор трансфекции клеток IC-21 зависит как от времени инкубации, так и от соотношения числа первичных аминогрупп полимера к числу ортоэфирных групп нуклеиновой кислоты (соотношения N/P).
4. Нацеленные на Е-селектин сшитые блок-иономерные комплексы гидрофобизованного фермента супероксиддисмутазы и PEG-^-pAsp(DET) связываются эффективнее после облучения
рентгеновским излучением как при доставке in vitro в клетки культуры HUVEC, так и при доставке in vivo в эндотелий сосудов головного мозга.
5. Нацеленный на ASGPR конъюгат бетулина in vivo в печени мыши накапливается в цитоплазматических везикулах гепатоцитов, а ненацеленный - на стенках сосудов и внешних сторонах мембраны гепатоцитов.
6. Параметр эффективности нацеливания может быть использован для оптимизации платформы нацеленной доставки биологически активных макромолекул в рамках одной серии экспериментов.
Методология исследования и методы исследования. В рамках данной работы были использованы следующие методы и подходы: современные методы синтетической полимерной химии (анионная полимеризация с раскрытием цикла), методы характеризации материалов (спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса, спектрофотометрия, спектроскопия 1H-ЯМР, эксклюзионная хроматография, динамическое светорассеяние), химический дизайн бионаноматериалов (образование блок-иономерных комплексов, использование сшивающих агентов), методы генной инженерии (трансфекция клеток), методы клеточной биологии (культивирование клеток, исследование цитотоксичности), методы визуализации (интравитальная микроскопия, проточная цитометрия, люминометрия, флуоресцентная микроскопия).
Личный вклад автора. Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены лично автором, либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований под руководством д.х.н., профессора Клячко Н.Л. и д.х.н., член-корр. РАН, профессора Кабанова А.В. Автор самостоятельно изучил современные литературные данные по теме исследования и на основании изученных работ составил литературный" обзор. Автор самостоятельно или при непосредственном участии выполнил все эксперименты, собрал, обработал и проанализировал полученные результаты, принимал участие в написании всех статей. В работах, опубликованных в соавторстве, основополагающий вклад принадлежит автору. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность представленных в диссертации данных и сделанных выводов определяется использованием большого количества современных методов исследования и выполнением экспериментов на высокоточном оборудовании с обработкой результатов статистическими методами. Результаты исследования обсуждались на семинарах лаборатории, публиковались в рецензируемых зарубежных и отечественных изданиях и докладывались на российских и международных конференциях, в том числе:
• The 3d International hybrid school-conference "SCANNING PROBE MICROSCOPY FOR BIOLOGICAL SYSTEMS - 2021", Москва, Россия, 2021 (устный доклад)
• 12th International Conference "Biomaterials and Nanobiomaterials: Recent Advances of Toxicology and Ecology Issues", Ираклион, Греция, 2021 (устный доклад)
• Международный форум «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, 2020 (тезисы)
• 11th International Conference "Biomaterials and Nanobiomaterials: Recent Advances of Toxicology and Ecology Issues", Ираклион, Греция, 2020 (стендовый доклад)
• ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «МАРКОВНИКОВСКИЕ ЧТЕНИЯ» (WSOC-2020), пансионат МГУ «Красновидово», Россия, 2020 (стендовый доклад)
• V Всероссийская конференция с международным участием по органической химии, Владикавказ, Россия, 2019 (стендовый доклад)
• The Fifth International Scientific Conference "Advances in Synthesis and Complexing, Москва, Россия, 2019 (стендовый доклад)
• Markovnikov Congress on Organic Chemistry, Москва, Казань, Россия, 2019 (устный доклад)
• XVIII International Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry "BIOHETEROCYCLES 2019", Гент, Бельгия, 2019 (тезисы)
• 9th International Conference "Biomaterials and Nanobiomaterials: Recent Advances of Toxicology and Ecology Issues", Ираклион, Греция, 2018 (устный доклад)
• 3 th International Conference "Nano 2015", Москва, Россия, 2015 (стендовый доклад) Доклады автора на Российско-Греческом симпозиуме с международным участием
«Biomaterials and Nanobiomaterials: Recent Advances of Toxicology and Ecology Issues» (2018, 2021) были признаны лучшими среди докладов молодых ученых.
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 8 статей в рецензируемых научных журналах, индексируемых базами Web of Science и Scopus, и 6 тезисов докладов всероссийских и международных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (207 ссылок) и Приложения. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 56 рисунков, 2 схемы и 15 таблиц.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. МАННОЗНЫЙ РЕЦЕПТОР В НАЦЕЛЕННОЙ ДОСТАВКЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ
1.1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МАННОЗНОМ РЕЦЕПТОРЕ
Маннозный рецептор (macrophage mannose receptor, MMR, CD206) является членом суперсемьи Са2+-зависимых лектинов (лектинов С-типа) и относится к семейству маннозных рецепторов, включающего также рецептор коллагена Endo180 (CD280, uPARAP), фосфолипазу А2 (PLA2R M-типа) и лимфоцитарный антиген DEC-205 (CD205, gp200-MR6) [1]. Характерной особенностью рецепторов, входящих в это семейство, является множество лектиновых доменов С-типа (CRD), расположенных в единой полипептидной цепочке, а также наличие цистеин-обогащенный домена (cysteine-rich domain) и домена типа фибронектин II (fibronectin type II domain).
Маннозный рецептор впервые был выделен в конце 1970-ых из альвеолярных макрофагов и макрофагов печени [2]. Рецептор преимущественно обнаруживается на поверхности макрофагов соединительной ткани и дендритных клетках, и, в меньших количествах - на эндотелиальных клетках печени и селезенки [3], фибробластах кожи и кератиноцитах [4, 5]. Воздействие сигнальных медиаторов воспаления, таких, как кортикостероиды, витамин Д3, простагландин Е, интерлейкины IL-4, IL-10, IL-13, увеличивает экспрессию рецептора, в то время, как интерферон у (INF у), липополисахарид (LPS) и некоторые иммунные комплексы вызывают уменьшение экспрессии рецептора [6, 7, 8, 9, 10, 11].
Схема строения рецептора представлена на рисунке 1. MMR является трансмембранным белком типа I (с COOH-концом внутри клетки) с цитоплазматическим хвостом из 45 аминокислот.
Углевод-распознающие домены
(CRD)
Вовлечены в слабое связывание углеводов; показывают большую аффинность к поликоординированным лигандам и олигосахаридам
CRD 5-8
CRD 1-3
Домен типа фиброне
Rfil. м............
ШШЦЩЩ CRD 4; PDB 1 EGG
Цистеин-обогащенный домен; PDB1DQG
Способен связывать сульфатированные углеводы
Имеет высокую аффинность к маннозе, фукозе, N-ацетилглюкозамину
Рисунок 1. Схема организации доменов маннозного рецептора.
Отдельно выделенный CRD-4 связывает маннозу, GlcNAc, фукозу и глюкозу с константами диссоциации порядка мМ (миллимоль/литр) [12]. Интактный рецептор также обладает специфичностью для этих моносахаридов с константами диссоциации в диапазоне мМ. Таким образом, один CRD 4 может имитировать моносахарид-связывающие свойства всего рецептора. Однако CRD 4 слабо связывается с полисахаридами, такими, как маннан дрожжей, и гликопротеинами, такими как инвертаза, и, таким образом, не может объяснить связывание рецептора с природными лигандами. Предполагается, что CRD 5-8 необходимы для связывания с олигосахаридами. Комбинация CRD 4 и 5 демонстрируют намного более высокое сродство к лигандам, таким как дрожжевой маннан и инвертаза, чем один CRD-4. Эти два домена образуют протеазо-устойчивое лиганд-связывающее ядро, необходимое для связывания с высокой аффинностью мультивалентных лигандов [13]. Однако сродство к маннану возрастает по мере того, как добавляется больше CRD, причем полное сродство рецептора к этому лиганду достигается только при наличии CRD 4-8. Таким образом, как и CRD 4 и 5, дополнительные домены 6, 7 и 8 необходимы для связывания с некоторыми лигандами. Высокая аффинность связывания с природными лигандами достигается благодаря множеству слабых взаимодействий с несколькими CRD в структуре рецептора.
Необычен тот факт, что домены, которые наиболее существенны для связывания лигандов (CRD 4 и 5) расположены в середине полипептидной цепи, а не в конце. Одним из объяснений
этого феномена может быть то, что внеклеточная область рецептора изгибается, чтобы принять и-образную конформацию (рисунок 2, справа).
Рисунок 2. Три возможные конформации маннозного рецептора: компактная модель, предполагающая множественное контактное взаимодействие между CRD доменами (слева), вытянутая модель (в центре), модель U-формы (справа) [14].
Такая конформация позволяет расположить CRD 4 и 5 дальше всего от мембраны и ближе всего к потенциальным лигандам во внеклеточной среде. Однако, могут реализовываться и другие конформации, так как неизвестно, в какой степени домены рецептора взаимодействуют друг с другом. Отдельные CRD разделены связывающими участками, состоящими из 10-20 аминокислотных остатков (в том числе нескольких остатков пролина) [14], благодаря чему может реализовываться вытянутая в пространстве конформация «бусин на верёвке» (рисунок 2, в центре). Другой альтернативной конформацией может быть расположение рецептора с множественными контактами между отдельными доменами (рисунок 2, слева).
Известно, что протеолиз фрагмента рецептора, состоящего из CRD 4-5, не приводит к высвобождению отдельных CRD. Предполагается, что эти два CRD не просто являются частью единой аминокислотной последовательности, но имеют множество междоменных контактов [13]. Это обеспечивает фиксирование взаимной относительной конфигурации сайтов связывания CRD 4 и 5.
Связывание СКО-4 с моносахаридами подробно изучено с применением методов сайт-направленного мутагенеза и ЯМР-спектроскопии [15, 16, 17]. СКО-4 обладает специфичностью к маннозе, GlcNAc и фукозе. Сравнение СКО-4 с углевод-связывающими доменами манноз-связвающего лектина (МВР-А и МВР-С) обнаруживает схожие аспекты как в субстратной специфичности, так и в механизме связывания иона Са2+ и моносахарида (рисунок 3) [18, 19].
Рисунок 3. Сравнение лиганд-связывающего сайта CRD-4 маннозного рецептора (показан серым цветом) и MBP-A (показан коричневым цветом). Ион Ca2+ показан зеленым цветом, атомы кислорода красным, атомы азота синим. В скобках подписаны соответствующие остатки в структуре MBP-A [19].
Показано, в структуре CRD-4 имеется два сайта связывания иона Ca2+, однако углевод-связывающей способностью обладает только один из сайтов. Необходимый для связывания Ca2+ находится в октаэдрическом окружении, связываясь с семью атомами пяти окружающих аминокислот (Glu725, Asn188, Asn727, Asn728, Glu733). Восьмую позицию в координационной сфере занимает молекула воды. Стабильность связывания Ca2+ зависит от pH, и конформационное изменение CRD-4 из-за потери иона Ca2+ при низком pH, вероятно, способствует высвобождению гликоконъюгатов рецептором маннозы в эндосомах.
1.1.2. ФУНКЦИИ МАННОЗНОГО РЕЦЕПТОРА
Маннозный рецептор играет роль в процессе фаго- и эндоцитоза маннозилированных структур, в частности, структур, представленных на поверхности микробных клеток [20, 21, 22]. Проникающие таким образом в клетку патогены утилизируются и не вызывают иммунного ответа. Другие функции рецептора включают поддержание гомеостаза за счет удаления из циркуляции подлежащих переработке маннозилированных гликопротеинов и некоторых гормонов гипофиза, таких, как лютеинизирующий и тиреотропный. Маннозный рецептор постоянно рециркулирует между плазматической мембраной и эндосомами с участием клатрин-зависимого механизма эндоцитоза [23].
Маннозный рецептор играет роль в патогенезе онкологических заболеваний. В опухоли обнаруживаются макрофаги, экспрессирующие маннозный рецептор, со связанным лигандом -муцином (MUC1), в избытке экспрессируемом опухолевыми клетками [24]. MUC1 связывается с дендритными клетками и опухоль-ассоциированными макрофагами (tumor-associated macrophages, TAM), и ингибирует возможный иммунный ответ организма по отношению к злокачественному образованию.
1.1.3. ЛИГАНДЫ МАННОЗНОГО РЕЦЕПТОРА
Домены рецептора способны связываться с различными лигандами. Цистеин-обогащенный домен образует комплексы с лютеинизирующим и тиреотропным гормонами гипофиза [25], хондроитинсульфатами [26], и сульфатированными производными углеводов [1, 27]. Домен типа фибронектин II способен связыватся со структурами коллагенов I, II, III и IV [28]. Лектиновые домены С-типа связываются с фукозой, маннозой, N-ацетилглюкозамином [1].
Патогены Mycobacterium tuberculosis [29], Leishmania donovani [30], Trypanosoma cruzi [31], Trichinella spiralis [32], Streptococcus pneumoniae [33], ВИЧ [34], вирус гриппа [35], способны проникать в клетки благодаря углеводным лигандам на своей поверхности. Так, M. tuberculosis проникает внутрь благодаря представленному на мембране липоарабиноманнану (LAM), и далее способен жить и развиваться внутри макрофага [36].
1.1.4. НАЦЕЛИВАНИЕ НА МАННОЗНЫЙ РЕЦЕПТОР
Нацеливание на маннозный рецептор находит своё основное применение при доставке нуклеиновых кислот в макрофаги. Так, доставка плазмиды, кодирующей интерлейкин 12 (IL-12),
индуцирует смену фенотипа макрофага с «анти-воспалительного» М2 в «про-воспалительный» M1 тип. Макрофаги типа М1 способны распознавать клетки опухоли и уничтожать их [37]. Другим практическим примером применения нацеленной доставки гена в макрофаги для борьбы с онкологическим заболеванием является введение терапевтического гена цитохрома P4502B6 (CYP2B6). Трансфецированные макрофаги способны накапливаться в опухоли, и вызывать апоптоз клеток путём индукции сигнальных каскадов [38]. Доставка гена в макрофаги может быть применена не только для терапии онкологических заболеваний. Так, описан эксперимент по трансфекции макрофагов терапевтическим геном, кодирующим антиоксидантный фермент каталазу. Системное введение трансфекцированных таким образом макрофагов в организм мыши привело к снижению уровня воспаления в мозговых тканях в три раза и высокому уровню нейропротекции (на животной модели болезни Паркинсона) [39]. Доставка в макрофаги миРНК для остановки экспрессии Ca2+/кальмодулин-зависимой киназы у и последующее введение клеток в организм мыши привели к улучшению стабильности атеросклеротических бляшек и снижению риска тромбоза и инфаркта [40]. Наилучшим подходом для конструирования платформы для нацеленной доставки гена является использование гена репортерного белка. Репортерный белок, например, зеленый флуоресцирующий белок или люцифераза, позволяет значительно быстрее оценивать результативность трансфекции, чем отслеживание размеров опухоли у опытных животных, что может быть важно при проведении большого количества экспериментов при оптимизации платформы для нацеленной доставки.
Маннозилирование применялось для доставки комплекса полиаспартамида и плазмиды, кодирующей усиленный зеленый флуоресцирующий белок (enhanced green fluorescent protein plasmid, pEGFP) в культуру иммортализованых макрофагов Raw 264.7. Полиплексы были приготовлены при соотношении N/P = 5. Эффективность трансфекции нацеленными полиплексами, оцененная с помощью метода проточной цитометрии, была в 2.5 раза выше по сравнению с таковой для ненацеленных полиплексов [41]. Эффективность доставки в клетки Raw 264.7 комплексов pEGFP и маннозилированного полимера состава хитозан-графт-полиэтиленимин (N/P =14) была в 9.4 раза выше, по сравнению с доставкой ненацеленных полиплексов [42].
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Лиганды асиалогликопротеинового рецептора и конъюгаты на их основе с терапевтическими и диагностическими агентами2018 год, кандидат наук Маклакова, Светлана Юрьевна
Влияние лизосомотропных соединений на функциональную активность лизосомного аппарата клетки2003 год, кандидат биологических наук Леонтьева, Екатерина Андреевна
Исследование взаимодействий агентов на основе наночастиц с эукариотическими клетками с целью создания эффективных систем контролируемой доставки лекарственных средств2022 год, кандидат наук Мочалова Елизавета Никитична
Адресная коррекция опухолевых процессов многофункциональными молекулярными конструкциями с распознающими элементами – ДНК-аптамерами2023 год, доктор наук Коловская Ольга Сергеевна
Аутоантитела и молекулы клеточной адгезии при беременности, осложненной преэклампсией2016 год, кандидат наук Зиганшина Марина Михайловна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лопухов Антон Владимирович, 2022 год
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. East L., Isacke C. M. The mannose receptor family //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 2002. - Т. 1572. - №. 2-3. - С. 364-386.
2. Wileman T. E., Lennartz M. R., Stahl P. D. Identification of the macrophage mannose receptor as a 175-kDa membrane protein //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1986. - Т. 83. - №. 8. - С. 2501-2505.
3. Linehan S. A. et al. Enhanced expression of the mannose receptor by endothelial cells of the liver and spleen microvascular beds in the macrophage-deficient PU. 1 null mouse //Histochemistry and cell biology. - 2005. - Т. 123. - №. 4. - С. 365-376.
4. Szolnoky G. et al. A mannose-binding receptor is expressed on human keratinocytes and mediates killing of Candida albicans //Journal of investigative dermatology. - 2001. - Т. 117. - №. 2. - С. 205213.
5. Sheikh H. et al. Endo180, an endocytic recycling glycoprotein related to the macrophage mannose receptor is expressed on fibroblasts, endothelial cells and macrophages and functions as a lectin receptor //Journal of cell science. - 2000. - Т. 113. - №. 6. - С. 1021-1032.
6. Mokoena T. et al. Human macrophage activation. Modulation of mannosyl, fucosyl receptor activity in vitro by lymphokines, gamma and alpha interferons, and dexamethasone //The Journal of clinical investigation. - 1985. - Т. 75. - №. 2. - С. 624-631.
7. Shepherd V. L., Konish M. G., Stahl P. Dexamethasone increases expression of mannose receptors and decreases extracellular lysosomal enzyme accumulation in macrophages //Journal of Biological Chemistry. - 1985. - Т. 260. - №. 1. - С. 160-164.
8. Clohisy D. R. et al. 1, 25-Dihydroxyvitamin D3 modulates bone marrow macrophage precursor proliferation and differentiation. Up-regulation of the mannose receptor //Journal of Biological Chemistry. - 1987. - Т. 262. - №. 33. - С. 15922-15929.
9. Schreiber S. et al. Prostaglandin E specifically upregulates the expression of the mannose-receptor on mouse bone marrow-derived macrophages //Cell regulation. - 1990. - Т. 1. - №. 5. - С. 403-413.
10. Shepherd V. L. et al. Down-regulation of mannose receptor activity in macrophages after treatment with lipopolysaccharide and phorbol esters //The Journal of Immunology. - 1990. - Т. 145. - №. 5. - С. 1530-1536.
11. Schreiber S. et al. Aggregated bovine IgG inhibits mannose receptor expression of murine bone marrow-derived macrophages via activation //The Journal of Immunology. - 1991. - T. 147. - №. 4. -C. 1377-1382.
12. Taylor M. E., Bezouska K., Drickamer K. Contribution to ligand binding by multiple carbohydrate-recognition domains in the macrophage mannose receptor //Journal of Biological Chemistry. - 1992. -T. 267. - №. 3. - C. 1719-1726.
13. Taylor M. E., Drickamer K. Structural requirements for high affinity binding of complex ligands by the macrophage mannose receptor //Journal of Biological Chemistry. - 1993. - T. 268. - №. 1. - C. 399404.
14. Taylor M. E. et al. Primary structure of the mannose receptor contains multiple motifs resembling carbohydrate-recognition domains //Journal of Biological Chemistry. - 1990. - T. 265. - №. 21. - C. 12156-12162.
15. Mullin N. P., Hall K. T., Taylor M. E. Characterization of ligand binding to a carbohydrate-recognition domain of the macrophage mannose receptor //Journal of Biological Chemistry. - 1994. -T. 269. - №. 45. - C. 28405-28413.
16. Mullin N. P., Hitchen P. G., Taylor M. E. Mechanism of Ca2-and Monosaccharide Binding to a C-type Carbohydrate-recognition Domain of the Macrophage Mannose Receptor //Journal of Biological Chemistry. - 1997. - T. 272. - №. 9. - C. 5668-5681.
17. Hitchen P. G., Mullin N. P., Taylor M. E. Orientation of sugars bound to the principal C-type carbohydrate-recognition domain of the macrophage mannose receptor //Biochemical Journal. - 1998. - T. 333. - №. 3. - C. 601-608.
18. Weis W. I., Drickamer K. Structural basis of lectin-carbohydrate recognition //Annual review of biochemistry. - 1996. - T. 65. - №. 1. - C. 441-473.
19. Feinberg H. et al. Structure of a C-type carbohydrate recognition domain from the macrophage mannose receptor //Journal of Biological Chemistry. - 2000. - T. 275. - №. 28. - C. 21539-21548.
20. Astarie-Dequeker C. et al. The mannose receptor mediates uptake of pathogenic and nonpathogenic mycobacteria and bypasses bactericidal responses in human macrophages //Infection and immunity. -1999. - T. 67. - №. 2. - C. 469-477.
21. Stahl P. D., Ezekowitz R. A. B. The mannose receptor is a pattern recognition receptor involved in host defense //Current opinion in immunology. - 1998. - T. 10. - №. 1. - C. 50-55.
22. Allavena P. et al. From pattern recognition receptor to regulator of homeostasis: the double-faced macrophage mannose receptor //Critical Reviews™ in Immunology. - 2004. - T. 24. - №. 3.
23. Gazi U., Martinez-Pomares L. Influence of the mannose receptor in host immune responses //Immunobiology. - 2009. - T. 214. - №. 7. - C. 554-561.
24. Lau S. K., Weiss L. M., Chu P. G. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study //American journal of clinical pathology. -2004. - T. 122. - №. 1. - C. 61-69.
25. Roseman D. S., Baenziger J. U. Molecular basis of lutropin recognition by the mannose/GalNAc-4-SO4 receptor //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000. - T. 97. - №. 18. - C. 99499954.
26. Leteux C. et al. The cysteine-rich domain of the macrophage mannose receptor is a multispecific lectin that recognizes chondroitin sulfates A and B and sulfated oligosaccharides of blood group Lewisa and Lewisx types in addition to the sulfated N-glycans of lutropin //The Journal of experimental medicine. - 2000. - T. 191. - №. 7. - C. 1117-1126.
27. Fiete D. J., Beranek M. C., Baenziger J. U. A cysteine-rich domain of the "mannose" receptor mediates GalNAc-4-SO4 binding //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1998. - T. 95. - №. 5. - C. 2089-2093.
28. Napper C. E., Drickamer K., Taylor M. E. Collagen binding by the mannose receptor mediated through the fibronectin type II domain //Biochemical Journal. - 2006. - T. 395. - №. 3. - C. 579-586.
29. Schlesinger L. S., Hull S. R., Kaufman T. M. Binding of the terminal mannosyl units of lipoarabinomannan from a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis to human macrophages //The Journal of immunology. - 1994. - T. 152. - №. 8. - C. 4070-4079.
30. Wilson M. E., Pearson R. D. Evidence that Leishmania donovani utilizes a mannose receptor on human mononuclear phagocytes to establish intracellular parasitism //The Journal of Immunology. -1986. - T. 136. - №. 12. - C. 4681-4688.
31. Kahn S. et al. Trypanosoma cruzi amastigote adhesion to macrophages is facilitated by the mannose receptor //The Journal of experimental medicine. - 1995. - T. 182. - №. 5. - C. 1243-1258.
32. Gruden-Movsesijan A., Milosavljevic L. S. The involvement of the macrophage mannose receptor in the innate immune response to infection with parasite Trichinella spiralis //Veterinary Immunology and Immunopathology. - 2006. - T. 109. - №. 1-2. - C. 57-67.
33. Macedo-Ramos H. et al. Olfactory ensheathing cells as putative host cells for Streptococcus pneumoniae: evidence of bacterial invasion via mannose receptor-mediated endocytosis //Neuroscience research. - 2011. - T. 69. - №. 4. - C. 308-313.
34. Nguyen D. G., Hildreth J. E. K. Involvement of macrophage mannose receptor in the binding and transmission of HIV by macrophages //European journal of immunology. - 2003. - T. 33. - №. 2. - C. 483-493.
35. Reading P. C., Miller J. L., Anders E. M. Involvement of the mannose receptor in infection of macrophages by influenza virus //Journal of virology. - 2000. - T. 74. - №. 11. - C. 5190-5197.
36. Johnson B. K. et al. Macrophage Infection Models for Mycobacterium tuberculosis //Mycobacteria Protocols. - Humana, New York, NY, 2021. - C. 167-182.
37. He X. Y. et al. A multi-functional macrophage and tumor targeting gene delivery system for the regulation of macrophage polarity and reversal of cancer immunoresistance //Nanoscale. - 2018. - T. 10. - №. 33. - C. 15578-15587.
38. Griffiths L. et al. The macrophage-a novel system to deliver gene therapy to pathological hypoxia //Gene therapy. - 2000. - T. 7. - №. 3. - C. 255-262.
39. Haney M. J. et al. Specific transfection of inflamed brain by macrophages: a new therapeutic strategy for neurodegenerative diseases //PloS one. - 2013. - T. 8. - №. 4. - C. e61852.
40. Liu Y., Chen X. Macrophage-Targeted Gene Therapy to Improve the Atherosclerotic Plaque Stability //Matter. - 2020. - T. 3. - №. 3. - C. 621-622.
41. Zhang Y. et al. Targeted gene delivery to macrophages by biodegradable star-shaped polymers //ACS applied materials & interfaces. - 2016. - T. 8. - №. 6. - C. 3719-3724.
42. Jiang H. L. et al. Mannosylated chitosan-graft-polyethylenimine as a gene carrier for Raw 264.7 cell targeting //International journal of pharmaceutics. - 2009. - T. 375. - №. 1-2. - C. 133-139.
43. Yu S. S. et al. Macrophage-specific RNA interference targeting via "click", mannosylated polymeric micelles //Molecular pharmaceutics. - 2013. - T. 10. - №. 3. - C. 975-987.
44. Sato A. et al. Enhanced gene transfection in macrophages using mannosylated cationic liposome-polyethylenimine-plasmid DNA complexes //Journal of drug targeting. - 2001. - T. 9. - №. 3. - C. 201207.
45. Fukuda I., Mochizuki S., Sakurai K. Macrophage-targeting gene delivery using a micelle composed of mannose-modified lipid with triazole ring and dioleoyl trimethylammonium propane //BioMed research international. - 2015. - T. 2015.
46. Ruan G. X. et al. Macrophage mannose receptor-specific gene delivery vehicle for macrophage engineering //Acta Biomaterialia. - 2014. - T. 10. - №. 5. - C. 1847-1855.
47. De Vlaeminck Y. et al. Single-domain antibody fusion proteins can target and shuttle functional proteins into macrophage mannose receptor expressing macrophages //Journal of Controlled Release. -2019. - T. 299. - C. 107-120.
48. Gao X. et al. Specific Targeting, Imaging, and Ablation of Tumor-Associated Macrophages by Theranostic Mannose-AIEgen Conjugates //Analytical Chemistry. - 2019. - T. 91. - №. 10. - C. 68366843.
49. Yin L. et al. Biodegradable micelles capable of mannose-mediated targeted drug delivery to cancer cells //Macromolecular rapid communications. - 2015. - T. 36. - №. 5. - C. 483-489.
50. Su F. Y. et al. Macrophage-targeted drugamers with enzyme-cleavable linkers deliver high intracellular drug dosing and sustained drug pharmacokinetics against alveolar pulmonary infections //Journal of Controlled Release. - 2018. - T. 287. - C. 1-11.
51. Filatova L. Y., Klyachko N. L., Kudryashova E. V. Targeted delivery of anti-tuberculosis drugs to macrophages: targeting mannose receptors //Russian Chemical Reviews. - 2018. - T. 87. - №. 4. - C. 374.
52. Francis A. P., Jayakrishnan A. Conjugating doxorubicin to polymannose: a new strategy for target specific delivery to lung cancer cells //Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. - 2019. - T. 30. - №. 16. - C. 1471-1488.
53. Lowsberg D., Smith J. Effect of mannose modified chitosan on uptake of nanoparticles by macrophages //bioRxiv. - 2019. - C. 620906.
54. Glass E. B. et al. Optimizing mannose "click" conjugation to polymeric nanoparticles for targeted siRNA delivery to human and murine macrophages //ACS omega. - 2019. - T. 4. - №. 16. - C. 1675616767.
55. He H. et al. Development of mannose functionalized dendrimeric nanoparticles for targeted delivery to macrophages: use of this platform to modulate atherosclerosis //Translational Research. - 2018. - T. 193. - C. 13-30.
56. Gan J. et al. Producing anti-inflammatory macrophages by nanoparticle-triggered clustering of mannose receptors //Biomaterials. - 2018. - Т. 178. - С. 95-108.
57. Costa A., Sarmento B., Seabra V. Mannose-functionalized solid lipid nanoparticles are effective in targeting alveolar macrophages //European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2018. - Т. 114. - С. 103-113.
58. Shibaguchi K. et al. Mannosylated polyrotaxanes for increasing cellular uptake efficiency in macrophages through receptor-mediated endocytosis //Molecules. - 2019. - Т. 24. - №. 3. - С. 439.
59. Ostroff G. R. Drug delivery product and methods : пат. 7740861 США. - 2010.
60. Schlesinger L., Bachelder E., Cope F. O. Compositions for targeting macrophages and other CD206 high expressing cells and methods of treating and diagnosis : пат. 10806803 США. - 2020.
61. Pahlsson P. et al. Role of N-linked glycosylation in expression of E-selectin on human endothelial cells //European journal of immunology. - 1995. - Т. 25. - №. 9. - С. 2452-2459.
62. Bevilacqua M. P. Endothelial-leukocyte adhesion molecules //Annual review of immunology. -1993. - Т. 11. - №. 1. - С. 767-804.
63. Graves B. J. et al. Insight into E-selectin/ligand interaction from the crystal structure and mutagenesis of the lec/EGF domains //Nature. - 1994. - Т. 367. - №. 6463. - С. 532-538.
64. Bevilacqua M. P. et al. Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1987. - Т. 84. - №. 24. - С. 9238-9242.
65. Bevilacqua M. P. et al. Endothelial leukocyte adhesion molecule 1: an inducible receptor for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectins //Science. - 1989. - Т. 243. - №. 4895. - С. 1160-1165.
66. Montgomery K. F. et al. Activation of endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) gene transcription //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1991. - Т. 88. - №. 15. - С. 65236527.
67. Wong D., Dorovini-Zis K. Regulation by cytokines and lipopolysaccharide of E-selectin expression by human brain microvessel endothelial cells in primary culture //Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. - 1996. - Т. 55. - №. 2. - С. 225-235.
68. Von Asmuth E. J. U. et al. Evidence for endocytosis of E-selectin in human endothelial cells //European journal of immunology. - 1992. - Т. 22. - №. 10. - С. 2519-2526.
69. Subramaniam M., Koedam J. A., Wagner D. D. Divergent fates of P-and E-selectins after their expression on the plasma membrane //Molecular biology of the cell. - 1993. - Т. 4. - №. 8. - С. 791801.
70. Matsumoto M. et al. CD43 functions as a ligand for E-Selectin on activated T cells //The Journal of Immunology. - 2005. - Т. 175. - №. 12. - С. 8042-8050.
71. Dimitroff C. J. et al. CD44 is a major E-selectin ligand on human hematopoietic progenitor cells //The Journal of cell biology. - 2001. - Т. 153. - №. 6. - С. 1277-1286.
72. Kotovuori P. et al. The vascular E-selectin binds to the leukocyte integrins CD11/CD18 //Glycobiology. - 1993. - Т. 3. - №. 2. - С. 131-136.
73. Gout S. et al. Death receptor-3, a new E-Selectin counter-receptor that confers migration and survival advantages to colon carcinoma cells by triggering p38 and ERK MAPK activation //Cancer research. -2006. - Т. 66. - №. 18. - С. 9117-9124.
74. Moore K. L. et al. The P-selectin glycoprotein ligand from human neutrophils displays sialylated, fucosylated, O-linked poly-N-acetyllactosamine //Journal of Biological Chemistry. - 1994. - Т. 269. -№. 37. - С. 23318-23327.
75. Steegmaler M. et al. The E-selectin-ligand ESL-1 is a variant of a receptor for fibroblast growth factor //Nature. - 1995. - Т. 373. - №. 6515. - С. 615-620.
76. Ушакова Н.А., Преображенкая М.Е., Берд М.И., Прист Р., Семенов А.В., Мазуров А.В., Нифантьев Н.Э., Почечуева Т.В., Галанина О.Е., Бовин Н.В. Мономерные и мультимерные блокаторы селектинов: сравнение активности in vitro и in vivo //Биохимия. - 2005. - Т. 70. - №. 4. - С. 523-532.
77. Walz G. et al. Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinant on myeloid and tumor cells //Science. - 1990. - Т. 250. - №. 4984. - С. 1132-1135.
78. McEver R. P. Selectin-carbohydrate interactions during inflammation and metastasis //Glycoconjugate journal. - 1997. - Т. 14. - №. 5. - С. 585-591.
79. Ehrhardt C., Kneuer C., Bakowsky U. Selectins—an emerging target for drug delivery //Advanced drug delivery reviews. - 2004. - Т. 56. - №. 4. - С. 527-549.
80. Adams D. H. et al. Expression of E-selectin and E-selectin ligands in human liver inflammation //Hepatology. - 1996. - Т. 24. - №. 3. - С. 533-538.
81. Jubeli E. et al. E-selectin as a target for drug delivery and molecular imaging //Journal of controlled release. - 2012. - T. 158. - №. 2. - C. 194-206.
82. Kulig G., Pilarska K. The role od adhesion molecules in the pathogenesis of Graves ophthalmopathy //Klinika Oczna. - 2001. - T. 103. - №. 2-3. - C. 147-150.
83. Wikaningrum R. et al. Pathogenic mechanisms in the rheumatoid nodule: comparison of proinflammatory cytokine production and cell adhesion molecule expression in rheumatoid nodules and synovial membranes from the same patient //Arthritis & Rheumatism: Official Journal of the American College of Rheumatology. - 1998. - T. 41. - №. 10. - C. 1783-1797.
84. Jung U. et al. Transit time of leukocytes rolling through venules controls cytokine-induced inflammatory cell recruitment in vivo //The Journal of clinical investigation. - 1998. - T. 102. - №. 8.
- C. 1526-1533.
85. Kiriyama K., Ye C. E-selectin expression in serum and tissue correlates with distant metastasis of colorectal cancer //Nihon rinsho. Japanese Journal of Clinical Medicine. - 1995. - T. 53. - №. 7. - C. 1760-1764.
86. Mayer B. et al. De novo expression of the cell adhesion molecule E-selectin on gastric cancer endothelium //Langenbeck's archives of surgery. - 1998. - T. 383. - №. 1. - C. 81-86.
87. Renkonen J. et al. Sialyl-Lewisx/a-decorated selectin ligands in head and neck tumours //Journal of cancer research and clinical oncology. - 1999. - T. 125. - №. 10. - C. 569-576.
88. Nguyen M. et al. Vascular expression of E-selectin is increased in estrogen-receptor-negative breast cancer: a role for tumor-cell-secreted interleukin-1 alpha //The American journal of pathology. - 1997.
- T. 150. - №. 4. - C. 1307.
89. Kannagi R. et al. Carbohydrate-mediated cell adhesion in cancer metastasis and angiogenesis //Cancer science. - 2004. - T. 95. - №. 5. - C. 377-384.
90. Takada A. et al. Contribution of carbohydrate antigens sialyl Lewis A and sialyl Lewis X to adhesion of human cancer cells to vascular endothelium //Cancer research. - 1993. - T. 53. - №. 2. - C. 354-361.
91. Izumi Y. et al. Characterization of human colon carcinoma variant cells selected for sialyl Lex carbohydrate antigen: liver colonization and adhesion to vascular endothelial cells //Experimental cell research. - 1995. - T. 216. - №. 1. - C. 215-221.
92. Bendas G. et al. Selectins as new targets for immunoliposome-mediated drug delivery: a potential way of anti-inflammatory therapy //Pharmaceutica Acta Helvetiae. - 1998. - T. 73. - №. 1. - C. 19-26.
93. Bendas G. et al. Targetability of novel immunoliposomes prepared by a new antibody conjugation technique //International journal of pharmaceutics. - 1999. - Т. 181. - №. 1. - С. 79-93.
94. Kessner S. et al. Investigation of the cellular uptake of E-Selectin-targeted immunoliposomes by activated human endothelial cells //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. - 2001. - Т. 1514. - №. 2. - С. 177-190.
95. Sakhalkar H. S. et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2003.
- Т. 100. - №. 26. - С. 15895-15900.
96. Kunkel E. J., Ley K. Distinct phenotype of E-selectin-deficient mice: E-selectin is required for slow leukocyte rolling in vivo //Circulation research. - 1996. - Т. 79. - №. 6. - С. 1196-1204.
97. Gholizadeh S. et al. E-selectin targeted immunoliposomes for rapamycin delivery to activated endothelial cells //International journal of pharmaceutics. - 2018. - Т. 548. - №. 2. - С. 759-770.
98. Minaguchi J. et al. Transvascular accumulation of Sialyl Lewis X conjugated liposome in inflamed joints of collagen antibody-induced arthritic (CAIA) mice //Archives of histology and cytology. - 2008.
- Т. 71. - №. 3. - С. 195-203.
99. Banquy X. et al. Selectins ligand decorated drug carriers for activated endothelial cell targeting //Bioconjugate chemistry. - 2008. - Т. 19. - №. 10. - С. 2030-2039.
100. Chantarasrivong C. et al. Sialyl LewisX mimic-decorated liposomes for anti-angiogenic everolimus delivery to E-selectin expressing endothelial cells //RSC advances. - 2019. - Т. 9. - №. 36. - С. 2051820527.
101. Kogan T. P. et al. Binding of E-selectin or P-selectin to sialyl Lewisx or sialyl-Lewisa : пат. 5444050 США. - 1995.
102. Handa K. et al. Carbohydrate ligands (myelorollin) that cause E-selectin dependent cell rolling and adhesion under dynamic flow system : пат. 6133239 США. - 2000.
103. Muz B. et al. Targeting E-selectin to tackle cancer using uproleselan //Cancers. - 2021. - Т. 13. -№. 2. - С. 335.
104. Han X. et al. Free paclitaxel-loaded E-selectin binding peptide modified micelle self-assembled from hyaluronic acid-paclitaxel conjugate inhibit breast cancer metastasis in a murine model //International Journal of Pharmaceutics. - 2017. - Т. 528. - №. 1-2. - С. 33-46.
105. Tsoref O. et al. E-selectin-targeted copolymer reduces atherosclerotic lesions, adverse cardiac remodeling, and dysfunction //Journal of Controlled Release. - 2018. - T. 288. - C. 136-147.
106. Mondal N. et al. Glycoengineering of chimeric antigen receptor (CAR) T-cells to enforce E-selectin binding //Journal of Biological Chemistry. - 2019. - T. 294. - №. 48. - C. 18465-18474.
107. Gentile F. et al. The margination propensity of spherical particles for vascular targeting in the microcirculation //Journal of nanobiotechnology. - 2008. - T. 6. - №. 1. - C. 1-9.
108. Liu J. et al. Computational model for nanocarrier binding to endothelium validated using in vivo, in vitro, and atomic force microscopy experiments //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2010. - T. 107. - №. 38. - C. 16530-16535.
109. Liu J. et al. Multivalent binding of nanocarrier to endothelial cells under shear flow //Biophysical journal. - 2011. - T. 101. - №. 2. - C. 319-326.
110. Muro S. et al. Endothelial targeting of high-affinity multivalent polymer nanocarriers directed to intercellular adhesion molecule 1 //Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 2006. -T. 317. - №. 3. - C. 1161-1169.
111. Calderon A. J. et al. Optimizing endothelial targeting by modulating the antibody density and particle concentration of anti-ICAM coated carriers //Journal of Controlled Release. - 2011. - T. 150. -№. 1. - C. 37-44.
112. Singbartl K., Green S. A., Ley K. Blocking P-selectin protects from ischemia/reperfusion-induced acute renal failure //The FASEB Journal. - 2000. - T. 14. - №. 1. - C. 48-54.
113. Cataldi M. et al. Emerging role of the spleen in the pharmacokinetics of monoclonal antibodies, nanoparticles and exosomes //International journal of molecular sciences. - 2017. - T. 18. - №. 6. - C. 1249.
114. Schädlich A. et al. How stealthy are PEG-PLA nanoparticles? An NIR in vivo study combined with detailed size measurements //Pharmaceutical research. - 2011. - T. 28. - №. 8. - C. 1995-2007.
115. Cooke R. M. et al. The conformation of the sialyl Lewis X ligand changes upon binding to E-selectin //Biochemistry. - 1994. - T. 33. - №. 35. - C. 10591-10596.
116. Zinn K. R. et al. Specific targeting of activated endothelium in rat adjuvant arthritis with a 99mTc-radiolabeled E-selectin-binding peptide //Arthritis & Rheumatism: Official Journal of the American College of Rheumatology. - 1999. - T. 42. - №. 4. - C. 641-649.
117. Ashwell G., Harford J. Carbohydrate-specific receptors of the liver //Annual review of biochemistry. - 1982. - T. 51. - №. 1. - C. 531-554.
118. Morell A. G. et al. The role of sialic acid in determining the survival of glycoproteins in the circulation //Journal of Biological Chemistry. - 1971. - T. 246. - №. 5. - C. 1461-1467.
119. Harvey H. A. et al. Receptor-mediated endocytosis of Neisseria gonorrhoeae into primary human urethral epithelial cells: the role of the asialoglycoprotein receptor //Molecular microbiology. - 2001. -T. 42. - №. 3. - C. 659-672.
120. Harvey H. A. et al. Gonococcal lipooligosaccharide is a ligand for the asialoglycoprotein receptor on human sperm //Molecular microbiology. - 2000. - T. 36. - №. 5. - C. 1059-1070.
121. Huang X., Leroux J. C., Castagner B. Well-defined multivalent ligands for hepatocytes targeting via asialoglycoprotein receptor //Bioconjugate chemistry. - 2017. - T. 28. - №. 2. - C. 283-295.
122. Stockert R. J. The asialoglycoprotein receptor: relationships between structure, function, and expression //Physiological reviews. - 1995. - T. 75. - №. 3. - C. 591-609.
123. Meier M. et al. Crystal structure of the carbohydrate recognition domain of the H1 subunit of the asialoglycoprotein receptor //Journal of molecular biology. - 2000. - T. 300. - №. 4. - C. 857-865.
124. Feinberg H. et al. Mechanism of pH-dependentN-Acetylgalactosamine Binding by a Functional Mimic of the Hepatocyte Asialoglycoprotein Receptor //Journal of Biological Chemistry. - 2000. - T. 275. - №. 45. - C. 35176-35184.
125. D'Souza A. A. et al. Comparative in silico-in vivo evaluation of ASGP-R ligands for hepatic targeting of curcumin Gantrez nanoparticles //The AAPS journal. - 2013. - T. 15. - №. 3. - C. 696-706.
126. Ueki A. et al. Synthesis and evaluation of glyco-coated liposomes as drug carriers for active targeting in drug delivery systems //Carbohydrate research. - 2015. - T. 405. - C. 78-86.
127. Rensen P. C. N. et al. Design and synthesis of novel N-acetylgalactosamine-terminated glycolipids for targeting of lipoproteins to the hepatic asialoglycoprotein receptor //Journal of medicinal chemistry. - 2004. - T. 47. - №. 23. - C. 5798-5808.
128. Thapa B. et al. Asialoglycoprotein receptor-mediated gene delivery to hepatocytes using galactosylated polymers //Biomacromolecules. - 2015. - T. 16. - №. 9. - C. 3008-3020.
129. Pathak P. O. et al. Cholesterol anchored arabinogalactan for asialoglycoprotein receptor targeting: synthesis, characterization, and proof of concept of hepatospecific delivery //Carbohydrate research. -2015. - T. 408. - C. 33-43.
130. Wang Y. et al. A polymeric prodrug of cisplatin based on pullulan for the targeted therapy against hepatocellular carcinoma //International journal of pharmaceutics. - 2015. - T. 483. - №. 1-2. - C. 89100.
131. Shi B., Abrams M., Sepp-Lorenzino L. Expression of asialoglycoprotein receptor 1 in human hepatocellular carcinoma //Journal of Histochemistry & Cytochemistry. - 2013. - T. 61. - №. 12. - C. 901-909.
132. Mohr A. M. et al. Enhanced colorectal cancer metastases in the alcohol-injured liver //Clinical & experimental metastasis. - 2017. - T. 34. - №. 2. - C. 171-184.
133. Ueno S. et al. Asialoglycoprotein receptor promotes cancer metastasis by activating the EGFR-ERK pathway //Cancer research. - 2011. - T. 71. - №. 20. - C. 6419-6427.
134. Becker S., Spiess M., Klenk H. D. The asialoglycoprotein receptor is a potential liver-specific receptor for Marburg virus //Journal of General Virology. - 1995. - T. 76. - №. 2. - C. 393-399.
135. Dotzauer A. et al. Hepatitis A virus-specific immunoglobulin A mediates infection of hepatocytes with hepatitis A virus via the asialoglycoprotein receptor //Journal of virology. - 2000. - T. 74. - №. 23.
- C. 10950-10957.
136. Treichel U. et al. The asialoglycoprotein receptor mediates hepatic binding and uptake of natural hepatitis B virus particles derived from viraemic carriers //Journal of General virology. - 1994. - T. 75.
- №. 11. - C. 3021-3029.
137. Harvey H. A. et al. Gonococcal lipooligosaccharide is a ligand for the asialoglycoprotein receptor on human sperm //Molecular microbiology. - 2000. - T. 36. - №. 5. - C. 1059-1070.
138. Harvey H. A. et al. Receptor-mediated endocytosis of Neisseria gonorrhoeae into primary human urethral epithelial cells: the role of the asialoglycoprotein receptor //Molecular microbiology. - 2001. -T. 42. - №. 3. - C. 659-672.
139. Pranatharthiharan S. et al. Asialoglycoprotein receptor targeted delivery of doxorubicin nanoparticles for hepatocellular carcinoma //Drug delivery. - 2017. - T. 24. - №. 1. - C. 20-29.
140. Wu G. Y., Wu C. H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo //Journal of Biological Chemistry. - 1988. - T. 263. - №. 29. - C. 14621-14624.
141. Oh H. R. et al. Galactosylated liposomes for targeted co-delivery of doxorubicin/vimentin siRNA to hepatocellular carcinoma //Nanomaterials. - 2016. - T. 6. - №. 8. - C. 141.
142. Zhang Y. et al. Targeted delivery of atorvastatin via asialoglycoprotein receptor (ASGPR) //Bioorganic & medicinal chemistry. - 2019. - T. 27. - №. 11. - C. 2187-2191.
143. Zheng G. et al. Co-delivery of sorafenib and siVEGF based on mesoporous silica nanoparticles for ASGPR mediated targeted HCC therapy //European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2018. - T. 111. - C. 492-502.
144. Dehshahri A. et al. P-Galactosylated alkyl-oligoamine derivatives of polyethylenimine enhanced pDNA delivery into hepatic cells with reduced toxicity //Current Nanoscience. - 2012. - T. 8. - №. 4. -C. 548-555.
145. Maruyama K. et al. Novel receptor-mediated gene delivery system comprising plasmid/protamine/sugar-containing polyanion ternary complex //Biomaterials. - 2004. - T. 25. - №. 16. - C. 3267-3273.
146. Narainpersad N., Singh M., Ariatti M. Novel neo glycolipid: formulation into pegylated cationic liposomes and targeting of DNA lipoplexes to the hepatocyte-derived cell line HepG2 //Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. - 2012. - T. 31. - №. 3. - C. 206-223.
147. Bhingardeve P. et al. Receptor-specific delivery of peptide nucleic acids conjugated to three sequentially linked N-acetyl galactosamine moieties into hepatocytes //The Journal of Organic Chemistry. - 2020. - T. 85. - №. 14. - C. 8812-8824.
148. Scott L. J. Givosiran: first approval //Drugs. - 2020. - T. 80. - №. 3. - C. 335-339.
149. Garrelfs S. F. et al. Lumasiran, an RNAi therapeutic for primary hyperoxaluria type 1 //New England Journal of Medicine. - 2021. - T. 384. - №. 13. - C. 1216-1226.
150. German C. A., Shapiro M. D. Small interfering RNA therapeutic inclisiran: a new approach to targeting PCSK9 //BioDrugs. - 2020. - T. 34. - №. 1. - C. 1-9.
151. Titze-de-Almeida S. S. et al. Leading RNA interference therapeutics part 1: silencing hereditary transthyretin amyloidosis, with a focus on patisiran //Molecular diagnosis & therapy. - 2020. - T. 24. -№. 1. - C. 49-59.
152. Zhang X. et al. GlcNAc conjugated atorvastatin with enhanced water solubility and cellular internalization //Bioconjugate chemistry. - 2017. - T. 28. - №. 8. - C. 2109-2113.
153. Petrov R. A. et al. New Small-Molecule Glycoconjugates of Docetaxel and GalNAc for Targeted Delivery to Hepatocellular Carcinoma //Molecular Pharmaceutics. - 2020. - T. 18. - №. 1. - C. 461468.
154. Петров Р. А. и др. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ И ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНЫХ ЛИГАНДОВ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ ПЕЧЕНИ : пат. № 2696096 C2 РФ - 2019.
155. Dou H. et al. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery //Blood. - 2006. - Т. 108. - №. 8. - С. 2827-2835.
156. Schindelin J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis //Nature methods. -2012. - Т. 9. - №. 7. - С. 676-682.
157. Berg S. et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis //Nature Methods. -2019. - Т. 16. - №. 12. - С. 1226-1232.
158. Finak G. et al. OpenCyto: an open source infrastructure for scalable, robust, reproducible, and automated, end-to-end flow cytometry data analysis //PLoS computational biology. - 2014. - Т. 10. -№. 8. - С. e1003806.
159. Van P. et al. ggCyto: next generation open-source visualization software for cytometry //Bioinformatics. - 2018. - Т. 34. - №. 22. - С. 3951-3953.
160. Chew S. A. et al. Biodegradable branched polycationic polymers with varying hydrophilic spacers for nonviral gene delivery //Biomacromolecules. - 2009. - Т. 10. - №. 9. - С. 2436-2445.
161. Schaffert D., Wagner E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems //Gene therapy. - 2008. - Т. 15. - №. 16. - С. 1131-1138.
162. Wayne E. C. et al. Targeted delivery of siRNA lipoplexes to cancer cells using macrophage transient horizontal gene transfer //Advanced Science. - 2019. - Т. 6. - №. 21. - С. 1900582.
163. Lahmar Q. et al. Tissue-resident versus monocyte-derived macrophages in the tumor microenvironment //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer. - 2016. - Т. 1865. - №. 1. - С. 23-34.
164. Erbacher P. et al. Gene transfer by DNA/glycosylated polylysine complexes into human blood monocyte-derived macrophages //Human Gene Therapy. - 1996. - Т. 7. - №. 6. - С. 721-729.
165. Diebold S. S. et al. Mannose polyethylenimine conjugates for targeted DNA delivery into dendritic cells //Journal of biological chemistry. - 1999. - Т. 274. - №. 27. - С. 19087-19094.
166. Hashimoto M. et al. Gene transfer by DNA/mannosylated chitosan complexes into mouse peritoneal macrophages //Biotechnology letters. - 2006. - Т. 28. - №. 11. - С. 815-821.
167. Jiang H. L. et al. The potential of mannosylated chitosan microspheres to target macrophage mannose receptors in an adjuvant-delivery system for intranasal immunization //Biomaterials. - 2008. -T. 29. - №. 12. - C. 1931-1939.
168. Yu W. et al. Mannan-modified solid lipid nanoparticles for targeted gene delivery to alveolar macrophages //Pharmaceutical research. - 2010. - T. 27. - №. 8. - C. 1584-1596.
169. Dey D. et al. Polyplex formation between PEGylated linear cationic block copolymers and DNA: equilibrium and kinetic studies //The Journal of Physical Chemistry B. - 2014. - T. 118. - №. 25. - C. 7012-7025.
170. Oupicky D., Carlisle R. C., Seymour L. W. Triggered intracellular activation of disulfide crosslinked polyelectrolyte gene delivery complexes with extended systemic circulation in vivo //Gene therapy. - 2001. - T. 8. - №. 9. - C. 713-724.
171. Katakura H. et al. Improvement of retroviral vectors by coating with poly (ethylene glycol)-poly (l-lysine) block copolymer (PEG-PLL) //The Journal of Gene Medicine: A cross-disciplinary journal for research on the science of gene transfer and its clinical applications. - 2004. - T. 6. - №. 4. - C. 471477.
172. Jiang Y. et al. SOD1 nanozyme with reduced toxicity and MPS accumulation //Journal of Controlled Release. - 2016. - T. 231. - C. 38-49.
173. Manickam D. S. et al. Well-defined cross-linked antioxidant nanozymes for treatment of ischemic brain injury //Journal of controlled release. - 2012. - T. 162. - №. 3. - C. 636-645.
174. Oupicky D., Carlisle R. C., Seymour L. W. Triggered intracellular activation of disulfide crosslinked polyelectrolyte gene delivery complexes with extended systemic circulation in vivo //Gene therapy. - 2001. - T. 8. - №. 9. - C. 713-724.
175. Stahl P. et al. Receptor-mediated pinocytosis of mannose glycoconjugates by macrophages: characterization and evidence for receptor recycling //Cell. - 1980. - T. 19. - №. 1. - C. 207-215.
176. Steinman R. M. et al. Endocytosis and the recycling of plasma membrane //The Journal of cell biology. - 1983. - T. 96. - №. 1. - C. 1-27.
177. Stahl P. D. The macrophage mannose receptor: current status //Am J Respir Cell Mol Biol. - 1990. - T. 2. - №. 4. - C. 317-318.
178. Sheikh H. et al. Endo180, an endocytic recycling glycoprotein related to the macrophage mannose receptor is expressed on fibroblasts, endothelial cells and macrophages and functions as a lectin receptor //Journal of cell science. - 2000. - T. 113. - №. 6. - C. 1021-1032.
179. Storrie B. Direct endocytosis of concanavalin A by motile fibroblasts //Experimental Cell Research.
- 1979. - T. 118. - №. 1. - C. 135-141.
180. Fiani M. L. et al. Regulation of mannose receptor synthesis and turnover in mouse J774 macrophages //Journal of leukocyte biology. - 1998. - T. 64. - №. 1. - C. 85-91.
181. Godek M. L. et al. Adsorbed serum albumin is permissive to macrophage attachment to perfluorocarbon polymer surfaces in culture //Journal of Biomedical Materials Research Part A: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials. - 2009. - T. 88. - №. 2. -C. 503-519.
182. Chamberlain L. M. et al. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype //Journal of biomedical materials research Part A. - 2015. - T. 103.
- №. 9. - C. 2864-2874.
183. Chamberlain L. M. et al. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models //Journal of Biomedical Materials Research Part A: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials. - 2009. - T. 88. - №. 4. - C. 858871.
184. Close D. M. et al. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models //Journal of biomedical optics. - 2011. - T. 16. - №. 4. - C. 047003.
185. Raviv L., Jaron-Mendelson M., David A. Mannosylated polyion complexes for in vivo gene delivery into CD11c+ dendritic cells //Molecular pharmaceutics. - 2015. - T. 12. - №. 2. - C. 453-462.
186. McCord J. M., Roy R. S. The pathophysiology of superoxide: roles in inflammation and ischemia //Canadian journal of physiology and pharmacology. - 1982. - T. 60. - №. 11. - C. 1346-1352.
187. Banci L. et al. Spectroscopic characterization of polyethyleneglycol modified superoxide dismutase: 1H NMR studies on its Cu2Co2 derivative //Journal of inorganic biochemistry. - 1990. - T. 39. - №. 2. - C. 149-159.
188. Krol S. K. et al. Comprehensive review on betulin as a potent anticancer agent //BioMed research international. - 2015. - T. 2015.
189. Weber L. A. et al. Betulinic acid shows anticancer activity against equine melanoma cells and permeates isolated equine skin in vitro //BMC veterinary research. - 2020. - T. 16. - №. 1. - C. 1-9.
190. Liu Z. et al. Global incidence trends in primary liver cancer by age at diagnosis, sex, region, and etiology, 1990-2017 //Cancer. - 2020. - T. 126. - №. 10. - C. 2267-2278.
191. De Toni E. N. et al. Age independent survival benefit for patients with hepatocellular carcinoma (HCC) without metastases at diagnosis: a population-based study //Gut. - 2020. - T. 69. - №. 1. - C. 168-176.
192. Llovet J. M. et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma //New England journal of medicine. - 2008. - T. 359. - №. 4. - C. 378-390.
193. Kudo M. et al. Lenvatinib versus sorafenib in first-line treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: a randomised phase 3 non-inferiority trial //The Lancet. - 2018. - T. 391. -№. 10126. - C. 1163-1173.
194. Terada T. et al. Analysis of the molecular interaction of glycosylated proteins with rabbit liver asialoglycoprotein receptors using surface plasmon resonance spectroscopy //Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. - 2006. - T. 41. - №. 3. - C. 966-972.
195. Stokmaier D. et al. Design, synthesis and evaluation of monovalent ligands for the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R) //Bioorganic & medicinal chemistry. - 2009. - T. 17. - №. 20. -C. 7254-7264.
196. Mukherjee R. et al. Betulinic acid derivatives as anticancer agents: structure activity relationship //Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents). - 2006. - T. 6. - №. 3. - C. 271-279.
197. Bronich T. K. et al. Effects of block length and structure of surfactant on self-assembly and solution behavior of block ionomer complexes //Langmuir. - 2000. - T. 16. - №. 2. - C. 481-489.
198. Gref R. et al. 'Stealth'corona-core nanoparticles surface modified by polyethylene glycol (PEG): influences of the corona (PEG chain length and surface density) and of the core composition on phagocytic uptake and plasma protein adsorption //Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 2000. - T. 18. - №. 3-4. - C. 301-313.
199. Takeda K. M. et al. Poly (ethylene glycol) crowding as critical factor to determine pDNA packaging scheme into polyplex micelles for enhanced gene expression //Biomacromolecules. - 2017. - T. 18. -№. 1. - C. 36-43.
200. Osada K. Versatile DNA folding structures organized by cationic block copolymers //Polymer Journal. - 2019. - T. 51. - №. 4. - C. 381-387.
201. Chen W. Y. et al. Onset of tethered chain overcrowding //Physical review letters. - 2004. - T. 93. - №. 2. - C. 028301.
202. Garapaty A., Champion J. A. Tunable particles alter macrophage uptake based on combinatorial effects of physical properties //Bioengineering & translational medicine. - 2017. - T. 2. - №. 1. - C. 92101.
203. Sharma G. et al. Polymer particle shape independently influences binding and internalization by macrophages //Journal of controlled release. - 2010. - T. 147. - №. 3. - C. 408-412.
204. Nowacek A. S. et al. Analyses of nanoformulated antiretroviral drug charge, size, shape and content for uptake, drug release and antiviral activities in human monocyte-derived macrophages //Journal of controlled release. - 2011. - T. 150. - №. 2. - C. 204-211.
205. Miyata K. et al. PEG-based block catiomers possessing DNA anchoring and endosomal escaping functions to form polyplex micelles with improved stability and high transfection efficacy //Journal of controlled release. - 2007. - T. 122. - №. 3. - C. 252-260.
206. Itaka K. et al. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity //Biomaterials. - 2010. - T. 31. - №. 13. - C. 3707-3714.
207. Yokoyama M. et al. Preparation of micelle-forming polymer-drug conjugates //Bioconjugate chemistry. - 1992. - T. 3. - №. 4. - C. 295-301.
ПРИЛОЖЕНИЕ
П1. Синтез РБО-рЬЬ
Схема S1. Схема синтеза Маи-РБО-й-РЬЬ. Синтез N-карбоксиангидрида N-8-
бензилоксикарбонил-Ь-лизина (БуБ^-ЫСА). (B) Синтез пропаргил-функционализированного полиэтиленгликоль амина. (С) Синтез блок-сополимра состава пропаргил-РБО-й-РБЬ. ф) Синтез 2'-азидоэтил-0-а-0-маннопиранозида. (Е) Конъюгация пропаргил-РБО-й-РББ и 2'-азидоэтил-О-а-О-маннопиранозида методом «клик»-реакции.
Катионный блок-сополимер РБО-й-РББ был получен в результате реакции анионной полимеризации с раскрытием цикла с использованием №карбоксиангидрида N-8-бензилоксикарбонил-Ь-лизина 1. Полимер пропаргил-РБО- NH2 3 выступал в роли инициатора реакции. (Схема 1) После снятия боковых защитных групп был получен конечный продукт пропаргил-РБО-й-РББ 4. Конъюгация полимера с нацеливающим лигандом 2'-азидоэтил-0-а-0-маннопиранозидом 6 происходила с помощью реакции азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого Си(1). В результате был получен продукт Маи-РБО-й-РББ 7.
Степень полимеризации (БР) блока полилизина 4 была определена с помощью 1Н-ЯМР спектроскопии и расчитывалась из отношения интегральной интенсивности метиленовых
протонов полиэтиленгликоля -СН2- 5=3.6 м.д. к интенсивности протонов бензильных защитных групп -СООСН2С6Н5 5=7.2 м.д. до реакции депротекции. По результатам эксклюзионной хроматографии (ОРС) для полимера 4 (Рисунок 82) были определен Мш и РБ1. В спектре 1Н-ЯМР 7 (Рисунок 83) видно появление сигнала 1,2,3-триазольного кольца 5=7.8 м.д. и исчезновение пика пропаргильного протона 5=2.3. Основываясь на этих данных, была оценена степень конверсии 4 в 7 (Таблица 81). На основе данных 1Н-ЯМР и ОРС соединениям 7 были присвоены соответствующие структурные формулы.
Таблица S1. Характеризация блок-сополимеров Man-PEG-^-PLL.
Состав PDIa Степень маннозилированияь, %
Man-PEGii4-6-PLL62 i.27 87
Man-PEGii4-6-PLLi50 i.25 72
Man-PEGii4-6-PLL206 i.i9 95
a Определенный методом GPC индекс полидисперсности (PDI) равен Mw/Mn; b Степень маннозилирования выражается как отношение числа молекул сополимера, сконъюгрованного с маннозным остатком, к общему числу сополимерных молекул, выраженное в процентах.
Длина катионных блоков синтезированных сополимеров PEG-&-PLL составляла 62, 150 и 206 структурных единиц. При использовании сополимера с 62 структурными единицами при одном и том же соотношении N/P в полиплексе будет в 2.4 и 3.3 раз больше цепей полиэтиленгликоля, чем в случае сополимеров с 150 и 206 структурными единицами катионного блока, соответственно. Известно, что стабильность ПЭГилированных частиц в водном растворе увеличивается с ростом молярной фракции полиэтиленгликоля [197], а также что плотность короны полиэтиленгликоля влияет на уровень адсорбции частиц белками плазмы [198]. Взаимодействие цепей полиэтиленгликоля определяет форму полиплекса. При высокой плотности цепей невозможно образование глобулярной структуры вследствие стерического отталкивания, что приводит к формированию стержневидных частиц [199, 200]. Для оценки плотности цепей используется параметр RTD (reduced tethering density, приведенная плотность цепей) [201]. Значение параметра RTD > 1 свидетельствует о взаимном вытеснении цепей из единицы объёма пространства, что приводит к формированию стержневидной структуры. Значения RTD для исследуемых сополимеров состава PEG-&-PLL приведены в таблице S2. Известно, что стержневидные частицы более активно захватываются клетками иммунной системы, чем глобулярные [202, 203], а также что процесс интернализации происходит быстрее в случае стержневидных частиц [204]. Поэтому для дальнейших экспериментов был выбран полимер состава PEGii4-£-PLL62.
П2. Синтез РБО-рАвр(ББТ)
Схема S2. Схема синтеза Мап-РБО-й-рАвр(ББТ). (A) Синтез №карбоксиангидрида Р-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты (БЬА-ЫСА). (B) Синтез блок-сополимеров состава шРБО-й-рАвр(ББТ) (Ю) и алкин-РБО-й-рАвр(ББТ) (Я2). (С) Конъюгация алкин-РБО-й-рАвр(ББТ) и а-Б-Мап-ТБО-№ методом «клик»-реакции.
Катионный блок-сополимер РБО-й-рАвр(ОБТ) был получен в результате реакции анионной полимеризации с раскрытием цикла с использованием №карбоксиангидрида Р-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты 8 [205, 206, 207]. Полимеры с mPEG-NH2 9a и алкин-РБО-ЫН 9Ь выступали в роли инициатора реакциии. В ходе реакции были получены и выделены промежуточные соединения - сополимеры с защитными группами mPEG-й-PBЬA 10a и алкин-РБО-й-РВЬА 10Ь - введенные далее в реакцию с ^-(2-аминоэтил)этан-1,2-диамином (ББТ). В результате были получены сополимеры шРБО-й-рАвр(ББТ) и алкин-РБО-й-рАвр(ББТ) 11Ь. Полимер с алкиновой функциональной группой был далее сконъюгирован с нацеливающим лигандом а-Э-Мап-ТБО-№ с помощью реакции азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого Си(1). В результате был получен продукт Мап-РБО-й-рАвр(ББТ) 12.
Степень полимеризации (БР) блока РВЬА сополимеров 10a, 10Ь была определена с помощью 1Н-ЯМР спектроскопии и рассчитывалась из отношения интегральной интенсивности метиленовых протонов бензильных защитных групп -СООСН2С6Н5 5=5.0 м.д. к интенсивности -
СНз_протонов mPEG 5=3.3 м.д. (10a) или алкинового протона алкин-PEG 5=2.1 м.д. (10b). Полученные значения DP составили ~56 и ~40 для 10a и 10b, соответственно. По результатам эксклюзионной хроматографии (GPC) соединений 10a и 10b (Рисунок S5) было определено, что в каждом случае в смеси присутствуют основной продукт с массой Mn 15,360 Да и распределением Mw/Mn 1.030 для 10a и 1.207 для 10b, и небольшие фракции гомополимеров PBLA (Mn 2,480 Да и 3,290 Да, соответственно).
Примеси гомополимеров были удалены после конверсии промежуточных соединений 10a и 10b в продукты - катионные блок-сополимеры 11a и 11b - в процессе диализа в растворе 0.01 N HCl с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы 10 кДа. Продукты 11a и 11b были исследованы методом GPC (Рисунок S7). В результате было показано полное исчезновение примеси гомополимера и определена масса продуктов, составившая Mn 14,690 Да, Mw/Mn 1.018 для 11a и Mn 14,740 Да, Mw/Mn 1.036 для 11b.
Полная конверсия блока PBLA в pAsp(DET) в этих полимерах была подтверждена полным исчезновением пика "с" 5 = 5.0 м.д. в спектрах 1H-NMR соединений 11a и 11b (Рисунок S6). Основываясь на результатах GPC и 1H-NMR соединениям 11a и 11b были присвоены соответствующие структурные формулы CH3-(CH2CH2Ü)n4-p[Asp(DET)]50 и HC=C-CH2Ü-(CH2CH2O) 114-p [Asp(DET)]50.
На 1H-NMR спектре соединения 12 (Рисунок S8) видно появление характерного сигнала протонов 1,2,3-триазольного кольца 5=7.6 м.д. и исчезновение пика, соответствующего протону 5=2.3 м.д. алкиновой группы алкин-PEG. Степень конверсии 11b в 12 составила ~90%.
О
7 0 6 0 5 0 4 0 30 2 0 10
Рисунок 81. Спектр 1Н-ЯМР соединения пропаргил-РБОи4-6-РЬЬ(2)б2 (БМБО-ёб, 400 МГц, 25 °С).
—I-1-Г
12 16 V (т!)
Рисунок S2. Результат эксклюзионной хроматографии соединений пропаргил-РБОп4-й-РЬЬ(2)б2 (черный), пропаргил-РБОи4-й-РЬЬ(2)15о (красный), пропаргил-РБОи4-й-РЬЬ(2)20б (синий) в ДМФА с добавлением 1% ЫВг при 45 °С, скорость потока 1.0 мл/мин, с использованием детектора показателя преломления.
Рисунок 83. Спектр 1Н-ЯМР соединения Мап-РБОп4-6-РШ,2 Р2О, 400 МГц, 25 °С).
Рисунок 84. Спектр 1Н-ЯМР соединений шРБО-й-РБЬЛ (слева) и алкин-РБО-й-РБЬЛ (справа) (СБС1э, 400 МГц, 25 °С).
В -24.0-
-30.0- ImhM
Refractive Index
«mummm»—
И-1-1-Г
16.0 20.0 24.0 28.0
Retention Volume (ml)
В
£ -24.0-
I
Ï -26.0—
$ 1 J Refractive Index i ..L
16.0 20.0 24.0
Retention Volume (ml)
Рисунок S5. Результат эксклюзионной хроматографии соединений шРБО-й-рВЬА и ф) алкин-РБО-й-рВЬА в ДМФА с добавлением 1% ЫВг при 45 °С, скорость потока 1.0 мл/мин, с использованием детектора показателя преломления.
Рисунок S6. Спектр 1Н-ЯМР соединений mPEG-^-pAsp(DET) (слева) and алкин-РБО-й-pAsp(DET) (справа) (CDCI3, 400 МГц, 25 °C).
Рисунок 87. Результат эксклюзионной хроматографии соединений (А) шРБО-й-рЛвр(ББТ) и (В) алкин-РБО-й-рЛвр(ББТ) в ДМФА с добавлением 1% ЫБг при 45 °С, скорость потока 1.0 мл/мин, с использованием детектора показателя преломления.
Рисунок 88. Спектр 1Н-ЯМР соединения Маи-РБО-6-рЛ8р(ББТ) (СБС1э, 400 МГц, 25 °С).
Рисунок 810. Соединение I
Рисунок 811. Соединение II
Рисунок 812. Соединение III
А
Рисунок 813. Соединение IV
Рисунок 814. Соединение V
Рисунок 815. Соединение VI
Рисунок 816. Соединение VII
ЭОз"
Рисунок 817. Соединение VIII
Таблица S2. Характеризация полиплексов, сформированных сополимерами PEG-&-PLL с различной длиной катионного блока. Плотность цепей полиэтиленгликоля была расчитана как количество цепей на одну молекулу ДНК при образовании гипотетического стехиометрического комплекса с учетом площади молекулы нуклеиновой кислоты [для плазмиды gWiz-GFP, 5757 п.н.: 2п х 1 (нм) х 0.338 (нм/ п.н.) х 5757 (п.н.) = 12 226.2 (нм2)]. Приведенная плотность цепей (RTD) была рассчитана по формуле RTD = nRg2o. Радиус вращения (Rg, нм) полиэтиленгликоля был расчитан по формуле: Rg = 0.181 х (DP PEG)0 58 = 2.82 (нм).
Полимер Плотность цепей, о (цепей/нм2) RTD, nRg2o
PEGii4-^-PLL62 0.046 1.141
PEGii4-^-PLLi50 0.019 0.471
PEG114- b-PLL206 0.014 0.343
Таблица S3. Результаты трансфекции культуры макрофагов IC-21 нацеленными и ненацеленными полиплексами состава mPEG-£-pAsp(DET)^HK и Man-PEG-&-pAsp(DET)/,nHK при различных соотношениях N/P (1, 8, 20). Концентрация ДНК (gWiz-Luc) составляла 4.5 мкг/мл. Уровень люминисценции был нормализован на содержание общего белка в клеточном лизате. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM) (n = 3).
Тип полиплекса 103 RLU/мг белка
Используемый полимер N/P 4 ч инкубации 8 ч инкубации 24 ч инкубации
mPEG-b-pAsp(DET) 1 18.7 ± 1.6 23.4 ± 3.0 42.8 ± 3.7
mPEG-b-pAsp(DET) 8 33.0 ± 2.6 24.4 ± 11.8 194.1 ± 97.0
mPEG-b-pAsp(DET) 20 887.2 ± 252.2 168.5 ± 64.9 364.8 ± 187.2
Man-PEG-b-pAsp(DET) 1 68.9 ± 8.7 164.7 ± 18.1 389.3 ± 110.9
Man-PEG-b-pAsp(DET) 8 866.6 ± 84.2 10196.8 ± 1803.8 23372.3 ± 3155.4
Man-PEG-b-pAsp(DET) 20 14325.4 ± 1506.2 79739.5 ± 2087.0 104834.8 ± 16372.9
Таблица S4. Эффективность нацеливания определялась как отношение нормализованного уровня люминисценции трансфецированных нацеленными и ненацеленными полиплексами (PEG-£-pAps(DET)/,nHK) клеток линии IC-21 для каждого соотношения N/P и времени инкубации. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM) (n = 3)
N/P Возрастание (число раз)
4 ч инкубации 8 ч инкубации 24 ч инкубации
1 3.7 ± 0.1 7.0 ± 0.1 8.9 ± 1.2
8 26.2 ± 0.3 469.8 ± 128.8 139.9 ± 45.5
20 16.7 ± 2.3 524.5 ± 150.3 335.0 ± 108.8
Таблица S5. Концентрация общего белка (мг/мл), определенная с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) в лизате клеток IC-21 после инкубации в присутствии полиплексов состава PEG-£-pAsp(DET)/,nHK. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM) (n = 3)
Тип полиплекса Время инкубации, ч
Используемый полимер N/P 4 ч инкубации 8 ч инкубации 24 ч инкубации
mPEG-й -pAsp(DET) 1 2.19 ± 0.08 2.05 ± 0.34 0.80 ± 0.15
mPEG-й -pAsp(DET) 8 2.06 ± 0.07 2.47 ± 0.44 0.81 ± 0.16
mPEG-Ä-pAsp(DET) 20 1.08 ± 0.86 1.85 ± 0.21 0.86 ± 0.13
Man-PEG-Ä-pAsp(DET) 1 1.93 ± 0.24 1.89 ± 0.22 0.89 ± 0.09
Man-PEG-й -pAsp(DET) 8 1.79 ± 0.18 2.05 ± 0.31 0.85 ± 0.16
Man-PEG-й -pAsp(DET) 20 1.72 ± 0.24 1.91 ± 0.26 0.92 ± 0.11
Таблица S6. Расчитанные значения коэффициента распределения (LogP) и топологической полярной площади поверхности (Topological Polar Surface Area, TPSA) исследуемых веществ -бетулина и его конъюгатов.
Соединение LogP TPSA (Ä)
Бетулин 7.00 40.4
Соединение I 5.28 176.3
Соединение II 5.12 185.5
Соединение III 5.28 176.3
Соединение IV 5.12 185.5
Соединение V 3.56 312.1
Соединение VI 3.25 330.5
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.