Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Хашин, Олег Валентинович

• Хашин, Олег Валентинович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хашин, Олег Валентинович

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. Общая характеристика семейства ортомиксовирусов

2.1.1. Грипп А

2.1.2. Структура и функция гемагглютинина

2.1.3. Структура и функция нейраминидазы

2.1.4. Структура и функция липидов

2.1.5. Структура и функция М белка

2.1.6. Структура и функция NP белка

2.1.7. Структура и функция белков-полимераз

2.2. Структура генома

2.3. Антигенная изменчивость вирусов гриппа 21 2.3.1. Антигенная структура гликопротеидов вирусов гриппа

2.4. Этапы репликации вируса гриппа 25 2.4.1. Роль вирусных белков в процессе репликации вируса гриппа А

2.5. Лабораторная диагностика гриппа птиц

2.5.1. Выделение вируса 31 2.5.1.1 .Взятие и подготовка материала 31 2.5.1.2. Заражение куриных эмбрионов

2.5.2. Серодиагностика и ретроспективная диагностика

2.5.3.1.РТГА

2.5.2.2.РСК

2.5.2.3. Реакция радиального гемолиза

2.5.2.4.Иммуноферментный метод для диагностики гриппа птиц

2.6. Очистка и концентрирование вируса гриппа А и его структурных компонентов

2.7. Профилактика гтриппа типа А 43 2.7.1. Серологическая оценка поствакцинального иммунитета

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом»

1.1. Актуальность темы.

Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

В связи с сохранением в нашей стране крупных птицеводческих хозяйств, остается актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации птицы часто проявляется у кур. Грипп - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней кур при промышленном птицеводстве. Изучение гриппа кур в течении последнего времени показало актуальность данной проблемы.

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшения качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов G, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам птиц они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Быстрый и точный диагноз гриппа кур является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, использзуемых в качестве компонента набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в иммуноферментнм анализе.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Репродукцровать вирус гриппа А птиц, штаммы: А/утка/Альберта/35/76

H1N1); А/утка/Германия/1215/73 (H2N3); А/утка/Украина/1/63 (H3N8); А/утка/Чехословакия/56 (H4N6); А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (H6N2);

А/курица/СССР/315/70 (H6N2); А/индюк/Онтарио/6118/68 (H8N4); А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2); А/цыпленок/Германия/49 (H10N7); А/утка/Англия/56 (H11N6); А/утка/Альберта/60/16 (H12N5) и А/черноголовый хохотун/Астрахань/1421/79 (H13N2) в 9 - 11 дневных SPF куриных эмбрионах;

1.2.2. Определить условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП1

А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2) в первично-трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

1.2.3. Разработать метод получения очищенноых и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2), репродуцированного в культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

1.2.4. Получить антисыворотки к 13 сероподтипам ((H1N1), (H2N3), (H3N8),

H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N7), (H11N6), (H12N5) и (H13N2)) вируса гриппа А кур на SPF петухах;

1.2.5. Определить уровень антител к гомологичным штаммам вируса гриппа

А в полученых антисыворотках и степень перекркстных реакций с гомологичными штаммами в РТГА;

1.2.6. Выделить IgG кур, получить анти-IgG кур антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG кур антитела и синтезировать анти-IgG кур иммунопероксидазный коньюгат;

1.2.7. Разработать компоненты набора для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе;

1.2.8. Определить воспроизводимость результатов по определению уровня антител к вирусу гриппа А полученных с использованием разработанного иммуноферментного набора;

1.2.9. Исследовать специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур;

1.2.10. Провести сравнительную оценку чувствительности РТГА и разработанного иммуноферментного Набора при определения уровня анти-гриппозных антител в сыворотках больной и вакцинированной вирусом гриппа А птицы.

1.3. Научная новизна.

- В результате проведенной работы, определены условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2) в первично-трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

- Разработан метод получения очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2), репродуцированного в культуре клеток SPF куриных эмбрионов;

- Получена панель антисывороток к 13 сероподтипам ((H1N1), (H2N3), (H3N8), (H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N7), (H11N6), (H12N5) и (H13N2)) вируса гриппа А кур на SPF петухах; Определен уровень антител к гомологичным штаммам вируса гриппа А в полученых антисыворотках и степень перекркстных реакций с гомологичными штаммами в РТГА;

- разработана технология изготовления набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе;

- Определена воспроизводимость результатов и специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур;

- Проведена сравнительная оценка чувствительности РТГА и разработанного иммуноферментного Набора при определения уровня анти-гриппозных антител в сыворотках больной и вакцинированной вирусом гриппа А птицы.

1.4. Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволили разработать инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-гриппазных антител в сыворотках крови кур.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья кур, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Обшая характеристика семейства ортомиксовирусов.

Вирусы гриппа принадлежат семейству Orthomyxoviridae [62]. Это семейство включает в себя четыре рода: род Influenzavirus, к которому относят вирус гриппа типа А, род Influenzavirus, к которому относят вирус гриппа типа В, род Influenzavirus, к которому относят вирус гриппа типа С, и род Thogotovirus. Такая классификация вирусов гриппа получила свое применение с 1990-х годов при участии Международного Комитета Таксономии Вирусов [150].

Вирионы ортомиксовирусов имеют липидосодержащие наружные оболочки, на которых расположены большие поверхностные выступы («шипы»). Вирусные оболочки окружают спиральный нуклеокапсид, имеющий диаметр от 9 до 15 нм. Характер укладки нуклеокапсида в вирионе неизвестен. Геном ортомиксовирусов состоит из восьми молекул одноцепочечной негативной РНК и имеет суммарную молекулярную массу 5 - 106 Да [175]. Все вирусы семейства имеют от семи до десяти главных полипептидов. Вирусы обладают гемагглютинирующей активностью, обусловленной наличием гликопротеинового комплекса поверхностных «шипов». Репродукция ортомиксовирусов происходит в ядре и в цитоплазме, а сборка включает этап отпочковывания от плазматической мембраны. При смешанном заражении вирусы этого семейства могут обмениваться сегментами генома. Это явление получило название реассортации сегментов или рекомбинации вирусов гриппа.

Обнаружено, что ортомиксовирусы распространены в природе чрезвычайно широко, как в плане географическом, так и в плане круга хозяев вируса. Важность вирусов, входящих в это семейство настолько велика для гуманитарной (грипп занимает третье место по наносимому ущербу [109]) и ветеринарной медицины, а сами вирусы настолько интересны своей антигенной и генетической структурой, что вирус гриппа стал одной из наиболее часто встречающихся моделей в исследованиях по иммунологии, молекулярной биологии и генетике. Следствием такого внимания к ортомиксовирусам стал огромный по объему и значению поток информации по различным аспектам их биологии [20, 25, 62, 229]. Однако, подавляющее большинство получаемых данных и в настоящее время относится к вирусам гриппа человека. Это естественно, учитывая его уникальную роль в патологии человека, но существенно затрудняет понимание общих закономерностей, свойственных природе вирусов гриппа в целом. Только в последнее десятилетие сформировалось понимание тех фактов, что циркуляция вирусов гриппа в природе - это целостный процесс, в который вовлечены вирусы гриппа целого ряда видов животных и человека; что генетический обмен между штаммами вирусов гриппа [29, 30], поражающих разные виды хозяев, - это не экзотика, а каждодневная реальность; что очаги и пути распространения эпидемически и эпизоотически опасных штаммов и вариантов нельзя выявить, изучая только вирус гриппа человека, равно как только вирус гриппа любого другого вида животных.

Всех хозяев вируса гриппа можно условно разделить на три группы в первую - попадают животные - эндемики, во вторую - животные, кочующие в естественных условиях пли перемещаемые человеком, в третью -самую интересную - сам человек, птицы, в первую очередь перелетные и домашние, и, в меньшей степени, морские сезонно мигрирующие млекопитающие. Важностью последней группы и обусловлен выбор объекта исследований -вируса гриппа птиц - в настоящей работе.

Многочисленные исследования свидетельствуют о необычайной способности вируса изменять антигенную структуру и биологические свойства своих поверхностных гликопротеидов в процессе циркуляции [18, 24, 151, 203, 201, 214]. Изменчивость приводит к формированию и постоянной замене антигенных детерминант поверхностных антигенов другими, что обеспечивает гетерогенность возбудителей, и, вероятно, основной механизм противодействия популяционному иммунитету. В результате качественных изменений гемагглютинина (НА) и нейраминидазы {NA} возникают новые подтипы вируса гриппа, обусловливающие возникновение пандемий, эпизоотии гриппа. Каждая новая пандемия или эпизоотия вызывается возбудителем, антигенная структура которого в той или иной степени отличается от структуры возбудителя предыдущей вспышки гриппа [50].

Характерной чертой современных эпизоотий гриппа является возможность одновременной циркуляции на протяжении одного и того же периода в одном и том же ареале хозяина нескольких вариантов вируса гриппа, различающихся по антигенной специфичности гликопротеидов.

2.1.1. Грипп А

Вирус гриппа типа А, вызывающий заболевание человека, свиней, лошадей и птиц, представлен рядом типов. Типы включают в себя антигенные варианты, которые различаются по составу поверхностных гликопротеидов - НА и NA. В настоящее время различают 14 подтипов вируса гриппа по гемагглютинину и 9 noNA [142, 143, 155, 189, 213].

Характерной чертой морфологии ортомиксовирусов является их гетерогенность - неоднородность размеров и форм вирионов. Свежевыделенные штаммы вируса гриппа, как правило, имеют нитевидную (филаментозную) форму. Эти частицы часто изогнуты, имеют диаметр 70-80 нм и длину 200-300 нм, могут значительно превышать по длине размеры сферических частиц. В результате повторных пассажей вирус гриппа приобретает однородность и содержит в основном сферические и овальные формы частиц диаметром от 80 до 120 нм.

Структура вирионов вируса гриппа в настоящее время достаточно подробно изучена и обобщена во многих литературных обзорах [20, 36, 37, 42, 67, 83, 93, 128, 133, 157, 206, 216].

Структурными компонентами вируса гриппа являются одноцепочечная фрагментированная РНК (0,8-1,1 %), белки (70-75 %), липиды {20-24 %) и углеводы (5-8 %}.

Вирус гриппа представлен нуклеокапспидом со спиральным типом симметрии и наружной оболочкой, имеющей сложную пространственную организацию [201,229].

Поверхностный слой вириона вируса гриппа образован множеством пепломеров, представляющих собой экстрамембранные части гликопротеидов - НА и NA. Внутримембранные части этих двух белков и липидный бислой, происходящий из плазмалеммы клеток-хозяев, образуют мембрану вириона. Непосредственно к ее внутренней поверхности примыкает слой, образованный М-белком, находящимся в непосредственном контакте с С- и N-концевыми фрагментами гликопротеидов. Таким образом, вирусная оболочка сформирована тремя белками и липидным бислоем. Сердцевина вириона представлена нуклеокапсидом, образованным спиралью рибонуклеопротеида, состоящего из фрагментированной вирионной РНК, и нуклеопротеинов.

Функциональная роль компонентов вириона, в общих чертах, известна. Мембранная оболочка определяет форму и целостность вириона, обеспечивает защиту вирионного рибонуклеопротеидного комплекса от воздействий внешней среды.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Хашин, Олег Валентинович

6. Выводы

6.1. Отработаны условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГП-1-А (утка/Альберт/15/76) (H1N1) и ГП-9-А (индюк/Висконсин/1/66) (H9N2) в первично трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов. Вирус (H1N1) имел большую ГА-активность по сравнению с (H9N2) и был равен 1:64 и 1:32, соответственно. К 5 пассажу титр ГА-активности увеличивался до 1:4096-1:8192. Титры инфекционности были равны 7 lg ЭИД50/мл и 7-8 lg ЭИД50/МЛ.

6.2. Разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса гриппа А, включающий осаждение ПЭГ М-6000 7,5%, высокоскоростное и градиентное центрифугирование, который позволил получить препараты с титром инфекционности выше, чем в исходной суспензии на 1,6-2,0 lg ЭИД50/мЛ- Очистка вируса от балластных белков достигла 98-99%.

6.3. Получена панель к 13 сероподтипам вируса гриппа A: (H1N1), (H2N3), (H3N8), (H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N2), (H11N6), (H12N5) и (H13N2). Сыворотки к гомологичным антигенам имели титр в РТГА от 1:128 до 1:2084, с гетерологичными от 1:4 до 1:32.

6.4. Разработаны компоненты набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в иммуноферментном анализе, определены условия постановки реакции, доказана воспроизводимость, чуствительность и специфичность разработанных реагентов для постановки ИФА.

6.5. Определен коэффицент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени адсорбции положительной и нормальной сывороток для оценки внутри- и межпланшетной воспроизводимости. Среди лунок кэффицент вариации составил 3-6%, для адсорбции специфических антител на планшетах - 4%, между отдельными планшетами - менее 4%.

6.6. Установлена при определении чуствительности метода полная корреляция между Iog2 разбавлением сыворотки и Iog2 показателем отношения адсорбции образца к позитиву (коффециент корреляции г =98). ИФА способен обнаружить специфические антитела к вирусу гриппа птиц в 5-7 разведениях антигриппозной сыворотки. РТГА выявляла специфические антитела только в первых трех разведениях.

6.7. При сравнительной оценке методов ИФА и РТГА для определения уровня антител в сыворотке было установлено, что 60% цыплят давали положительную реакцию в ИФА через 2 недели после заражения вирусом гриппа, через 5 недель после заражения - 90%, результаты в РТГА в этот период были негативными. Ответ в ИФА увеличивался на бустер - инъекцию к 25 неделе, к этому сроку результаты в РТГА были положительны на 100%. Это свидетельствует о воз-можности выявления антигрипозных антител на ранних стадиях заражения с помощью набора ИФА.

7. Практическая значимость

На основе проведенной работы представлен проект нормативной документации:

Временная инструкция по изготовлению и контролю набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе» утверждена директором ВНИТИБП (25.06.04).

Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе»,

Проект «Временного наставления по применению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе»,

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хашин, Олег Валентинович, 2004 год

1. Баречкова Е . , Любовцева О.Е., Русс Г., Стик Б., Закстельская Л. Я., Яхно М.А // Анализ нейраминидазы вируса гриппа с помощью лектинового теста и моноклональных антител /.//Acta virol.- Vol. 30, №4.-P. 281-288.(1)

2. Варич Н.Л. // Механизм синтеза РНК вируса гриппа. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1989,4: 3-13. (2)

3. Вебстер Р., Лейвер В., Эйр Г. // Антигенные вариации // Генетика вирусов гриппа. М., 1986,- С.123-160. (18)

4. Вебстер Р.Г, Лейвер В.Г. // Антигенная изменчивость вируса гриппа // Вирусы гриппа и грипп / Под ред. Е.Д. Килбурна 1978.- С.309-354. (17)

5. Гендон Ю. 3. // Молекулярные основы изменчивости эпидемических штаммов вируса гриппа человека // Молекул, генет., микроби-ол. и вирусол. 1985,- №8,- С.3-12. (24)

6. Голубев Д.Б. // Происхождение пандемических штаммов вируса гриппа А // Вопр. вирусол. 1932.- №3. - С. 130-135. (29)

7. Голубев Д.Б., Константинов В.К. // Современные аспекты учения об антигенной изменчивости вируса гриппа // Актуальные проблемы иммунологии, вирусологии, химиотерапии и эпидемиологии инфекционных заболеваний. -Л.,1373,- С.140-144. (33)

8. Голубев Д.Б., Константинов В.К., Парамонова М.С. // Биологические и молекулярные аспекты антигенной изменчивости вируса гриппа // Этиология, эпидемиология, лечение и профилактика гриппа и других респираторных инфекций.- Л., 1978.- С.5-13. (32)

9. Голубев Д.Б., Медведева М.Н. // Экспериментальное моделирование антигенной изменчивости вируса гриппа при персистенции // Профилактика и лечение гриппа. Л., 1976,- С.38-49. (31)

10. Голубев Д.Е. // Происхождение пандемических и эпидемических штаммов вируса гриппа // Обзорная информация. Медицина и здравоохранение. Серия: эпидемиология, вирусология и инфекционные заболеваний.- ВНИИМИ, 1985. Вып.1.- 70с. (30)

11. Гринбаум Е.Б. // Изучение иммунологических взаимоотношений нейраминидаз различных штаммов вируса гриппа А // Проблемы гриппа и острых респираторных заболеваний. Л.,1973.- №3 . -С.84-89. (35)

12. Гурачевская Л.П. // Достижения науки в изучении структуры вируса гриппа // Научно-технический прогресс и медико-биологические аспекты охраны окружающей среды, рациональное использование природных ресурсов,- Душанбе, 1983.- С.25-27. (37)

13. Дубова Е.А. , Саятов М.Х., Ямникова С. С. // Изучение антигенного дрейфа вирусов гриппа различного происхождения с использованием

14. Жансеитова М.Т. // Изоляция и изучение свойств вирусов гриппа А, ассоцниорованных с дикими птицами и членистоногими . // Авто-реф.дисс. канд . мед . наук : 03.00.06,- Алма-Ата.: 1983 .- 23с. (40)

15. Жданов В.М. // Проблемы гриппа и генная инженерия // Молекул, генетика, микробиол. и вирусология.- 1984,- N-7 . С. 3-6. (41)

16. Жилинская И.Н.//Структура вируса гриппа //Успехи современной биологии. 1983.- Т.95, №3. - с.с. 373-382. (42)

17. Жирнов О.П. // Аномальные изоэлектрические свойства матриксного белка Ml вирусов гриппа. // Вопросы вирусологии, 1991, 36(3): 191194. (7)

18. Жирнов О.П. // Белки вируса гриппа: получение растворимого полипептида Ml посредством поэтапной депротеинизации вирионов. // Молекулярная биология, 1991, 25: 375-379. (6)

19. Жуматов К. X. и др. Докл. АН Респ. Казахстан, 1992, 4,4 :48.(1)

20. Жуматов К.Х. // Антигенная композиция гемагглютининов вирусов гриппа // Биология вирусов гриппа. Тр. инст. микр. и ви-русол. АН КазССР.- 1987.- Т. 32.- С. 74-90. (43)

21. Закстельская JI. Я. // Некоторые методологические особенности изучения роли птиц в экологии вирусов гриппа //Экология вирусов, связанных с птицами. Минск, 1374.- С. 12-13. (45)

22. Закстельская Л. Я., Исаченко В. А., Оскерко Т. А., Шендеро-вич С.Ф. // Изменения в антигенной композиции гемагглютинина вирусов гриппа A (H1N1) в 1977-1982гг, выявленные с помощью моноклональных антител //Вопр. вирусол.- 1934.-Т.29,№.1.- С. 62-66. (49)

23. Закстельская Л. Я., Яхно М.А., Исаченко В.А., Антонов И.В. // Изменчивость вирусов гриппа А и ее значение в эпидемическом процессе // Актуальные вопросы общей и медицинской вирусологии.-М., 1986.-С. 104-1 15.(50)

24. Закстельская Л.Я., Молибог Е.В., Хлюстов С.В., Исаченко В. А. // Штаммовые различия в специфичности нейраминидазы подтипа N1. // Вопр. вирусол. 1977,- N-6. - С. 67 9-682. (135)

25. Иванова В.Т., Закстельская Л.Я., Трушинская Г.Н., Шендерович С.Ф., Любовцева О.В. // Использование агарозы для изоляции белков вируса гриппа, сохранивших высокую иммуногенность. // Вопр. Вирусологии, 1983,4: 32-34. (13)

26. Исаева Е.И., Белкина Т.С., Ровнова З.И. // Антигенное маркеры в гемагглютининах вирусов гриппа типа A(H1N1) различных периодов циркуляции // Вопр. вирусол.- 1983.- №6.- С.702-706. (56)

27. Исаева Е.И., Ровнова З.И., Полякова Т.Г., Подчерняева Г.Я. // Новые сайты в составе гемагглютининов эпидемических вариантов вируса гриппа A(H3N2) 1989-1990гг. //Вопр. вирусол.-1991.-N5.- С.368-371. (88)

28. Исаева Е.М., Иванова В.Т., Ровнова З.И. // Картирование сайтов гемагглютинина вирусов гриппа H3N2 1990-1993гг выделения // Вопр. вирусол. 1994. - №2. - С,62-65. (68)

29. Исаева Е.С., Чувакова З.К., Березин В.Э. // Гликопротеиды ортомиксовирусов. Алма-Ата, 1988,- С.1-168. (62)

30. Исмайлова И.М. // Антигенный состав гемагглютининов вируса гриппа типа А2 H2N2. // Дисс. канд. мед. наук.03.00.06.-М. ,1984.-170с. (64)

31. Каверин Н.В., Варич Н.Л., Склянская Е.И. // Молекулярные механизмы смешанной гетеротипической гриппозной инфекции. // Сборник "Молекулярная биология вирусов", 1985, стр. 20-27. (14)

32. Карпухин Г.И. // Грипп.- // Л.«Медицина,1986.- 346с. (67)

33. Карпухин Г.И. // Грипп: (Руководство) Л.Медицина,1986.- 352с.:ил. (36)

34. Килбурн Э.Д., Шоппин П.В., Компанс Р.В. // Вирусы гриппа и грипп // Под ред. Э.Д. Килбурна; Пер. с англ. И.Г.Харитоненкова и др.; Под ред. Д.К.Львова.- М.:Медици-на,1978.- 585с.:ил. (20)

35. Кингсбери Д.У. // Генетика вирусов гриппа: // Пер. с англ. Под ред.П.Пейлиза,.- М.:Медицина,1986.- 336 с.:ил. (25)

36. Косяков П.Н., Панкратов B.C., Ровнова З.И. // Антигены гемагглютинина вирусов гриппа, выделенных от человека и птиц // Вопр. вирусол.- 1979,- №3.- С.242-246. (74)

37. Кущ А.А., Цой Л.А., Исаева Е.П. // Изучение гибридом, продуцирующих моноклинальные антитела к вирусам гриппа // Вопр.вирусол.- 1985.- №1,- С.22-24. (53)

38. Лашкевич В.А. // Использование моноклональных антител в вирусологии // Вопр.вирусол.- 1983,- №5,- С.648-655. (77)

39. Лузянина Т. Я . , Голубев Д . Е ., Иванова Н.А. // Антигенный профиль нейраминидазы вирусов гриппа А, выделенных в 1957-73гг // Acta virologica-1974.-Т. 18,Вып.6.-G 479485. (8)

40. Львов Д.К., Подчерняева Р.Я., Вебстер Р. // Получение рекомбинантов, антигенно идентичных циркулирующим в природе штаммам вируса гриппа // Вопр. вирусол.- 1979.- №5.-С.493-497. (102)

41. Маркушин С.Г. // Актуальные вопросы молекулярной генетики вируса гриппа А // Молекул, генетика, микробиол. и вирусология.-1984.- №8.- С.3-12. (82)44