Разработка молекулярно-генетических подходов для оптимизации промышленно-важных характеристик фитазы Citrobacter freundii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Гордеева, Татьяна Леонидовна

• Гордеева, Татьяна Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гордеева, Татьяна Леонидовна

I ВВЕДЕНИЕ.

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 ЗНАЧЕНИЕ ФИТАЗ ДЛЯ КОРМОПРОИЗВОДСТВА.

2 КЛАССИФИКАЦИЯ И СВОЙСТВА ФИТАЗ.

2.1 Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз.

2.1.1 Грибные фитазы.

2.1.2 Бактериальные фитазы.

2.2 Фитазы семейства пирофосфотаз ф-пропеллерных фитаз).

2.3 Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз.

3 ПРОМЫШЛЕННО ВАЖНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФИТАЗ.

4 ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ ФЕРМЕНТОВ С УЛУЧШЕННЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ

4.1 Принципы рационального конструирования белков.

4.2 Принципы «направленной эволюции».

4.3 Принципы «полурационалыюго» конструирования белков.

5 ЭКСПРЕССИЯ ФИТАЗ В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ.

5.1 Экспрессия фитаз в бактериях.

5.2 Экспрессия фитаз в грибах.

5.3 Экспрессия фитаз в дрожжах.

6 МЕТОДЫ СИНТЕЗА ГЕНОВ.

III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1 Среды и условия культивирования.

2 Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды.

3 Манипуляции с ДНК.

4 Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз.

5 "Errore-prone" ПЦР, конструирование библиотеки мутантных генов.

6 Отбор фитаз с повышенной термостабильностью.

7 Сайт-направленный и сайт-направленный насыщающий мутагенез.

8 Мутагенез областей K29-G74 и Q104-Q131, конструирование библиотеки мутантных генов.

9 Метод синтеза генаphyA-Cfmod из олигонуклеотидов.

10 Определение фитазной активности.

11 Определение свойств фитаз.

12 Анализ аминокислотных последовательностей и мутаций.

IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1 ПРИМЕНЕНИЕ СТРАТЕГИИ СЛУЧАЙНОГО МУТАГЕНЕЗА ЦЕЛОЙ ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНОВ ФИТАЗ С. FREUNDIIС ПОВЫШЕННОЙ

ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬЮ.

1.1 Получение генов, кодирующих фитазы C.freimdii с повышенной термостабильностью, методом "error-prone" ПЦР.

1.1.1 Выбор объекта для мутагенеза.

1.1.2 Разработка окспрессионной системы и выбор реципиента.

1.1.3 Проведение мутагенеза методом "error-prone "ПЦР.

1.1.4 Разработка метода отбора фитаз с повышенной термостабильностью.

1.1.5 Отбор фитазы с повышенной термостабильностью.

1.1.6 Оценка эффективности метода.

1.2. Оценка возможности применения метода ДНК-"шаффлинга" для создания генов фитаз C.freundii с повышенной термостабильностью.

2. ПРИМЕНЕНИЕ СТРАТЕГИИ СФОКУСИРОВАННОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГЕНОВ ФИТАЗ С ПОВЫШЕННОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬЮ И ВЫСОКОЙ УДЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

2.1 Выбор реципиента и системы экспрессии.

2.1.1 Выбор реципиента.

2.1.2 Получениерекомбинантных плазмид рРЮ-С и рРЮ-0 и штаммов на их основе.

2.2 Разработка полурационального подхода для получения генов термостабильных фитаз.

2 2.1. Получение, клонирование, экспрессия генов phyA-CMl и phyA-OMl.

2.2.2 Определение свойств фитаз PlxyA-CfMl и PhyA-OpMl.

2.2.2.1 Определение молекулярной массы.

2.2.2.2 Сравнение термостабильности.

2.2.2.3 Оценка удельной активности.

2.2.3 Получение, клонирование и экспрессия генаphyA-Cl.

2.3 Получение генов, кодирующих термостабильные фитазы с увеличенной удельной активностью.

2.3.1 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности phyA-CMl.

2.3.2 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности phyA-Cl.

2.3.2.1 Выбор мутаций с помощью программы I-Mutant 2.0.

2.3.2.2 Получение, клонирование и экспрессия геновphyA-C(2-6).

3. РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОГО ПОДХОДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО МУТАНТНЫЙ ВАРИАНТ ФИТАЗЫ С ОПТИМИЗИРОВАННЫМИ СВОЙСТВАМИ.

3.1 Разработка подхода и теоретическое обоснование его эффективности.

3.2 Получение генаphyA-СМЗ в результате применения разработанного подхода.

3.3 Анализ аминокислотных замен.

4. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФИТАЗЫ PHYA-CFM3.

4.1 Анализ термостабильности.

4.2 Определение молекулярной массы и удельной активности.

4.3 Определение оптимальной рабочей температуры и рН профиля.

4.4 Влияние гликозилирования и рН на термостабильность и фитазную активность.

4.5 Определение кинетических характеристик.

4.6 Оценка кормовых качеств фитазы PhyA-CfM3.

5. ЭФФЕКТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА PHYA-CM3MOD В ДРОЖЖАХ Р. PASTORIS.

5.1. Разработка синтетической последовательности гена phyA-Cmod.

5.2 Разработка метода синтеза гена phyA-Cmod.

5.3 Влияние оптимизации кодонов на эффективность экспрессии гена phyA-Cmod.

5.4 Получение штамма Р. pastoris с повышенной экспрессией гена phyA-CM3mod.

5.4 Сравнение фитазных активностей КЖ лучших штаммов после прогрева.

V ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка молекулярно-генетических подходов для оптимизации промышленно-важных характеристик фитазы Citrobacter freundii»

Актуальность темы

В последнее время для улучшения питательных свойств растительных кормов широко применяются ферменты — фитазы микробного происхождения, катализирующие гидролиз фитатов с отщеплением неорганического фосфата.

Фитаты (мио-инозитол гексакисфосфаты), в виде которых растения запасают фосфор, практически не усваиваются организмом животных с однокамерным желудком и домашней птицей [1]. Значительная доля неусвоенного фосфора выводится с экскрементами из организма и загрязняет окружающую среду [2]. Кроме того, фитаты являются хелатирующими агентами и способны образовывать комплексы с дивалентными катионами, а также с белками [3]. Фитазы - ценные пищевые добавки. Введение их в растительные корма повышает усвоение фосфора, кальция, микроэлементов, белков и аминокислот желудочно-кишечным трактом животных [4].

Дефицит и высокая стоимость рыбной муки (в качестве источника фосфора) привели к тому, что всё чаще при выращивании животных и птицы стали использовать рационы растительного типа (зерно, семена масличных культур, бобовые). Таким образом, возникает повышенная потребность кормопроизводства в пищевых добавках, содержащих фитазы.

Для практического использования фитазы должны обладать следующими характеристиками:

1. быть устойчивыми к кратковременному (5-10 мин.) действию высоких температур (70°С - 80°С) в ходе гранулирования комбикормов;

2. обладать высокой удельной активностью;

3. способностью работать в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта (температурный оптимум около 42°С, рабочий профиль в интервале рН 3-5);

4. способностью выдерживать действие среды желудка животных (стабильность при низких значениях рН 1,5-2,5 и устойчивость к протеолитическим ферментам).

Все известные фитазы имеют разные характеристики, причем у каждого фермента есть свои преимущества и недостатки. Недостатком бактериальных фитаз, принадлежащих к семейству кислых гистидиновых фосфатаз, является их низкая термостабильность. Однако, они весьма перспективны из-за высокой удельной активности, устойчивости к протеолитическим ферментам, способности работать в кислых условиях и выдерживать низкие значения рН.

Известны различные молекулярно-генетические подходы, позволяющие значительно повысить термостабильность белков [5, 6]. Однако они не всегда могут быть применимы к исследуемым ферментам, а так же имеют ряд недостатков. Так, увеличение термостабильности часто влечёт за собой смещение температурного оптимума фермента и значительное уменьшение его удельной активности. Таким образом, разработка молекулярно-генетических подходов для получения мутантных генов, кодирующих фитазы с оптимизированными промышленными характеристиками, является актуальной задачей. Кроме того, на Российском рынке препараты фитаз представлены только зарубежными производителями, поэтому получение отечественных конкурентно-способных ферментов также актуально.

Цели и задачи работы

Целью данной работы явилась разработка молекулярно-генетического подхода к конструированию мутантного гена, кодирующего фитазу с повышенной термостабильностью, высокой удельной активностью и неизменённым температурным оптимумом, а так же его эффективная экспрессия в системе, пригодной для промышленности.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Оценить эффективность различных молекулярно-генетических подходов с целью получения мутантных генов бактериальных фитаз с повышенной термостабильностью.

2. Разработать наиболее эффективный молекулярно-генетический подход и на его основе сконструировать, клонировать и экспрессировать мутантный ген фитазы с оптимизированными свойствами.

3. Охарактеризовать свойства полученного мутантного варианта фитазы с оптимизированными свойствами.

4. Показать возможность эффективной экспрессии сконструированного мутантного гена и оценить потенциальную возможность применения полученной на его основе фитазы в кормопроизводстве.

Научная новизна

Методами сайт-направленного мутагенеза и "error-prone" ПЦР были получены, различные мутантные гены, кодирующие фитазы с повышенной термостабильностью. Разработана система для клонирования, экспрессии и отбора мутантных генов. Показано, что некоторые аминокислотные замены в консервативных областях фитазы АррА Е. coli, приводящие к увеличению её термостабильности, аналогичным образом влияют на термостабильность фитаз Citrobacter freundii и Obesumbacterium proteus, несмотря на низкую аминокислотную гомологию. Впервые были получены мутантные фитазы остаточные фитазные активности которых (после 10 минутного прогрева при 80°С) составили 45% и 60%, соответственно. Таким образом, термостабильность мутантных фитаз при указанных условиях возросла в 15 и 10 раз, соответственно.

Для получения мутантных генов фитаз с повышенной термостабильностью был разработан полурациональный подход, основанный на сфокусированном мутагенезе. В нём впервые в качестве сайтов-мишеней для проведения случайного мутагенеза были предложены области (аминокислотной последовательности) с высокой консервативностью. Так, в результате случайного мутагенеза областей гена, соответствующих аминокислотным участкам K29-G74 и Q104-Q131, методом "error-prone" ПЦР был получен мутантный ген, кодирующий оптимизированную по свойствам фитазу. После 10 минутного прогрева при 70°С и 80°С остаточная фитазная активность которой составила 50% и 35%, соответственно. Таким образом, термостабильность при указанных условиях возросла в 5 и 11 раз, соответственно. Удельная активность уменьшилась незначительно и составила 2215 ед/мг белка. Температурный оптимум полученного фермента не сместился, а эффективность работы при 40°С увеличилась на 20%.

Для увеличения экспрессии гена оптимизированной фитазы в дрожжах P. pastoris была разработана синтетическая нуклеотидная последовательность (депонирована в ГенБанк) с учётом правила оптимальности кодонов, а таюке предложен усовершенствованный ПЦР-метод для её синтеза. Ген фитазы с оптимизированной нуклеотидной последовательностью был синтезирован, трансформирован в клетки P. pastoris и отобран клон с активностью 650 ед/мл (при культивировании в лабораторных условиях), что показывает 50%-ое < увеличение продуктивности* полученного штамма.

Практическая значимость

Разработанный молекулярно-генетический подход, основанный на сфокусированном случайном мутагенезе высоко-консервативных областей, может быть полезен для получения новых мутантных генов фитаз с повышенной термостабильностью.

Предложенный ПЦР-метод для синтеза ДНК последовательностей из олигонуклеотидов является простым и удобным инструментарием для генетической инженерии.

В ходе работы были обнаружены высокие показатели кормовых качеств фитазы PhyA-Cf, а также схожесть её свойств с мутантной термостабильной фитазой PhyA-CfM3, что даёт возможность перспективно использовать последнюю в процессе приготовления комбикормов при повышенных температурах.

Для продукции промышленных ферментов необходимо создание высокоэффективных продуцентов. В данной работе показана возможность эффективной экспрессии полученного мутантного гена термостабильной фитазы PhyA-CfM3 в широко используемых в промышленности дрожжах P. pas tor is.

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Гордеева, Татьяна Леонидовна

V выводы

1. Обнаружены одинаковые аминокислотные мутации, приводящие к увеличению термостабильности фитаз из одного и того же семейства, несмотря на низкую аминокислотную гомологию.

2. Предложены области для проведения сфокусированного случайного мутагенеза с целью эффективного получения генов фитаз с повышенной термостабильностью.

3. Получен, клонирован и экспрессирован мутантный вариант гена фитазы С. /геипсШ с оптимизированными характеристиками

4. Охарактеризован мутантный вариант фитазы С. /геипсШ с оптимизированными промышленно-важными свойствами.

5. Разработан усовершенствованный ПЦР метод, которым синтезировали новый синтетический ген термостабильной фитазы для эффективной экспрессии в дрожжах Р. раБ^пБ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гордеева, Татьяна Леонидовна, 2010 год

1. Bitar К., Reinhold J.G. Phytase and alkaline phosphatase activities in intestinal mucosae of rat, chicken, calf, and man. Biochim Biophys Acta, 1972. 268: p. 442-452.

2. Harland B.F., Morris E.R. Phytate: A good or bad food component? Nutr Res, 1995.15: p. 73-75.

3. Boling-Frankenbach S.D., Douglas M.W., Snow J.L., Parsons C.M., Baker D.H. Efficacy of phytase for increasing protein efficiency ratio values of feed ingredients. Poult Sci, 2001. 80(11): p. 1578-84.

4. Nielsen P.H., Wenzel H. Environmental Assessment of Ronozyme® P5000 CTPhytase as an Alternative to Inorganic Phosphate Supplementation to Pig Feed Used in Intensive Pig Production. Int J LCA, 2006. 7: p. 1-7.

5. Eijsink V.G.H, Gaseidnes S, Borchert T.V, van den Burg B. Directed evolution of enzyme stability. Biomolecular Engineering, 2005. 22: p. 21-30.

6. Телишевская JI.Я, Комаров А.А, Болденко Ю.В., Ферментные препараты в кормопроизводстве. Вестник биотехнологии и физико- ~ химической биологии имени Ю.А. Овчинникова, 2005. Т. 1, № 2 стр.63-65.

7. Raboy V, Gerbasi P. Genetics of myo-inositol phosphate synthesis and accumulation. Subcell Biochem, 1996. 26: p. 257-85.

8. Biswas B.B., Ghosh B, Majumder A.L. Myo-inositol polyphosphates and their role in cellular metabolism. A proposed cycle involving glucose-6-phosphate and myo-inositol phosphates. Subcell Biochem, 1984. 10: p. 23780.

9. Reddy N.R, Sathe S, Salunkhe D.K. Phytates in legumes and cereals. Adv Food Res, 1982. 28: p. 1-92.

10. Sandberg A.S, Andersson H. Effect of dietary phytase on the digestion of phytate in the stomach and small intestine of humans. J Nutr, 1988. 118(4): p. 469-473.

11. He Z, Griffin T.S., Honeycutt C.W. Enzymatic hydrolysis of organic phosphorus in swine manure and soil. J Environ Qual, 2004. 33(1): p. 367-72.14.