Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретического определения катехоламинов и полифенолов с электрохимическим детектированием в микрочипе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат наук Николаев, Андрей Валерьевич

• Николаев, Андрей Валерьевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Николаев, Андрей Валерьевич

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные направления в создании микрофлюидных устройств

1.2. Принципы создания микрофлюидных чипов для капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием

1.3. Основные варианты капиллярного электрофореза

1.4. Материалы и техника изготовления микрофлюидных аналитических систем

1.4.1. Стеклянные микрочипы для капиллярного электрофореза

1.4.2. Полимерные чипы для капиллярного электрофореза

1.4.3. Обработка полимерных матриц

1.5. Микрочипы на основе полидиметилсилоксана

1.5.1. Герметизация ПДМС-чипов

1.5.2. Физическо-химические характеристики поверхности ПДМС

1.5.3. Модификация поверхности ПДМС

1.5.3.1. Модификация поверхности ПДМС в газовой фазе

1.5.3.2. Модификация поверхности ПДМС в жидкой фазе

1.6. Электрохимическое детектирование в капиллярном электрофорезе на чипах

1.6.1. Конфигурации электрохимической ячейки

1.6.1.1. «Епс1-скагте1 »-детектирование

1.6.1.2. «1п-сИаппе1 »-детектирование

1.6.1.3. «ОДГ-скаппе1»-детектирование

1.6.1.4. Двухэлектродное амперометрическое детектирование

1.6.2 Сочетание амперометрического детектирования с другими способами детектирования

1.6.2. ¡.Сочетание амперометрического детектирования с электрохемшюминисцентным

I.6.2.2. Амперометрическое/флуоресцентное детектирование

1.6.3. Материалы для изготовления электродов

1.6.4. Варианты электрохимического детектирования в КЭ на чипах

1.7. Примеры использования микрофлюидных чип-анализаторов с ЭХ детектированием

1.7.1. Биологический и клинический анализ

1.7.2. Анализ объектов окружающей среды

1.7.3. Анализ пищевых продуктов

II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

И.1. Оборудование

II. 1.1. Микрофлюидный чип-анализатор

И. 1.2. Аппаратура для изготовления чипов

И. 1.3. Аналитическое оборудование

II. 1.4. Вспомогательное оборудование

П.2. Реактивы

П.З Подготовка чипа, аналитического оборудования, рабочих растворов

электролитов к анализу

П.3.1 Изготовление чипа

П.З. 1.1. Подготовка кремниевой матрицы

П.З. 1.2. Изготовление золотых электродов на стеклянной подложке

микрочипа

П.З. 1.3. Создание реплик (формовка)

П.3.2. Обработка поверхности каналов чипа

П. 3.2.1. Обработка плазмой

II. 3.2.2. Динамическая модификация поверхности канала

II.3.3. Ввод пробы в сепарационный канал микрочипа

И. 3.4. Изучение движения жидкости в канале с использованием

флуоресцеина

Н.3.5. Гальваническая модификация поверхности электродов чипа

П.3.6. Подготовка кварцевого капилляра к работе ("Капель 105", КЗЭ)

П.3.7. Приготовление подвижных фаз и буферных электролитов

II. 3.7.1. Приготовление воротного буферного электролита для анализов (КЗЭ)

11.3.7.2. Приготовление ацетатного буферного электролита (рН 4.0) (КЗЭ)

11.3.7.3. Приготовление буферного электролита (МЭКХ)

П.3.8. Подготовка стандартных растворов к анализу

П.3.9. Пробоподготовка реальных объектов к электрофоретическому и

хроматографическому анализу

И.ЗЛО. Определение полифенолов методом ОФ ВЭЖХ с

электрохимическим детектированием

IL3.11. Определение полифенолов в различных режимах капиллярного

электрофореза

П.3.12. Определение нейротрансмиттеров методом капиллярного зонного

электрофореза с УФ-детектированием

П.3.13. Определение катехоламинов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием

III. ПОДГОТОВКА ЧИП-АНАЛИЗАТОРА И ОПТИМИЗАЦИЯ ЕГО РАБОЧИХ ПАРАМЕТРОВ

IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗРАБОТАННОГО МИКРОФЛЮИДНОГО ЧИП-АНАЛИЗАТОРА С ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ

V. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПОЛИФЕНОЛЬНОГО ТИПА В РАЗЛИЧНЫХ

РЕЖИМАХ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка микрофлюидной аналитической системы для электрофоретического определения катехоламинов и полифенолов с электрохимическим детектированием в микрочипе»

ВВЕДЕНИЕ

Масштабы исследований и разработок, посвященных микрофлюидным аналитическим системам (МФАС), активно растут. Объединив все стадии химического анализа (ввод пробы, дериватизацию, разделение и детектирование) на миниатюрной платформе, в 1990 г. швейцарские ученые А. Манц и Г. Видмер предложили концепцию «лаборатории-на-чипе» [1], которая впоследствии получила широкое развитие во многих странах мира (Китай, Франция, Испания, США, Япония). Сегодня этому направлению посвящены сотни публикаций в ведущих научных журналах [2-4], многочисленные международные конференции; издаются монографии.

Одним из первых методов анализа, переведенных в микроформат, стал капиллярный электрофорез (КЭ), и до сих пор это направление считается наиболее перспективным [5, 6]. Причина заключается в том, что КЭ на чипах присущи высокая скорость разделения и введения образца; малый расход реагентов, простота в оформлении и возможность проведения большого количества параллельных определений.

Традиционные варианты детектирования в капиллярном электрофорезе на микрочипах - ультрафиолетовое (УФ), флуориметрическое, масс-спектрометрическое и электрохимическое (ЭХ). Наше внимание сконцентрировано на последнем, характеризующемся высокой чувствительностью, простотой реализации и сравнительно низкой стоимостью.

Капиллярный электрофорез в чип-формате с электрохимическим детектированием получил достаточно широкое распространение за рубежом, однако в нашей стране практически не изучен, и в настоящее время отечественных микрофлюидных систем КЭ с ЭХ-детектированием нет.

В качестве интересных и информативных моделей для исследования новых вариантов капиллярного электрофореза можно использовать биогенные амины и природные антиоксиданты.

Биогенные амины (дофамин, норадреналин, адреналин) -диагностические маркеры различных заболеваний сердечно-сосудистой и центральной нервной систем.

Определению антиоксидантов в пищевых продуктах, БАДах, биологических жидкостях в последние годы уделяется огромное внимание, наиболее эффективными среди которых являются природные полифенолы. Такой активный интерес к этим аналитам обусловлен их способностью блокировать вредное воздействие на организм свободных радикалов, замедляя процессы старения, защищая от ряда заболеваний.

Использование микрофлюидных систем, обеспечивающих экспрессное определение этих аналитов, открывает новые перспективы. Этим определена и актуальность решаемой задачи.

Цель диссертационного исследования: разработка микрофлюидной аналитической системы с электрохимическим детектированием и выявление ее возможностей при определении электроактивных аналитов (катехоламинов, катехинов, фенолов).

В связи с поставленной целью решались задачи:

— Отработка основных этапов изготовления микрофлюидного чипа, оптимизация условий и рабочих параметров {конфигурация электрохимической ячейки, герметизация чипа, сепарационное напряжение в канале микрочипа, очистка поверхности электрода, состав и концентрация буферного раствора) на примерах модельных систем электроактивных аналитов.

— Выявление возможности on-line концентрирования катехоламинов с использованием стэкинга с усилением поля на разработанной микрофлюидной аналитической системе с электрохимическим детектированием.

— Модификация каналов микрочипа окислением в газовом разряде (N2+O2) и поверхностно-активными веществами (ПАВ) (додецилсульфатом натрия, дезоксихолатом натрия и ионной жидкостью 1-додецил-З-метилимидазолий хлоридом) с целью снижения гидрофобности поверхности.

— Получение сравнительных оценочных аналитических характеристик по эффективности, воспроизводимости электроосмотического потока (ЭОП), пределам обнаружения, временам миграции электроактивных аналитов (катехоламинов, фенолов, катехинов) с использованием микрофлюидной аналитической системы и традиционных вариантов КЭ с УФ- и ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.

— Определение электроактивных компонентов в реальных объектах с использованием разработанной микрофлюидной аналитической системы {зеленый чай, вино, фармпрепараты).

Научная новизна

Разработана портативная микрофлюидная аналитическая система для экспрессного электрофоретического определения катехоламинов и полифенольных антиоксидантов с электрохимическим детектированием в гибридном микрочипе из стекла и ПДМС.

Предложены новый вариант гибридного микрочипа с золотыми электродами и способы стабилизации в нем скорости электроосмотического потока обработкой поверхности канала в газовом разряде (N2+02) и ПАВ (додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, ионная жидкость 1-додецил-З-метилимидазолий хлорид). Установлено, что в результате модификации поверхности чипа анионными ПАВ (ДДСН, дезоксихолат натрия) увеличилась скорость ЭОП и воспроизводимость времен миграции (с 10 до 5 %). Модификация ионной жидкостью (1-додецил-З-метилимидазолий хлорид) привела к обращению ЭОП и обеспечила максимальное увеличение эффективности в сравнении с результатами, полученными на необработанном чипе.

Разработана экспрессная схема микрочипового капиллярного электрофореза для определения катехоламинов с предварительным стэкингом с усилением поля.

Предложен способ повышения воспроизводимости времен миграции и снижения пределов обнаружения аналитов в условиях микрофлюидной аналитической системы за счет контроля герметичности соединения покровной пластины с микроканалом в области измерительных электродов электрохимического детектора (по электрохимическому осаждению серебра на электроды).

Практическая значимость работы

Разработан макет гибридного микрочипа для качественного и количественного определения полифенольных антиоксидантов в реальных объектах (образцы зеленого чая, красные вина) с пределами детектирования (3.5-2.3) мкг/мл и общим временем анализа 4 мин.

Реализован вариант on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля) при электрофоретическом определении катехоламинов в МФАС, обеспечивший снижение пределов обнаружения более чем в 10 раз.

Показано, что в условиях микрофлюидной аналитической системы возможно проведение как группового анализа полифенольных антиоксидантов (режим капиллярного зонного электрофореза), так и установление покомпонентного состава анализируемой смеси (режим мицеллярной электрокинетической хроматографии).

Положения, выносимые на защиту

1. Микрофлюидная аналитическая система капиллярного электрофореза с электрохимическим детектором для экспрессного определения природных антиоксидантов полифенольного типа.

2. Конфигурация электрохимической ячейки (in-channel) с расположением рабочего электрода и электрода сравнения перпендикулярно сепарационному полю, и условия электрофоретического определения катехинов и катехоламинов.

3. Схема гибридного микрочипа из ПДМС-стекла с золотыми электродами и модифицированной поверхностью каналов микрочипа (окисление в газовом разряде, добавка ДЦСН, дезоксихолата и 1-додецил-З-метилимидазолий хлорида).

4. Схема on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля) при электрофоретическом определении катехоламинов в МФАС, обеспечившая снижение пределов обнаружения более чем в 10 раз.

5. Схема экспрессного анализа реальных объектов (чай, вино) с помощью микрофлюидной аналитической системы для определения антиоксидантов полифенольного типа.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ПДМС — полидиметилсилоксан ПЭТ - полиэтилентерефталат ПК - поликарбонат ПММА — полиметилметакрилат КЭ - капиллярный электрофорез

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЭХ - электрохимический

УФ - ультрафиолетовый

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ЭОП - электроосмотический поток

ЛИФ - лазерно-индуцированная флуоресценция

МФЧА — микрофлюидный чип-анализатор

МФАС — микрофлюидная аналитическая система

МС - масс-спектрометрическое

АД — амперометрический детектор

п.ф. - подвижная фаза

н.ф. - неподвижная фаза

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

КЭХ - капиллярная электрокинетическая хроматография

ЛИФ - лазерно-индуцированная флуоресценция

ДДСН - додецилсульфат натрия

ДМСО - диметилсульфоксид

УНТ - углеродная нанотрубка

MES - 2-(ТЧ-морфолино)этансульфоновая кислота

1E-3MI-TFB — 1-этил-З-метилимидазол тетрафторборат

HIAA - 5-гидроксииндол-З ацетоуксусная кислота

NBD - 4-хлор-7-нитробензофуразан

ЭК - эпикатехин ЭГК — эпигаллокатехин ЭКГ - эпикатехин галлат ЭГКГ - эпигаллокатехин галлат НА - норадреналин ДА - дофамин А - адреналин

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные направления в создании микрофлюидных устройств

Основными требованиями, предъявляемыми современными клинико-диагностическими лабораториями к анализу, являются экспрессность, использование минимального объема пробы, возможность «доставки» прибора к объекту анализа, простота автоматизации. Этому полностью соответствуют микрофлюидные аналитические системы (МФАС), к которым в настоящее время отмечен повышенный интерес в нашей стране и за рубежом. Кроме очевидных преимуществ миниатюризации аналитических систем таких, как интегрирование в одном чипе нескольких реакторов, смесителей, экстракторов, насосов, дозаторов, они позволяют реализовать в одном устройстве размером в несколько квадратных сантиметров все стадии пробоподготовки, дозирования, смешивания реагентов, очистки, разделения и анализа пробы [7].

Выделяют два основных класса микроаналитических систем: микрофлюидные (основаны на принципах проточного анализа и представляющие собой различные формы капиллярного электрофореза и хроматографии) и матричные (содержат топологически кодированные площадки с тем или иным способом иммобилизованными комплементарными группировками, избирательно связывающими целевые компоненты) [8].

Среди микрофлюидных систем наибольший интерес вызывают развитие и коммерциализация МФАС, являющихся чип-реализацией высокоэффективного капиллярного электрофореза [2, 9, 10].

1.2. Принципы создания микрофлюидных чипов для капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием

Схемы наиболее часто применяемых структур микрофлюидных чипов для капиллярного электрофореза представлены на Рис. 1.

Чип с простым перекрестным, или Т-инжектором (Рис. 1. а), и с двойным Т-инжектором (Рис. 1. б) [11], включают систему микроканалов шириной от 10 до 100 мкм и резервуаров (100 - 250 мкл). При этом длина рабочего канала варьируется от 3 до 10 см, а объем резервуаров определяется, в значительной степени, областью применения чипа.

1=3-10 см

(а) (б)

Рис. 1. Схематическое изображение МФЧА с перекрестным (а) и двойным Т- инжектором (а) [11].

В резервуарах располагаются микроэлектроды, соединенные с источником высокого напряжения, с помощью которого осуществляется электрокинетический ввод пробы и ее разделение в рабочем канале. Электрохимический детектор обычно представлен трехэлектродной системой: в качестве электрода сравнения чаще всего выступает хлорсеребряный электрод

Резервуары (100-250 мкл)

_гл

ипги

О

"О

10-100 мкм

Сепарационный канал

1-1-г

4 20 мкм ;

т

50 мкм

(А§М^С1), рабочим электродом является золотой или платиновый. Третий -вспомогательный электрод - также изготавливают из золота либо платины.

Возможно использование и двухэлектродной схемы.

1.3. Основные варианты капиллярного электрофореза

Основные виды капиллярного электрофореза следующие: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ), мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ), капиллярная электрохроматография (КЭХ) [12].

Капиллярный зонный электрофорез (или электрофорез в свободном растворе) — самый простой и наиболее широко востребованный вариант капиллярного электрофореза при разделении ионогенных аналитов. Компоненты анализируемой смеси движутся в среде электролита под действием электрического поля с разными скоростями, образуя дискретные зоны; нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью электроосмотического потока (ЭОП) [12].

Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ), введенная в 1984 г. японским ученым Терабе, получила широкое распространение, в первую очередь, за счет возможности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты пробы. Разделению нейтральных соединений способствовало введение в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) (например, додецилсулъфата натрия) [12] в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ), образующего псевдостационарную фазу.

Капиллярная электрокинетическая хроматография (КЭХ).

В капиллярной электрокинетической хроматографии (наличие стационарной фазы) селективность разделения повышается за счет объединения двух процессов: электрофореза и хроматографического разделения.

1.4. Материалы и техника изготовления микрофлюидных аналитических систем

1.4.1. Стеклянные микрочипы для капиллярного электрофореза

Основные материалы, используемые при производстве чипов, представлены на Рис. 2.

20

16

«

О*

Н «5 Н и

О о

52<а полимеры

стекло

пдмс

10е/,

пдмс/стекло

ПММА

38%

стекло

ПДМС /стекло ПЭТ

Topas

1

1 2 3 4 5 6

материал чипа

Рис. 2. Применение различных материалов в МФЧА в период с 2005 г

[13].

МФАС для капиллярного электрофореза впервые были созданы в четырех лабораториях: Манца [1], Харрисона [14], Рамсея [15] и Мэтиса [16]. Большая часть первых микрочипов изготовлена с применением доступных и хорошо разработанных технологий микроэлектроники: фотолитографии и травления в кремнии или стекле. Однако кремний - сравнительно дорогой материал, непрозрачен в видимой и УФ-областях спектра и не позволяет проводить оптическую регистрацию аналитов. Стекло прозрачно, однако процесс изготовления таких чипов с использованием фотолитографии и травления дорог и занимает много времени [17].

Поскольку поверхности стекла и оксида кремния заряжены отрицательно, в канале чипа создаются условия для возникновения электроосмотического потока (ЭОП). Вместе с тем, стеклянно-кремниевые чип-КЭ устройства имеют ряд ограничений.

Обработка стеклянных матриц занимает много времени и предъявляет повышенные требования к чистоте аппаратуры и реагентов. Для создания глубоких каналов (> 50мкм) с параллельными стенками используют лазерную абляцию [18], травление плазмой [19] и т.д., однако эти методы являются дорогостоящими и требуют сложного аппаратурного оформления [20].

После создания микроканалов систему необходимо собрать, закрыв матрицу с каналами и резервуарами покровной пластиной, чтобы стало возможным движение жидкости внутри микрочипа. Для обеспечения герметичности применяются анодное и термическое связывание, обжиг [20].

Ниже рассмотрены наиболее распространенные методы создания микроканалов на стеклянных и полимерных матрицах.

Для создания необходимых микроструктур (каналов, резервуаров) в стеклянных субстратах обычно применяют стандартную фотолитографию [2022], (Рис.3).

Стеклянная подложка

Нанесение фоторезиста

УФ облучение фоторезиста через фотошаблон

О

фотошаблон

Проявление фоторезиста

Травление стекла

Удаление фоторезиста

Герметизация канала

Рис.3. Основные стадии изготовления микроканалов в стекле [23].

На стеклянную пластину (Рис.3) наносят слой фоторезиста — полимера, который становится растворимым («позитивное» проявление) или нерастворимым («негативное» проявление) в проявляющей смеси после обработки светом. Далее микрочип подвергается УФ-облучению через фотомаску - шаблон с изображением необходимых микроструктур. После этого микрочип некоторое время нагревается, чтобы облученный фоторезист затвердел, и далее засвеченную в УФ часть удаляют раствором проявителя. После этого обработанные участки микрочипа подвергаются химическому травлению. В качестве реагентов для этой цели применяют растворы, содержащие плавиковую кислоту: НРМН4Р, НР/НЫ03 и концентрированную Ш7. Скорость процесса легко контролируется изменением температуры. После

вытравливания микроканалов, удаляют оставшиеся фоторезист и защитный слой. В пластине делают отверстия для подачи реагентов и, наконец, закрепляют на ней покрывающий слой субстрата из стекла или полимерного материала.

1.4.2. Полимерные чипы для капиллярного электрофореза Через несколько лет после первых сообщений в области МФАС появились публикации об использовании новых полимерных материалов [24]. Их применение в чип-КЭ ограничено из-за гидрофобных свойств поверхности полимеров: затруднена работа с водными растворами и наблюдается адсорбция аналитов на стенках капилляра. Кроме того, эти материалы часто не выдерживают высоких температур [25].

Для изготовления полимерных чипов используют: полидиметилсилоксан (ПДМС) [26-31], полиметилметакрилат (ПММА) [32-34], полиэтилентерефталат (ПЭТ) [35-37], поликарбонат (ПК) [38-40], полиэстер [41-43], Topas (циклический олефиновый сополимер с аморфной структурой, включающей цепи из молекул этилена и нонборнена) [44-46] (Рис. 4).

си, |СНГС1-

с = о

I

о

си,

пмма

0-CH,-CHjv V.

пэт

сн5

I

но | о'

СНз

сн5

I •

.sl

CIL

/Si

но

CHj п СН3

ПДМС Тора«

Рис. 4. Структурные формулы наиболее часто применяемых полимеров.

1.4.3. Обработка полимерных матриц

Существует два основных способа создания полимерных чипов: репликация с матрицы и непосредственная обработка слоя полимера [21, 47]. Создание реплик подразумевает получение микроструктур формированием точной полимерной копии с образца. К таким методам относятся: формование [48], импринтинг (горячее тиснение) [49] и отливка [50]. При непосредственной обработке полимера применяют лазерную фотоабляцию (выжигание) [51].

Формование

Формование подразумевает применение химических процессов для затвердевания полимера [48]. Необходимо наличие основы (жидкий полимер или мономер) и сшивателя. Образующийся полимер принимает нужную форму. Затем готовую реплику удаляют с матрицы. Такая технология особенно часто используется при обработке эластомерных материалов, типа ПДМС: они способны герметично, но обратимо присоединяться к гладким поверхностям за

1) Кремниевая матрица

о

2) Нанесение смеси мономера и сшивателя

О

3) Затвердевание смеси и ее отделение от матрицы

О

4) Закрепление полимерной реплики на стеклянной пластине с электродами

Рис. 5. Схематичное изображение создания микроструктур в слое полимера [48].

Каналы в слое ПДМС формируются репликацией на матрице, изготовленной «негативным» вариантом фотолитографии: смесь мономера и

счет сил адгезии (Рис. 5).

*

сшивателя помещается на маску и полимеризуется при атмосферном давлении и комнатной температуре.

Последний этап - отделение реплики и ее соединение с покровной пластиной из ПДМС. Чип обрабатывается плазмой кислорода воздуха, что обеспечивает необратимую адгезию при соединении пластин; повышается способность поверхности капилляров чипа к ионизации. Это, в свою очередь, стабилизирует ЭОП.

Импринтинг

Горячее тиснение (импринтинг) - процесс, при котором маску (форму) впечатывают в разогретый, размягченный термопластик, затем охлаждают и, таким образом, получают зеркально отображенную реплику. Весь процесс занимает всего несколько мин [49]. Существует два варианта тиснения.

В первом случае (Рис. 6, А) проволоку малого диаметра отпечатывают в слегка нагретом пластике.

Второй тип устройств (Рис. 6, В) приводит к получению более сложной конфигурации. Они могут быть многократно использованы для воспроизводимого получения серии чипов.

Пресс

I 05 °С

в

Пресс

135°С

проволока

I текло

ПММА Стекло

Металл □ ПММА

КрСМНИЙ Мелил

Пресс

I

I

Пресс

Рис. 6. Схема изготовления микроканалов методом горячего тиснения. Размягченному нагреванием ПММА придают форму с помощью проволоки (А) или трехмерного металлизированного кремниевого пуансона (В) [49].

Лазерная абляция (выжигание)

Обработка поверхности полимеров лазером - метод, основанный на удалении участков субстрата с помощью интенсивного УФ- или ИК-излучения. Суть процесса заключается в том, что коротковолновый лазерный импульс разрушает ковалентные связи между молекулами в цепях полимера, в результате чего происходит отторжение и выталкивание разрушенных фрагментов [52-54]. Таким способом можно обрабатывать большинство используемых в промышленности полимерных материалов, включая поликарбонат, ПММА, нитроцеллюлозу и политетрафторетилен [23]. Лазерная обработка позволяет достигать высокой точности при изготовлении каналов, но является слишком дорогостоящей для массового производства.

1.5. Микрочипы на основе полидиметилсилоксана

В [55] впервые сообщается о применении доступного эластомера 8у^аг<1 184, содержащего преимущественно поперечно-сшитый ПДМС, для изготовлении микрочипов (Рис. 4).

Полидиметилсилоксановые чипы нашли широкое применение [56-61] благодаря ряду особенностей: ПДМС оптически прозрачен; полимеризуется при низких температурах; способен закрепляться на гладких поверхностях путем обратимой адгезии при комнатной температуре; его поверхность легко модифицируется с помощью плазмы кислорода или воздуха.

7.5.7. Герметизация ПДМС-чипое

В результате формовки создается реплика, содержащая три из четырех стенок канала. Соединение реплики с плоской поверхностью создает четвертую стенку. Этим плоским материалом может быть ПДМС; таким образом, все стенки канала - из одного и того же материала. Но может использоваться и другой материал, например, стекло. Для герметизации чипа применяются два метода: обратимое герметичное соединение с плоской поверхностью [55] и

необратимое - с обработкой обеих соединяемых поверхностей в воздушной плазме [48].

1.5.2. Физическо-химические характеристики поверхности ПДМС

Удобный способ охарактеризовать поверхность канала чипа — контролировать подвижность (/лэоп) электроосмотического потока (ЭОП).

При расчете скорости ЭОПа удается получить информацию о таких важных показателях как полный заряд (£) и стабильность поверхности, оценить рабочую область применимости электрофоретического метода. Увеличение, уменьшение или изменение заряда поверхности на противоположный — общая цель модификации поверхности в чип-КЭ. Именно измерение скорости ЭОПа как функции рН помогает определить доступную область применимости метода.

Существует два основных пути измерения ЭОПа: метод поточного контроля и нейтрального маркера [62].

В первом случае из одного буфера изготавливаются два раствора с разной ионной силой. Капилляр и один из резервуаров заполняются буферным раствором, а второй резервуар заполняется — другим буферным раствором. Чтобы "сдвинуть" буфер во второй резервуар через капилляр, необходимо приложить разделительное напряжение. Поток постепенно изменяется, пока новый буфер вымещает предыдущий. Время, необходимое для достижения постоянного потока, используется для определения скорости ЭОПа. В обычном электрофорезе можно определять ЭОП по времени миграции нейтральных маркеров. Эта технология не работает в условиях мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).

Другой важной физической характеристикой поверхности является угол смачивания (или краевой угол смачивания) [23], измеряемый специальным прибором - гониометром. Угол смачивания характеризует относительную

гидрофильность/гидрофобность поверхности. Различные способы обработки поверхности могут существенно изменить угол смачивания.

Так, обработка ПДМС плазмой кислорода уменьшает угол смачивания до значения менее, чем в 60°, за короткий интервал времени.

1.5.3. Модификация поверхности ПДМС

Поверхность ПДМС гидрофобна, что затрудняет его использование в микрочипах: возможна сорбция гидрофобных аналитов на стенках капилляров. Существуют различные варианты обработки поверхности ПДМС для повышения ее гидрофильности [63].

Они включают

а) в газовой фазе: окисление плазмой; ультрафиолетовое облучение; химическое осаждение из пара и вакуумное напыление слоя металла.

б) в жидкой фазе: осаждение «слой за слоем», использование золь-гель покрытий, адсорбцию белков, силанизацию и динамическую модификацию поверхностно активными веществами (ПАВ).

Рассмотрим эти варианты подробнее.

1.5.3.1. Модификация поверхности ПДМС в газовой фазе

Окисление плазмой. При модификации плазмой используются кислород, азот или водород, которые, диссоциируя, реагируют с поверхностью субстрата, формируя функциональные группы. Этот метод обработки ПДМС пользуется большой популярностью [63-66].

При этом одна из возникающих проблем — регенерация гидрофобности ПДМС, вызванная миграцией необработанных олигомеров ПДМС из объема к поверхности. В качестве способа сохранения гидрофильности после обработки плазмой кислорода в [67] рекомендуют обеспечивать контакт поверхности ПДМС с водой.

Ультрафиолетовая обработка. В сравнении с окислением ПДМС плазмой УФ обработка занимает больше времени [68]. В [69] проводилось сравнение скоростей обработки и глубины модификации поверхности ПДМС в длинноволновом УФ, коротковолновом УФ с генерацией озона и плазмой кислорода. Времена модификации оказались равными соответственно 160, 66 и 0.3 мин. При этом после обработки УФ оставались неокисленные СНз- группы.

Плазменно-химическое осаждение из паровой фазы — процесс химического осаждения тонких пленок из паровой фазы при низком давлении с использованием высокочастотной плазмы. В [65] проводили обработку поверхности микрочипа из ПДМС для капилярного электрофореза. Сначала поверхность обрабатывали аргоновой плазмой для улучшения адгезии, после чего проводили модификацию плазмой C3F8 или плазмой акриловой кислоты. В случае обработки плазмой акриловой кислоты получали гидрофильную поверхность, результатом чего явилось 20%-ное увеличение скорости ЭОП в щелочных буферных электролитах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Николаев, Андрей Валерьевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Manz, A., Graber, N.,Widmer, Н.М. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing. II Sens. Actuators, B. 1990. V. l.P. 244-8.

2. Shang, F., Guihen, E.,Glennon, J.D. Recent advances in miniaturisation - the role of microchip electrophoresis in clinical analysis. II Electrophoresis. 2012. V. 33. P. 105-116.

3. Mora, M.F., Stockton, A.M.,Willis, P.A. Microchip capillary electrophoresis instrumentation for in situ analysis in the search for extraterrestrial life. II Electrophoresis. 2012. V. 33. P. 2624-2638.

4. Xu, Y., Jang, K., Yamashita, Т., Tanaka, Y., Mawatari, K.,Kitamori, T. Microchip-based cellular biochemical systems for practical applications and fundamental research: From microfluidics to nanofluidics. II Anal. Bioanal. Chem. 2012. V. 402. P. 99-107.

5. Kenyon, S.M., Meighan, M.M., Hayes, M.A. Recent developments in electrophoretic separations on microfluidic devices. II Electrophoresis. 2011. V. 32. P. 482-493.

6. Subirats, X., Blaas, D.,Kenndler, E. Recent developments in capillary and chip electrophoresis of bioparticles: Viruses, organelles, and cells. II Electrophoresis. 2011. V. 32. P. 1579-1590.

7. Сляднев, M.H. Микрочиповые системы для молекулярно-генетического анализа. II Российский химический журнал. 2011. Т. LV. С. 118-132.

8. Зимина, Т.М., Лучинин, В.В. Микросистемы для экспресс-анализа. II Журнал аналитической химии. 2011. Т. 66. С. 1252-1275.

9. Breadmore, М.С., Shallan, A.I., Rabanes, H.R., Gstoettenmayr, D., Abdul Keyon, A.S., Gaspar, A., Dawod, M., Quirino, J.P. Recent advances in enhancing the sensitivity of electrophoresis and electrochromatography in capillaries and microchips (2010-2012). И Electrophoresis. 2013. V. 34. P. 2954.

10. Ghanim, M.H., Abdullah, M.Z. Integrating amperometric detection with electrophoresis microchip devices for biochemical assays: Recent developments. U Talanta. 2011. V. 85. P. 28-34.

11. Blasco, A., Escarpa, A. Electrochemical detection in capillary electrophoresis on microchips. II Comprehensive Analytical Chemistry. 2005. V. 45. P. 703758.

12. Комарова, H.B., Каменцев, Я. С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза капель. II СПб.: ООО «Веда». 2006. 212. С

13. Xu, J.-J., Wang, A.-J.,Chen, H.-Y. Electrochemical detection modes for microchip capillary electrophoresis. II TrAC, Trends Anal. Chem. 2007. V. 26. P. 125-132.

14. Harrison, D.J., Manz, A., Fan, Z., Luedi, H.,Widmer, H.M. Capillary electrophoresis and sample injection systems integrated on a planar glass chip. И Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 1926-32.

15. Waters, L.C., Jacobson, S.C., Kroutchinina, N., Khandurina, J., Foote, R.S., Ramsey, J.M. Multiple sample per amplification and electrophoretic analysis on a microchip. II Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 5172-5176.

16. Woolley, A.T.,Mathies, R.A. Ultra-high-speed DNA fragment separations using microfabricated capillary array electrophoresis chips. II Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. V. 91. P. 11348-52.

17. Kitagawa, F.,Otsuka, K. Recent progress in microchip electrophoresis-mass spectrometry. IIJ Pharm Biomed Anal. 2011. V. 55. P. 668-78.

18. Gomez, D., Goenaga, I., Lizuain, I., Ozaita, M. Femtosecond laser ablation for microfluidics. II Opt. Eng. (Bellingham, WA, U. S.). 2005. V. 44. P. 051105/1051105/8.

19. Park, J.H., Lee, N.E., Lee, J., Park, J.S., Park, H.D. Deep dry etching of borosilicate glass using sf6 and sf6/ar inductively coupled plasmas. H Microelectron. Eng. 2005. V. 82. P. 119-128.

20. Castano-Alvarez, M., Pozo Ayuso, D.F., Garcia Granda, M., Fernandez-Abedul, M.T., Rodríguez Garcia, J., Costa-Garcia, A. Critical points in the fabrication of microfluidic devices on glass substrates. II Sens. Actuators, B. 2008. V. 130. P. 436-448.

21. Madou, M.J. Fundamentals of microfabrication and nanotechnology (3rd edition). 2010. 2640 pp.

22. Евстрапов, A.A., Лукашенко, T.A., Рудницкая, Г.Е., Буляница, А.Л., Курочкин, В.Е. Микрофлюидные чипы из стеклянных материалов. II Научное приборостроение. 2012. Т. 22. С.

23. Wiederschain, G. Y. Handbook of capillary and microchip electrophoresis and associated microtechniques (3rd edn.) edited by j. P. Landers. Vol. 73. 2008. 1350.

24. Guber, A.E., Heckele, M., Herrmann, D., Muslija, A., Saile, V., Eichhorn, L., Gietzelt, Т., Hoffmann, W., Hauser, P.C., Tanyanyiwa, J., Gerlach, A., Gottschlich, N., Knebel, G. Microfluidic lab-on-a-chip systems based on polymers - fabrication and application. II Chem. Eng. J. (Amsterdam, Neth.). 2004. V. 101. P. 447-453.

25. Беленький, Б.Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез и микрофлюидные чип-анализаторы. II. Микрофлюидные чип-анализаторы. II Научное приборостроение. 2003. Т. 13. С. 3-13.

26. Wu, М.-Н. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. II Surf. Interface Anal. 2009. V. 41. P. 11-16.

27. Li, X.-A., Zhou, D.-M., Xu, J.-J., Chen, H.-Y. Determination of chloride, chlorate and perchlorate by pdms microchip electrophoresis with indirect amperometric detection. II Talanta. 2008. V. 75. P. 157-162.

28. Liu, В., Jin, Q., Zhang, Y., Mayer, D., Krause, H.-J., Zhao, J., Offenhaeusser, A. A simple poly(dimethylsiloxane) electrophoresis microchip with an integrated contactless conductivity detector. II Microchim. Acta. 2011. V. 172. P. 193-198.

29. Nandi, P., Desai, D.P., Lunte, S.M. Development of a pdms-based microchip electrophoresis device for continuous online in vivo monitoring of microdialysis samples. //Electrophoresis. 2010. V. 31. P. 1414-1422.

30. Zhang, Y., Bao, N., Yu, X.-D., Xu, J.-J., Chen, H.-Y. Improvement of heat dissipation for polydimethylsiloxane microchip electrophoresis. II J. Chromatogr. A. 2004. V. 1057. P. 247-251.

31. Liang, R.-P., Gan, G.-H., Qiu, J.-D. Surface modification of poly(dimethylsiloxane) microfluidic devices and its application in simultaneous analysis of uric acid and ascorbic acid in human urine. II J. Sep. Sci. 2008. V. 31. P. 2860-2867.

32. Hupert, M.L., Guy, W.J., Llopis, S.D., Shadpour, H., Rani, S., Nikitopoulos, D.E., Soper, S.A. Evaluation of micromilled metal mold masters for the replication of microchip electrophoresis devices. II Microfluid. Nanofluid. 2007. V. 3.P. 1-11.

33. Okada, H., Kaji, N., Tokeshi, M., Baba, Y. Polymethylmethacrylate) microchip electrophoresis of proteins using linear-poly (acrylamide) solutions as separation matrix. 11 Anal. Sci. 2008. V. 24. P. 321-325.

34. Osiri John, K., Shadpour, H., Park, S., Snowden Brandy, C., Chen, Z.-Y., Soper Steven, A. Generating high peak capacity 2-d maps of complex proteomes usingpmma microchip electrophoresis. II Electrophoresis. 2008. V. 29. P. 4984-92.

35. Liu, A.-L., He, F.-Y., Hu, Y.-L., Xia, X.-H. Plastified poly(ethylene terephthalate) (pet)-toner microfluidic chip by direct-printing integrated with electrochemical detection for pharmaceutical analysis. II Talanta. 2006. V. 68. P. 1303-1308.

36. Liu, C., Li, J.-M., Liu, J.-S., Wang, L.-D., Hao, Z.-X., Chen, H.-W. Fracture mechanism of metal electrode integrated on a chip and fabrication of a poly(ethylene terephthalate) electrophoresis microchip. // Talanta. 2009. V. 79. P. 1341-1347.

37. Shadpour, H., Musyimi, H., Chen, J., Soper, S.A. Physiochemicalproperties of various polymer substrates and their effects on microchip electrophoresis performance. II J. Chromatogr. A. 2006. V. 1111. P. 238-251.

38. Liu, Y., Ganser, D., Schneider, A., Liu, R., Grodzinski, P., Kroutchinina, N. Microfabricated polycarbonate ce devices for DNA analysis. II Micro Total Anal. Syst. 2001, Proc. pTAS 2001 Symp., 5th. 2001. V. 119-120.

39. Shadpour, H., Hupert, M.L., Patterson, D., Liu, C., Galloway, M., Stryjewski, W., Goettert, J., Soper, S.A. Multichannel microchip electrophoresis device fabricated in polycarbonate with an integrated contact conductivity sensor array. II Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 870-878.

40. Wang, Y., Chen, H., He, Q., Soper, S.A. A high-performance polycarbonate electrophoresis microchip with integrated three-electrode system for endchannel amperometric detection. //Electrophoresis. 2008. V. 29. P. 1881-1888.

41. Duarte, G.R.M., Coltro, W.K.T., Borba, J.C., Price, C.W., Landers, J.P., Carrilho, E. Disposable polyester-toner electrophoresis microchips for DNA analysis. II Analyst (Cambridge, U. K.). 2012. V. 137. P. 2692-2698.

42. Gabriel, E.F.M., Duarte, G.F., Jr., Garcia, P.d.T., de Jesus, D.P., Coltro, W.K.T. Poly ester-toner electrophoresis microchips with improved analytical performance and extended lifetime. II Electrophoresis. 2012. V. 33. P. 26602667.

43. Vickers, J.A., Dressen, B.M., Weston, M.C., Boonsong, K., Chailapakul, O., Cropek, D.M., Henry, C.S. Thermoset polyester as an alternative material for microchip electrophoresis/electrochemistry. II Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 1123-1129.

44. Castano-Alvarez, M., Fernandez-Abedul, M.T., Costa-Garcia, A. Polymethylmethacrylate) and topas capillary electrophoresis microchip performance with electrochemical detection. II Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 3160-3168.

45. Castaño-Alvarez, M., Fernandez-Abedul, M.T., Costa-Garcia, A. Analytical performance of ce microchips with amperometric detection. Il Instrum. Sci. Technol. 2006. V. 34. P. 697-710.

46. Castano-Alvarez, M., Fernandez-Abedul, M.T., Costa-Garcia, A. Amperometric detector designs for capillary electrophoresis microchips. II J. Chromatogr. A. 2006. V. 1109. P. 291-299.

47. Geschke, O., Klank, H., Telleman, P., Editors, Microsystem engineering oflab-on-a-chip devices; second, revised and enlarge edition. 2008. 285 pp.

48. Dufíy, D.C., McDonald, J.C., Schueller, O.J.A., Whitesides, G.M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). II Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 4974-4984.

49. Martynova, L., Locascio, L.E., Gaitan, M., Kramer, G.W., Christensen, R.G., MacCrehan, W.A. Fabrication of plastic microfluid channels by imprinting methods. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 4783-4789.

50. McCormick, R.M., Nelson, R.J., Alonso-Amigo, M.G., Benvegnu, D.J., Hooper, H.H. MicroChannel electrophoretic separations of DNA in injection-molded plastic substrates. II Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 2626-2630.

51. Roberts, M.A., Rossier, J.S., Bercier, P., Girault, H. Uv laser machined polymer substrates for the development of microdiagnostic systems. // Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 2035-2042.

52. Fogarty, B.A., Heppert, K.E., Cory, T.J., Hulbutta, K.R., Martin, R.S., Lunte, S.M. Rapid fabrication of poly(dimethylsiloxane)-based microchip capillary electrophoresis devices using co2 laser ablation. II Analyst (Cambridge, U. K.). 2005. V. 130. P. 924-930.

53. Nie, Z.,Fung, Y.S. Microchip capillary electrophoresis for frontal analysis of free bilirubin and study of its interaction with human serum albumin. II Electrophoresis. 2008. V. 29. P. 1924-1931.

54. Obata, K., Sugioka, K., Shimazawa, N., Midorikawa, K. Fabrication of microchip based on uv transparent polymer for DNA electrophoresis by f2 laser ablation. //Appl. Phys. A Mater. Sci. Process. 2006. V. 84. P. 251-255.

55. Effenhauser, C.S., Bruin, G.J.M., Paulus, A., Ehrat, M. Integrated capillary electrophoresis on flexible silicone microdevices: Analysis of DNA restriction fragments and detection of single DNA molecules on microchips. II Anal. Chem. 1997. V. 69. P. 3451-3457.

56. Liang, R.-P., Meng, X.-Y., Liu, C.-M., Qiu, J.-D. Pdms microchip coated with poly dopamine/gold nanoparticles hybrid for efficient electrophoresis separation of amino acids. II Electrophoresis. 2011. V. 32. P. 3331-3340.

57. Nii, K., Sueyoshi, K., Otsuka, K., Takai, M. Zone electrophoresis of proteins in poly(dimethylsiloxane) (pdms) microchip coated with physically adsorbed amphiphilic phospholipid polymer. II Microfluid. Nanofluid. 2013. V. 14. P. 951-959.

58. Seno, M., Sueyoshi, K., Kitagawa, F., Otsuka, K. Stable coating using nafion thin membrane for fast electroosmotic flow in pdms microchips. II Pacifichem 2010, International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, HI, United States, December 15-20, 2010. 2010. V. ANYL-533.

59. Shao, G., Wang, J., Li, Z., Saraf, L., Wang, W., Lin, Y. Poly(dimethylsiloxane) microchip-based immunoassay with multiple reaction zones: Toward on-chip multiplex detection platform. II Sens. Actuators, B. 2011. V. 159. P. 44-50.

60. Tanigawa, K., Sueyoshi, K., Kitagawa, F., Otsuka, K. Study on microchip electrophoresis of proteins using microheater integrated pdms chip. II Pacifichem 2010, International Chemical Congress of Pacific Basin Societies, Honolulu, HI, United States, December 15-20, 2010. 2010. V. ANYL-534.

61. Wang, H., Han, C., Wang, H., Jin, Q., Wang, D., Cao, L., Dong, L. Clinical application research of polydimethylsiloxane microchip electrophoresis. II Guoji Jianyan Yixue Zazhi. 2012. V. 33. P. 4-6.

62. Huang, X., Gordon, M.J., Zare, R.N. Current-monitoring method for measuring the electroosmotic flow rate in capillary zone electrophoresis. // Anal. Chem. 1988. V. 60. P. 1837-8.

63. Zhou, J., Ellis, A.V., Voelcker, N.H. Recent developments in pdms surface modification for microfluidic devices. II Electrophoresis. 2010. V. 31. P. 2-16.

64. Huynh, B.H., Fogarty, B.A., Nandi, P., Lunte, S.M. A microchip electrophoresis device with on-line microdialysis sampling and on-chip sample derivatization by naphthalene 2,3-dicarboxaldehyde/2-mercaptoethanol for amino acid and peptide analysis. II J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V. 42. P. 529-534.

65. Martin, I.T., Dressen, B., Boggs, M., Liu, Y., Henry, C.S., Fisher, E.R. Plasma modification ofpdms microfluidic devices for control of electroosmotic flow. II Plasma Processes Polym. 2007. V. 4. P. 414-424.

66. Wu, C.-C., Wu, R.-G., Huang, J.-G., Lin, Y.-C., Chang, H.-C. Three-electrode electrochemical detector and platinum film decoupler integrated with a capillary electrophoresis microchip for amperometric detection. II Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 947-952.

67. Ren, X., Bachman, M., Sims, C., Li, G.P., Allbritton, N. Electroosmotic properties of microfluidic channels composed of poly(dimethylsiloxane). // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2001. V. 762. P. 117-125.

68. Efimenko, K., Wallace, W.E., Genzer, J. Surface modification of sylgard-184 poly (dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. II J. Colloid Interface Sci. 2002. V. 254. P. 306-315.

69. Ye, H., Gu, Z., Gracias, D.H. Kinetics of ultraviolet and plasma surface modification of poly(dimethylsiloxane) probed by sum frequency vibrational spectroscopy. //Langmuir. 2006. V. 22. P. 1863-1868.

70. Zhang, Z., Feng, X., Luo, Q., Liu, B.-F. Environmentally friendly surface modification ofpdms using peg polymer brush. II Electrophoresis. 2009. V. 30. P. 3174-3180.

71. Mourzina, Y., Kalyagin, D., Steffen, A., Offenhaeusser, A. Electrophoretic separations of neuromediators on microfluidic devices. // Talanta. 2006. V. 70. P. 489-498.

72. Madadi, H., Casals-Terre, J. Long-term behavior of nonionic surfactant-added pdms for self-driven microchips. II Microsyst. Technol. 2013. V. 19. P. 143150.

73. Garcia, C.D., Dressen, B.M., Henderson, A., Henry, C.S. Comparison of surfactants for dynamic surface modification of poly(dimethylsiloxane) microchips. //Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 703-709.

74. Sun, P., Armstrong, D.W. Ionic liquids in analytical chemistry. II Anal. Chim. Acta. 2010. V. 661. P. 1-16.

75. Ohno, H., Editor, Electrochemical aspects of ionic liquids, second edition. 2011.485 pp.

76. Xu, Y., Li, J., Wang, E. Microchip micellar electrokinetic chromatography based on one functionalized ionic liquid and its excellent performance on proteins separation. I I J. Chromatogr. A. 2008. V. 1207. P. 175-180.

77. Xu, Y., Jiang, H., Wang, E. Ionic liquid-assisted pdms microchannel modification for efficiently resolving fluorescent dye and protein adsorption. II Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 4597-4605.

78. Zeng, H.-L., Shen, H., Nakagama, T., Uchiyama, K. Property of ionic liquid in electrophoresis and its application in chiral separation on microchips. II Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 4590-4596.

79. Jacobson, S.C., Ramsey, J.M. Integrated microdevice for DNA restriction fragment analysis. II Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 720-3.

80. Woolley, A.T., Hadley, D., Landre, P., deMello, A.J., Mathies, R.A., Northrup, M.A. Functional integration of per amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device. II Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 4081-4086.

81. Lee, H.G., Kumar, K.S., Soh, J.-R., Cha, Y.-S., Kang, S.H. Ultra-fast simultaneous detection of obesity-related coenzymes in mice using microchip electrophoresis with a lif detector. II Anal. Chim. Acta. 2008. V. 619. P. 94100.

82. .Mainz, E.R., Gunasekara, D.B., Caruso, G., Jensen, D.T., Hulvey, M.K., Fracassi da Silva, J.A., Metto, E.C., Culbertson, A.H., Culbertson, C.T., Lunte, S.M. Monitoring intracellular nitric oxide production using microchip electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. II Anal. Methods. 2012. V. 4. P. 414-420.

83. Liang, Z., Chiem, N., Ocvirk, G., Tang, T., Fluri, K., Harrison, D.J. Microfabrication of a planar absorbance and fluorescence cell for integrated capillary electrophoresis devices. II Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 1040-6.

84. Lee, Y.-H., Maus, R.G., Smith, B.W., Winefordner, J.D. Laser-induced fluorescence detection of a single molecule in a capillary. II Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 4142-9.

85. Barry, J.P., Muth, J., Law, S.-J., Karger, B.L., Vouros, P. Analysis of modified oligonucleotides by capillary electrophoresis in a polyvinylpyrrolidone matrix coupled with electrospray mass spectrometry. II J. Chromatogr. A. 1996. V. 732. P. 159-166.

86. Zhang, H., Caprioli, R.M. Capillary electrophoresis combined with matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Continuous sample deposition on a matrix-precoated membrane target. II J. Mass Spectrom. 1996. V. 31. P. 1039-1046.

87. Musyimi, H.K., Guy, J., Narcisse, D.A., Soper, S.A., Murray, K.K. Direct coupling of polymer-based microchip electrophoresis to online maldi-ms using a rotating ball inlet. II Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 4703-4710.

88. Oleschuk, R.D.,Harrison, D.J. Analytical microdevices for mass spectrometry. II TrAC, Trends Anal. Chem. 2000. V. 19. P. 379-388.

89. Ewing, A.G., Mesaros, J.M., Gavin, P.F. Electrochemical detection in microcolumn separations. //Anal. Chem. 1994. V. 66. P. 527A-537A.

90. Forry, S.P., Murray, J.R., Heien, M.L.A.V., Locascio, L.E., Wightman, R.M. Probing electric fields inside microfluidic channels during electroosmotic flow with fast-scan cyclic voltammetry. II Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 4945-4950.

91. Martin, R.S., Ratzlaff, K.L., Huynh, B.H., Lunte, S.M. In-channel electrochemical detection for microchip capillary electrophoresis using an electrically isolatedpotentiostat. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 1136-1143.

92. Wallenborg, S.R., Nyholm, L., Lunte, C.E. End-column amperometric detection in capillary electrophoresis: Influence of separation-related parameters on the observed half-wave potential for dopamine and catechol. 11 Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 544-549.

93. Baldwin, R.P., Roussel, T.J., Jr., Crain, M.M., Bathlagunda, V., Jackson, D.J., Gullapalli, J., Conklin, J.A., Pai, R., Naber, J.F., Walsh, K.M., Keynton, R.S. Fully integrated on-chip electrochemical detection for capillary electrophoresis in a microfabricated device. // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 3690-3697.

94. Vandaveer, W.R.I.V., Pasas, S.A., Martin, R.S., Lunte, S.M. Recent developments in amperometric detection for microchip capillary electrophoresis. //Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 3667-3677.

95. Wang, J. Electrochemical detection for capillary electrophoresis microchips: A review. //Electroanalysis. 2005. V. 17. P. 1133-1140.

96. Wang, J., Tian, B., Sahlin, E. Integrated electrophoresis chips/amperometric detection with sputtered gold working electrodes. II Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 3901-3904.

97. Liu, Y., Vickers, J.A., Henry, C.S. Simple and sensitive electrode design for microchip electrophoresis/electrochemistry. II Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 1513-1517.

98. Castano-Alvarez, M., Fernandez-Abedul, M.T., Costa-Garcia, A., Agirregabiria, M., Fernandez, L.J., Ruano-Lopez, J.M., Barredo-Presa, B. Fabrication of su-8 based microchip electrophoresis with integrated electrochemical detection for neurotransmitters. II Talanta. 2009. V. 80. P. 2430.

99. Keynton, R.S., Roussel, T.J., Crain, M.M., Jackson, D.J., Franco, D.B., Naber, J.F., Walsh, K.M., Baldwin, R.P. Design and development of microfabricated capillary electrophoresis devices with electrochemical detection. II Anal. Chim. Acta. 2004. V. 507. P. 95-105.

100. Zeng, Y., Chen, H., Pang, D.-W., Wang, Z.-L., Cheng, J.-K. Microchip capillary electrophoresis with electrochemical detection. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 2441-2445.

101. Wang, J. Electrochemical detection for microscale analytical systems: A review. II Talanta. 2002. V. 56. P. 223-231.

102. Chen, D.C., Chang, S.S., Chen, C.H. Parallel-opposed dual-electrode detector with recycling amperometric enhancement for capillary electrophoresis. II Anal Chem. 1999. V. 71. P. 3200-5.

103. Bianchi, F., Lee, H.J., Girault, H.H. Ionode detection and capillary electrophoresis integrated on a polymer micro-chip. II J. Electroanal. Chem. 2002. V. 523. P. 40-48.

104. Rossier, J.S., Ferrigno, R., Girault, H.H. Electrophoresis with electrochemical detection in a polymer microdevice. II J. Electroanal. Chem. 2000. V. 492. P. 15-22.

105. Osbourn, D.M., Lunte, C.E. On-column electrochemical detection for microchip capillary electrophoresis. II Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 2710-2714.

106. Lacher, N.A., Lunte, S.M., Martin, R.S. Development of a microfabricated palladium decoupler/electrochemical detector for microchip capillary electrophoresis using a hybrid glass/poly(dimethylsiloxane) device. II Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 2482-2491.

107. Lai, C.-C.J., Chen, C.-h.,Ko, F.-H. In-channel dual-electrode amperometric detection in electrophoretic chips with a palladium film decoupler. II J. Chromatogr. A. 2004. V. 1023. P. 143-150.

108. Martin, R.S., Gawron, A.J., Lunte, S.M., Henry, C.S. Dual-electrode electrochemical detection for poly(dimethylsiloxane)-fabricated capillary electrophoresis microchips. II Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 3196-3202.

109. Qiu, H., Yin, X.-B., Yan, J., Zhao, X., Yang, X., Wang, E. Simultaneous electrochemical and electrochemiluminescence detection for microchip and conventional capillary electrophoresis. II Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 687693.

110. Lapos, J. A., Manica, D.P.,Ewing, A.G. Dual fluorescence and electrochemical detection on an electrophoresis microchip. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 3348-3353.

111. Lacher, N.A., Garrison, K.E., Martin, R.S., Lunte, S.M. Microchip capillary electrophoresis/electrochemistry. II Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 25262536.

112. Gawron, A.J., Martin, R.S., Lunte, S.M. Fabrication and evaluation of a carbon-based dual-electrode detector for poly (dimethyls iloxane) electrophoresis chips. //Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 242-248.

113. Martin, R.S., Gawron, A.J., Fogarty, B.A., Regan, F.B., Dempsey, E., Lunte, S.M. Carbon paste-based electrochemical detectors for microchip capillary electrophoresis/electrochemistry. I I Analyst (Cambridge, U. K.). 2001. V. 126. P. 277-280.

114. Woolley, A.T., Lao, K., Glazer, A.N., Mathies, R.A. Capillary electrophoresis chips with integrated electrochemical detection. II Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 684-688.

115. Wang, J., Chatrathi, M.P., Tian, B. Micromachined separation chips with a precolumn reactor and end-column electrochemical detector. II Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 5774-5778.

116. Wang, J., Chatrathi, M.P., Tian, B. Microseparation chips for performing multienzymatic dehydrogenase/oxidase assays: Simultaneous electrochemical measurement of ethanol and glucose. II Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 12961300.

117. Wang, J., Chatrathi, M.P., Tian, B., Polsky, R. Microfabricated electrophoresis chips for simultaneous bioassays of glucose, uric acid, ascorbic acid, and acetaminophen. II Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 2514-2518.

118. Wang, J., Chatrathi, M.P., Ibanez, A., Escarpa, A. Micromachined separation chips with post-column enzymatic reactions of "class" enzymes and end-column electrochemical detection: Assays of amino acids. II Electroanalysis. 2002. V. 14. P. 400-404.

119. Wang, J., Escarpa, A., Pumera, M., Feldman, J. Capillary electrophoresis-electrochemistry microfluidic system for the determination of organic peroxides. II J. Chromatogr. A. 2002. V. 952. P. 249-254.

120. Wang, J., Chen, G., Chatrathi, M.P., Musameh, M. Capillary electrophoresis microchip with a carbon nanotube-modified electrochemical detector. II Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 298-302.

121. Vlckova, M.,Schwarz, M.A. Determination of cationic neurotransmitters and metabolites in brain homogenates by microchip electrophoresis and carbon nanotube-modified amperometry. II J. Chromatogr. A. 2007. V. 1142. P. 214221.

122. Wang, J., Chen, G., Chatrathi, M.P., Fujishima, A., Tryk, D.A., Shin, D. Microchip capillary electrophoresis coupled with a boron-doped diamond electrode-based electrochemical detector. II Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 935939.

123. Wang, J., Chatrathi, M.P., Tian, B., Polsky, R. Capillary electrophoresis chips with thick-film amperometric detectors: Separation and detection of hydrazine compounds. //Electroanalysis. 2000. V. 12. P. 691-694.

124. Galloway, M., Stryjewski, W., Henry, A., Ford, S.M., Llopis, S., McCarley, R.L., Soper, S.A. Contact conductivity detection in poly(methyl methacrylate)-based microfluidic devices for analysis of mono- and polyanionic molecules. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 2407-2415.

125. Guijt, R.M., Baltussen, E., Van der Steen, G., Schasfoort, R.B.M., Schlautmann, S., Billiet, H.A.H., Frank, J., Van Dedem, G.W.K., Van den Berg, A. New approaches for fabrication of microfluidic capillary electrophoresis devices with on-chip conductivity detection. 11 Electrophoresis.

2001. V. 22. P. 235-241.

126. Pumera, M., Wang, J., Grushka, E., Polsky, R. Gold nanoparticle-enhanced microchip capillary electrophoresis. II Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 5625-5628.

127. Fanguy, J.C., Henry, C.S. Pulsed amperometric detection of carbohydrates on an electrophoretic microchip. II Analyst (Cambridge, U. K.). 2002. V. 127. P. 1021-1023.

128. Hebert, N.E., Snyder, B., McCreery, R.L., Kuhr, W.G., Brazill, S.A. Performance of pyrolyzed photoresist carbon films in a microchip capillary electrophoresis device with sinusoidal voltammetric detection. II Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 4265-4271.

129. Tanyanyiwa, J., Hauser, P.C. High-voltage capacitively coupled contactless conductivity detection for microchip capillary electrophoresis. I I Anal. Chem.

2002. V. 74. P. 6378-6382.

130. Kikura-Hanajiri, R., Martin, R.S., Lunte, S.M. Indirect measurement of nitric oxide production by monitoring nitrate and nitrite using microchip electrophoresis with electrochemical detection. II Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 6370-6377.

131. Pasas, S.A., Lacher, N.A., Davies, M.I., Lunte, S.M. Detection of homocysteine by conventional and microchip capillary electrophoresis/electrochemistry. //Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 759-766.

132. Fanguy, J.C., Heniy, C.S. The analysis of uric acid in urine using microchip capillary electrophoresis with electrochemical detection. // Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 767-773.

133. Hert, D.G., Fredlake, C.P., Barron, A.E. DNA sequencing by microchip electrophoresis using mixtures of high- and low-molar mass poly(n,n-dimethylacrylamide) matrices. II Electrophoresis. 2008. V. 29. P. 4663-4668.

134. Wang, J., Chen, G., Pumera, M. Microchip separation and electrochemical detection of amino acids and peptides following precolumn derivatization with naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde. II Electroanalysis. 2003. V. 15. P. 862865.

135. Dou, Y.-H., Bao, N., Xu, J.-J., Chen, H.-Y. A dynamically modified microfluidic poly (dimethyls iloxane) chip with electrochemical detection for biological analysis. //Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 3558-3566.

136. Wang, J., Chatrathi, M.P., Tian, B. Capillary electrophoresis microchips with thick-film amperometric detectors: Separation and detection of phenolic compounds. II Anal. Chim. Acta. 2000. V. 416. P. 9-14.

137. Zhang, D., Zhang, J., Li, M., Li, W., Aimaiti, G., Tuersun, G., Ye, J.,Chu, Q. A novel miniaturised electrophoretic method for determining formaldehyde and acetaldehyde in food using 2-thiobarbituric acid derivatisation. I I Food Chem. 2011. V. 129. P. 206-212.

138. Dossi, N., Susmel, S., Toniolo, R., Pizzariello, A., Bontempelli, G. Application of microchip electrophoresis with electrochemical detection to environmental aldehyde monitoring. //Electrophoresis. 2009. V. 30. P. 3465-3471.

139. Kovachev, N., Canals, A., Escarpa, A. Fast and selective microfluidic chips for electrochemical antioxidant sensing in complex samples. II Anal. Chem. (Washington, DC, U. S.). 2010. V. 82. P. 2925-2931.

140. Bhalla, V., Carrara, S., Stagni, C., Samori, B. Chip cleaning and regeneration for electrochemical sensor arrays. // Thin Solid Films. 2010. V. 518. P. 33603366.

141. Nikolajsen, R.P.H.,Hansen, A.M. Analytical methods for determining urinary catecholamines in healthy subjects. II Anal. Chim. Acta. 2001. V. 449. P. 1-15.

142. Kagedal, B. Catecholamines and their metabolites. II J. Chrom. B. 1988. V. 429. P.

143. Bergquist, J., Sciubisz, A., Kaczor, A., Silberring, J. Catecholamines and methods for their identification and quantitation in biological tissues and fluids. II J. Neurosci. Methods. 2002. V. 113. P. 1-13.

144. Ragab, G.H., Nohta, H., Zaitsu, K. Chemiluminescence determination of catecholamines in human blood plasma using l,2-bis(3-chlorophenyl)ethylenediamine as pre-column derivatizing reagent for liquid chromatography. II Anal. Chim. Acta. 2000. V. 403. P. 155-160.

145. Su, S.C., Chou, S.S., Chang, P.C., Hwang, D.F. Determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning by micellar electrokinetic capillary chromatography. II J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 2000. V. 749. P. 163169.

146. Сидорова, A.A., Карцова, JI.A. Хроматографическое и электрофоретическое определение катехоламиное, метанефринов, 3,4-дигидроксифенилаланина в моче и плазме крови. II Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. V. 10. Р. 533-542.

147. Карцова, JI.A., Бессонова, Е.А. Методы концентрирования в капиллярном электрофорезе. // Журнал аналитической химии. 2009. V. 64. Р. 340-351.

148. Raggi, М.А., Sabbioni, С., Casamenti, G., Gerra, G., Calonghi, N., Masotti, L. Determination of catecholamines in human plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. II J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 1999. V. 730. P. 201-211.

149. Harumi, Т., Akutsu, H.,Matsushima, S. Simultaneous determination of serotonin, n-acetylserotonin and melatonin in the pineal gland of the juvenile golden hamster by high-performance liquid chromatography with

electrochemical detection. II J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 1996. V. 675. P. 152-6.

150. Карцова, JI.A., Сидорова, A.A., Казаков, B.A., Бессонова, Е.А., Яшин, А.Я. Определение катехоламинов методами капиллярного электрофореза и обращенно-фазовой вэжх. II Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. С. 826-831.

151. Я.И.Яшин, В.Ю.Рыжнев, А.Я.Яшин,Черноусова, Н.И. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека. II ТрансЛит. 2009. 212 С.

152. Dalluge, J.J., Nelson, B.C. Determination of tea catechins. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 411-424.

153. Blahova, E., Lehotay, J. Sample preparation and hplc determination of catechins in green tea. // Chem. Anal. (Warsaw, Pol.). 2006. V. 51. P. 795-807.

154. Malovana, S., Garcia Montelongo, F.J., Perez, J.P., Rodríguez-Delgado, M.A. Optimisation of sample preparation for the determination of trans-resveratrol and other polyphenolic compounds in wines by high performance liquid chromatography. II Anal. Chim. Acta. 2001. V. 428. P. 245-253.

155. Pascual-Marti, M.C., Salvador, A., Chafer, A., Berna, A. Supercritical fluid extraction of resveratrol from grape skin of vitis vinifera and determination by hplc. II Talanta. 2001. V. 54. P. 735-740.

156. Sano, M., Tabata, M., Suzuki, M., Degawa, M., Miyase, T., Maeda-Yamamoto, M. Simultaneous determination of twelve tea catechins by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection. II Analyst (Cambridge, U. K.). 2001. V. 126. P. 816-820.

157. Kumamoto, M., Sonda, T., Takedomi, К., Tabata, M. Enhanced separation and elution of catechins in hplc using mixed-solvents of water, acetonitrile and ethyl acetate as the mobile phase. // Anal. Sci. 2000. V. 16. P. 139-144.

158. Kotani, A., Hayashi, Y., Matsuda, R., Kusu, F. Optimization of hplc-ecd conditions for determination of catechins with precision and efficiency based on the fumi theory. И Anal. Sci. 2003. V. 19. P. 865-869.

159. Карцова, JI.A., Ганжа, O.B. Электрофоретическое разделение чайных флавоноидов в режиме зонного капиллярного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии. II Журнал прикладной химии. 2006. Т. 79. С. 1120-1124.