Разработка микрофлюидной аналитической системы для экспрессного определения ДНК методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Лаврова, Марина Викторовна

• Лаврова, Марина Викторовна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Лаврова, Марина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микрофлюидные системы в биохимическом анализе.

1.2. Полимеразно-цепная реакция: развитие метода.

1.3. ПЦР - анализ в микрофлюидном чипе.

1.3.1. Материалы и методы изготовления МФЧ для проведения ПЦР анализа.

1.3.2. Пассивация внутренней поверхности микрореакторов для проведения

ПЦР анализа.

1.3.3. Поддержание температуры в микрореакторах ПЦР-МФЧ; методы определения ампликонов в микроструктурах МФЧ.

ГЛАВА 2. ПЦР-МИКРОЧИП: СОЗДАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ

ТОПОЛОГИИ.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ДНК МЕТОДОМ ПЦР-РВ В МИКРОРЕАКТОРАХ ПЦР МИКРОЧИПА, ВСПОМОГАТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МЕТОДИКИ.

3.1. Система флуоресцентного детектирования на основе ПЗС-матрицы.

3.2. Система термоциклирования на основе термоэлектрического модуля.

3.2.1. Установка для проведения термоциклирования ПЦР смеси в микрореакторах микрочипа.

3.2.2. Регулирование температуры в микрореакторах ПЦР микрочипа.

3.2.3. Способы измерения температуры внутри микрореакторов ПЦР микрочипа.

3.3. Растворы, методики и экспериментальные установки, используемые при проведении экспериментов.

3.3.1. Приготовление модельных смесей флуоресцеина и градуировочных растворов для оценки аналитических параметров созданной установки флуоресцентного детектирования.

3.3.2. Приготовление растворов родамина В для оценки аналитических параметров созданной установки для проведения термоциклирования.

3.3.3. Приготовление ПЦР смесей и режимы амплификации.

3.3.4. Статическая модификация модельных кремниевых пластин, приготовление растворов и методики обработки пластин.

3.3.5. Растворы для динамической модификации модельных кремниевых пластин.

3.3.6. Анализ результатов ПЦР: агарозный гель-электрофорез.

3.3.7. Модификация ПЦР микрочипов.

3.3.8. Метод расчета величины порогового цикла ПЦР кривой.

3.3.9. Методики очистки ПЦР микрочипа.

ГЛАВА 4. ПЦР-АНАЛИЗ В СТЕКЛЯННО-КРЕМНИЕВОМ МИКРОЧИПЕ.

4.1. Оптимизация методов ввода пробы в микрочип.

4.2. Предотвращение движения и испарения внутри микроканалов и реакторов микрочипа при проведении ПЦР-анализа.

4.3. Предотвращение сорбции компонентов ПЦР.

4.4. Регенерация поверхности микрореакторов микрочипа после проведения ПЦР.

ГЛАВА 5. ПЦР-АНАЛИЗ В МИКРОРЕАКТОРАХ ПЦР МИКРОЧИПА: ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОТЕКАНИЯ РЕАКЦИИ И СРАВНЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ СОЗДАННОЙ МИКРОЧИПОВОЙ СИСТЕМЫ СО СТАНДАРТНЫМ ОБОРУДОВАНИЕМ.

5.1. Увеличение селективности определения ДНК методом ПЦР-РВ в микрореакторах ПЦР микрочипа: оптимизация генерации репортного сигнала.

5.2. Сравнение аналитических характеристик экспериментальной установки и стандартного ПЦР-РВ-анализатора.

5.3. Создание методики экспрессного определения ДНК методом ПЦР-РВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка микрофлюидной аналитической системы для экспрессного определения ДНК методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени»

Существующие на настоящий момент методы анализа в области биоаналитической химии и медицинской диагностики развиваются по пути массового автоматического анализа сложных проб в сторону повышения производительности, экспрессности, селективности и экономичности анализа. Так как количество объектов анализа неуклонно растет, то это влечет за собой необходимость использования производительных автоматизированных аналитических систем, и проведения анализа в режиме максимально приближенному к реальному времени. Особенно необходимо увеличение экспрессности анализа для целей геномных исследований, медицинской диагностики и для проведения анализа в условиях чрезвычайных ситуаций. В современной аналитической химии при анализе различных объектов все более широкое применение находят микрофлюидные аналитические системы (МФАС), основой которых являются микрофлюидные чипы (МФЧ). Они представляют собой устройства планарной геометрии, в которых создана разветвленная сеть микроструктур (микроканалов и микрореакторов), в которых возможно осуществление аналитических операций в микрофлюидных потоках жидкости. К преимуществам МФЧ относятся малый расход проб и реагентов в ходе проведения анализов, возможность интеграции нескольких стадий анализа на едином устройстве, ускорение протекания химических реакций, процессов массо- и теплопереноса из-за значительного увеличения отношения площади поверхности к объему (высокая роль поверхностных эффектов) по сравнению с обычными реакторами. Типичные объемы проб при работе с микрочипами находятся в диапазоне от десятков нл до сотен мкл, что позволяет использовать такие устройства при анализе объектов в областях медицинской клинической диагностики, биохимии и лабораторной криминалистике, где расход дорогостоящих реагентов и малый объем проб часто являются ключевыми факторами. Уже показаны возможности проведения и интеграции на одном микрочипе ряда операций и процессов: (био)химических реакций в проточной микроканальной системе или в микрореакторе; жидкостной и твердофазной экстракции в потоке; разделения компонентов смеси методами хроматографии и капиллярного электрофореза.

Лидирующие позиции в применении МФЧ занимают методы пробоподготовки биообъектов, и такие методы как иммунноферментный анализ (ИФА) и полимеразно-цепная реакция (ПЦР) традиционно используемые для выявления и изучения инфекционных и вирусных заболеваний. Суть последнего метода заключается в том, что из нескольких копий геномной ДНК, которую нельзя зафиксировать в силу ее малой концентрации в большом объеме пробы, при циклической смене температур и использовании определенного набора реагентов можно получить несколько миллионов ДНК копий (ампликонов). Детектировать ПЦР продукты можно различными способами: при помощи горизонтального гель-электрофореза или непосредственно во время анализа, т.е. совмещая намножение и детектирование. Последний метод носит название ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и имеет ряд потенциальных преимуществ, таких как значительное увеличение экспрессности анализа за счет совмещения операций намножения и детектирования, уменьшение трудоемких операций, отсутствие контаминации проб и, что самое главное, возможность оценки начальной концентрации ДНК в пробе. Стандартное оборудование для проведения ПЦР имеет такие ограничения как низкие скорости термоциклирования, неравномерное распределение температур внутри реакторов, наличие температурного градиента нагреваемой зоны и большой расход дорогостоящих реагентов на единичный анализ. Перечисленные параметры ограничивают производительность, экспрессность и селективность анализа. Реализация ПЦР в микроструктурах микрофлюидных чипов позволяет устранить эти ограничения, так как за счет выбора материала микрочипа с высокими коэффициентами теплопроводности и высокой плотности расположения микрореакторов малого объема достигаются высокие скорости нагрева/охлаждения ПЦР смеси и равномерное распределение температур внутри нагреваемой зоны, что приводит к увеличению экспрессности, производительности и селективности анализа. Наиболее часто при создании ПЦР-МФЧ возникают такие трудности, как:

1. инактивация компонентов ПЦР смеси на поверхность микрореакторов и каналов, что влечет ингибирование реакции или значительное снижение эффективности намножения;

2. низкая эффективность использования пробы;

3. очистка ПЦР микрочипа для многократного использования.

На настоящий момент, уже создан ряд биоаналитических МФЧ, позволяющих проводить не только ПЦР-анализ, но и детектирование ампликонов, а также пробоподготовку биологических объектов, таких как кровь или иные биологические жидкости. Существующие микрофлюидные ПЦР системы ограничены или малым количеством микрореакторов или низкими скоростями нагрева/охлаждения реакционной смеси, вызванных использованием полимерных материалов при изготовлении микрочипов. Таким образом, большинство существующих микрофлюидных аналитических ПЦР систем имеют ограниченные возможности, не сочетающие все достоинства МФЧ.

Следовательно, необходимы теоретически обоснованные экспериментальные исследования по разработке новой мультиреакторной микрофлюидной биоаналитической системы, позволяющей экспрессно, селективно и высокочувствительно проводить ПЦР-анализ нескольких проб в режиме реального времени.

Целью данной диссертационной работы является разработка, мультиреакторной микрофлюидной аналитической системы, для экспрессного, селективного и высокочувствительного определения ДНК методом ПЦР-РВ.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Лаврова, Марина Викторовна

выводы

1. Оптимизирована топология мультиреакторного ПЦР микрочипа, что позволило увеличить производительность системы. Разработаны способы экспрессного ввода проб и герметизации микрочипа. Разработан способ регенерации поверхности микрореакторов, который позволяет многократно использовать ПЦР микрочип.

2. Разработана методика пассивации поверхности микрореакторов, обеспечивающая минимизацию сорбции компонентов ПЦР смеси, что позволило достичь теоретически максимально возможной чувствительности разработанной аналитической системы. Минимальное детектируемое количество молекул ДНК составило 1 копию на микрореактор.

3. Разработана мультиреакторная микрофлюидная аналитическая система, позволяющая проводить определение ДНК методом ПЦР-РВ, с близкими к теоретически возможным минимальными временами термоцикла.

4. Разработана методика экспрессного определения ДНК, оценены ее правильность и воспроизводимость с использованием тест-системы для определения вируса гепатита С. Время ПЦР-РВ анализа составило всего 18 мин, что в 4.5 раза быстрее, по сравнению со стандартным методом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Лаврова, Марина Викторовна, 2007 год

1. Sethu, P. Cast epoxy-based microfluidic systems and their application in biotechnology Текст. / С. H. Mastrangelo // Sens. Actuators B. 2004. - № 98. - C. 337346.

2. Беленький, Б.Г. Микрофлюидные аналитические системы (Часть 1) Текст. / Н.И. Комяк, В.Е. Курочкин, А. А. Евстрапов, В. Л. Суханов // Научное приборостроение. 2000. - Т. 10. - № 2. - С. 57-64.

3. Беленький, Б.Г. Микрофлюидные аналитические системы (Часть 2) Текст. / Н.И. Комяк, В.Е. Курочкин, А.А. Евстрапов, В.Л. Суханов // Научное приборостроение. 2000. - Т. 10. - № 3. - С. 3-16.

4. Беленький, Б.Г. Новые возможности лабораторной аналитики: микрофлюидные чип-анализаторы Текст. // Клиническая лабораторная диагностика.2001.-№3,-С. 26-31.

5. Беленький, Б.Г. Новые возможности лабораторной аналитики: микрофлюидные чип-анализаторы (продолжение) Текст. // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - № 4. - С. 25-32.

6. Paegel, В.М. Microfluidic devices for DNA sequencing: sample preparation and electrophoretic analysis Text. / R.G. Blazej, R.A. Mathies [Text] // Current Opinion in Biotechnology. 2003. - V. 14. - P. 42-50.

7. Surmeian, M. Three-layer flow membrane system on a microchip for investigation of molecular transport Text. / M.N. Slyadnev, H. Hisamoto, A. Hibara, K. Uchiyama, T. Kitamori[Text] // Anal. Chem. 2002. - V. 74. - № 9. - P. 2014-2020.

8. Lindner, D. The Micro-Chemlab project: Micro Total Analysis System R&D at Sandia National Laboratories Text. // Lab. Chip. 2001. - V. 1. - P. 15N - 19N.

9. Eijkel, J.C.T. A miniaturised total chemical analysis system: ц-TAS in "Organic Mesocsopic Chemistry" Text. / A.J. de Mello, A. Manz // IUPAC monograph (Ed. H. Masuhara, F.C. Schryver). 1999.

10. Tiidos, A.J. Trends in miniaturized total analytical systems for point-of-care testing in clinical chemistry Text. / G.A.J. Besselink, R.B.M. Schasfoort // Lab Chip. 2001. -V. l.-P. 83-95.

11. Kopf-SiM, A.R. Successes and challenges of lab-on-a-chip Text. // Lab Chip.2002. V. 2. - P. 42N-47N.

12. Sanders, G.H.W. Chip-based microsystems for genomic and proteomic analysis Text. / A. Manz // Trends Anal. Chem. 2000. - V. 19. - P. 364-378.

13. Li, J. Application of Microfluidic Devices to Proteomics Research Text. / T. Le Riehe, T.L. Tremblay, C. Wang, E. Bonneil, D.J. Harrison, P. Thibault // Molecular&Cellular Proteomics. 2002. - V. 12. - P. 157-168.

14. Liu, R.H. Self-contained, fully integrated biochip for samples preparation, polymerase chain reaction amplification, and DNA microarray detection Text. / J. Yang, R. Lenigk, J. Bonanno, P. Grodzinski // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - P. 1824-1831.

15. Gascoyne, P. Microfluidic approaches to malaria detection Text. / J. Satayavivad, M. Ruchirawat // Acta Tropica. 2004. - V. 89. - P. 357-369.

16. Nagai, H. Development of a microchamber array for picoliter PCR Text. / Y. Murakami, Y. Morita, K. Yokoyama, E. Tamiya // Anal. Chem. 2001. - V. 73. - № 5. - P. 1043-1047.

17. Zhaoa, Z. Monolithically integrated PCR biochip for DNA amplification Text. / Z. Cui, D. Cui, S. Xia // Sens. Actuators A. 2003. - V. 108. - P. 162-167.

18. Мирзабеков, А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века Текст. // Вестник РАН. 2003. - Т.73. - № 5. с. 412-426.

19. Nagai, Н. High-throughput PCR in silicon based microchamber array Text. / Y. Murakami, K. Yokoyama, E. Tamiya // Biosens. Bioelectron. 2001. - V. 16. - P. 1015— 1019.

20. Anderson, R.C. A miniature integrated device for automated multistep genetic assays Text. / X. Su, G.J. Bogdan, J. Fenton // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - № 12. -P. 60-65.

21. Sato, K. Integration of chemical and biochemical analysis systems into a glass microchip Text. / A. Hibara, M. Tokeshi, H. Hisamoto, T. Kitamori // Anal. Sci. 2003. - V. 19. - P. 15-22.

22. Sato, K. Integration of an immunosorbent assay system: analysis of secretory human immunoglobulin A on polystyrene beads in a microchip Text. / M. Tokeshi, T. Odake, H. Kimura, T. Ooi, M. Nakao, T. Kitamori // Anal. Chem. 2000. - V. 20 - P. 144-147.

23. Lee, P.H. Transport, Manipulation, and Reaction of Biological Cells On-Chip Using Electrokinetic Effects Text. / D.J. Harrison // Anal. Chem. 1997. - V. 69. - № 8. - P. 1564.

24. Cady, N.C. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures Text. / S. Stelick, C.A. Batt // Biosens. Bioelectron. 2003. - V. 19. - P. 59-66.

25. Cady, N.C. Real-time PCR detection of Listeria monocytogenes using an integrated microfluidics platform Text. / S. Stelick, M.V. Kunnavakkam, C.A. Batt// Sens. Actuators. B. -2005. V. 107.-P. 332-341.

26. Wilding, P. Integrated cell isolation and polymerase chain reaction analysis analysis using silicon microfilter chambers Text. / L J. Kricka, J. Cheng, G. Hvichia, M.A. Shoffner, P. Fortina //Anal. Biochem. 1998. - V. 257. - P. 95-100.

27. Koh, C.G. Integrating polymerase chain reaction, valving, and electrophoresis in a plastic device for bacterial detection Text. / W. Tan, M. Zhao, A.J. Ricco, Z.H. Fan // Anal. Chem. 2003. - V. 75. - № 17. - P. 4591- 4598.

28. Harrison, D.J. A miniaturized capillary electrophoresis based chemical analysis system on a chip Text. / K. Fluri, K. Seiler, Z.H. Fan, C.S. Effenhauser, A. Manz // Science. 1993.-V. 261.-P. 895-902.

29. Yuen, P.K. Microchip Module for Blood Sample Preparationand Nucleic Acid Amplification Reactions Text. / L.J. Kricka, P. Fortina, N.J. Panaro, T. Sakazume, P. Wilding//Genome Res. 2001. V. 11. - № 3. P. 405-412.

30. Mullis, K.B. The Polymerase Chain Reaction Text. / F. Ferre, R.A. Gibbs // Birkhauser, Boston, Mass.

31. Глик, Б. Молекулярная биотехнология, перевод с англ. Баскакова Н.В., Колесникова О.А., Романова Ю.М., Серова М.А., Чухрова A.JI. Текст. / Дж. Пастернак // М. МИР.- 2002.

32. Досон, Р. Справочник биохимика, перевод с англ. B.JI. Друцы и О.Н. Королевой Текст. / Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс // М. Мир. -1991.

33. Кольман, Я. Наглядная биохимия, перевод с нем. Козлова JI. В., Левиной Е. С., Решетова П. Д. Текст. / К.Г. Рем // М. Мир. - 2004.

34. Сингер, М. Гены и геномы в 2 т., перевод с англ. Ильина Т., Романова Ю. Текст. / П. Берг // М. Мир. - 1998.

35. Petersen, К.Е. Toward next generation clinical diagnostic instruments: scaling and new processing paradigms Text. / W.A. McMillan, G.T.A. Kovacs, M.A. Northrup, L.A. Christel, F. Pourahmadi //Biomed. Microdevices. 1998. - V. 1. - № 1. - P. 71-79.

36. Vaerman, J.L. Evaluation of real-time PCR data Text. / P. Saussoy, I. Ingargiola // J. of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 2004. - V. 18. - P. 212-214.

37. Термостат программируемый для проведения ПЦР-анализа четырехканальный ТП4-ПЦР-01-«Терцик» Текст. // www.dna-technology.ru

38. Анализаторы нуклеиновых кислот АНК Текст. // www.syntol.ru/productank.htm

39. Specifications for MJ Mini Gradient Thermal Cycler Text. // www.biorad.com

40. Reiss, J. The polymerase chain reaction and its potential role in clinical diagnostics and research / J. Intern. Med. -1991. -V. 230. № 5. p. 391-395.

41. Kainz, P. Specificity-enhanced hot-start PCR: addition of double-stranded DNA fragments adapted to the annealing temperature Text. / A. Schmiedlechner, H.B. Strack // Biotechniques. 2000. - V. 28. - № 2. - P. 278-282.

42. Malcov, M. Preimplantation genetic diagnosis for fragile X syndrome using multiplex nested PCR Text. / T. Naiman, D.B. Yosef, A. Carmon, N. Mey-Raz, A. Amit, I. Vagman, Y. Yaron // Reprod. Biomed. Online. 2007. - V. 14. - № 4. - P. 515521.

43. Hiihmer, A.F.R. Noncontact infrared-mediated thermocycling for effective polymerase chain reaction amplification of DNA in nanoliter volumes Text. / J.P. Landers // Anal. Chem. 2000. - V. 72. - P. 5507-5512.

44. Waters, L.C. Multiple sample PCR amplification and electrophoretic analysis on a microchip Text. / S.C. Jacobson, N. Kroutchinina, J. Khandurina, R.S. Foote, J.M. Ramsey //Anal. Chem. 1998. - V. 70. - P. 5172-5176.

45. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer Text. // Methods -2001. V.-25.-№1,-P.-78-86.

46. Higuchi, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences Text. / G. Dollinger, P.S. Walsh //Biotechnology. 1992. - V. 10. - P. 413-417.

47. Elniforo, E.M. Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology Text. / A.M. Ashishi, R.J. Cooper, P.E. Klapper // Clin. Microbiol. Rev. 2000. - V. 3. - № 4. - P. 559-570.

48. Adleberg, J.M. Use of the polymerase chain reaction in the diagnosis of ocular disease Text. / C. Wittwer // Curr. Opin. Ophthalmol. 1995. - V. 6. - P. 80-85.

49. Wittwer, C.T. Fluorescence monitoring of rapid cycle PCR for quantification Text. / K. Ririe, R.P. Rasmussen // Gene quantification. 1998. Birkhauser, Boston MA.

50. Livak, K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACt method Text. / T.D. Schmittgen // Methods. 2001. - V. 25. - P. 402-408.

51. Pfaffl, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR Text. //Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 2002-2007.

52. Rutledge, R.G. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves Text. / C. Cote // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - № 16. - P. 93-99.

53. Krishnan, M. Polymerase chain reaction in high surface-to-volume Si02 microstructures Text. / D.T. Burke, M.A. Burns // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - № 22. -P. 6588-6593.

54. Kalinina, O. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection Text. /1. Lebedeva, J. Brown, J. Silver//Nucleic Acids Res. 1997,-V. 25.-№ 10.-P. 1999-2004.

55. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methtodological implications Text. / H. Brunner, J. Berghagen, F. Vitzthum //Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 103-113.

56. Wittwer, C. Rapid Cycle Real-time PCR Text. / K. Nakagawara // Methods and Applications. Springer Press. - Heidelberg. - P. 21-34.

57. Cosa, G. Photophysical properties of fluorescent DNA-dyes bound to single- and double-stranded DNA in aqueous buffered solution Text. / K.S. Focsaneanu, J.R. McLean, J.P. McNamee, J.C. Scaiano // Photochem. Photobiol. 2001. - V. 73. - P. 585599.

58. Belgrader, P. Rapid PCR for identity testing using a battery-powered miniature thermal cycler Text. / J.K. Smith, V.W. Weedn, M.A. Northrup // J. Forensic. Sei. 1998. -V. 43.-№2.-P. 315-319.

59. Taylor, T.B. Optimization of the performance of the polymerase chain reaction in silicon-based microstructures Text. / E.S Winn-Deen, E. Picozza, T.M. Woudenberg, M. Albin //Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - № 15. - P. 3164-3168.

60. Benett, W.J. Handheld advanced nucleic acid analyzer Text. / J.B. Richards, P. Stratton, D.R. Hadley, B.H. Bodtker, S.L. Nasarabadi // ProcSPIE. 2000. - № 420. - P. 55-63.

61. Lee, D.S. Bulk micromachined submicroliter-volume PCR chip with very rapid thermal response and low power consumption Text. / S.H. Park, H. Yang, K.-H. Chung, T.H. Yoon, S.J. Kim, K. Kim, Y.T. Kim // Lab Chip. 2004. - V. 4. - P. 401-407.

62. Eijkel, J.C.T. Micromachined heated chemical reactor for pre-colomn derivatization Text. / A. Prak, S. Cowen, D.H. Craston, A. Manz // J. Chromatogr. A. -1998.-V. 815.-P. 265-271.

63. Ueno, K. Channel Shape Effects on the Solution-Flow Characteristics and the Liquid/Liquid Extraction Efficiency in Polymer MicroChannel Chips Text. / H.-B. Kim, N. Kitamura // Anal. Sei. 2003. - V. 19. - P. 391-394.

64. Becker, H., Polumer microfluidic devices Text. / L.E. Locascio // Talanta. 2002. -V. 56.-P. 267-287.

65. De Mello, A.J. Plastic fantastic? Text. // Lab Chip. 2002. - V. 2. - P. 31N-36N.

66. Shin, Y.S. PDMS based micro PCR chip with parylene coating Text. / K. Cho, S.H. Lim, S. Chung, S.J. Park, C. Chung // J. Micromech. Microeng. 2003. - V. 13. - P. 768-774.

67. Giordano, B.C. Polymerase chain reaction in polymeric microchips: DNA amplification in less than 240 seconds Text. / J. Ferrance, S. Swedberg, A.F.R. Hiihmer, J.P. Landers //Anal. Biochem. 2001. - V. 291. - P. 124-132.

68. Lagally, E.T. Integrated portable genetic analysis microsystem for pathogen/infectious disease detection Text. / J.R. Scherer, R.G. Blazej, N.M. Toriello, B.A. Diep, M. Ramchandani //Anal. Chem. 2004. - V. 76. - № 11. - P. 3162-3170.

69. Lagally, E.T. Integrated genetic analysis Microsystems Text. / H.T. Soh // Critical Reviews in solid state and materials sciences. 2005. - V. 30. - P. 207-233.

70. Cheng, J. Chip PCR. II. Investigation of different PCR amplification system in microfabricated silicon-glass chip Text. / M.A. Shoffner, G.H. Hvichia, L.J. Kricka, P. Wilding // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - №. 2. - P. 380-385.

71. Shoffner, M.A. Chip PCR. I. Surface passivation of microfabricated silicon-glass chip for PCR Text. / J. Cheng, G.E. Hvichia, L.J. Kricka, P. Wilding // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - № 2. - P. 375-379.

72. Liao, C. Micromachined polymerase chain reaction system for multiple DNA amplification of upper respiratory tract infectious diseases Text. / G. Lee, J. Wu, C. Changd, T. Hsieh, F. Huangb, C. Luo // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 20. - P. 1341— 1348.

73. Giordano, B.C. Towards dynamic of glass microchip chamber for amplifying DNA via the polymerase chain reaction Text. / E.R. Copeland, J.P. Landers // Electrophoresis. 2001. - V. 22. - P. 334-340.

74. Pal, D. A portable battery-operated chip thermocycler based on induction heating Text. / V. Venkataraman // Sens. Actuators A Phys. 2002. - V. 102. - P. 151-156.

75. Fintschenko, Y. Silicon microtechnology and microstructures in separation science Text. / A. Van den Berg//J. Chromatogr. A. 1998. - V. 819. - P. 3-12.

76. Tjerkstra, R.W. Etching Technology for microchannels Text. / M. De Boer, E. Berenshot, J.G.C. Gardeniers, A. Van den Berg, M. Elwenspoek // Proc. IEEE MEMS" 97. 1997.-P. 147-152.

77. Seidel, H. Anisotropic etching of crystalline silicon in alkaline solutions; I Orientetion dependence and behavior of passivation layers Text. / L. Csepregi, A. Heuberger, H. Baumgartel // J. Electrochemical Soc. 1990. - V. 137. - №. 11. - P. 36123622.

78. Tjerkstra, R.W. Etching technology for chromatography microchannels Text. / M. De Boer, E. Berenshot, J.G.C. Gardeniers, A. Van den Berg, M. Elwenspoek // Electrochimica Acta. 1997. - V. 42. - № 20-22. - P. 3399-3406.

79. Пресс, Ф.П. Фотолитографические методы в технологии полупроводниковых приборов и интегральных микросхем Текст. // М. Советское радио. - 1978. - 123 с.

80. Lagally, Е.Т. Fully integrated PCR-capillary electrophoresis microsystem for DNA analysis Text. / C.A. Emrich, R.A. Mathies // Lab. Chip. 2001. - V. 1. - P. 102-107.

81. Fujii, T. Microchip-based biochemical analysis devices for 'bioarchitect' research Text. //RIKEN Review. 2001. - V. 41. - P. 98-99.

82. Chou, C.F. A miniaturized cyclic PCR device—modeling and experiments Text. / R. Changrani, P. Roberts, D. Sadlera, J. Burdona, F. Zenhauserna, S. Lin, A. Mulholland, N. Swami, R. Terbrueggen // J. Micromech. Microeng. 2002. - V. 61-62. - P. 921-925.

83. Liu, J. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction Text. / M. Enzelberger, S. Quake //Electrophoresis. 2002. - V. 23. - P. 1531-1536.

84. Kopp, M.U. Chemical amplification: continuous-flow PCR on a chip Text. / A.J. de Mello, A. Manz // Science. 1998. - V. 280. - P. 1046-1048.

85. Hansen, C.L. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator Text. / M. Sommer, S.R. Quake // PNAS 2004;101;14431-14436.

86. Lee, T.M.H. A miniaturized DNA amplifier: its application in traditional Chinese medicine Text. / I.M. Hsing, A.I.K. Lao, M.C. Carles // Anal. Chem. 2000. - V. 72. - P. 4242-4247.

87. Erill, I. Biochemical analysis and optimization of inhibition and adsorption phenomena in glass-silicon PCR-chips Text. / S. Campoy, N. Erill, J. Barbé, J. Aguiló //Sens. Actuators B. 2003. - V. 96. - P. 685-692.

88. Panaro, N.J. Surface effects on PCR reactions in multichip microfluidic platforms Text. / J.L. Xing, P. Fortina, L.J. Kricka, P. Wilding // Biomed. Microdevices. 2004. -V. 6. - № 2. - P. 75-80.

89. Lagally, E.T. Monolithic integrated microfluidic DNA amplification and capillary electrophoresis analysis system Text. / P.C. Simpson, R.A. Mathies // Sens. Actuators В Chem. 2000. - V. 63. - P. 138-146.

90. Khandurina, J. Integrated system for rapid PCR-based DNA analysis in microfluidic devices Text. / Т.Е. McKnight, S.C. Jacobson, L.C. Waters, R.S. Foote, J.M. Ramsey // Anal. Chem. 2000. - V. 72. - № 13. - P. 2995-3000.

91. Felbel, J. Investigations on the compatibility of chemically oxidized silicon (SiOx)-surfaces for applications towards chip-based polymerase chain reaction Text. /1. Bieber, J. Pipper, J.M. Köhler // Chem. Eng. J. 2004. - V. 101. - P. 333-338.

92. Lavrova, M.V. Surface Modification of Microchip Input Reservoirs for Pressure-induced Sample Injection into Microreactors Text. / V.A. Kazakov, A.A. Ganeev, L.M. Moskvin, M.N. Slyadnev//Anal. Sei. 2005. - V. 21. - № 4. P.293-294.

93. Hurley, J. Nanoliter high throughput quantitative PCR Morrison Text. / J. Garcia, Y.K. Katz,A. Roberts, D. Cho, J. Kanigan, T. Ilyin, S.E. Horowitz, D. Dixon, J.M., Brenan [Text] / Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - № 18. - P. 123-132.

94. Profi, C. Low volume PCR (LV-PCR) for STR typing of forensic casework samples Text. / M.A. Rothschild, P.M. Schneider // International Congress Serie. 2006. -V. 1288.-P. 645-647.

95. Чернышев, A.B. Проблемы создания оборудования для медицинской ПЦР диагностики Текст. / B.JI. Друца // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2004. - № 12. - С. 18.

96. Tanaka, Y. Non-contact photothermal control of enzyme reactions on a microchip by using a compact diode laser Text. / M.N. Slyadnev, A. Hibara, M. Tokeshi, T. Kitamori // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 894. - P. 45-51.

97. Jorgenson, J.W. Contactless resistive heater for liquids in microenvironments and related methods Text. // United States Patent Application: 200220092363. July-18-2002.

98. Poser, S. Chip elements for fast thermocycling Text. / T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J.M. Kohler, D. Schimkat // Sens. Actuators A Phys. 1997. - V. 62. - P. 672-675.

99. Lao, A.I.K. Precise temperature control of microfluidic chamber for gas and liquid phase reactions Text. / T.M.H. Lee, I.M. Hsing, N.Y. Ip // Sens, and Actuators. 2000. -V. 84.-P. 11-17.

100. Suna, K. A heater-integrated transparent microchannel chip for continuous-flow PCR Text. / A. Yamaguchib, Y. Ishidac, S. Matsuoa, H. Misawa // Sens, and Actuators B. 2002. - V. 84. - P. 283-289.

101. Sasaki, N. A Novel Control System for Polymerase Chain Reaction Text. / M. Izawa, M. Shimojo, K. Shibata, J. Akiyama, M. Itoh, S. Nagaoka, P. Carninci, Y. Okazaki, T.

102. Moriuchi, M. Muramatsu, S. Watanabe, Y. Hayashizaki // DNA Research. 1997. - V. 4. - P. 387-391.

103. Liu, J. Solving the "world-to-chip" interface problem with a microfluidic matrix Text. / C. Hansen, R.S. Quake // Anal. Chem. 2003. - V. 75. - P. 4718^723.

104. GuIIiksen, A. Real-time nucleic acid sequence-based amplification in nanoliter volumes Text. / L. Solli, F. Karisen, H. Rogne, E. Hovig, T. Nordstrom // Anal. Chem. -2004. V. 76. - P. 9-14.

105. Fluorescence excitation and emission spectra of SYBR Green I nucleic acid gel stain bound to DNA Text. // www.probes.invitrogen.com

106. Fluorescence excitation and emission spectra of 6-FAM Text. // www.biosearchtechnologies.com

107. Black hole quencher dyes Text. // www.biosearchtech.com

108. MultiBlue Biotech CCD Camera System Text. // www, optoelectronics. perkinelmer.com

109. Сляднев, M.H. Микрофлюидная система экстракции с химически индуцированным образованием трех фаз в потоке Текст. / В.А. Казаков, Е.Д. Макаров, A.A. Танеев, JI.H. Москвин // Научное Приборостроение. 2005. - Т. 15. - № 2. - С.11-20.

110. Приборы для анализа ДНК и РНК на основе ПЦР в реальном времени АНК-16 и АНК-32 Текст. // www.iai.rssi.ru/pcr.php

111. Chaudhari, А.М. Transient liquid crystal thermometry of microfabricated PCR vessel arrays Text. / T.M. Woudenberg, M. Albin, K.E. Goodson // J. Microelectromech. Syst. -1998.-V. 7.-№4.-P. 345-355.

112. Lee, G.B. Microfluidic chips for DNA amplification, electrophoresis separation and on-line optical detection Text. / C.H. Lin, F.C. Huang, C.S. Liao, C.Y. Lee, S.H. Chen // IEEE. MEMS. 2003. - P. 423- 426.

113. Curcio, M., Continuous segmented-flow polymerase chain reaction for high-throughput miniaturized DNA amplification Text. / J. Roeraade // Anal. Chem. 2003. - V. 75.-№ l.-P. 1-7.

114. Coppeta, J. Fluorescence Imaging Normalization For Direct Planar Scalar Behavior Measurements," Experiments In Fluids Text. / C. Rogers //Experimentais in Fluids 1998. -V. 25.-№ l.-P. 20-24.

115. Roe, B.A. DNA Isolation and Sequencing Essential Techniques Series Text. / J. Crabtree, A. Khan. DNA Isolation and Sequencing //. John Wiley and Sons Ltd, New York. -1996.-P. 326.

116. Bar, T. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR Text. / A. Stahlberg, A. Muszta, M. Kubista // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - № 17. - P. 105-112.

117. Tichopad, A. Standardized determination of real-time PCR effciency from a single reaction set-up Text. / M. Dilger, G. Schwarz, M.W. Pfaf // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31.-№20.-P. 122-128.

118. Tichopad, A. Improving quantitative real-time RT-PCR reproducibility by boosting primer-linked amplification efficiency Text. / A. Dzidic, M.W. Pfaf // Biotechnology Letters. 2002. - V. 24.-P. 2053-2056.

119. Johnson, M.P. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR Text. / L.M. Haupt, L.R. Griffths // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - № 6. - P. 55-64.

120. Kricka, L.J. Microchip PCR Text. / P. Wilding // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - V. 377. - P. 820-825.

121. Zhang, C. PCR microfluidic devices for DNA amplification Text. / J. Xu, M.W. Zheng // Biotechnology Advances. 2006. - V. 24. - P. 243-284.

122. Lagally, E. Single-Molecule DNA Amplification and Analysis in an Integrated Microfluidic Device Text. /1. Medintz, R.A. Mathies // Anal. Chem. 2001. - V. 73. - P. 565-570.

123. Fazzio, T.G. Chromatin Remodeling In Vivo: Evidence for a Nucleosome Sliding Mechanism Text. / T. Tsukiyama // Molecular Cell. 2003. - V. 12. - P. 1333-1340.

124. Nazarenko, I. Multiplex quantitative PCR used self-quenched primers labeled with a single fluorophore Text. / B. Lowe, M. Darfler, P. Iconomi, D. Schtuster, A. Rashtchain // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - № 9. - P. 37-44.

125. Chelsey, H. Faster quantitative real-time PCR protocols may lose sensitivity and show increased variability Text. / W. Vahrson and D. P. Dittmer // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33.-№.21.-P. 182-190.