Разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов с использованием Н-фосфонатной конденсации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Есипов, Дмитрий Станиславович

• Есипов, Дмитрий Станиславович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Есипов, Дмитрий Станиславович

Содержание

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов

Нуклеозид Н-фосфонаты (методы получения)

синтез олигодезоксирибонуклеотидов

Стадия детритилированш

Стадия конденсации

Стабильность олигонуклеотид Н-фосфонатов

Стадия хеширования

Стадия окисления

синтез модифицированных олигонуклеотидов

заключение

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Разработка методов синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по 5'- или 3'-концу

Синтез 5 '-фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов

Синтез олигонуклеотид а, терминированного 3 '-азидотимидином

Разработка метода синтеза олигонуклеотидов, содержащих липофильные группы

Синтез церамидфосфотимидина

Синтез церамидфосфоазидотимидина

Разработка метода синтеза модифицированных олигонуклеотидов на основе реакции Тодда-Атертона

Изучение устойчивости амидофосфатной межнуклеотидной связи в условиях олигонуклеотидного синтеза

Синтез олигонуклеотид а с аминоспейсером и его иммобилизация на поверхности макропористого носителя

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Приборы и материалы

Методы

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список используемых сокращений

ВЭЖХ - высоко-эффективная жидкостная хроматография

ДХУ - дихлоруксусная кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ABz - N6-6emomi 2' -дезоксиаденозин

Ас20 - уксусный ангидрид

AZT(azT) - З'-азидотимидин

В - нуклеиновые основания

CBz - ]Ч4-беюоил 2' -дезоксицитидин

CPG - control pore glasse (макропористое стекло с контролируемым

размером пор)

DBU - 1,8-диазобицикло-[5.4.0]-ундец-7-ен

DCCD - дициклогексилкарбодиимид

DEAE - диэтиламиноэтил

DMTr - диметокситритильная группа

D4T - 3'-дезокси-2',3'-дидегидротимидин

FmocCl - флуоренилметоксикарбонилхлорид

GlBu - М2-изобутирил 2'-дезоксигуанозин

Melrn - N-метилимидазол

N-MM - N-метилморфолин

(NPh-Et)p - и-нитрофенилэтил фосфат

PivCl - пивалоилхлорид

p-NPh-OH - л-нитрофенол

Ру - пиридин

RT - обратная транскриптаза

Т - тимидин (2'-дезокситимидин)

irei-BuDMe - /ире/и-бутилдиметил

TEA - триэтиламин

ТЕААс - триэтиламмония ацетат

ТЕАВ - триэтиламмония бикарбонат

THF - тетрагидрофуран

TPSC1 - триизопропилбензолсульфохлорид

Tri - триазол

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов с использованием Н-фосфонатной конденсации»

Введение

Олигонуклеотиды в настоящее время являются незаменимыми инструментами для генной инженерии. В последнее время они находят все большее применение и в медицине для диагностики наследственных и вирусных заболеваний. Делаются попытки использовать олигонуклеотидные производные для генетической коррекции организма. Новейшие разработки по использованию иммобилизованных олигонуклеотидов дают возможность реализации высокоскоростного секвенирования нуклеиновых кислот. Модифицированные олигонуклеотиды, несущие различные активные группы, испытываются как терапевтические препараты. Поэтому разработка и совершенствование методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов, а также изучение их физико-химических и молекулярно-биологических свойств является одной из ключевых задач биоорганической химии.

Целью работы являлась разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов, содержащих функциональные группы ненуклеотидной природы или модифицированные нуклеозиды.

Научная новизна и практическая значимость работы. С использованием Н-фосфонатной конденсации разработаны методы введения в олигонуклеотиды 5'-фосфатной группы, 3'-концевого остатка азидотимидина, спейсерной аминогруппы по межнуклеотидному фосфату, липофильного 5'-концевого остатка церамида. Изучена стабильность амидофосфатдиэфирной связи в условиях олигонуклеотидного синтеза. С

помощью разработанных методов осуществлен синтез ряда модифицированных олигонуклеотидов, которые были использованы при химико-ферментативном синтезе протяженного фрагмента ДНК rec А-промотора Е. coli*.

Разработанные методы дают возможность создания новых аффинных лигандов для изучения белок-нуклеиновых взаимодействий. Они также могут быть использованы для приготовления нового класса антисмысловых олигонуклеотидов - потенциальных регуляторов экспрессии генов.

Положения, выносимые на защиту:

Разработка метода получения 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов.

Разработка метода синтеза олигонуклеотидов, содержащих 3'-концевой азидотимидин.

Разработка метода получения липофильных аналогов олигонуклеотидов.

Разработка метода получения олигонуклеотидов, содержащих спейсерные аминогруппы.

* Эта часть работы выполнялась совместно с Калиниченко C.B. (сотрудником лаборатории химии генов ИБХ РАН)

Обзор литературы

Обзор литературы посвящен Н-фосфонатному методу синтеза олигонуклеотидов. В нем рассматриваются основные аспекты Н-фосфонатного метода синтеза олигонуклеотидов, такие как: 1) методы получения мононуклеозид Н-фосфонатов; 2) методы создания Н-фосфонатдиэфирной связи; 3) устойчивость Н-фосфонатдиэфиров, побочные реакции; 4) стадия кепирования; 5) стадия окисления. Обсуждены достоинства и недостатки метода применительно к синтезу модифицированных олигонуклеотидов. В отдельную главу собраны наиболее яркие примеры использования Н-фосфонатного метода для получения модифицированных олигонуклеотидов.

Н-Фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов

Рибонуклеозид Н-фосфонаты для синтеза олигонуклеотидов были впервые применены Тоддом в 1957 г. для приготовления дирибонуклеозид фосфатдиэфиров [1]. Н-Фосфонаты активировались с помощью дифенилхлорфосфата, в дальнейшем этот активатор был использован и в синтезе дезоксирибонуклеотидных димеров [2]. Различные Н-фосфонатные димеры дезокси- и рибо-ряда были получены в растворе и охарактеризованы с помощью физико-химических методов [3].

В дальнейшем, использование в качестве активаторов ацилхлоридов позволило проводить синтез олигонуклеотидов длиной более чем 100

оснований. Н-Фосфонатным методом был осуществлен химический синтез дезоксирибоолигонуклеотидов длиной 107 оснований [4,5]. Модифицированный Н-фосфонатный метод был применен для синтеза 32 олигодезоксирибонуклеотидов длиной от 23 до 28 оснований, которые были использованы для энзиматической сборки гена интерлейкина-4 человека [6, 7].

С развитием автоматического фосфорамидитного метода синтеза олигонуклеотидов делались попытки автоматизировать и Н-фосфонатный метод. Основным препятствием для автоматизации Н-фосфонатного метода являлась скорость прохождения конденсации, а точнее скорость активации Н-фосфонатов. Тем не менее в 1988 году в Новосибирске был разработан автоматический синтезатор "Ген-2", приспособленный к Н-фосфонатному методу. Модифицированная схема синтеза включала детритилирование трифторуксусной кислотой в дихлорметане, промывку ацетонитрилом, вместо смеси пиридина и ацетонитрила, и одностадийное окисление раствором йода в уксусной кислоте и пиридине, вместо двухстадийного в присутствии сильных оснований. Посредством этого метода было синтезировано более 160 полинуклеотидов, содержащих от 8 до 83 мономеров, которые затем были использованы для различных биохимических целей, включая синтез промоторной области (260 п.о.) гена металлотионеина-1 мыши [8].

Таким образом, Н-фосфонатный метод хорошо зарекомендовал себя для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, применяющихся при сборке структурных генов. Систематические исследования показали, что частота

возникновения ошибок после клонирования синтетических фрагментов, полученных с помощью Н-фосфонатного метода, составляет 1 на 241 основание, что являлось вполне приемлемой величиной [9].

Н-Фосфонатный метод с успехом применялся и для синтеза рибоолигонуклеотидов с различными защитными группами по 2'-гидроксилу [10-13]. Олигорибонуклеотиды с длиной цепи от 7 до 34 были синтезированы с использованием о-нитробензильной защиты 2'-гидроксила как в ручном варианте твердофазного синтеза, так и на автоматическом синтезаторе [14]. В работах [15,16] были изучены различные группы для защиты 2'-гидроксильной группы в олигонуклеотидном синтезе с использованием Н-фосфонатного подхода.

Методы автоматизированного синтеза РНК были предложены для приготовления олигонуклеотидов, содержащих тиомодификации фосфатного остова и 2'-0-алкилированную рибозу. Разработаны комбинации фосфорамидитного и Н-фосфонатного методов для введения в олигонуклеотиды биотина, флуоресцентных агентов и других репортерных групп [17].

Таким образом, Н-фосфонатный метод используется не только для рутинного синтеза олигонуклеотидов - инструментов в классических методах генной инженерии, но и нашел широкое применение для синтеза модифицированных олигонуклеотидов - инструментов для изучения нуклеотид-нуклеотидных и белок-нуклеотидных взаимодействий.

Нуклеозид Н-фосфонаты (методы получения)

Нуклеозид Н-фосфонаты - стабильные гигроскопичные твердые вещества, которые могут храниться в атмосфере аргона при О °С более 3-х лет. В смеси пиридин/ацетонитрил Н-фосфонаты стабильны, хотя наблюдается медленная потеря диметокситритильной группы. Соли с 1,8-диазобицикло-[5.4.0]-ундец-7-еном (БВи) более устойчивы [18]. Нуклеозид Н-фосфонаты устойчивы к окислению и окисляются только сильными окислителями, например МПО4"1 [19]. Кроме того, моноэфиры устойчивы к кислотному и основному гидролизу, что является несомненным преимуществом Н-фосфонатов по сравнению с амидитами.

Н-Фосфонаты (III) можно получить при этерификации ОН-группы спиртов (I) фосфоновой КИСЛОТОЙ (НР(0)(0Н)2) (II) в присутствии различных конденсирующих агентов (Схема 1), таких, как триизопропилбензолсульфохлорид (ТРЭО), мезитиленсульфохлорид (М8С1), конденсацией спиртов с РС1з и дальнейшим гидролизом полученного дихлорфосфита (IV), реакцией трис(диалкиламидо)фосфитов (V) с ОН-компонентом и последующим гидролизом диамидофосфита (VI) [20].

1

0=р—о

(VI)

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Есипов, Дмитрий Станиславович, 1999 год

Список литературы

1. Hall R.H., Todd S.A., Webb R.F. // Nucleotides. Part XLI. Mixed anhydrides as intermediates in the synthesis of dinucleoside phosphates.// J.Chem.Soc., 1957, p.3291-3296.

2. Garegg P.J., Regberg Т., Stawinski J., Stromberg R.// Formation of internucleotidic bonds via phosphonate intermediates.// Chemica Scripta, 1985, v.25, p. 280-282.

3. Jager A., Charubala R., Pfleiderer W. //Synthesis and characterization of deoxy-and ribo H-phosphonate dimers.//Nucleic Acids Symp Ser, 1987; v. 18, p. 197-200.

4. Froehler B.C., Matteucci M.D.// Nucleoside H-phosphonates: valuable intermediates in the synthesis of deoxyoligonucleotides. // Tetrahedron Lett., 1986, v.27, p. 469-472.

5. Froehler ВС, Ng PG, Matteucci MD //Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates.//Nucleic Acids Res., 1986, v. 14(13), p.5399-5407.

6. Кулагина M.A., Скапцова H.B., Батчикова H.B., Куркин А.Н., Ажаев А.В. // Н-Фосфонатный метод в синтезе структурного гена интерлейкина-4 человека. // Биоорган, химия, 1990, т. 16, № 5, с.625-634.

7. Kurkin A., Coulagina М., Batchikova N., Smirnov V., Lutsenko S., Azhayev A. // Recombinant human interleukin. 4. H-Phosphonate synthesis of structural gene, expression in E.coli, isolation and study of chemical and biological properties.// Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.294.

8. Кумарев В.П., Баранова JI.B., Кобзев В.Ф., Кузделов К.Д., Средин Ю.Г. //Быстрый автоматический синтез полидезоксинуклеотидов.//Биоорган. химия, 1988, т. 14, № 2, с.276-278.

9. Vasser М., Ng P., Jhurani P., Bishofberger N. // Error rates in oligonucleotides synthesized by the H-phosphonate method. //Nucl. Acids Res., 1990, v. 18,

p.3089.

10. Rozners E., Kumpins V., Bizdena E. // Synthesis of oligoribonucleotides by the H-phosphonate approach using base labile 2'-0-protective groups.//Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.47-48.

11. Stawinski J., Stromberg R., Westman E // Studies on reaction conditions for ribonucleotide synthesis via the H-phosphonate approach //Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.228.

12. Веньяминова А.Г., Горн B.B., Зенкова M.A., Комарова Н.И., Репкова М.Н. // Автоматический Н-фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов с использованием 2'-0-тетрагидропиранильной защитной группы //Биоорган, химия, 1990, т. 16, № 7, с. 941-950.

13. Venyaminova A.G., Repkova M.N., Maltseva T.V. // Preparative solid phase synthesis of a tetradecamer r(GAUUGAAAAUCCCC) by the H-phosphonate method using a 2'-0-tetrahydropyranyl protective group.//Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.263.

14. Tanaka Т., Tamatsukuri S., Ikehara M. // Solid phase synthesis of oligoribonucleotides using the o-nitrobenzyl group for 2'-hydroxyl protection and H-phosphonate chemistry. //Nucleic Acids Res., 1987, v. 15(18), p.7235-7248.

15. Rozners E., Westman E., Stromberg R. // Evaluation of 2'-hydroxyl protection in RNA-synthesis using the H-phosphonate approach.//Nucleic Acids Res., 1994, v.22(l), p.94-99.

16. Stawinski J., Stromberg R., Thelin M., Westman E. // Studies on the t-butyldimethyl-silyl group as 2'-0-protection in oligoribonucleotide synthesis via the H-phosphonate approach.//Nucleic Acids Res., 1988, v. 16(19), p.9285-9298.

17. Gait MJ // DNA/RNA synthesis and labelling //Curr. Opin. Biotechnol., 1991, v.2(l), p.61-68.

18. Froehler B.C., Matteucci M.D. //The use of nucleoside H-phosphonates in the synthesis of deoxyoligonucleotides. //Nucleosides Nucleotides, 1987, v.6, p.287-291.

19. Brown D.M., Hammond P.R. //Studies on phosphorylation. Part XX. The oxidation of mono- and di-alkyl- phosphites.// J. Chem. Soc., 1960, p. 4229-4230.

20. Замятина А.Ю., Бушнев A.C., Швед В.И. // Фосфиттриэфирный и Н-фосфонатный методы в синтезе фосфолипидов.// Биоорган, химия, 1994, т.20, № 12, с.1253-1296.

21. Marugg J.E., Tromp М., Kuyl-Yeheskiely Е., van der Marel G.A., van Boom J.H. // A convenient and general approach to the synthesis of properly protected d-nucleoside-3'-hydrogenphosphonates via phosphite intermediates. //Tetrahedron Lett., 1986, v.27, p.2661-2664.

22. Kuyl-Yeheskiely E., Tromp C.M., Schaeffer A.H., van der Marel G.A., van Boom J.H. // A model study directed towards the preparation of nucleopeptides via H-phosphonate intermediates.//Nucleic Acids Res., 1987, v. 15(4), p. 18071818.

23. Sakatsume О., Yamane H., Takaku H., Yamamoto N. // Use of new phosphonylating and coupling agents in the synthesis of oligodeoxyribo-nucleotides via the H-phosphonate approach.// Nucleic Acids Res., 1990, v,18(l 1), p.3327-3331.

24. Sakatsume O., Ohtsuki M., Takaku H., Reese C.B. // Solid phase synthesis of oligoribonucleotides using the l-[(2-chloro-4-methyl)phenyl]-4-methoxypiperidin-4-yl (Ctmp) group for the protection of the 2'-hydroxy functions and the H-phosphonate approach.//Nucleic Acids Res., 1989, v. 17(10), p.3689-3697.

25. Ozola V., Reese C.B., Song Q. //Use of ammonium aryl H-phosphonates in the preparation of nucleoside H-phosphonate building blockes.// Tetrahedron Lett., 1996, v.37, N 47, p. 8621-8624.

26. Dubey I.Ya., Lyapina T.V., Fedoryak D.M. // H-Phosphonate oligonucleotide synthesis in solution.//Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.270.

27. Исагулянц М.Г., Самошин B.B., Макеева И.В., Смирнов В.Д. //Эффективный синтез олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов Н-фосфонатным методом в пластиковой микроколонке// Биоорган, химия, 1990, т. 16, № 7, с. 933-940.

28. Garegg Р.J., Regberg Т., Stawinski J., Stomberg R. // Studies on the synthesis of oligonucleotides via the hydrogenphosphonate approach. //Nucleosides Nucleotides, 1987, v.6, p.283-286.

29. Garegg P.J., Regberg Т., Stawinski J., Stomberg R. // Nucleoside H-phosphonates. V. The mechanism of hydrogenphosphonate diester formation

using acyl chlorides as coupling agents in oligonucleotide synthesis by the hydrogenphosphonate approach. //Nucleosides Nucleotides, 1987, v. 6, p.655-662.

30. Efimov V.A., Dubey I.Y., Chakhmakhcheva O.G. // NMR study and improvement of H-phosphonate oligonucleotide synthesis. // Nucleosides Nucleotides, 1990, v.9, p.473-477.

31. Kume A., Fujii M., Sekine M., Hata T. // Acylphosphonates. 4. Synthesis of dithymidine phosphonate: a new method for generation of phosphonate function via acylphosphonate intermediates. //J. Org. Chem., 1984, v. 49, p.2139-2143.

32. de Vroom E., Spierenburg M., Dreef C., van der Marel G., van Boom J. // A general procedure to convert H-phosphonate mono- or diesters of nucleic acids into valuable phosphate di- or triesters. //Reel. Trav. Chim. Pays-Bas., 1987, v. 106, p.65-66.

33. Скапцова H.B., Куркин A.H., Ажаев A.B. // Н-Фосфонатный синтез олигодезоксирибонуклеотидов с использованием и-нитрофенилэтильной защитной группы // Биоорган, химия, 1989, т. 15, № 7, с. 940-946.

34. Stromberg R., Stawinski J. // Evaluation of some new condensing reagents for hydrogenphosphonate diester formation.//Nucleic Acids Symp Ser 1987; v. 18,

p.185-188.

35. Efimov V.A., Kalinkina A.L., Chakhmakhcheva O.G. // Dipentafluorophenyl carbonate - a reagent for the synthesis of oligonucleotides and their conjugates.// Nucleic Acids Res., 1993, v.21(23), p.5337-5344.

36. Ефимов B.A., Калинкина A.Jl., Чахмахчева ОТ.11 Дипентафторфенилкарбонат в синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом // Биоорган, химия, 1994, т. 20, № 3, с.323-326.

37. Ефимов В.А., Дубей И.И. // Модификация Н-фосфонатного метода синтеза олигонуклеотидов на полимерных носителях // Биоорган, химия, 1990, т. 16, № 2, с. 211-218.

38. Wada Т., Honda F., Sato Y., Kawahara S., Sekine M. // Chemical synthesis of H-phosphonate DNA without using N-protecting groups //Nucleic Acids Symp Ser 1997; v.37, p.19-20.

39. Huss S., Gosselin G., Stawinski J., Stromberg R., Imbach i.-L.il Studies on ribonucleoside hydrogenphosphates. Effect of a vicinal hydroxyl function on the stability of H-phosphonate diester bond. // Nucleosides Nucleotides, 1988, v.7, N3, p.321-337.

40. Gaffney B.L., Jones R.A. // Large-scale oligonucleotide synthesis by the H-phosphonate method. // Tetrahedron Lett., 1988, v. 29, p.2619-2622.

41. Andrus A., Efcavitch J.W., McBride L.J., Giusti B. //Novel activating and capping reagents for improved hydrogenphosphonate DNA synthesis. //Tetrahedron Lett., 1988, v. 29, N 8, p.861-864.

42. Hosaka H., Suzuki Y., Sato H., Gug-Kim S., Takaku H. // A convenient approach to the synthesis of medium size oligodeoxyribonucleotides by improved new phosphite method.//Nucleic Acids Res., 1991, v.19(1 1), p.2935-2940.

43. Lewis E.S., Spears Ir., L.G. // Ionization of the pH bond in diethyl phosphonate. // J. Am. Chem. Soc., 1985, v. 107, p. 3918-3921.

44. Garegg P.J., Regberg Т., Stawinski J., Stromberg R. //Nucleoside phosphonates: Part 7. Studies on the oxidation of nucleoside phosphonate esters. // J.Chem. Soc. Perkin Trans., 1987, v. 1, p.1269-1273.

45. Sinha N.D., Cooke R.M. // The preparation and application of functionalized synthetic oligonucleotides. III. Use of H-phosphonate derivatives of protected amino-hexanol and mercapto-propanol or hexanol. //Nucl. Acids Res., 1988, v.16, p.2659-2669.

46. Полушин H.H., Пашкова И.Н., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А. // Применение гидразина для быстрого деблокирования синтетических олигонуклеотидов // Биоорган, химия, 1993, т. 19, № 3, с. 318-326.

47. Garegg P.J., Lindh I., Regberg T., Stawinski J., Stromberg R. // Nucleoside H-phosphonates. III. Chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides by the hydrogen-phosphate approach. //Tetrahedron Lett., 1986, v. 27, p.4051-4054.

48. Agrawal S., Goodchild J., Civeria M., Thornton A., Sarin P., Zamecnik P. // Oligodeoxynucleoside phosphoramidates and phosphorothioates as inhibitors of human immunodeficiency virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v. 85, p.7079-7083.

49. Froehler B.C. // Deoxynucleoside H-phosphonate diester intermediates in the synthesis of internucleotide phosphate analogues. // Tetrahedron Lett., 1986, v.27, p.5575-5578.

50. Froehler B.C., Ng P., Matteucci M.D. // Phosphoramidate analogues of DNA: synthesis and thermal stability of heteroduplexes. //Nucl. Acids Res., 1988, v. 16, p.4831-4839.

51. Agrawal S., Tang, J.-Y. // Efficient synthesis of oligoribonucleotide and its phosphorothioate analogue using H-phosphonate approach. // Tetrahedron Lett., 1990, v.31, p.7541-7544.

52. Andrus A., Zon G. // Phosphorothioate DNA: synthesis via improved hydrogen-phosphonate chemistry. //Nucl. Asids Res. Symposium Series, 1988, No. 20, p.121-122.

53. Letsinger R. L., Zhang G., Sun D.K., Ikeuchi T., Sarin P.S. // Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties and activity as ingibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, p.6553-6556.

54. Seela F., Kretshmer U. // Diastereomerically pure Rp and Sp dinucleoside H-

phosphonates: The stereochemical course of their conversion into P-methyl-

1 ft

phosphonates, phosphorothioates, and [ O] chiral phosphates.// J. Org. Chem., 1991, v. 56, p.3861-3869.

55. Letsinger R.L., Singman C.N., Histand G., Salunkhe M. // Cationic oligonucleotides. // J. Am. Chem. Soc., 1988, v. 110, p.4470-4471.

56. Reese C.B., Song Q.// A new approach to oligonucleotide synthesis in solution.//Nucleic Acids Symp Ser 1997; v.37, p. 1-2.

57. Stawinski J., Stromberg R., Szabo T., Thelin M., Westman E., Zain R //Synthesis and some reactions of nucleoside H-phosphonothioate esters. //Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.95-98.

58. Stawinski J., Stromberg R., Zain R. //Some chemical and stereochemical aspects of oxidation of nucleoside H-phosphonothioate diesters.// Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.230.

59. Aimer H., Stawinski J., Stromberg R., Thelin M. // Synthesis of diribonucleoside thiophosphates via stereospecific sulphurization of H-phosphonates. //Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.227.

60. Stawinski J., Szabo Т., Thelin M., Westman E., Zain R.// Recent studies on nucleoside H-phosphonothioate and nucleoside methylphosphonothioate synthesis //Nucleic Acids Symp Ser 1989; v.21, p.47-48.

61. Веньяминова А.Г., Косолапова 3.A., Репкова M.H. // С)лиго(2'-0-метилрибонуклеотиды) и их производные. I. Автоматический синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) через Н-фосфонаты. // Биоорган, химия, 1990, т. 16, № 5, с. 635-642.

62. Rosenberg I., Tocik Z., Watanabe K.A. // Synthesis of some oligodeoxynucleotides containing the C-nucleoside and 2'-deoxy-2'-fluoronucleoside moieties.// Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.43-46.

63. Sobkowski M., Kraszewski A., Stawinski J. // The reactions of H-phosphonates with bifunctional reagents. Part V. Functionalization of support-bound oligonucleotides and synthesis of non-radioactive hybridization probes.// Nucleosides Nucleotides, 1998, v,17(l-3), p.253-267.

64. Misra H.K., Khan N.N., Agrawal S., Wright G.E. // Chemical and enzymatic incorporation of N2-(p-n-butylphenyl)-2'-deoxyguanosine into an oligodeoxyribo-nucleotide.//Nucleic Acids Res., 1992, v.20(17), p.4547-4551.

65. Augustyns K., Van Aerschot A., Van Schepdael A., Urbanke C., Herdewijn P. // Influence of the incorporation of (S)-9-(3,4-dihydroxybutyl)adenine on the enzymatic stability and base-pairing properties of oligodeoxynucleotides.// Nucleic Acids Res., 1991, v,19(10), p.2587-2593.

66. Cai T.W., Min J.M., Zhang L.H. // Synthesis of lactosyl phosphate diester derivatives of nucleosides.// Carbohydr Res., 1997, v.303(l), p. 113-117.

67. Lin P.K., Brown D.M. // Synthesis and duplex stability of oligonucleotides containing cytosine-thymine analogues.//Nucleic Acids Res., 1989, v. 17(24), p.10373-10383.

68. Marangoni M., Van Aerschot A., Augustyns P., Rozenski J., Herdewijn P. // Synthesis and hybridization properties of inverse oligonucleotides.// Nucleic Acids Res., 1997, v.25(15), p.3034-3041.

69. Seela F., Chen Y., Melenewski A., Rosemeyer H., Wei C. // Synthesis and application of novel nucleoside phosphonates and phosphoramidites modified at the base moiety. // Acta Biochim Pol., 1996, v.43(l), p.45-52.

70. Cech D., Schubert F., Moller U. // Non-radioactive labelling of oligonucleotides with pre-functionalized phosphoramidites or H-phosphonates during automated synthesis. //Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24. p.205-206.

71. Lindh I., Stawinski J. // Synthesis of phospholipids and nucleoside-phospholipid conjugates via hydrogenphosphonate intermediates. // Nucleic Acids Symp Ser 1987; v. 18, p. 189-192.

72. Vinogradov S.V., Suzdaltseva Y.G., Kabanov A.V. // Block polycationic oligonucleotide derivative: synthesis and inhibition of herpes virus reproduction.//Bioconjug. Chem., 1996, v.7(1), p.3-6.

73. Pannekouke X., Parmentier G., Schmitt G., Dolle F., Luu B. // Tetrahedron. 1994, v. 50, p. 1173-1178.

74. Venyaminova A.G., Sergeyeva Z.A., Bashirova V.Z. // A new method for introduction of steroid residues in mono- and oligonucleotides via H-phosphonates of hydroxysterols.//Nucleic Acids Symp Ser 1991; v.24, p.265.

75. Kim S.G., Nakashima H., Shoji Y., Inagawa Т., Yamamoto N., Kinzuka Y., Takai K., Takaku H. // 5'-Linked lipid-oligodeoxyribonucleotide derivatives as inhibitors of human immunodeficiency virus replication.//Bioorg. Med. Chem., 1996, v.4(4), p.603-608.

76. Stein C., Iverson P., Subasinghe C., Cohen J., Stec W., Zon G. // Preparation of 35S-labeled polyphosphorothioate oligodeoxyribonucleotides by use of hydrogen phosphonate chemistry. // Analytical Biochemistry, 1990, v. 188, p.l 116.

77. Shaw J-P., Kent K., Bird J., Fishback J., Froehler B. // Modified deoxyoligonucleotides stable to exonuclease degradation in serum. // Nucl. Acids Res., 1991, v. 19, p.747-750.

78. Самошин B.B., Кудяков И.Е., Смирнов В.Д. // Использование временной защитной группы при синтезе олигонуклеотидов с неприродной связью. // Биоорган, химия, 1991, т.17, № 2, с. 241-245.

79. Peyrottes S., Vasseur J.J., Imbach J.L., Rayner В. // Oligodeoxynucleoside phosphoramidates (P-NH2): synthesis and thermal stability of duplexes with DNA and RNA targets.//Nucleic Acids Res., 1996, v.24(10), p.1841-1848.

80. Aimer H., Stawinski J., Stromberg R. // Solid support synthesis of all-Rp-oligo(ribonucleoside phosphorothioate)s.//Nucleic Acids Res., 1996, v.24(19), p.3811-3820.

81. Boutorine A.S., Venyaminova A.G., Repkova M.N., Sergeyeva Z.A., Pyshnyi D.V.// Effect of derivatization of ribophosphate backbone and terminal ribophosphate groups in oligoribonucleotides on their stability and interaction with eukaryotic cells.// Biochimie, 1994, v.76(l), p.23-32.

82. Makino К., Murakami A., Nagahara S., Nakatsuji Y., Takeuchi T. // A study on spin-labelled oligonucleotide synthesis and its electron spin resonance behavior in solution.// Free Radic. Res. Commun., 1989, v.6(5), p.311-316.

83. Ikeda H., Fuji К., Tanaka K. //Preparation, characterization and DNA photocleavage of diazapyrene-tethered oligothymidilates. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, v. 6,N. l,p. 101-104.

84. Murakami A., Nagahara S., Takeuchi Т., Makino K. // ESR behaviour of spinlabelled oligoDNAs.//Nucleic Acids Symp Ser 1989; v.21, p.89-90.

85. Li H., Fedorova O.S., Trumble W.R., Fletcher T.R., Czuchajowski L. // Site-specific photomodification of DNA by porphyrin-oligonucleotide conjugates synthesized via a solid phase H-phosphonate approach. // Bioconjug. Chem., 1997, v.8(l), p.49-56.

86. Helene C., Garestier Т., Giovannangeli C., Sun J-S. // Sequence-specific control of gene expression by antigen and clamp oligonucleotides. //Gen Ther. Mol. Biol., 1998, v.l, p. 467-474.

87. Коршун B.A., Берлин Ю.А. // Введение нерадиоактивных репортерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их детекция. // Биоорган, химия, 1994, т. 20, №6, с. 565-616.

88. Marugg J.E., Piel N., McLaughlin L.W., Tromp M., Veeneman G.H., van der Marel G.A., van Boom J.H. // Polymer supported DNA synthesis using hydroxybenzotriazole activated phosphotriester intermediates. // Nucl. Acids Res., 1984, v.12, N 22, p.8639-8651.

89. Himmelsbach F., Pfleiderer W. // Tetrahedron Lett., 1982, v. 23, N 46, p. 4793-4796.

90. Connoly A.B.// Tetrahedron Lett., 1987, v. 18, N 4, p. 463-466.

91. Uhlmann E., Engles J.// Tetrahedron Lett., 1986, v.27, N. 9, p. 1023-1026.

92. Филиппов С.А., Есипов Д.С., Калиниченко С.В., Добрынин В.Н. // Синтез 5'-фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов Н-фосфонатным методом. // Биоорган, химия, 1989, т. 15, № 4, с. 527-529.

93. Bordier В., Helene С., Barr P.J., Litvak S., Sarih-Cottin L.// In vitro effect of

antisense oligonucleotides on human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription. //Nucleic Acids Res., 1992, v. 20, p. 5999-6006.

94. Heidenreich O., Kruhoffer M., Grosse F., Eckstein F.// Inhibition of human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase by 3'-azidothymidine triphosphate. //Eur. J. Biochem., 1990, v.192, p.621-625.

95. Gait M.J. //Oligonucleotide synthesis: a practical approach /Washington DC, Oxford, IRL Press, 1984.

96. Oligonucleotides and analogues. (Practical approach) /Edited by F. Eckstein. Oxford University Press, 1991.

97. Letsinger R.L., Chaturvedi S. // Tailored hydrophobic cavities in oligonucleotide-steroid conjugates. // Bioconjug Chem., 1998, v. 9(6), p.826-830.

98. Gryaznov S.M., Lloyd D. // Modulation of oligonucleotide duplex and triplex stability via hydrophobic interactions. //Nucl. Acids. Res., 1993, v. 21, p. 59095915.

99. Vu H, Singh P, Joyce N, Hogan ME, Jayaraman К // Synthesis of cholesteryl supports and phosphoramidites containing a novel peptidyl linker for automated synthesis of triple-helix forming oligonucleotides (TFOs). // Nucleic Acids Symp Ser 1993, v. 29, p. 19-20.

100. Kabanov A.V., Vinogradov S.V., Ovcharenko A.O., Krivonos A.V., Melik-Nubarov N.S., Kiselev V.I., Severin E.S. // A new class of antivirals: antisense oligonucleotides combined with a hydrophobic substituent effectively inhibit influenza vims reproduction and synthesis of virus-specific proteins in MDCK cells. // FEBS Lett., 1990, v. 259, p. 327-330.

101. Saison-Behmoaras Т., Tocque В., Rey I., Chassignol M., Thuohg N.T., Helene C. // Short modified antisense oligonucleotides directed against Ha-ras point mutation induce selective cleavage of the mRNA and inhibit T24 cells proliferation. // EMBO J., 1991, v. 10, p. 1111-1118.

102. Hong C.I., Kirisits A.J., Nechaev A., Buchheit D.J., West C.R. // Nucleoside conjugates. 11. Synthesis and antitumor activity of 1-beta-D-arabinofuranosyl-cytosine and cytidine conjugates of thioether lipids. // J. Med. Chem., 1990, v. 33, p. 1380-1386.

103. Hong C.I., West C.R., Bernacki R.J., Tebbi C.K., Berdel W.E. // 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine conjugates of ether and thioether phospholipids. A new class of ara-C prodrug with improved antitumor activity. // Lipids, 1991, v.26, p. 1437-1444.

104. Hong C.I., Nechaev A., Kirisits A.J., Vig R., West C.R. // Nucleoside conjugates. 13. Synthesis and antitumor activity of 1-beta-D-arabinofuranosyl-cy to sine conjugates of thioether lipids with improved water solubility. // J. Med. Chem., 1993, v. 36, p. 1785-1790.

105. Осколкова O.B., Замятина А.Ю., Швец В.И., Есипов Д.С., Коробко В.Г. // Синтез церамидфосфотимидина как модельного соединения в синтезе сфинго фосфоолигонуклеотидов. // Биоорган, химия, 1996, т. 22, № 4, с. 307313.

106. De Clercq Е., //Toward improved anti-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for intervention with HIV infections. //J. Med. Chem., 1995, v.38, p. 2491-2517.

107. Водовозова E.JI., Павлова Ю. Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А, Гараев М.М., Молотковский Ю. Г.// Новые фосфолипиды - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность // Биоорган, химия, 1996, т. 22, № 6, с. 451-457.

108. Осколкова О.В., Перепелов А.В., Есипов Д.С., Замятина А.Ю, Алексеева С.Г., Швец В.И. // Синтез фосфоцерамида азидотимидина и фосфоцерамида дидегидродезокситимидина. // Биоорган, химия, 1997, т. 23, № 7, с. 544-549.

109. Hostomsky Z., Smrt J., Arnold L., Tocik Z., Paces V. //Solid-phase assembly of cow colostrum trypsin inhibitor gene. // Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, N 12, p.4849-4856.

110. Goldkorn Т., Prockop D. // A simple and efficient enzymatic method for covalent attachment of DNA to cellulose. Application for hybridization-restriction analysis and for in vitro synthesis of DNA probes. //Nucl. Acids Res., 1986, v. 15, N22, p. 9171-9191.

111. Ghosh S.S., Musso G.F. //Covalent attachment of oligonucleotides to solid supports. //Nucl. Acids Res., 1987, v. 15, N 13, p. 5353-6372.

112. Atherton T.R., Openshaw H.T., Todd A.R. // J. Chem Soc. 1945. v. 5, p. 660.

113. Sancar A., Stachelek C., Königsberg W., Rupp W.D. //Sequences of the recA gene and protein. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1980, v. 77, N 5, p. 2611-2615.

114. Atkinson Т., Smith M. // Oligonucleotide synthesis : a practical approah / Ed. Gait M.J. Oxford: IRL Press, 1984. p. 35-81.

115. Добрынин B.H., Калиниченко С.В., Фархутдинов М.Р., Филиппов С.А., Коробко В.Г. // Химико-ферментативный синтез и клонирование ДНК, кодирующей сигнал для секреции белков в грамотрицательных бактериях. // Биоорган, химия, 1989, т. 15, № 9, с. 1232-1238.

116. Филиппов С.А., Калиниченко С.В., Есипов Д.С., Шибанова Е.В., Шингарова JI.H., Коробко В.Г., Добрынин В.Н. // Твердофазное лигирование синтетических фрагментов ДНК. // Биоорган, химия, 1990, т. 16, № 8, с. 1045-1051.

117. Dittmer J.C., Lester R.L.// J. Lipid. Res., 1964, v.5, p.126.

118. Кочетков H.K. //Методы химии углеводов. - М.: Мир, 1967.

119. Shapiro D.// Chemistry of sphingolipides. //Paris: Hermann. 1996. P. 111.

120. Франтова А.Ю., Бушнев A.C., Звонкова E.H., Швец В.И.// Н-Фосфонат-ный и фосфиттриэфирный способы получения сфингофосфолипидов. // Биоорг. химия, 1991, т.17, № 11, с. 1562-1573.