Разработка методов серологической диагностики инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Суворова, Зоя Константиновна

• Суворова, Зоя Константиновна
• кандидат биологических наук
• 1991

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Суворова, Зоя Константиновна

ф СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигенная структура вируса иммунодефицита человека и гуморальный иммунитет

1.2. Лабораторная диагностика инфекции, вызываемой ВИЧ.\

1.3. Использование синтетических антигенных детерминант для диагностики.

1. 4. Выбор эпитопов, используемых для диагностики.

1. 5. Использование коньюгатов пептидоЕ в качестве антигенов в иммуноферментном анализе.

1.6. Использование пептидов для определения антител в сыворотках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика используемых сывороток крови

2.2. Характеристика синтетических антигенных детерминант.

2.3. Проведение твердофазного иммуноферментного анализа.

2. 4. Проведение иммуноблоттинга.

2.5. Математическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Формирование панели сывороток.

3.2. Разработка условий твердофазного ИФА с использованием синтетических пептидов.

3.3. Изучение антигенной активности и диагностической значимости синтетических пептидов. . 57 3.4. Определение чувствительности и специ -фичности разработанной тест -системы "Шптест" и сравнение ее с другими диагностическими препаратами.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов серологической диагностики инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека»

Ф . В условиях развития пандемии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), важное значение для организации эпиднадзора и проведения противоэпидемических мероприятий, а также для постановки индивидуального диагноза приобретает своевременная диагностика случаев заболевания. В настоящее Бремя ВИЧ-инфекция распространяется на территориях, ранее считавшихся свободными от данной инфекции (страны Восточной Европы, Азия). Характер распространения может приобретать формы вспышек, госпитальной инфекции с формированием целой сети вторичных очагов, как это было установлено в СССР (Элиста, Ростов, Волгоград) и Румынии.

Помимо инфекции, вызываемой ВИЧ 1, в последнее время все более широкое распространение получает вирус иммунодефицита 4 человека второго типа (ВИЧ 2). Несмотря на то, что в СССР выявлено только несколько случаев инфекции ВИЧ 2, большой поток иностранных студентов из регионов эндемичных по ВИЧ 2, может привести к широкому распространению этого вируса в нашей стране. В связи с этим разработка диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ 2 является актуальной.

Большинство методов диагностики ВИЧ -инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в крови или других биологических жидкостях. С этой целью чаще всего используются различные методики, основанные на принципах иммуноферментного анализа (ИФА). С целью исключения возможных ложноположительных ре-р акций, полученных на первом этапе исследования сыворотки, проводится подтверждение этого результата с помощью иммунного блоттинга. Однако применение подтверждающих тестов значительно повышает стоимость обследования и интерпретация результатов иммунного блоттинга представляет определенную сложность и требует специальной подготовки. Избежать большого количества лож-ноположительных реакций можно повышая качество тест-систем, применяемых на первом этапе обследования.

Эффективность диагностики зависит от качества и специфичности антигенов, используемых в тест -системе, ее оптимизации и стандартизации.

В первых диагностических тест-системах использовались антигены ВИЧ, полученные из культуры клеток, зараженных ВИЧ. Недостатками таких тест систем являются: 1) недостаточно высокая специфичность; 2) низкая стабильность антигенов в процессе хранения; 3) недостаточная стандартность и . воспроизводимость результатов 4) необходимость соблюдения особых мер безопасности в процессе производства и использования тест -систем. Кроме того в СССР отсутствуют клеточные линии - продуценты ВИЧ.

Одним из путей совершенствования диагностических тест -систем является использование пептидных аналогов основных им-мунодоминантных эпитопов ВИЧ, полученных методом химического синтеза (синтетические пептиды) и генной инженерии (рекомби-нантные белки). Достоинствами таких тест -систем являются: 1) высокая специфичность; 2) возможность проведения дифференциации между двумя типами БИЧ; 3) более высокая стандартность и воспроизводимость теста; 4) невысокая стоимость; 5) отсутствие необходимости в особых мерах безопасности.

Однако при разработке и оценке качества диагностикумов на основе пептидных аналогов эпитопов ВИЧ, необходимо использовать достаточное количество образцов сывороток крови, полученных из различных географических зон, в связи с возможными вариациями антигенов вируса, а соответственно и специфичности антител. Кроме того в состав панели необходимо включать сыворотки крови от лиц, инфицированных ВИЧ, находящихся на разных стадиях заболевания, а именно, период ранней сероконверсии, развернутую клиническую и терминальную стадии, а также образцы сывороток от детей, инфицированных ВИЧ.

Несмотря на то, что качество используемых тест-систем постоянно повышается, избавиться от всех недостатков пока не удалось. Недостаточная чувствительность тест -систем снижает эффективность обследования населения, а большое количество ложноположительных реакций приводит к значительной затрате средств на проводимое обследование. Применение тест -систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью позволило бы избавиться от перечисленных недостатков. Таким образом разработка и внедрение диагностических тест-систем, обладающих такими качествами и позволяющих выявлять антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является совершенствование серологической диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, путем разработки диагностической тест -системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать антительный ответ к отдельным анти-ф генным структурам ВИЧ и сформировать панель сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ.

2. Изучить антигенные свойства синтетических пептидов с помощью созданной панели сывороток.

3. Подобрать оптимальный состав смеси антигенов на основе синтетических антигенных детерминант для иммуноферментной тест-системы, выявляющей антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.

4. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест -системы и сравнить ее с другими диагностикумами.

Научная новизна полученных данных.

Научная новизна представляемой работы заключается е том, что дается характеристика синтетических антигенных детерминант, аналогов различных участков белков ВИЧ, по их способнос-* ти взаимодействовать с антителами к ВИЧ, что позволило оценить роль различных участков белковых молекул в развитии иммунного ответа и выбрать иммунодоминантные зпитопы ВИЧ.

Учет штаммоспецифических различий в сиквенсе эпитопов поверхностных гликопротеинов позволил разработать оптимальный сорбент для ИФ тест-системы.

Предложен метод сорбции биотинилированных синтетических антигенных детерминант на твердую фазу с использованием стреп-тавидина в качестве носителя, что привело к повышению чувствительности реакции и сокращению количества антигена при сорбции.

Практическая ценность работы. % Практическая значимость работы заключается в том, что на основании полученных материалов была разработана тест -система "Пептест", предназначенная для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ Ф 2. В настоящее время разработанная тест-система внедряется в НПО "Вектор" г. Новосибирск под названием "ВИЧ-тест 1+2".

Используя данные, полученных при создании панели сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ, разработан критерий оценки результатов тестирования сывороток крови методом иммунного блоттинга, а также схема проведения серологической диагностики. Данные материалы учитывались при разработке методических рекомендаций "Серологическая диагностика инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека, иммуноферментными методами".

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигенные структуры вируса иммунодефицита человека и гуморальный иммунитет.

Вирус иммунодефицита человека является этиологическим агентом, вызывающим у человека заболевание иммунной системы, приводящее к развитию синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - это ретровирус, который поражает преимущественно клетки, имеющие рецептор CD4.

На рисунке 1 схематически приведен геном вируса и его основные антигены. Ген gag кодирует р55 - полипротеин предшественник. При его расщеплении образуются меньшие структурные белки р17 и р24. Ген env кодирует высоко иммуногенный предшественник гликопро-теин - gpl60. При его расщеплении образуются гликопротеины gpl20 и gp41. Ген pol кодирует фермент обратную транскриптазу (р66/р51) и белок эндонуклеазу р31.

Исследования, проведенные с помощью методов иммунного блот-тинга и радиоиммунопреципитации, показали, что антитела против gpl60, gpl20, р24 и р17 при инфекции ВИЧ появляются первыми, через 2-4 недели выявляются антитела к gp41 и антигены молекул, Еесом от 50 до 65 кД (2-8). Антитела к р31 формируются в период от 3 до 6 недель, после появления самых ранних антител (2,5,8). Титр всех антител продолжает нарастать в течение нескольких месяцев и затем стабилизируется у бессимптомных носителей. У пациентов с прогрессирующим заболеванием по мере приближения к СПИД, продукция антител к р24 ослабевает и они исчезают у 2/3 пациентов (9,10), а антитела к поверхностным антигенам - gp41, gpl20 и gp 160 остаются щ геу Ж Ш т дод

УрГ ури р55

Р01 епу

Ий пе{ р47 р24 р15 др 460 р7 р9 р22 рбб/р5\ рЗ/ драо др44

Рисунок 1. Строение генома и основные антигены ВИЧ 1.

2,8,11-13). Антитела к р31 также исчезают при приближении к СПИД, но не в тот период, когда исчезают антитела к р24, а позже(13). Также важно наличие антител к р17, т. к. антитела к этому белку появляются одними из первых и пропадают при ухудшении состояния пациента раньше, чем антитела к р24, что позволяет назначить необходимое лечение своевременно. Кроме того, в ряде случаев антитела к р24 исчезают и появляется антиген р24, но этот процесс бывает не связан с ухудшением состояни пациента, а изучения уровня антител к р17 и р24 позволяет повысить надежность предсказания течения инфекции (14).

Во многих исследованиях, проведенных различными авторами, дату инфицирования установить не удалось, но сероконверсия с характерной картиной антительного ответа имела место во время или вскоре после развития острого симптомакомплекса, вызываемого ВИЧ. Эти случаи описаны для групп реципиентов крови, наркоманов, вводящих наркотик внутривенно и гомосексуалистов (4, 15-17). Сероконверсия наблюдается у большинства лиц в течение 2-3 месяцев после первичных проявлений ВИЧ инфекции. Однако, данные, полученные в последнее время свидетельствуют о том, что вирус может находиться в латентном состоянии, сроки которого точно не определены (18). И только пременение метода PCR(polymerase chain reaction - реакция цепной полимеризации ) позволит установить длительность этого периода. Кроме того, по данным некоторых авторов, у этих лиц присутствуют антитела к,регуляторному белку, кодируемому геном пеГ (19).

Из серологических методов при изучении сероконверсии лучше использовать те, которые обладают наибольшей чувствительностью при определении антител р24 или к поверхностным гликопротеинам с высоким молекулярным весом. Burke и др. (13) показали, что чувствительность комерческих наборов для определени антител к индивидуальным вирусным белкам значительно отличается, в частности, тест-система фирмы "Abbot" больше отражает уровень антител к gp41 и р31, тогда как другие тест-системы больше коррелируют с уровнем антител к р24, особенно наборы фирмы "Du Pont". Таким образом, данные о се-роконверсии будут различаться в зависимости от применяемой тест-системы (5).

Как и при других заболеваниях вирусной этиологии, невозможно определить антитела к ВИЧ на ранних стадиях. Кроме того описаны случаи, когда у пациентов выделяли вирус, но они при этом оставались серонегативными(2б,27). Такая ситуация встречается крайне редко, кроме периода в течение трех, а иногда больше месяцев, пока не образуются антитела к вирусу.

Данные, приведенные выше, относятся к ВИЧ 1, но в последнее время появилась информация о распространении ВИЧ 2 ео всем мире и в СССР (44-46). ВИЧ 1 и ВИЧ 2 различаются по молекулярному сиквен-су более чем на 55%, но они имеют много общих черт в морфологии, геномной организации, а также в биологии. Так же как ВИЧ 1, штаммы ВИЧ 2 обладают антигенной и биологической гетерогенностью (47). Антитела в сыворотках крови, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ 2, могут перекрестно реагировать с антигенами ВИЧ 1 (48-50). Перекрестная реактивность наблюдается и при использовании метода им-муноблоттинга. Чаще всего такая перекрестная реактивность отмечается с белками, кодируемыми геном gag, хотя антитела к поверхностным белкам ВИЧ 2 также могут связываться, но в меньшей

- 14 степени, с поверхностными белками ВИЧ 1 (51-54).

Использование очищенных белков из ВИЧ 1 и ВИЧ 2 при проведении иммуноблоттинга, а также синтетических пептидов из иммунодоми-нантных областей трансмембранных белков ВИЧ 1 и ВИЧ 2 показало, что некоторые сыворотки крови взаимодействуют и с белками из ВИЧ 1 и из ВИЧ 2 (46-60). В ряде работ было высказано предположение, что такие лица инфицированы и ВИЧ 1 и ВИЧ 2. У нескольких пациентов было проведено выделение обеих вирусов и определена их провирусная ДНК с помощью PCR (61,62).

Сравнение продуктов регуляторных генов из ВИЧ 1 и БИЧ 2 показало, что белки из ВИЧ 1 ne Г, tat, rev и vpr имеют соответственно 34, 31, 36 и 35% идентичности по аминокислотам с ВИЧ 2, но ген vpu уникален для ВИЧ 1 (63,64), a vpx для ВИЧ 2 (65,66).

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Суворова, Зоя Константиновна

ВЫВОДЫ

1. Собрала панель сьшороток от лиц инфицированных ВИЧ, состоящая из 516 образцов сывороток крови с антителами к ВИЧ 1 и 22 сьшороток с антителами к ВИЧ 2, которая является хорошим инструментом для решения научных и практических задач .

2. Исходя из данных о взаимодействии 36 тестированных синтетических пептидов с антителами в сыворотках крови, подобрана смесь антигенов, используемых в тест-системе "Пептест" для сенсибилизации планшетов, которая состояла из трех синтетических антигенных детерминант, последовательности которых взяты из gp41 штаммов LAV-BRU и LAV -ELI ВИЧ 1 и из gp36 ВИЧ 2.

3. Применение авидина в качестве носителя для биотинили-рованных пептидов позволило повысить чувствительность ИФА более, чем в два раза и снизить количество синтетических пептидов при сенсибилизации планшета в 10 раз.

4. Разработана новая иммуноферментная тест -система "Пептест" для определения антител к ВИЧ 1 и БИЧ 2. Чувствительность и специфичность ее при анализе 397 позитивных и 1000 негативных по анти -ВИЧ антителам образцов сывороток крови, составили соответственно 100% и 99,5%.

Сравнительные испытания тест -системы "Пептест" показали, что она не уступает лучшим образцам сущест-вуюцдих тест -систем.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Суворова, Зоя Константиновна, 1991 год

1. Steckelbergj. М. and Cockerill F. R. Serologic testing for human immunodeficiency virus' antibodies./Mayo clin.Proc. 1988.- V.63. - P. 373-380.

2. Primary human T-lymphotropic virus typelll infection./ Ho D. D., Sarngadharan M.G. ,Resnick L. et al // Ann. Intern. Med. -1985. -V. 103. P. 880-883.

3. Importance of Western blot analysis in predicting infectivity of anti -HTLV -III/LAV positiv blood./ J. I. Esteban, J. W.-K. Shih, C.C.Tai et al.// Lancet. -1985. -V. 2. P. 1083-1086.

4. Cooper D. A., Imrie A. A., Penny R. Antibody responce to human immunodeficiency virus after primary infection./ J. Infect. Dis. 1987.-V. 155. - P. 1113-1118.

5. Distinct IgG recognition patterns during progression of subclinical and clinical infection with lymfoadenopathy associated virus/human T lymfotropic virus./J. M. A. Lange, A. R. Coutinho, W. J. A. Krone et al.// Br. Med. J. 1986.-V. 292. - P. 228-230.

6. Diagnostic significance of quantitative determination of HIV antibody specific for envelope and core proteins. / G. G. Frosner, V. Erlfe, W. hfellert et al. // Lancert. -January. 1987. - P. 18.

7. Escherichia coli expression,purification, and biological activity of a truncated soluble CD4./R. Garlick, R. Kirschner, F. Eckenrode et al.// AIDS Res. and Human Retroviruses.- 1990.- V. 6. N4.-P. 455-479.

8. Antibodies reactive with AIDS and pre-AIDS, and in groups at risk for AIDS./J. Schupbach, 0. Haller, № Vogt et al.//N. Engl. J. Med. 1985.-V. 312. - P. 265-270.

9. Prevalence of antibodies to the core protein P17, a serological marcer during HIV 1 infection. / S. Mehta, K. Rupprecht, J. Hunt et al. // AIDS Research and human retroviruses. 1990.- V. 6. - N4.- P. 443-454.

10. Lymphadenopathy syndrome in two thalassemic patients after LAV contamination by blood transfusion./ F. Boiteux, E. Vilmer, R. Girot et al. // N. Engl. J. Med. -1985.- V. 312. P. 648-649.

11. HTLV III infection associated with glandular-fever -like ilness in a haemophiliac. /J. Tucker, C. A. Ludlarn,

12. A. Craig et al. //Lancet. 1985. - V. 1. - P. 535.

13. Acute encephalopathy coincident with seroconversion. / C. A. Carne, R. S. Tedder, A. Smith,et al.// Lancet. 1985.-V.2. - P. 1206-1208.

14. Farzadegan H., Pol is № , Wolinsky M. Loss of human immunodeficience virus type 1(HIY 1) antibody with evidence of viral infection in asymptomatic homosexual men. / Ann Intern Med. 1988. - V. 10S. - P. 785-790.

15. Antibodies to the nef protein and to nef peptides in HIV 1 infected seronegative individuals./ J. Ameisen,

16. B. Guy, S. Chamaret et al. // AIDS Res. and Human Retroviruses. 1989. - V. 5. - N3. -P. 279-291.

17. Серологический скрининг инфекции вирусом иммунодефицита в 1987г. /В. В. Покровский, Д. JL Виноград, М. О. Деулина и др. //ШЭИ. -1988. -Т. 12. С. 56-59.

18. Первичный серологический скрининг инфекции, вызываемой вирусом LAV/HTLV III/HIV в Москве. /В. Е Покровский, 3. К. Янкина, Л К Топоровский и др. //ЖМЭИ. 1987. - Т. 7. -С. 21-23.

19. Егоров А. М. Современный иммунохимический анализ и перспективы его развития. Москва. 1989.

20. Advancesin the isolation of HTLV-III from patients with AIDS and AIDS related complex and from donors at risk. /Р. D. Markham, S. Z. Salahuddin, RPopovic et al.// Cancer.- 1985.- Res. 45. P. 4588-4591.

21. Goedert J.J. Testing for human immunodeficiency virus./ Ann. Intern. Med. 1986. - V. 105. - P. 609-610.

22. Expression of human immunodeficiency virus antigen (HIV Ag) in serum and cerebrospinal fluid during acute and chronic infection./J. Goudsmit, F. de Volf, D. A. Paul et al.//Lancet. 1986.- 4.2. - P. 177-180.

23. HTLV III in symptom -free seronegative persons./S. Z. Salahuddin, J. E. Groopman, P. D. Markham et al. //Lancet. -1984.- V.2.- P. 1418-1420.

24. Human T -lymphotropic virus type III in high-risk, antibody-negative homosexual men./К. H. Mayer, A. M. Stoddard, J. McCusker et al.//Ann. Intern. Med. 1986.-V. 104.- P. 194-196.

25. Screening test for HTLV -III antibodies: specificity, sencitivity, and applications./S. H. Weiss, J. J. Goedert,

26. M. G. Sarngadharan et al.// JAMA.- 1985.- V. 253. P. 221225.

27. Kuhnl P., Seidl S. , Holzberger G. HLA DR4 antibodies cause positive HTLV -III antibody ELISA results./ Lancet.- 1985.- V.l. P. 1222-1223.

28. False positive antibody tests for human imrnunodeficiency virus in transplantant patients with anti lyrnfocyte antibodies. / C. T. Wittwer, A. M. Smith, K. 0. Ash et al.// Transplantation.- 1987.- V. 44. 6.- P. 843-844.

29. Non -specific reactivity in HIV antigen assay of sera from organ transplant recipients./ A.Sonnerborg, A. Tibella, G. Strannegard et al.// Infection.- 1989.-V. 17. 3.- P. 168-159.

30. Screening and diagnostic . performance of enzymeirtminoassay for antibody to lymphadenopathy-associated virus. /H. H. Handsfield, M. Vandell, L.Goldstein et al.// J. Clin. Microbiol.- 1987.- V. 25. P. 879-884.

31. Sero immunology of AIDS retrovirus infection. I. Use of immunofluorescence assay to confirm sera with ELISA reactivity. / A. A. Irnrie, S. Kehrer, G.W.Smith et al.// Pathology. 1986.- V. 18.- P. 438-443.

32. Lennette E. T. , Karpatkin S. , J. A. Levy. Inderect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. / J. Clin. Microbiol. 1987.- V. 25.- P. 199-202.

33. Council on Scientific Affairs: Status report on the acquired immunodeficiency syndrome: human T-cell lymphotropic virus type III testing./ JAMA- 1985.- V. 254.- F. 1342-1345.

34. Reisch Marc. New AIDS test is said to reduce false positives. / Chem.and Eng. News. 1988.- V. 66. - 9.- P. 56.

35. Josephson S. L., Swack N. S. , Hausier V.J. Studies of "p24 only" immunoblot reactivity to human immunodeficiency virus./ III International Conferency of AIDS. 1987. - DC.

36. Burke D.S., Redfield R. R. False positive Western blot tests for antibodies to HTLV -III./ JAMA.- 1986.-V. 255. P. 347.

37. Blood donors with indeterminate anti -p24gag reactivity in HIV -I Western blot: absence .;ofinfectivity to transfused patients and in virus culture. /C. L. Foel, P. N. Lelie, H. W. Reesink et al.// % Vox. Sang.- 1989.- V. 56. N3.- P. 162-167.

38. Longterm persistence of false positive antibody reactivity in HIV Western blot testing of sera from a healthy blood donor. / B. Settergren, L. A. Burman, A. Gustafsson et al. // Saand. J. Infect. Diseases. 1S89. -V. 21. - N2.- P. 233-235.

39. HIV-2 associated AIDS and HIV-2 sercprevalence in Bissau, Guinea-Bissau. /Naucler A, Andreasson P, Mendes Costa et al. // AIDS. 1989. - N 2. - C. 88-89.

40. New human T -lyrnphotropic retrovirus related to simian T -lyrnphotropic virus type III./ P. Kanki, F. Bärin, S. M'Bour et al.// Science. 1986.- V. 232.- P. 238-243.

41. Human T -lyrnphotropic virus type 4 arid the humanimmunodeficiency virus in West Africa. / P. J. Kanki, S.

42. M'Boup, D.Richard et al.// Science. 1987.- V. 236. - P. 827-831.

43. Genome organization and transact i vat ion of the human immunodeficiency virus type 2./ M.Guyader, M. Emerman, P. Sonigo et al. // Nature. 1987. - V. 325. - P. 652-669.

44. Comparison of 10 enzyme immunoassays for detection of antibody to human immunodeficiency virus type 2 in Vest Africa sera. / F.Denis, G.Leonard, A.Sangare et al.// j. Clin. Microbiol.- 1988.- V. 26.- P. 1000-1014.

45. An STLV -III related human retrovirus HTLV-IV:

46. Analysis of cross -reactivity with the humanimmunodeficiency virus (HIV)./ F. Barin, F.Denis, A. Baillou et al. // J. Virol. Meth. 1987.- V.17. - P. 551."61

47. Detection of HIV -2 antibodies using five commercial

48. HIV enzyme immunoassays. / M. Peeters, E. Delaporte,

49. M. C. Dazza et al. // AIDS. 1988. - V. 2- P. 389-390.

50. Efficacy of five enzyme immunoassays for antibody to HIV in detecting antibody to HTLV -IV. /F.Denis, G.Leonard, MMsunier et al.// Lancet. 1987.- V.l.- P. 324-325.

51. Serological discrimination between HIV -1 and HIV-2./ T. F. Schultz, W. Oberhuber, B. Schmidt et al. // Lancet. -1988.- V.2.- P. 162-163.

52. Envelope cross -reactivity in Western blot for HIV-1 and HIV -2 may not indicate dual infection./• R. S. Tedder, T. O'Connor, A. Hughes et al.// Lancet. -1988.- V. 2. P. 927-930.

53. HIV -2 antisera cross neutralize HIV -1. / R. A. Weiss, P. R. Clapham, J.N.Weber et al.//- AIDS. -1988.- V.2.- P. 95-100.

54. The human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) contains a novel gene encoding a 16 kD protein associated with mature virions./ G. Franchini, J. R. Rusche, T. J. O'Keeffe et al.//AIDS Res. 'Hum. Retroviruses. 1988.- V. 4. - P. 243-250.

55. Heseltine W. Replication and pathogenesis of the AIDSvirus. / AIDS. 1988. - V. 1. - P. 217-240.

56. HIV -1 and HIV -2 double infection in a French homosexual male with AIDS related complex. / M. A. Rey,j P.M.Girad, J. J.Madjar et al.// Lancet.- 1987.- V. 1.1. P. 388-389.

57. Dual HIV -1 and HIV -2 infection in Vest Africa in supported by synthetic peptide analysis. / M.C. Cot, RPoulain, J. F.Delagneau et al.// AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1988. - V. 4. - P. 239-241.

58. Simultaneous isolation of HIV -1 and HIV -2 from an AIDS patient. /L. A. Evans, J. Kforeau, K. Odehouri et al. //1.ncet.- 1988.- V. 2. P. 1389-1391.

59. Synthetic peptide immunoassay distinguishes HIV Type 1 and HIV Type 2 infections. / J. V. Gnann, J. B. MoCormick, S.Mitchell et al.// Science.- 1987.- V.237. P. 13461349.

60. Descri mi nation between antibodies to HIV ¿ndt to related retroviruses using sitedirected serology./ E. Norrby, G. Biberfeld. F. Chiodi et al.// Nature. 1987.-V. 329. - P. 248-250.

61. Strebel K. , Klimkait T. ,Martin M. A. A novel gene of HIV1, vpu, and its 16-kilodalton product./ Science.ft- 1988.- V. 241. P. 1221-1223.

62. Human immunodeficiency virus typel has in additional coding sequence in the central region of the genom./ Matsuda Z. , Chou M. J., Masuda M. et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988.-V. 85.- P. 6968-6972.

63. Isolation and characterization of a novel protein from SIY and HIV 2./ Henderson L. E., Sowder R. C., Copeland T. D. et al. //Science.- 1988.- V. 241. P. 199-201.

64. Identification of a novel retroviral gene unique to human immunodeficiency virus type 2 and simian immunodeficiency virus SIV. / Kappes J. С. , Morrow C. D., Lee V. et al.// J.Virol. 1988.- V.62(9).- P. 3501-3505.

65. Expression of the Epstein Barr virus 138 kDa early protein in Escherichia coli for the use as antigen in diagnostic tests./Motz M. , Fan J. , Seibl R. et al.// 1986.- Gene.- V. 42. 303-312.

66. Carrier bound synthetic oligopeptides in ELISA test systems for distinction between HIV 1 and HIV 2 infection./Modrow S. , Hoflaßher В. , Gurtler L.// J. of AIDS. 1989.- V. 2.

67. Лабораторная диагнгостика: Сборник методических материалов /СЭВ. Постоянная комиссия в области здравоохранения. М. , 1984.-45с.

68. Neurath A. R. , Kent S. В. , Strick N. Specif ity of antibodies elicited by a synthetic peptide having a sequence in common with a fragment of a .virus protein, the Hepatiti surfase antigen./ Proc. Natl. Acad. So i. USA. -1982. V. 79. - P. 7871-7875.

69. Chemically synthesized peptides of Hepatitis B surfase antigen duplicate the d/y specifities and induce subtype specific antibodies in chimpanzees./ Gerin J. L. , Alexander H. , SHihi J. W.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1983.- V. 80. - P. 2365-2369.

70. Modrow S. , Wolf H. Characterization of two related Epstein-Barr virus encoded membrane protein that are differentially expressed in Burkitt lymphoma arid in vitro transformed cell lines. / Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1986.- V. 83. P. 5703-5707.

71. Synthetic peptide immunoassay distinguishes HIV type 1 and HIV type 2 infections./ Gnann J. W., McCormick J.B. , Mitchell S. et al.// Science.- 19S7. V. 237. - P. 1346-1349.

72. Gnann J. V. , Nelson J. A. , Olds tone M. B. Fine mapping of an immunodominant domain in the transmembrane glycoprotein of human immunodeficiency virus./ J.Virol.- 1987.- V.6'1.- P. 2539-2641.

73. Diagnosis of AIDS by using a 12 amino acid peptide representing an immunodominant epitope of the human immunodeficiency virus. /Gnann J. V. Schwimmbeck P. L. , Nelson J. A. et al. // J. Infect. Diseases. 1987.1. V. 159.- P. 261-267.

74. Human antibody response to a strain specific HIV 1 gpl20 epitope associated with cell fusion inhibition./ GoudsmitGJ. , Boucher C. A. , Meloen R. H. et al. // AIDS. -1988.- V. 2. P. 157-164.

75. Discrimination between antibodies to HIV and to related retroviruses using sitedirected serology./ Norrby E., Biberfeld G., Chiodi F. et al. // Nature. -1987.- V. 329. P. 248-250.

76. Middledorp J. M. , Meloen R. H. Epitope mapping on the Epstein Barr virus major capsid protein using systematic synthesis of overlapping oligopeptides./ J. Virol. Msth.- 1988.- V. 21. P. 147-159.

77. GeysenH. M. , Barteling S. J., Meloen R. H. Small peptides induce antibodies with a sequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies against the native protein. / Proo. Natl.' Acad. Sci. USA.- 1985.- V. 82. P. 178-182.

78. Minimum requirements for immunogenioc and antigenic activities ofhomologues of a synthetic peptide of Influenza virus hemagglutinine./X. L. Tang, G. W. Tregear, D. 0. Jackson// J.Virol. 1988.- V. 62. - P. 4745-4751.

79. Liljas A., Rosman M.G. X ray studies of protein interaction. / Ann. Rev. Biochem. 1974.- V. 43. -P. 475-507.

80. Hopp T. P. Immunogenecity of a synthetic HBsAg peptide: enhancement by conjugation to a fatty acid carrier./ Mol. Immunol.- 1984.- V. 21.- P. 13-16.

81. Conformation of aqmino acid side chains in proteins./ Janin J., Wodak S., Levitt M. et al.// J. Mol. Biol.-1987.- V. 125. P. 357-386.

82. Chou P. Y. , Fasman G. D. Prediction of the secondary-106 structure of proteins from their amino acid sequence./ Adv. Enzymol. 1987.- V. 47. - P. 45-148.

83. Garnier J., Osguthorpe 0.j.,Robson B. Analysis of the accurssy and implication or simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins./ J. Ivtol. Biol. 1987.- V. ISO. - P. 97-120.

84. Jemmerson R., Pater sen Y. Mapping epitopes on a protein antigen by the proteolysis of antigen-antibody complexes. / Science. 1986.- V. 232. - P. 1001-1004.

85. Redemacher T. V. , Parekh R. B., Dv/ak R. A. Glicobiology. / Ann. Rev. Biochem. 1988.- V. 57. - P. 785-838.

86. Phosphorylation loops in sinthetic peptides of the human neurofilament protein rr.iddlesized subunit. / L. Otvos, KiHollosi, A. Perczel et al.// J. Protein Chemistry. -1988. V. 7. - P. 365-376.

87. Geysen H.M. Antigen antibody interactions at the molecular level: adventures' in peptide synthesis. / Immunology Today. 1985. - V. 6. - P. 354-359.

88. Bought en R. A. General method for rapid sol id-phase synthesis of large numbers of peptides: Specifity of antigenantibody interaction at the level of individual-107 amino acids. / Proc. Natl. Acad. Sci. 1985.- V. 78. -P. 3824-3828.

89. Briand J. P.,Mailer S. ,van Regenmortel M. H. V. Synthetic peptides as antigens: pitfalls of conjugation methods. /J. Immunol. Methods. 1985. - V. 78. - P. 59-69.

90. Dyrberg T. ,01dstone M. B. A. Orientation of peptide antigens relative to carrier proteins influence antibody specif ity. / Vaccines. 1987.- V. 87. - P. 38-43.

91. Antiviral response elicitet by a completely synthetic antigen with builtin adjuvanticity. /R. Arnon, M.Sela, № Parant et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980.-V. 77. - P. 6769-6772.

92. Reichlin M. Use of glutaraldehyde as a coupling agent for proteins and peptides. / Methods Enzymol. 1980.-V. 70- P. 159-165.

93. Neurath A. R.',Kent S. B.,Strick N. ' Antibodies to Hepatitis B surface antigen (HBsAg) elicited by immunization with a synthetic peptide covalehtly linked to liposomes./ J.Gen. Virol.- 1984. YjS&i'-P.lOOg-lOl^

94. Canterero L. A. } Butler J.E. , Osborne J. W. The adsorptive characteristics of proteins for palyster^e-103 and their significance in solid phase immunoassays. / Anal. Biochem. 1280.- V. 105. - P. 375-332.

95. Carrier bound synthetic peptides: use as antigen in HIV 1 ELISA tests and in antiserum production. / S. Modrow, B.HoflacherfRi\fertz et al.//

96. J. Immunol. Mat'nods. 1989.- Y. 118. - P. 1-7.

97. Use of sinthetic oligopeptides in identification and characteizationrof immunological functions in the amino acid sequence of the envelope protein of HIV-1. / S.Modrow, B. Hoflacher, V. Mellert et al.// J. of AIDS. -1989.- V. 2. P. 21-27.

98. Genetic variability of the AIDS virus: nucleotide sequence analysis of two isolates from Africn patients. /MAlizcn, S. Vain Hobson, L. Kfontagnier et al.// Cell.-1986.- V. 46. P. 63-74.

99. Antibodies to the nef' protein and to the nef peptides in HIV l./J. C. Ameisen, B.Guy, S. Chamaret et al.// AIDS Res. Hun. Retroviruses. -1989. V. 5. - P. 279.

100. Use of synthetic peptides for the detection of antibodies against the nef regulation protein in sera of HIV-infected patients. /Sabatier Jean Marc, Clerget-109

101. Raslain Brigitte, Fontari Gilles et al.//AIDS.-1989. -3. N4. -C. 215-220.

102. Малета Ю. Т. .Тарасов RA. Методы математической статистики в биологии и медицине. М. ,йвд -ео МГУ.- 1985.

103. Maskill V. J. .Silvester С. ,Healey D.S. Application of protein blotting to the serodiagnosis of human immunodeficiency virus infection. /Protein Blotting. -1989.- P. 69-95.

104. P. Tiissen. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Practice and. theory of enzyme immunoassay. New York. V. 15.

105. New questions raised about accuracy of Western blots in AIDS testing. /Biochechnol. Mews. 1988.-V. 8. -N5,6.

106. Myrrnel H. ,Haukenes G. False positive band in the gp41 region in anti HIV Western blotting./AFMIS. 1983.- V. 96.- N 10.- P. 950-951.

107. Reich Marc. New AIDS test is said to reduce false positives./Chem. and Eng. News. 1988.-V. 66.-N 9.-P. 5-6.111. "Indeterminate" Western blots and HIV./ Lancet.- 1989.1. N 8661.- P. 576.

108. Cordonnier A. ,Montagnier L., Emerman M. Single amino acid changes in HIV envelope affect viral tropism and receptor binding. / Nature. 1989. - V. 340.

109. Transmission of human immunodeficiency virus (HIV) by blood transfusion screened as negative for HIV antibody. / J.Ward, S. Holtrberg, J.Allen et al.// N. Engl. J. Med. 1988.- V. 318. - P. 473-478.

110. Discrimination of HIV 2 infection from HIV 1 infection by Western blot and radioimmunoprecipitation analysys. /T. Holzer, R. Allen, C. Heynen et al. // AIDS Research and Human Retroviruses. 1990.- V. 6. - N4.- P. 515-524.

111. Bacterially Produced HIV 2 env polypeptides specific for distinguishing HIV 2 from HIV 1 infections./ M. Zuber, K. Samuel, J. Lautenberger et al.// AIDS Res. and Human Retroviruses.- 1990.- V. 6. N4.- P.525-534.