Разработка методов молекулярной оценки селекционного материала основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе RAPD технологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат сельскохозяйственных наук Лаптева, Марина Николаевна

• Лаптева, Марина Николаевна
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Лаптева, Марина Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ

12

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование морфологических и биохимических признаков в геномной идентификации растений

1.2. Молекулярные маркеры на основе ДНК в геномной идентификации растений

1.2.1. RFLP технологии и их использование в геномной идентификации растений

1.2.2. PCR технология и методы разработанные на ее основе

геномной идентификации растений

1.2.3. RAPD метод

1.2.4. Оценка различных методов молекулярного маркирования

в сравнении с RAPD методом

1.2.5. Методы выделения ДНК из растительных тканей

27

1.2.6. Оптимизация условий проведения PCR со случайными праймерами.

1.3. Области применения RAPD технологии

1.3.1. Картирование признаков и генетические карты

1.3.2. RAPD маркеры в оценке биоразнообразия зародышевой

плазмы

1.3.3. RAPD маркеры в сортовой идентификации и

семенном контроле

1.4. Таксономия рода Allium и изучение филогенетических связей между видами на основе морфологических и цитологических признаков

1.5. Межвидовая гибридизация и ее значение в селекции лука. 40 2. Молекулярно-биологические исследования лука в анализе

филогенетических связей и прикладных аспектах селекции и семеноводства

3. Андрогенез и гиногенез в создании исходного материала для гетерозисной селекции моркови и методы его оценки на выравненность

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал

2.2. 808-электрофорез запасных белков семян в полиакриламидном геле

2.3. Выделение геномной ДНК

2.4. Амплификация геномной ДНК. 5

2.5. Электрофорез в агарозном геле и визуализация продуктов амплификации

2.6. Математическая обработка полученных данных. 58 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Микрометод выделения геномной ДНК для КАРЭ анализа

и характеристика полученных препаратов

3.2. ЯДРО технология: оптимизация и подбор условий

проведения ПЦР

3.2.1. Обсуждение результатов

3.3. Геномная идентификация в изучении культурного и

дикого ассортимента луков

3.3.1. Подбор праймеров

3.3.2. ЯАРО анализ в изучении межвидового и внутривидового полиморфизма луков

3.3.3. ЫАРО анализ в сортовой идентификации

3.3.4. Обсуждение результатов

3.4. Биохимическая и молекулярная оценка коммерческих партий

семян

3.4.1. Сравнительный анализ эффективности использования биохимических методов и ЯАРБ технологии в оценке коммерческих партий семян лука

3.4.2. КАРБ технология в сортовой идентификации и оценке коммерческих партии семян капусты белокочанной

3.4.3. Обсуждение результатов

3.5. Анализ межвидовых гибридов лука

3.5.1. Использование RAPD технологии в анализе межвидовых гибридов

3.5.2. Обсуждение результатов

3.6. Молекулярная оценка выравненности линейного материала моркови, полученного с использованием культуры in vitro

3.6.1. Подбор праймеров

3.6.2. Молекулярный анализ андрогенных растений моркови

RAPD методом

3.6.3. Молекулярный анализ гиногенных растений моркови

RAPD методом

3.6.4. Обсуждение результатов. 117 ВЫВОДЫ 120 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121 ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов молекулярной оценки селекционного материала основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе RAPD технологии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из наиболее важных проблем в селекции и семеноводстве овощных культур является идентификация сортов и гибридов. Особенно это актуально для культур с перекрестным способом опыления, таких как: луки, морковь, капуста. Традиционно в качестве основных критериев оценки селекционного материала используются морфологические признаки. Однако различия между сортами по этим признакам не всегда достаточно четкие, оценка проводится, как правило, на взрослых растениях, получение которых требует немалых производственных затрат и времени. Поэтому, в последние годы, все чаще для решения практических задач используются методы молекулярно-генетических исследований растений (электрофорез запасных белков, изоферментов, методы анализа ДНК на основе М<ЪР- и КАРЭ-технологий). В связи с этим особый интерес представляет НАРБ-технология как эффективный метод анализа растительного генома. Она достаточно проста в исполнении, процесс автоматизирован, требует небольшого количества времени и растительного материала для анализа, вне зависимости от стадии развития самого растения. Стандартизация экспресс-методов выделения ДНК и условий проведения ИАРО анализа обеспечивают воспроизводимость и достоверность получаемых данных. Использование ЯАРБ технологии в геномной идентификации и паспортизации селекционного материала все чаще находит применение в оценке генетического разнообразия культурных растений и их диких сородичей, в реконструкции родословных, в подборе родительских пар и оценке гибридного потомства, в анализе новых форм, создаваемых с использованием биотехнологических приемов (соматический эмбриогенез и техники эмбриоспасения при отдаленной гибридизации, гино- и андрогенез), в совершенствовании методов семенного контроля. Данная технология впервые создала предпосылки для детального изучения природы хозяйственно ценных признаков, генетического картирования отдельных генов и для реализации программ, связанных с регистрацией новых селекционных достижений и защитой авторских прав селекционера.

Внедрение в практику молекулярно-генетических методов исследования растительного генома и ДНК «фингерпринтинга» призвано повысить эффективность селекционного процесса и сделать его более направленным.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было разработать методы идентификации селекционного материала основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе RAPD технологии.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. создать коллекции геномной ДНК исследуемых культур

2. оптимизировать условия проведения полимеразной цепной реакции и системы праймирования для каждой из исследуемых культур в решении конкретных задач

3. провести молекулярный анализ геномной ДНК отдельных видов и сортопопуляций лука

4. исследовать уровень интрогресии геномов при отдаленной гибридизации луков

5. на основе RAPD технологии разработать методику оценки коммерческих партий семян лука репчатого и капусты белокочанной на сортовую принадлежность и сортовую чистоту

6. с помощью RAPD технологии провести молекулярный анализ гиногенных и андрогенных растений моркови, оценить степень их гомогенности и выравненности, а также рассмотреть зависимость этих показателей от происхождения растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников in vitro

Научная новизна результатов исследований. Оптимизированы условия проведения полимеразной цепной реакции и подобраны системы праймирования для каждой из исследуемых культур в решении конкретных задач. На основании данных RAPD анализа уточнена филогения отдельных видов рода Allium и показана эффективность данного метода в изучении популяций диких видов лука. Впервые дана молекулярная характеристика межвидовых гибридов лука в процессе беккроссирования и линейного материала моркови, полученного с использованием культуры in vitro.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана быстрая технология RAPD анализа селекционного и семенного материала таких овощных культур как лук репчатый, чеснок посевной, капуста белокочанная, а также исходного материала для селекции лука и моркови. С помощью RAPD технологии проведены сортовая идентификация и оценка коммерческих партий семян лука репчатого и капусты белокочанной на сортовую принадлежность и сортовую чистоту. Молекулярные маркеры, полученные на основе ДНК амплификации, эффективны при

оценке коммерческих партий семян и должны служить средством правовой защиты селекционных достижений.

Опубликованы «Краткие методические указания по использованию RAPD маркеров для оценки генотипов луковых культур» в составе «Методических указаний по селекции луковых культур» (Москва: Издание РАСХН, 1997), которые предложены для использования в селекционной практике.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Актуальные проблемы растениеводства и животноводства», Москва, 1996; Международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры растений», Ялта, 1996; Международной конференции «Агробиотехнология растений и животных», Киев, 1997; на Втором международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения», Пущино, 1997; Международном симпозиуме «Гетерозис у сельскохозяйственных растений», 1997; VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда», Москва, 1997; Научной сессии «Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы», Киров, 1998.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Долгое время процесс создания того или иного сорта или гибрида оставался длительным и трудоемким процессом, успех которого во многом определялся трудолюбием и интуицией селекционера. До сих пор основными характеристиками при описании селекционного материала остаются морфологические признаки и реакции на целый ряд патогенов и насекомых-вредителей. При этом не всегда удается объективно оценивать генетически обусловленные особенности генотипа, популяции, сорта, сравнивать их между собой, а также планировать подбор пар для скрещивания и контролировать направление селекционного процесса. Поэтому в последние годы ведется интенсивный поиск эффективных способов анализа и все шире для этих целей используются дополнительные, нетрадиционные методы анализа: физиолого-биохимические и, в особенности, молекулярные методы исследования растительного генома по ДНК (КРЬР, ЯАРО, 88К-РСЯ и др.), а также молекулярные маркеры, полученные на их основе. Использование принципов и методов маркирования в молекулярно-генетических исследованиях впервые создало предпосылки к маркированию важных селекционно-значимых признаков, изучению их генетической основы и наследуемости. Это позволяет сделать селекционный процесс более направленным при создании новых форм, обладающих рядом ценных признаков, открывая широкие перспективы для повышения эффективности селекционной работы и ускорения темпов селекционного производства.

Молекулярные методы анализа растительного генома, геномной идентификации имеют также важное биологическое значение, так как являются ценным источником информации о филогении, структуре популяций, видов и о процессах формообразования в них протекающих, а также для сохранения и рационального использования генетических ресурсов культурных растений.

1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ В ГЕНОМНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЙ.

Традиционно в селекционной практике в качестве генетических маркеров используются морфологические признаки, а также физиолого-биохимические (содержание и состав различного рода соединений). Однако число таких признаков ограничено и большинство из них, в зависимости от условий среды, может

варьировать в широких пределах. Случаи сцепленности морфологического признака с тем или иным хозяйственно-важным признаком крайне редки. Эти особенности морфологических и биохимических признаков снижают их информативную ценность при геномной идентификации и паспортизации селекционного материала.

Использование в качестве фенотипических признаков электрофоретических спектров белков существенно расширили рамки генетического маркирования. Белковый признак в меньшей степени подвержен фенотипическим изменениям, так как путь от гена до белкового признака значительно короче, чем до морфологического или обычного биохимического и, следовательно, является более надежным генетическим маркером. Совокупность таких белков-маркеров отражает структуру генома, специфику генотипа и широко используется для идентификации сортов, биотипов и видов растений (Конарев, 1983, 1993; Созинов, 1985). Выбор белка-маркера и метода его оценки зависит от конкретных целей и задач исследования. Для сортовой идентификации и решения ряда проблем селекции и семеноводства эффективными генетическими маркерами являются полиморфные запасные белки семян и изоферменты растений.

Анализ запасных белков наилучшие результаты показал при идентификации селекционного материала и в семенном контроле ряда зерновых и зернобобовых культур таких как: пшеница (Конарев, 1973, 1980, 1987), ячмень (Поморцев, 1982; Поморцев, Нецветаев, Созинов, 1985), рожь (Пенева, Мартыненко, 1987), горох (Тарлаковская, 1987; Калинина и др.,1988), фасоль (Lioi, 1989). Запасные белки овощных культур оказались менее эффективны в качестве маркеров и не получили такого широкого применения при оценке селекционного материала, так как с помощью электрофореза удается регистрировать преимущественно видовую и надвидовую изменчивость. На овощных культурах полиморфизм запасных белков использовался в систематике и филогении луков (Гаврилова, 1969; Maaß, 1992), при изучении сортов и гибридов лука в связи с гетерозисом (Брежнев и др., 1971), в видо-и сортоидентификации (лук, огурец, дыня) (Nakamura, Tahara, 1977), в сортовой идентификации и семенном контроле у представителей рода Cucurbita (Кононков и др., 1989; Методич. указания, 1990), идентификации сортопопуляций и инбредных линий моркови (Калинина и др., 1990).

Наряду с запасными белками, в качестве биохимических маркеров используются изоферменты растений, многие из которых представляют собой многокомпонентные, генетически полиморфные системы. Небольшие количества растительного материала для экстракции, значительное число растений анализируемых в день, несложная технология проведения анализа, кодоминантный характер наследования и информативность - достоинства, сделавшие этот метод исследования очень популярным среди генетиков, селекционеров и ботаников. Дополняя традиционные методы селекции, изоферменты расширили спектр генетически исследуемых признаков и оказали существенное влияние на проведение генетико-селекционных исследований таких как: таксономия, оценка генетического разнообразия селекционного материала, паспортизация, сортовая идентификация, анализ межвидовых и внутривидовых скрещиваний, оценка гибридности и семенной контроль (Nielsen, 1985; Левитес, 1986; Weeden, 1989).

Впервые использование изоферментных фенотипов было предложено более тридцати лет назад (Brewbaker, 1966) для сортовой идентификации и результаты работ, посвященных этой проблеме рассмотрены в обзорах Nielsen (1985) и Weeden (1989). Было установлено, что генетические различия между сортами могут регистрироваться в полиморфизмах аллозимных спектров, и изоферментные фенотипы могут быть использованы для идентификации и различения сортов, так, например, с помощью изоферментных фенотипов были идентифицированы сорта и линии редиса (Нарбут и др., 1974; Saharan et al., 1991). Большую практическую значимость изоферментный анализ имеет в оценке генетической чистоты коммерческих партий семян гетерозисных гибридов F] (Arus, 1983) и защите авторских прав (Bailey, 1983). Контроль за уровнем гомозиготности изоферментных локусов у исходных линий, полученных путем инбридинга или in vitro технологий андро- и гиногенеза является весьма эффективным для ускорения гетерозисной селекции (Orton, 1983; Cum, 1995; Campion et al., 1995; Bohanec et al., 1995). Тестирование исходных линий и гибридов F} успешно проводилось на разновидностях Brassica oleracea (Arus et al., 1982), тыкве (Ignart, Weeden, 1984), редисе (Kim, Park, 1984), китайской капусте (Xiaoying, Yan, 1994).

На овощных культурах изоферментный анализ различных ферментных систем использовался для оценки филогенетических связей видов рода Cucumis (Esquinas,

1981; Perl-Treves et al., 1985), видов рода Brassica (Coulhart, Denford, 1982), видов лука (Hadacova et al., 1983; Maaß, 1997), разновидностей сельдерея (Arus, Orton, 1984); для оценки биоразнообразия генетических коллекций чеснока (Pooler, Simon, 1993; Simon, 1994; Maaß, Klaas, 1995), лука репчатого (Rouamba et al., 1993), образцов капусты кочанной (Phippen et al., 1997).

Как генетические маркеры, изоферменты привлекались для маркирования моногенных признаков: устойчивости к нематоде у томата (Rick, Fobes, 1974), устойчивости гороха к вирусу желтой мозаики (Hunt, Barnes, 1982), а также при работах по созданию генетических карт салата латук (Landry et al., 1987), моркови (Westhai, Wrike, 1989, 1991; Shulz et al., 1994), огурца (Knerr, Staub, 1992; Kennard et al., 1994), дыни (Meglik et al., 1994).

Другим способом применения изоферментов является подтверждение гибридной природы растений, полученных путем слияния протопластов или техник эмбриоспасения при отдаленной гибридизации (Rick, 1983; Wetter, Dyck, 1983; Гавриленко, Павлов, 1992). При этом обе родительские формы должны обладать аллозимными различиями по относительно стабильным ферментным системам. Помимо этого, для половых и соматических межвидовых гибридов большой интерес представляет изоферментный контроль за уровнем интрогрессии геномов при отдаленной гибридизации (Peffley et al., 1985; Cryder et al., 1991).

Однако не все овощные культуры обладают достаточным для идентификации гибридности уровнем аллозимной изменчивости. Очень незначительное количество полиморфных локусов у культурного томата (Rick, 1983), перца и огурца (Weeden, 1989; Staub, Meglik, 1993) и, напротив, значительный уровень гетерозиготности у лука репчатого (Weeden, 1989) делают использование изоферментов у этих культур малоэффективным не только для идентификации гибридов Fb но и сортов.

При всех своих достоинствах изоферменты имеют некоторые недостатки, касающиеся процедуры выделения, тканеспецифичности, зависимости от стадии развития растения и условий его выращивания. Это ограничивает использование изоферментов в качестве надежных генетических маркеров и требует стандартизации методик (Конарев, 1983).

1.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ НА ОСНОВЕ ДНК В ГЕНОМНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЙ.

Бурное развитие молекулярной генетики в последние десятилетия создало предпосылки для разработки новых методов геномной идентификации растений с помощью ДНК-маркеров, а также молекулярных основ наследственности и изменчивости признаков. С появлением ДНК-маркеров был сформулирован универсальный принцип генетического маркирования, основанный на применении в качестве нейтральных генетических маркеров локусов, обладающих свойствами структурного полиморфизма. Использование ДНК-зондов позволяет исследовать не только ту часть генома, которая непосредственно кодирует белковые молекулы, но и некодирующую часть генома (Сулимова, 1989). Поэтому число ДНК маркеров, их информативность во много раз превосходят потенциал белковых маркеров, а отсутствие зависимости от стадии развития организма и тканеспецифичности выгодно их отличают от изоферментов. В настоящее время ДНК-маркеры с успехом используются в классификации и паспортизации сортов, оценке генетического разнообразия растений, картировании генов и сцепленности их с хозяйственно-ценными признаками, а также для анализа интрогрессии генов при отдаленной гибридизации.

Существует несколько подходов для изучения структурного полиморфизма ДНК и отдельных фрагментов генома с помощью ДНК маркеров. Условно их можно разделить на три группы:

1. Методы, основанные на особенности ферментов - рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) узнавать специфические последовательности ДНК и разрезать нити ДНК по сайтам рестрикции - RFLP технологии анализа геномной ДНК

2. Методы на основе полимеразной цепной реакции (PCR) ДНК

3. Методы, сочетающие в себе RFLP и PCR методы исследования ДНК Остановимся подробнее на некоторых из этих методов и способах их использования в геномной идентификации растений.

1.2.1 RFLP ТЕХНОЛОГИИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ГЕНОМНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЙ.

Метод RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) основан на ферментативном расщеплении молекулы ДНК с помощью рестриктаз. Использование этой технологии направлено на выявление генетической изменчивости, которая затрагивает специфические локусы гомологичные последовательностям ДНК-зондов. Выполнение RFLP анализа геномной ДНК довольно трудоемкий процесс. Данная технология состоит из нескольких этапов: выделение геномной ДНК, гидролиз ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз и электрофоретическое разделение фрагментов рестрикции в геле, создание библиотеки клонов комплементарной ДНК (кДНК) или геномной ДНК, выбор и подготовка гибридизационных зондов, блот-гибридизация с меченными зондами и тестирование вступивших в гибридизацию фрагментов ДНК. Причины возникновения полиморфизма рестрикционных фрагментов ДНК кроются в точковых мутациях, затрагивающих сайты узнавания рестриктаз, либо в более крупных структурных изменениях молекулы ДНК (делеции, инсерции, транслокации). Таким образом, RFLP дает возможность выявлять наследственные фенотипически нейтральные особенности отдельных организмов и может быть использован в качестве генетических маркеров. Впервые свойства RFLP как генетических маркеров и теоретическое обоснование их использования были представлены в работе Ботштейна с соавторами при изучении генома человека (Botstein et al., 1980). Установлено, что ДНК-маркеры на основе RFLP наследуются стабильно в кодоминантной манере как простые менделевские признаки и не зависят ни от фазы онтогенеза, ни от условий внешней среды. Успех RFLP анализа ДНК во многом зависит от выбора фермента рестрикции и информативного зонда для блот-гибридизации. В качестве зондов могут использоваться клоны кДНК при изучении наследования конкретных генов (Bernatzky, Tanksley,1986), клоны низкокопийных или уникальных последовательностей ДНК при изучении нетранскрибируемых областей генома (Tanksley et al., 1987).

RFLP технология нашла широкое применение в построении генетических карт томата (Tanksley, 1987;1992), перца (Prince et al., 1993), моркови (Schulz et al.,1994), огурца (Kennard et al., 1994); в сортовой идентификации дыни (Neuhausen, 1992), перца (Lefebvre et al., 1993); в таксономических исследованиях и оценке

биоразнообразия капусты (Song et al., 1988 а,б), популяций лука репчатого (Bark, Havey, 1995); в маркировании локусов количественных признаков у перца (Lefebvre, 1993). Большинство RFLP маркеров - диаллельны, поэтому информативность таких маркеров невысока. Вследствие этого, RFLP маркирование связано с анализом значительного количества клонов и затратами на их проведение. Так, например, при построении генетической карты кукурузы потребовалось 338 таких зондов (Helentjaris, 1987).

Более информативные гибридизационные зонды появились с открытием гипервариабельных последовательностей ДНК в геномах различных организмов. Такие последовательности представлены тандемно повторяющимися единицами называемыми мини- и микросателлитами. Минисателлиты впервые были выделены из интронной области миоглобинового гена человека и представляли собой многократно повторенный основной мотив размером 33 п.н. (Jeffreys et al., 1985а). Впоследствии на основе бактериофага М13 были созданы гибридизационные зонды (33.6 и 33.15), которые содержали последовательности гомологичные тандемным повторам 33-нуклеотидной кор-последовательности (Jeffreys et al., 19856). Другое семейство гипервариабельных минисателлитов, аналогичное по своим свойствам пробам Джеффриса, обнаружено в ДНК самого фага М13 (Джинчарадзе, Иванов, Рысков, 1987; Vassart et al., 1987). Гибридизация минисателлитных проб с фрагментами геномной ДНК выявляет множество мультиаллельных гипервариабельных локусов, обладающих свойством структурного полиморфизма. Причины явления гипервариабельности пока точно не установлены, но большинство исследователей сходятся на том, что полиморфизм, выражающийся в различном количестве тандемных повторов, связан с неравным кроссинговером и проскальзыванием ДНК-полимеразы в процессе репликации (Tautz, 1989; Schlotterer, Tautz, 1992; Charlesworth et al.,1994). Высокий полиморфизм локусов в сочетании с их соматической стабильностью и менделевским характером наследования открыли широкие возможности для использования этого типа молекулярных маркеров в геномной идентификации отдельных образцов, оценке генофондов сортов культурных растений, их паспортизации и в установлении родства (Rogstad et al., 1988; Иванов, 1989; Сулимова, 1989; Nybom et al., 1990; Lavi et al., 1994; Sharon et al., 1995).

По сравнению с минисателлитами, последовательности микросателлитной ДНК состоят из более коротких (1 - 8 п.н.) тандемных повторов, повсеместно встречающихся в ядерном геноме эукариот (Hamada et al., 1982; Stallings et al., 1990). Обследование баз данных ДНК-последовательностей для 54 видов растений показало, что частота встречаемости ди-, три-, и тетрануклеотидных повторов составляет 1 повтор на 64,6 тыс.п.н. у однодольных и 21,2 тыс.п.н.- у двудольных видов (Wang et al., 1994). Сведения о числе, хромосомной локализации, функциональной направленности мини- и микросателлитных повторов у растений носят пока фрагментарный характер. Однако, показано, что для таких высокогомозиготных культур как томат, он может быть эффективен при различении сортов (Vosman et al., 1992). У сои было обнаружено, что на каждый микросаттелитный локус имеется 6-8 аллелей, сегрегирующих в 1:2:1 ко доминантной манере (Akkaya et al., 1992).

Подводя итог рассмотрению различных способов применения RFLP технологии в геномной идентификации овощных культур и растений в целом, следует отметить, что несмотря на все достоинства данной технологии (эффективность, высокая специфичность, кодоминантное наследование RFLP-маркеров), её использование для решения практических задач селекции и семеноводства затруднено ввиду трудоемкости, потребности в дорогостоящем оборудовании и материалах и значительных временных затрат на выполнение анализов. Особые требования в RFLP анализе предъявляются к препаратам ДНК и степени их очистки, поскольку примеси оказывают зачастую ингибирующее действие на активность ферментов рестрикции.

1.2.2. PCR ТЕХНОЛОГИЯ И МЕТОДЫ, РАЗРАБОТАННЫЕ НА ЕЕ ОСНОВЕ В ГЕНОМНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЙ.

Процесс полимеразной цепной реакции впервые был описан K.Mullis с соавторами (1986). Полимеразная цепная реакция представляет собой метод ферментативного синтеза специфических последовательностей ДНК in vitro. В качестве затравки для синтеза ДНК-фрагментов используются олигонуклеотидные праймеры, гибридизующиеся с нитями денатурированной ДНК-матрицы и фланкирующие её специфический отрезок. Полимеразная цепная реакция (PCR) состоит из серии повторяющихся циклов, включающих денатурацию ДНК-матрицы, «отжиг» праймеров и синтез новых фрагментов ДНК с помощью ДНК-полимеразы за

счет достройки последовательностей праймеров на основе принципа комплементарности (схема 1). Так как концевые последовательности синтезированных фрагментов ДНК включают и праймерные последовательности, эти фрагменты ДНК могут служить матрицей в последующих циклах амплификации. Таким образом, в каждом цикле количество последовательностей ДНК-мишени увеличивается вдвое и после п циклов амплификации синтезируется 2П копий ДНК-мишени. В результате, после 35 -45 циклов образуется характерный для данной ДНК-матрицы продукт PCR. Это дает возможность обнаруживать среди многообразных последовательностей геномной ДНК низкокопийные или уникальные последовательности, кодирующие гены или прилегающие к ним области генома. PCR технология не требует создания и поддержания библиотеки клонов для блот-гибридизационных зондов, использования радиоактивных изотопов, что в свою очередь, значительно упрощает процесс поиска информативных маркеров в молекулярно-генетических исследованиях.

Первоначально полимеразная цепная реакция осуществлялась с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I E.coli, но из-за инактивации ДНК-полимеразы при температурах выше 37°С реакцию приходилось проводить вручную, добавляя «свежий» фермент в каждом новом цикле. В результате специфичность реакции амплификации была недостаточно высокой и требовались дополнительные методы детекции и характеристики продуктов PCR. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus (Taq-полимеразы) позволило увеличить специфичность продуктов амплификации, увеличить размер синтезируемых фрагментов ДНК, их количество и выход, а сам процесс PCR сделать автоматизированным. Ферменты - термостабильные ДНК-полимеразы могут быть выделены из различных термофильных бактерий и обладать различными каталитическими свойствами (Gelfand, 1989; Meunier, Grimont, 1993; Schierwater, Ender, 1993; Wei, Campbell, Wang, 1997). Это обстоятельство учитывается при проведении PCR.

Разделение цепей ДНК и присоединение праймеров

1-й цикл <

Я1111Г1111111111111Н111111111111111111111Ш

I

с-,--..-1Ш1Н1Ц,

-Л]

2-й цикл '

3-й цикл <

V

шп,

„шгпп

V

штгтп.

жптп.

лшзшп

тшшшг

тшшпг

И 1.11:11ИЬ

о

Удлинение праймеров с образованием копий изучаемого фрагмента ДНК

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH

"IflllllillllllllllllllllllHIIIIII

llillllllllllilllllHIIIIIIIIHIIilll,

illlllllllllllllillllirnillllllll,

ЧИП IUI II III! INI IM M IIIIII III L

J

ЛП

гш

лп

чп

тп

ли

lllllllIHllllllllllb

lllllllllllllllllilllo

ПИНИИШННППэ

ГШ

illliHlillllllHIIlio Id

до бесконечности Схема. 1. Схема полимеразной цепной реакции.

В первое время использование PCR в исследованиях генома растений сдерживалось из-за необходимости в информации о нуклеотидных последовательностях ДНК-мишени для проектирования праймеров. Получение такой информации является трудоемким процессом, а для ряда видов растений практически невозможным, в силу слабой изученности их геномов. Революционный прорыв в исследовании геномов разнообразных видов живых организмов был осуществлен с

разработкой разными независимыми группами ученых методов амплификации со случайными праймерами произвольной нуклеотидной последовательности: RAPD (random amplified polymorphic DNA) метод (Williams et al., 1990) AP-PCR (arbitrary primed PCR) метод (Welsh, McClelland, 1990) DAF (DNA amplification fingerprinting) метод (Caetano-Annoles et al., 1991) а также метод УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) (Булат и др., 1992) Так как в основе этих методов лежат общие принципы праймирования RAPD, AP-PCR и DAF методы получили общее название - МААР (múltiple arbitrary amplicon profiling) технологии (Caetano-Annoles et al., 1992; 1993; 1994). В МААР технологиях используют короткие произвольно отобранные праймеры, которые связываясь с ДНК-матрицей, направляют амплификацию на синтез случайных фрагментов из многочисленных областей генома - «amplicons» (Mullis, 1991). Особенности МААР технологий представлены в таблице 1. Спектры «ампликонов», полученные разными методами, выявляют характерные особенности ДНК-матрицы и специфичны для каждой комбинации праймер/ДНК. Явление амплификационного полиморфизма -результат изменения нуклеотидных последовательностей в местах связывания праймера с ДНК-матрицей. Таким образом, анализ сходств/различий в спектрах продуктов амплификации позволяет обнаруживать и оценивать скрытую генетическую изменчивость у исследуемых организмов, идентифицировать линии, сорта и гибриды. МААР-технологии оказались успешны для генетического картирования, а также для анализа геномов тех видов растений, у которых получение молекулярно-генетических маркеров затруднено (томат, лук, перец, огурец).

1.2.3. RAPD МЕТОД. В 1990 году группой исследователей (Williams et al., 1990) впервые был описан новый класс молекулярных маркеров получивших название: Random Amplified Polymorphic DNA - произвольно амплифицированная полиморфная ДНК или сокращенно RAPD. Данный метод основан на амплификации случайных отрезков ДНК единичными десятинуклеотидными праймерами произвольной

Табл. 1. Сравнительная характеристика PCR методов анализа растительного генома и ДНК-маркеры, полученные на их основе.

Страте- Праймер Способ детекции Характер

гия Принцип Ампликон чис- длина в Т°С разделе- визуализа- наследования

ло нукл. отжига ние ция

1 2 3 4 5 6 7 8 9

RAPD недетерминированная PCR множественный 1(2) 8-10 34-37 ЭФ, агароза этидиум бромид доминантный

AP-PCR недетерминированная PCR множественный 1-2 16-25 первые 25 циклов-40, далее-60 ЭФ, агароза, ПААГ р/а метка доминантный

DAF недетерминированная PCR множественный 1(2) 5-8 30 ЭФ, ПААГ окраска серебром доминантный

tec- DAF + рестрикция множествен- 1(2) 5-8 30 ЭФ, ПААГ окраска доминантный

МААР ный серебром

SCAR RAPD + кл.+ секв.+ констр. праймеров для детерминированной PCR одиночный 2 20-24 60 ЭФ, агароза этидиум бромид кодоминантный

ASAP RAPD + кл.+ секв.+ констр. праймеров для детерминированной PCR одиночный 2 15-18 62-64 этидиум бромид доминантный

to

1 2 3 4 5 6 7 8 9

AFLP рестрикция + констр.праймеров + 2 раунда детерминированной PCR множественный 2 17-18 60 ЭФ, денату-рир. ПААГ окраска серебром, р/а метка доминантный

SSR- констр.праймеров + множествен- 1-2 16-18 50-60 ЭФ, этидиум кодоминантный

PCR детерминированная PCR ный агароза, ПААГ бромид, серебро, р/а метка

IRA констр.праймеров + детерминированная PCR множественный 1-2 18 52 ЭФ, ПААГ р/а метка доминантный

RAMPO RAPD или SSR-PCR + множествен- 1 16-18 RAPD- ЭФ, этидиум доминантный

блоттинг по Саузерну ный 35, SSR-PCR -50-58 агароза, ПААГ бромид, р/а метка

Обозначения: «кл.» - клонирование; «секв.» - секвенирование фрагментов ДНК; «констр.праймеров» - конструирование

олигонуклеотидных праймеров, последовательности которых гомологичны концам секвенированных фрагментовДНК; «нукл.» - нуклеотиды; ПААГ - полиакриламидный гель; «р/а метка» - радиоактивная метка.

последовательности, при этом содержание G+C оснований в них должно быть не ниже 50%. Продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном геле и выявляют после окрашивания гелей бромистым этидием в проходящем УФ-свете.

Техника приготовления агарозных гелей в RAPD методе значительно проще, чем приготовление полиакриламидных гелей, используемых в AP-PCR или DAF методах.

При этом отпадает необходимость в работе с акриламидом, являющимся опасным для здоровья нейротоксином. Детекция продуктов PCR в RAPD методе проще и быстрее по сравнению с AP-PCR, где используется радиоактивная метка или с DAF, использующим технологию окрашивания серебром. В отдельных случаях для более четкого разделения интересующих зон RAPD спектров могут быть использованы и полиакриламидные гели.

Полиморфизм, наблюдаемый в RAPD-спектрах исследуемых организмов, является следствием изменений в сайтах отжига праймера или делеций/инсерций амплифицируемого фрагмента ДНК-матрицы. В первом случае это приводит к исчезновению отдельных зон спектра, а во втором - к изменению размера синтезируемого продукта. Природа амплифицированных полиморфных фрагментов может быть различна. Как было показано в экспериментах на сое, 6 из 11 фрагментов, использованных в качестве RFLP-проб, гибридизовались с однокопийными последовательностями, остальные - со средне- и высокоповторяющимися последовательностями ДНК (Williams et al., 1990). Авторами было установлено, что значительная часть полиморфизмов доминантны. При картировании генома Neurospora crassa из 88 RAPD-маркеров 84 были доминантны и лишь 4 наследовались как кодоминантные признаки. Другими авторами (Bowditch et al., 1993) высказывалось предположение, что частота кодоминантных RAPD-маркеров может быть выше для геномов с большой долей рассеянных коротких повторов.

В тех случаях когда необходимо повысить точность праймирования и эффективность анализа «ампликонов» или необходима информация об организации и функциональной нагрузке «анонимных» RAPD-маркеров могут быть использованы технически более сложные методы, такие как: tecMAAP (template endonuclease cleaved multiple arbitrary amplicon profiling) (Caetano-Annoles et al., 1993), SCAR (sequence characterized amplified region) (Paran, Michelmore, 1993), амплификация с ASAPs (allele-specific associated primers) (Gu et al., 1995), AFLP (amplified fragment length

polymorphisms) (Vos et al.,1995) или CRED-RA (coupled restriction enzyme digestion and random amplification) (Cai et al., 1996).

По использованию методических приемов (рестрикция, клонирование, секвенирование, PCR) эти методы занимают промежуточное положение между RFLP и PCR технологиями, с одной стороны упрощая проведение RFLP-анализа, а с другой - увеличивая эффективность и надежность PCR технологии, обеспечивая её усовершенствование и развитие. Для исследования определенных, заранее выбранных последовательностей генома (sequence-tagget site - STS) в PCR технологии использовались также методы маркирования микросателлитных последовательностей ДНК: SSR-PCR (simple sequence repeat PCR) (Morgante, Olevieri, 1993; Lavi et al., 1994), RAMPO (random-amplified microsatellite polymorphisms) (Richardson et al., 1995; Ramser et al., 1997), а также прилегающих к ним участков : IRA (inter-repeat amplification) или inter-SSR (Zietkiewicz et al., 1994).

Таким образом, в настоящее время существует множество методов, разработанных на основе полимеразной цепной реакции, той или иной степени сложности. Однако большинство из них базируется на RAPD методе, который нашел самое широкое распространение в молекулярно-генетических исследованиях различных организмов: от микроорганизмов до высших растений и животных. Поэтому мы обратили более пристальное внимание на RAPD метод для решения проблем геномной идентификации в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений.

1.2.4. ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ

В СРАВНЕНИИ С RAPD МЕТОДОМ.

Как показали исследования, RAPD метод является простым и быстрым методом анализа, не требующим больших количеств растительного материала для выделения ДНК. По сравнению с другими молекулярными маркерами (изоферментными, RFLP), RAPD-маркеры обладают более высоким уровнем полиморфизма. Так у культурных томатов (Lycopersicon esculentum) из 313 праймеров 63% выявляли более 1 полиморфизма, тогда как у RFLP клонов только 16%, а по изоферментам не было выявлено никаких отличий (Foolad et al., 1993). Сходные результаты были получены при сравнении двух видов рода Populus по данным изоферментного, RFLP- и RAPD-

анализов. При этом RAPD метод выявил наибольший уровень гетерогенности и большее количество видоспецифичных локусов (Liu, Furnier, 1993).

При сравнительной оценке методов анализа геномной ДНК (микросателлитная проба (GATA)4, inter-SSR-PCR, RFLP и RAPD) для сортовой идентификации хризантемы авторы (Wolff et al., 1995) остановили свой выбор на RAPD методе как на самом быстром и простом, не требующим процедур радиоактивного мечения и гель-электрофореза в полиакриламидном геле. Другая группа ученых, сравнивая четыре вида ДНК маркеров (RFLP, RAPD, AFLP и SSR), показала, что SSR маркеры детектируют самую высокую гетерозиготность при анализе генотипов сои, a AFLP-зонды охватывают наибольшее число локусов в одном опыте (Powell et al., 1996). RAPD данные хуже коррелировали с данными других методов при установлении родства культурной и дикой сои, но показали одинаковые с AFLP результаты при сопоставлении форм дикорастущей сои. Использование RAPD метода в геномной идентификации растений и оценке биоразнообразия является высокоэффективным, приближаясь по значениям к AFLP, но из-за амплификации анонимных последовательностей ДНК не достаточно информативно. Поэтому этот тип ДНК-маркеров часто дает хорошие результаты в сочетании с анализом аллозимной изменчивости для уточнения внутривидовой классификации (Maaß, Klaas, 1995) или— в оценке биоразнообразия и географической структуры вида из коллекций генбанков (Le Thierry D'Ennequin et al., 1997; Phippen et al., 1997). Однако, при оценке межвидовых связей, RAPD метод требует дополнительного проведения блот-гибридизационных анализов для подтверждения того, что фрагменты одного размера в RAPD-спектрах разных видов гомологичны.

Одним из важных моментов при сравнении различных методов исследования является стоимость их проведения. Большую часть затрат на проведение анализов составляют заработная плата квалифицированного персонала. Она может быть очень различна среди институтов, компаний и в разных странах. Более того, стоимость химреактивов и оборудования, используемых при проведении анализов определяется компанией-производителем или компанией, занимающейся их распространением и может варьировать в широких пределах. Поэтому сравнивать стоимость проведения анализов можно только в относительных величинах. Стоимость электрофоретических методов анализа растений по белкам.

Наиболее дорогостоящим компонентом молекулярных анализов является подготовка образцов. При подготовке образцов для изоферментного анализа требуется мягкая гомогенизация с соблюдением температурных режимов выделения, которые бы обеспечили экстракцию нативных функционально-активных ферментов. Поэтому приготовление образцов для изоферментного анализа будет дороже, чем образцов запасных белков для их анализа. Приготовление крахмальных гелей для электрофореза дороже, чем полиакриламидных, но крахмальный гель может дать больше генетической информации, если его разрезать на пластины и окрасить на разную ферментную активность. Так, стоимость анализа кукурузы по 15 генам методом электрофореза в крахмальном геле составила 1,00-2,00$ на растение (Stuber et al., 1988). Использование полиакриламидных гелей увеличило бы эту стоимость в несколько раз, так как для анализа по каждому гену потребовался бы отдельный гель. Соответственно, если нужно проанализировать один белок или изофермент полиакриламидный гель более эффективен. Например, у сои анализ по локусам липоксигеназы потребовал менее 1,00$ на растение (Shoemaker, 1992). Стоимость молекулярных методов анализа растений по ДНК.

Также как и в белковом анализе, большую часть стоимости составляет оплата труда квалифицированного персонала. Как отмечали Ragot М. и Hoisington D.A. (1993), почти половину от оставшейся величины могут составить методы выделения ДНК и способы детекции продуктов амплификации. В RFLP анализе самым дорогостоящим является радиоактивное мечение гибридизационных проб (Hoisington et al., 1991). Хемилюминесцентное мечение может снизить стоимость проведения анализа до 0,25-0,40$ на локус. Стоимость RAPD анализа сравнима по величине с RFLP, а иногда может быть и выше. Совершенствуя методики выделения ДНК и способы детекции продуктов амплификации, можно добиться снижения стоимости RAPD анализов. Так, в 1995 году американскими учеными (Gu et al., 1995) предложена модификация RAPD метода - ASAPs (allele-specific associated primers). Комбинацию праймеров подбирают так, чтобы при проведении PCR синтезировался только единичный аллель-специфичный продукт. Получая единственный продукт амплификации, уже нет необходимости в электрофоретическом разделении .Он четко детектируется прямым окрашиванием в иммунологическом планшете бромистым этидием, что позволило исключить затраты на проведение гель-электрофореза и

сократить длительность всей процедуры выявления с четырех часов до 10-20 минут. Такая экспресс-диагностика дает возможность работать с большим числом образцов и эффективно проводить отбор по генотипу. При этом стоимость анализа снижается до 0,20$ на образец с минимальными затратами времени. Теперь стоимость процедуры определяется в основном ценой Тац-полимеразы.

Учитывая вышеизложенное, следует сделать вывод, что ЛАРО метод является наиболее эффективным и вместе с тем экономичным методом исследования генома, способным маркировать достаточно большое число локусов с высоким уровнем полиморфизма. Другие методы молекулярного анализа более трудоемки и дорогостоящи. Прогресс в КАРБ технологии может быть связан с методами выделения ДНК.

1.2.5. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ.

Большинство существовавших ранее методов выделения ДНК было разработано для КРЬР технологии. Поэтому они требовали больших количеств растительного материала и множества манипуляций, связанных с очисткой ДНК от примесей (белков, пигментов, углеводов и др.), так как примеси в препаратах ДНК нередко оказывали ингибирующее действие на рестрикционные эндонуклеазы. Новые методы на основе полимеразной цепной реакции не требуют больших количеств ДНК, и для проведения реакции необходимы лишь несколько нанограмм геномной ДНК, а фермент - Тад-полимераза, используемый в реакции, менее чувствителен к наличию примесей в препаратах ДНК. Поэтому был осуществлен поиск наиболее приемлемых методик микровыделения ДНК. Несмотря на это, основные принципы и этапы выделения ДНК сохраняются: а) препараты должны обладать достаточно высокой полимерностью; б) степень очистки ДНК должна быть такой, чтобы примеси в препаратах не оказывали ингибирующего воздействия на ферменты, используемые в работе; в) для выделения ДНК лучше использовать молодые растущие ткани -зародыши, проростки или бутоны, т.к. старые ткани содержат большое количество нуклеаз и с трудом подвергаются разрушению (Сулимова, Слюсаренко, 1972).

Условно процесс выделения ДНК можно разделить на несколько этапов:

1. гомогенизация растительной ткани

2. лизис клеточных мембран и экстракция дезоксинуклеопротеида

3. депротеинизация

4. очистка ДНК от РНК, полисахаридов и пигментов

Среди методов выделения ДНК широкой популярностью у исследователей пользуются методы с использованием цетилтриэтиламмониумбромида (СТАВ). При высокой концентрации хлорида натрия (до 0,7М), СТАВ способен формировать устойчивые растворимые комплексы с нуклеиновыми кислотами. В результате большая часть примесей остается в растворе (Murray, Thompson, 1980; Taylor, Powell, 1982; Saghai-Maroof et al., 1984; Doyle, Doyle, 1987). Такие методы использовались для выделения ДНК из самых различных типов тканей и видов растений. Однако методика выделения довольно трудоемка и не всегда обеспечивает хороший выход ДНК (Rogers, 1994).

Спецификой растительной ткани является наличие прочной клеточной стенки, что затрудняет выделение высокополимерной нативной ДНК. Для преодоления этой трудности был разработан метод с использованием бензилхлорида, который специфически реагирует с полисахаридами клеточной стенки, разрушая ее с наименьшим повреждением ДНК. По своим свойствам бензилхлорид сходен также с фенолом и способен экстрагировать белки и другие клеточные примеси из жидкой фазы (Zhu et al., 1993).

Для PCR технологии разрабатывались специальные микрометоды выделения ДНК. Одним из таких методов является метод группы исследователей (Edwards et al., 1991). Он разработан на основе метода Деллапорта (Deilaporta et al., 1983) с использованием в экстракционном буфере додецилсульфата натрия (SDS) в качестве лизирующего агента. В отличие от исходного метода было снижено содержание SDS в экстракционном буфере, исключена двухразовая депротеинизация смесью хлороформ/изоамиловый спирт, а ДНК осаждалась изопропанолом. Такие изменения были направлены на улучшение состояния ДНК и снижение затрат времени и средств на процедуру выделения.

В нашей работе мы использовали методику выделения геномной ДНК, которая была разработана Дороховым Д.Б. и Клоке Э., как модификация SDS-метода Эдвардса (Дорохов, Клоке, 1997). Данный метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования. Для улучшения качества препаратов и увеличения выхода ДНК, авторами введена в методику дополнительная очистка ДНК

5М раствором ацетата калия. Эта методика позволяет получать препараты нативной геномной ДНК, которые обладают высокой полимерностью, достаточной степенью очистки и стандартизированные по концентрации.

1.2.6 ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ PCR СО СЛУЧАЙНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ.

Авторы публикаций, в которых использовался RAPD метод, часто отмечают высокую чувствительность данного метода к условиям его проведения. В связи с этим успех анализа, достоверность и воспроизводимость полученных данных зависят от оптимизации и стандартизации условий проведения PCR. Определяющими факторами при этом являются:

а) состав реакционной среды (компоненты реакционного буфера, нуклеотидтрифосфаты, праймеры, ДНК-матрица, фермент Taq-полимераза); б) условия температурного режима PCR.

А. Состав реакционной среды.

Качественный и количественный состав реакционной среды в значительной степени определяется свойствами фермента. Оптимальные значения pH среды для работы Taq-полимеразы лежат в диапазоне 8.0-9.0.

Присутствие одновалентных катионов в реакционном буфере может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на Taq-полимеразу. Было показано, что в концентрациях не превышающих 50мМ соли калия (KCl), натрия (NaCl) или аммония (NH4)2S04 оказывали стимулирующее воздействие. По силе стимулирующего воздействия на фермент одновалентные катионы распределились в следующем порядке: NH4+> Na+> К+. Из солей аммония наиболее пригодным оказался сульфат аммония (Глухов и др. 1991). В иностранной литературе часто можно встретить указание на использование KCl, содействующего отжигу праймера на матрице ДНК (Innis, Gelfand, 1990). В концентрациях превышающих 50 мМ наблюдалось ингибирование.

Присутствие в реакционной среде формамида, диметилсульфоксида (ДМСО) или SDS оказывает ингибирующее воздействие на Taq-полимеразу, хотя замечено, что SDS в концентрациях до 0,001% проявляет легкий стимулирующих эффект (Gelfand, 1989).

Часто для стабилизации фермента в реакционный буфер добавляют желатин или сывороточный альбумин (100 мкг/мл), однако это необязательные компоненты (Innis, Gelfand, 1990), а желатин (0,01%) может ингибировать Taq-полимеразу (Глухов и др. 1991). Неионные детергенты (Твин-20, НР-40, тритон Х-100) в концентрации 0,01% значительно увеличивают выход продукта амплификации, особенно Твин-20. Объясняется это с одной стороны - увеличением активности Taq-полимеразы, с другой - действием детергента, препятствующим адсорбции фермента, а также праймера и ДНК-матрицы на стенках пробирки. Помимо этого при высоких температурах неионные детергенты стабилизируют молекулу фермента, тем самым повышая эффективность катализа. Концентрация ионов магния.

Большое значение для оптимизации PCR имеет концентрация ионов магния в реакционной среде, которые влияют на отжиг праймера на ДНК матрице, на температуру диссоциации нитей ДНК, на специфичность продуктов PCR, на ферментативную активность термостабильной ДНК-полимеразы. При концентрации MgCl2 ниже 1мМ продукты амплификации могут отсутствовать (Wei et al., 1997). Избыток ионов магния в реакционной среде приводит к получению размытых спектров, а при 10 мМ концентрации - к 40-50% ингибирующему эффекту. Оптимальное количество ионов магния определяется содержанием нуклеотидтрифосфатов, а их соотношение зависит от выбора термостабильной ДНК-полимеразы и олигонуклеотидного праймера. Присутствие ЭДТА в реакционной среде может изменить это значение (Глухов и др., 1991; Yong-Ha, Russell, 1994). Обычно для успешной амплификации необходимо 1,5-4 мМ MgCl2. Олигонуклеотидные праймеры.

Олигонуклеотидные праймеры служат затравкой для синтеза продуктов PCR. При выборе праймера необходимо соблюдать следующие требования: G+C содержание входящих в их состав нуклеотидов должно составлять не менее 50%; последовательности праймеров не должны содержать палиндромных цепей и трех или более одинаковых нуклеотидных оснований (G или С) на 3'-конце праймера (Innis, Gelfand, 1990). Нуклеотидный состав и длина праймера учитываются при выборе температуры и времени отжига. Фермент.

Когда состав реакционной среды оптимизирован важно установить количество ДНК-полимеразы достаточное для эффективного синтеза RAPD продуктов. Обычно оно составляет 0,5-1 ед.на 25 мкл реакционной среды. Недостаток фермента ведет к недостаточному количеству амплифицированных фрагментов, а избыток - к накоплению неспецифических продуктов. По каталитическим свойствам термостабильные ДНК-полимеразы могут быть разными в зависимости от источника (Gelfand, 1989; Meunier, Grimont, 1993; Schierwater, Ender, 1993; Wei et al., 1997). Геномная ДНК.

Геномная ДНК, служащая матрицей для PCR, добавляется в реакционную среду из расчета 0,004-0,8 нг/мкл среды (Bowditch et al., 1993). В классической PCR, направленной на амплификацию конкретного участка ДНК, рекомендовано использовать 0,5-10 нг для амплификации однокопийных локусов и 0,005-0,02 нг/мкл среды для амплификации мультилокусных генов (например рибосомальных), повторенных в геноме 200-500 раз (Saiki, 1990). Избыток матрицы ДНК в реакционной среде приводит к нечетким смазанным RAPD спектрам, а слишком малое ее количество - к нерегулируемой ПЦР (Rafalski et al., 1993).

Б. Условия температурного режима.

Этот этап оптимизации условий проведения PCR очень важен. Во многом он определяется техническими параметрами термоциклера (Macpherson et al., 1993). Поэтому часто проводят предварительное тестирование термоциклера и его регулировку. Поскольку процесс PCR трехступенчатый (денатурация-отжиг-элонгация), необходимо выбрать температурные параметры и продолжительность для каждой ступени цикла, а также задать число циклов.

Величина температуры денатурации должна быть такой, чтобы обеспечивать максимальную денатурацию ДНК-матрицы и продуктов амплификации. Однако, воздействие высоких температур и их продолжительность постепенно ведут к дезактивации Taq-полимеразы. В реакционной смеси она сохраняет 50% своей ферментативной активности в течение 130 мин при 92,5°С; 40 мин при 95°С и 5-6 мин при 97,5°С.

Оптимальная температура гибридизации праймеров с ДНК-матрицей рассчитывается по формулам, предложенным Ричлик с соавторами (Rychlik et al., 1990):

Таопт= 0,3Tmnp + 0,7Ттпрод - 14,9

где Та0ПТ- оптимальная температура гибридизации праймера с ДНК-матрицей,

Ттпр- температура плавления праймера, Ттпрод- температура плавления продукта, Температура плавления праймера вычисляется по формуле: Тпр"ра= - kdG/l03'3/13, где

к = 2,913682 при концентрации ионов калия 50 мМ, 10 - длина праймера Температура плавления продукта вычисляется по формуле: Тю - 81,5 + 16,61g(K+) + 0,41(G+C%) - 6751р, где (К+) - концентрация ионов калия, моль (G+C%) - количество G и С в продукте ПЦР, %

В RAPD методе температура отжига праймера обычно составляет 34 - 37°С. Продолжительность этой ступени цикла в 30 сек была оптимальна для праймеров с G+C содержанием 50-60%. Для праймеров с G+C равным 70-80% она не имела значения (Yu, Pauls, 1992).

Температура элонгации определяется характеристиками Taq-полимеразы и равна 72°С. В зависимости от состава реакционного буфера и природы ДНК-матрицы скорость синтеза составляет 35-100 нуклеотидов/сек (Innis et al., 1988; Saiki, Gelfand, 1989). Таким образом, за одну минуту можно получить продукт до двух тысяч пар нуклеотидов. Более длительное время элонгации может быть полезно при очень низких концентрациях матрицы на первых этапах амплификации. Следует также учитывать тот факт, что Taq-полимераза сохраняет свою активность в широком диапазоне температур - от 20 до 85°С.

Количество циклов амплификации зависит от начальной концентрации ДНК-мишени. Когда количество циклов превышает сорок, в реакционной среде могут накапливаться неспецифические продукты. Это происходит из-за постепенного снижения активности фермента, накопления продуктов реакции, а также за счет снижения содержания отдельных компонентов реакционной смеси. Наблюдается так

называемое «амплификационное плато». Установлено, что оптимальным является 35 циклов (Yu, Pauls, 1992).

1.3. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ RAPD ТЕХНОЛОГИИ.

1.3.1. КАРТИРОВАНИЕ ПРИЗНАКОВ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ.

Как было показано, RAPD маркеры наследуются как простые доминантные признаки в соответствии с законами Менделя (Williams et al., 1990). Следовательно, они могут быть использованы как генетические маркеры отдельных признаков или локусов при составлении карт. Однако доминантная природа RAPD маркеров не позволяет различать гетерозиготу от гомозиготы по маркируемому признаку. Поэтому необходимо создание высокогомозиготных линий (почти изогенных линий, рекомбинантных инбредных линий), сегрегирующих по конкретному признаку. С помощью такого подхода были установлены RAPD маркеры, тесно сцепленные с генами устойчивости к нематоде у томата (Klein-Lankhorst et al., 1991), а также с генами устойчивости к Pseudomonas (Martin et al.,1991). Разработка метода BSA (bulked segregant analysis) (Michelmore et al., 1991) значительно упростила процедуру создания псевдогомозиготных линий для молекулярного анализа, контрастирующих по одному маркируемому признаку. По другим признакам смеси (bulks) могут различаться. Такие смеси сегрегантов могут быть созданы для маркирования любого признака или участка хромосомы и создание их значительно проще, чем рекомбинантных инбредных линий или почти изогенных. С помощью BSA метода были идентифицированы RAPD маркеры сцепленные с генами устойчивости к ложной мучнистой росе у салата латук (Paran, Michelmore, 1993). Путем обращения доминантных RAPD маркеров в кодоминантные SCAR удалось повысить их надежность и информативность. SCAR маркерами идентифицировали ген устойчивости фасоли к вирусной мозаике (Melotto et al., 1996), устойчивость к пирикуляриозу у риса (Naqvi, Chattoo, 1996), устойчивость к нематоде у арахиса (Garcia et al., 1996), устойчивость к «Южной нематоде» (Meloidogyne javanica) у моркови (Simon et al., 1997).

RAPD маркеры существенно дополнили генетические карты ряда важных сельскохозяйственных культур, таких как: томат (Tanksley et al., 1992), огурец

(Kennard et al., 1994), перец сладкий (Lefebvre et al., 1995), сельдерей (Yang,Quiros, 1995), морковь (Westphal, Wricke, 1997), аспарагус (Yiang et al., 1997).

Создание подробных генетических карт направлено на идентификацию и картирование локусов количественных признаков (quantitative trait loci - QTLs), обусловливающих наследование большинства хозяйственно ценных признаков у растений (особенности строения, скорость развития, урожайность и качество продукции, устойчивость к биотическим и абиотическим факторам стресса). Картирование двух десятков количественных признаков у нескольких популяций томатов с использованием 120 маркеров (RFLP-зонды, дополненные небольшим числом RAPD- и морфологических маркеров), равномерно и плотно покрывающих всю карту генома, выявило многочисленные ассоциации локусов, контролирующих развитие растений и качество плодов (цит. по Хавкин, 1997). У томатов качество плодов определяется их окраской, кислотностью и формой; кроме того, некоторые признаки строения кисти и плода, а также и химического состава плодов существенно важны для машинной уборки и переработки томатов. Большинство этих признаков контролируется кластерами QTLs, расположенными на 2-ой и 8-ой хромосомах, а также на длинном плече 7-ой хромосомы. Отмечалось, что локусы, определяющие форму, окраску плодов и содержание в них сухих веществ, сцеплены с менделевским геном, контролирующим детерминированное развитие, и QTL для раннеспелости и числа цветков в кисти (Tanksley et al., 1996; Grandillo, Tanksley, 1996). Изучение количественных признаков, их природы и изменчивости по ДНК-маркерам дает новую информацию о функционировании геномов культурных растений, которая необходима для проведения правильной и эффективной селекционной работы. Селекция на основе QTL-сцепленных маркеров или MAS (marker assistant selection) позволит в будущем подойти к созданию новых уникальных форм, с целым набором хозяйственно важных признаков.

1.3.2 RAPD МАРКЕРЫ В ОЦЕНКЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ ЗАРОДЫШЕВОЙ ПЛАЗМЫ.

Одним из наиболее успешных и распространенных применений RAPD метода являются анализ внутривидовой изменчивости и оценка биоразнообразия культурных растений и их диких сородичей. Маркирование значительного числа анонимных

локусов с помощью этого метода позволяет наиболее полно охватывать весь геном и оценивать генетические дистанции между отдельными популяциями одного вида. В сравнении с другими методами детекции внутривидового полиморфизма по ДНК (RFLP с мини- и микросателлитными пробами, inter-SSR-PCR), RAPD менее трудоемкий и более экономичный метод анализа внутривидового полиморфизма. Он не требует таких больших количеств растительного материала как другие методы исследования и поэтому пригоден для анализа редких генотипов. Вследствие таких особенностей, RAPD метод эффективно использовался в анализе внутривидовой изменчивости и оценке генетических дистанций между образцами перца сладкого (Prince et al., 1995), ямса (Ramser et al., 1996), огурца и дыни (Staub et al., 1997), лука репчатого (Le Thierry D'Ennequin et al., 1997), в классификации и систематизации генетических коллекций чеснока (Maaß, Klaas, 1995), капусты качанной (Phippen et al., 1997). Данные RAPD анализа явились дополнительной информацией об отдельных коллекционных образцах, часто очень сходных между собой по морфологическим признакам, что позволило более рационально использовать финансовые средства на изучение и поддержание генетических коллекций.

1.3.3. RAPD МАРКЕРЫ В СОРТОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И СЕМЕННОМ КОНТРОЛЕ.

Методы сортовой идентификации, согласно AOSA (Association of Official Seed Analysts), должны отвечать следующим требованиям:

- простота в исполнении

- минимальное количество времени на проведение анализа

- низкая стоимость

- воспроизводимость

Стандартизация экспресс-методов выделения ДНК и условий проведения RAPD анализа обеспечивают выполнение всех этих требований для сортовой паспортизации и в семенном контроле самых различных культур. RAPD технология, как средство сортового «фингерпринтинга», открывает широкие возможности для интенсивного изучения и управления генетическими ресурсами культурных растений. Она впервые позволила подойти к паспортизации и оценке сортового разнообразия многолетних культурных растений, таких как: яблоня (Koller et al., 1993), малина (Parent et al.,

1993), земляника садовая (Gidoni et al., 1994), черная смородина (Lanham et al., 1995), сирень (Chen et al., 1995), маслины (Fabbri et al., 1995), инжир (Khadari et al., 1995).

У различных овощных культур за всю длительную историю селекции создано великое множество сортов и селекционных форм. Сегодня в селекционной практике наряду с традиционными методами создания исходного и сортового материала все чаще используются методы биотехнологии (соматический эмбриогенез и техники эмбриоспасения при отдаленной гибридизации, гино- и андрогенез, мутагенез и трансгенез). Геномная идентификация и систематизация такого разнообразия форм недостаточна только средствами описания морфологических и физиологических характеристик. Привлечение биохимических и молекулярных методов анализа: изоферментного методом электрофореза и методов анализа по ДНК, - существенно обогащает сведения об особенностях той или иной формы и генофонда культуры в целом. RAPD маркеры в отличии от изоферментов не зависят от условий среды и фазы развития растений, а использование нескольких олигонуклеотидных праймеров позволяет включать в анализ информацию о самых различных областях генома. Следовательно, RAPD спектры продуктов амплификации наиболее полно отражают генотип растения и сочетание в нем ценных наследственных факторов, характерных для отдельного сорта или гибрида, которые не всегда могут иметь четкие отличия. Особенно актуально использование RAPD технологии для тех культур, у которых нет надежных белковых или изоферментных маркеров. Сортовая идентификация с помощью RAPD метода с успехом проводилась на брокколи и цветной капусте (Ни, Quiros, 1991), сельдерее (Yang, Quiros, 1993), луке репчатом (Roxas, Peffley, 1993), рапсе (Hallden et al., 1994), свекле (Mandolino et al., 1996). На томатах RAPD маркеры выявляли более высокий уровень полиморфизма, чем RFLP анализ (Williams, St.Clair, 1993), но все же он был недостаточен для сортовой идентификации.

В настоящее время все большую долю в товарном производстве сельскохозяйственной продукции занимают гетерозисные гибриды F¡. Их использование обеспечивает увеличение урожайности на 30% и более, и часто в одном гибриде удается сочетать целый комплекс хозяйственно ценных признаков: высокое качество продукции, пригодность к механизированной обработке и скороспелость, устойчивость к биотическим и абиотическим факторам среды. Таким образом, гетерозисная селекция и использование ее достижений способствуют

интенсификации и механизации всего процесса производства. На сегодня в Госреестре селекционных достижений РФ у таких овощных культур как томат, огурец, морковь, капуста белокочанная значительную долю составляют гетерозисные гибриды (Пивоваров и др., 1997). Создание и производство гетерозисных гибридов сопряжено с получением высокогомозиготного селекционного материала, идентификацией и паспортизацией исходных линий с высокой комбинационной способностью и их гибридов Fi, а также с защитой авторских прав. Закон РФ «О селекционных достижениях», принятый в 1993 году гласит, что необходимыми условиями патентования и защиты авторских прав селекционеров должны быть отличимость (наличие минимальных дистанций между сортами и гибридами), новизна, стабильность проявления признаков или их изменчивость в установленных рамках. В этой связи, в литературе обсуждается вопрос об использовании ДНК «фингерпринтинга» молекулярно-биологическими методами (RFLP и RAPD) для идентификации инбредных линий, гибридов, сортов и защиты авторских прав селекционеров (Smith, 1992; Marsan et al., 1993; Pecchioni et al., 1993). Так RAPD метод с успехом использовался для оценки генетической чистоты и подлинности гибридных семян томата (Rom et al., 1995), огурца (Truksa, Prochazka, 1996). У гибридов капустных культур RAPD метод был использован для определения уровня инбредности партий семян из-за возможного загрязнения семенами от самоопыления материнской линии (Boury et al., 1992). Но пока не у всех культур идентификация линий, сортов и гибридов этим методом оказалась успешной. В большинстве случаев это наблюдалось у аллогамных культур, обладающих высоким уровнем генетической гетерогенности. Вследствие этого не удалось установить четких отличий между инбредными линиями лука репчатого (Bradeen, Havey, 1995), между сортами сахарной свеклы (Ford-Lloyd et al., 1993), между линиями и гибридами Fj у моркови (Grzebelus et al., 1997). При этом Ford-Lloyd с соавторами (1993) делают вывод, что использование RAPD метода для сортовой идентификации у видов-перекрестников ограничено, потому что не может отвечать двум из трех критериев Бейли (Bailey, 1983), т.е. наличию различимой межсортовой изменчивости и минимальной внутрисортовой изменчивости.

Анализ генетической чистоты коммерческих партий семян с помощью RAPD метода можно ускорить и упростить за счет совершенствования методов выделения

ДНК. Такие методы выделения ДНК непосредственно из семян были разработаны (Chungwongse et al., 1993; Wang et al., 1993; McDonald et al., 1994 и др.) . Однако, эксперименты по анализу семян сои показали, что результаты RAPD анализа могут зависеть от качества и физиологического состояния семян (Shatters et al., 1995). Следует также принять во внимание зараженность семян микроорганизмами и возможность амплификации не только растительной ДНК, но и ДНК грибной микрофлоры.

1.4. ТАКСОНОМИЯ РОДА ALLIUM И ИЗУЧЕНИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ МЕЖДУ ВИДАМИ НА ОСНОВЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ.

Род Allium L. включает в себя более 600 видов растений, широко распространенных главным образом в Северном полушарии. Среди представителей этого рода встречаются ценные овощные культуры, такие как: лук репчатый (А. сера L.), шалот (A. ascolonicum L.), лук-батун (A. fistulosum L.), шнитт-лук (А. schoenoprasum L.), чеснок (A. sativum L.), лук-порей (A. porrum L.). Благодаря особенностям химического состава, многие виды лука обладают лекарственными свойствами. Большое количество видов данного рода являются эндемиками, часть из которых находится на грани исчезновения.

Анализ филогенетических связей внутри рода Allium затруднен из-за многообразия форм и видов, а также вследствие того, что многие предковые формы вымерли в ледниковый период (Traub, 1968). На сегодня еще недостаточно полно изучен видовой состав центров происхождения лука: Среднеазиатский, Переднеазиатский, Китайский. Поэтому разделение рода на подроды, секции, подсекции на основе морфолого-географических признаков носит в некоторой степени условный характер. История систематики рода Allium представлена в работах Казаковой А.А. (Казакова, 1975,1978). Рассмотренные в этих работах системы рода, по мнению Фризен Н.В. (1988) можно разделить на три группы:

1. Система Дона-Коха (Don, 1832; Koch, 1837) и системы выстроенные на ее основе (Kunth,1843; Регель, 1876 и др.)

2. Видоизмененная система Дона (Введенский, 1935)

3. Полностью измененная система рода Дона (Stearn, 1944, 1980; Traub, 1968; Wendelbo, 1969;Ekberg, 1969; Казакова, 1978).

Большой вклад в описание рода Allium внес Регель Э.Л. (Регель, 1876; цит.по Казакова, 1978). Основываясь на обширном гербарном материале и личных сборах, он построил систему из 263 видов, распределив их по 6 секциям: Porrum, Schoenoprasum, Rhizirideum, Macrospatha, Mollium и Nectaroscordum. В последнюю секцию вошли два близких к луку рода: Nectaroscordum Lindl, и Nothoscordum Kunth. Впоследствии Регель дополнил свою систему рода еще 138 видами, в том числе 78 были описаны им самим. В 1935 году вышел в свет четвертый том «Флоры СССР» с классификацией видов лука Введенского А.И., в которой наиболее обширно представлены луки, произрастающие на территории Советского Союза (Введенский, 1935). Выстраивая виды в определенной системе с учетом их морфолого-географических признаков, многие исследователи отмечали искусственность этого подразделения. По мере расширения и углубления исследований рода Allium ботаники часто сталкиваются с трудностями в группировке видов из-за значительной изменчивости признаков и разного их сочетания у все возрастающего числа видов. В связи с этим, для уточнения межвидовых связей часто используют данные кариологических исследований видов, так как кариотип является одним из важных признаков вида. Изучение кариотипов лука показало, что виды отличаются по значительному числу признаков: по числу хромосом, по морфологии отдельных хромосом и по длине всего хромосомного набора (Levan, 1935; Бахтина, 1969; Чешмеджиев, 1972; Тарасова, 1972, 1973; Фризен, 1988; Погосян, 1983, 1991).

Дополнительным источником информации о близости или удаленности видов в таксономическом отношении могут служить результаты межвидовых скрещиваний (Ершов, Абрахина, 1970; Кокорева, 1982; Тарасова, Кокорева, 1982; Комиссаров, Кокорева, 1984; Тарасова, Кристен, 1984; Ершов, Юрьева, 1985; Тарасова, 1986), а также сведения о путях эволюции кариотипов (Чешмеджиев, 1972; Турков и др., 1979) и жизненных форм (Черемушкина,1992) внутри рода Allium. Систематически значимыми могут быть анатомические признаки (Traub, 1968;Фурст, 1973), особенности микрорельефа поверхности семян (Комиссаров и др., 1986).

В природных условиях процессы видообразования могут протекать различными способами: путем географического видообразования и путем гибридогенеза и

полиплоидизации. Последний играет особенно большую роль в эволюции видов рода Allium. В результате в пределах одного вида образуются полиплоидные ряды и комплексы: 2п = 16, 32, 40, 48 (если основное хромосомное число равно 8). Следствием спонтанной гибридизации являются встречающиеся в природе формы с несбалансированным числом хромосом, существование которых поддерживается благодаря вегетативному способу размножения. Вопрос о таксономическом ранге членов одного полиплоидного ряда у семенных растений является до сих пор спорным. Существует мнение, что члены полиплоидного ряда являются подвидами одного политипического вида (Цвелев, 1967) или даже могут иметь ранг вида (Грант, 1984). Фризен Н.В. (1988) считает, что нецелесообразно придавать ранг вида отдельной хромосомной расе, когда формы отличаются только по числу хромосом и констатирует только агрегатный характер данного вида. Таковыми по его мнению являются например виды A. splendens Willd.ex Schult.et Schult.fíl.(лук блестящий) и А. strictum Schräder (лук торчащий). В противоположность им, морфологическая тетраплоидная раса A. schoenoprasum, обитающая в литоральной зоне Телецкого озера заслуживает, по мнению автора, ранга вида и описана под названием А. altyncolicum Friesen (Фризен, 1988).

Внутривидовое разнообразие культурных видов описано и изучено более детально, хотя и здесь нет единства во мнениях. За многовековую историю селекции накоплен обширный материал по таким культурам как: лук репчатый, лук порей, чеснок, лук батун, созданы сорта шнитт-лука, шалота, многоярусного лука. Для более эффективного и рационального использования сортового разнообразия культурных форм необходима его систематизация.

История внутривидовой классификации лука репчатого подробно описана Казаковой A.A. (Казакова, 1978). Неудачи в классификации внутривидового разнообразия этой культуры связаны с тем, что часто за основу классификации брались только отдельные признаки: вкус, форма луковицы, окраска сухих чешуй, без учета мирового разнообразия и изменчивости признаков при выращивании в разных условиях. В «Культурной Флоре СССР» (1978) автором представлена классификация вида А. сера, в основу которой легли эколого-географический принцип и комплекс хозяйственно-биологических признаков сортов, возделываемых в определенном географическом районе. Сортовое разнообразие лука репчатого подразделяется на 3

подвида, 8 разновидностей и 19 сортотипов. Последние объединяют близкие сорта, созданные для различных природно-климатических зон. Эти сорта обладают определенными морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками, которые сформировались и закрепились у них под влиянием естественного отбора, путем гибридизации и различных типов искусственного отбора, используемых в селекционной практике.

Лук-шалот (A. ascolonicum L.) из-за внешнего сходства с шнитт-луком часто относили в секцию Schoenoprasum Koch. Однако, шалот легко скрещивается с луком репчатым (Алексеева, 1960) и дает плодовитое потомство. У гибридов Fl (шалот х репчатый) в ряде случаев наблюдался гетерозисный эффект (Ершов и др., 1979). Результаты кариологических исследований (Комиссаров, Тарасова, 1985; Тарасова, 1986) показали тождественность кариотипов этих двух видов. В связи с перечисленными выше фактами, авторы склонны относить шалот в ранг разновидности лука репчатого.

Вид A. flstulosum L.- лук-батун разделен на 2 подвида, 7 разновидностей и 9 сортотипов по характеру ветвления, мощности листьев, физиологическим особенностям, а также биохимическому составу, с учетом их распространения (Казакова, 1978). Однако другие авторы (Юрьева, Кокорева, 1992) придерживаются другой, более ранней классификации вида (Трофимец, 1941; цит.по: Казакова, 1978). В соответствии с последней , культурные формы внутри вида разделены на 3 подвида: китайский, японский и русский, а многоярусный лук выделен как самостоятельный вид - Allium viviparum (Makino) ТгоЦсин.: A. proliferum Schrad). Сравнительное изучение кариотипов лука репчатого, батуна и многоярусного (Vosa, 1976; Тарасова, 1984, 1986) и результатов скрещивания А. сера х A. flstulosum (Ершов, Абрахина, 1970; Ершов, Юрьева, 1985) показали гибридогенный характер многоярусного лука, включающего в себя один геном от А. сера и один геном от А. flstulosum (A. altaicum). Сделано предположение, что видообразование многоярусного лука связано как с гибридизацией А. сера х A. flstulosum, так и со спонтанной амфиплоидией, неоднократной элиминацией хромосом, вивипарией и отбором, способствующим закреплению вивипарии как доминирующего фактора по сравнению с генеративным воспроизведением (Тарасова, 1986).

Внутривидовая классификация таких видов как лук порей (более 500 форм), чеснок также сложна и неоднозначна, и у разных авторов разделение форм на подвиды, разновидности и группы сортов не отличается единством мнений (Казакова, 1978; Юрьева, Кокорева, 1992). В связи со сложностью и неоднозначностью систематики представителей рода Allium для более детальной их классификации необходимо использовать комплексную оценку по морфологическим, цитологическим, физиологическим и биохимическим признакам (Badr, Elkington, 1978). Классификация должна строиться с учетом мирового разнообразия форм и изменчивости систематически важных признаков в различных почвенно-климатических и географических зонах произрастания. Активную помощь в систематике рода Allium и анализе филогенетических связей между отдельными его представителями могут оказать современные молекулярно-биологические методы исследования.

1.5. МЕЖВИДОВАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В СЕЛЕКЦИИ ЛУКА.

Межвидовая гибридизация используется не только для анализа филогенетических связей, но и как способ улучшения сортов культурного вида путем передачи им отдельных хозяйственно-ценных признаков дикорастущих видов. Дикорастущие виды лука (лук Вавилова, лук Ошанина, батун, лук алтайский, слизун, лук душистый, шнитт-лук) обладают устойчивостью ко многим болезням и вредителям лука репчатого, высоким содержанием аскорбиновой кислоты, а также зимо- и морозостойкостью (лук батун, алтайский лук, шнитт-лук), хорошей лежкостью и повышенным содержанием сухих веществ (лук Ошанина).

Первые работы по межвидовой гибридизации лука в нашей стране были начаты в 1934 году кандидатом биологических наук A.A. Кривенко на Грибовской селекционной станции НИИ овощного хозяйства. Автором была разработана не только методика межвидовых скрещиваний, но и впервые проведен цито-эмбриологический анализ родительских форм и гибридов, полученных при скрещивании лука репчатого с такими видами, как: лук батун, алтайский, молочноцветный, шнитт, слизун и поррей (Кривенко, 1936; 1941). На гибридных растениях, даже с участием систематически удаленных видов (шнитт, слизун, поррей), A.A. Кривенко удалось получить семена. Однако, жизнеспособность

41 -"4-j,,-"- *

проростков этих гибридных семян была крайне низкой, что сводило на-нет результаты скрещиваний. Позднее, ряд методических приемов по отдаленной гибридизации луковых культур, разработанных A.A. Кривенко, легли в основу и получили дальнейшее развитие в многочисленных исследованиях селекционеров и генетиков (Ершов, Абрахина, 1970; Кузнецов, Туголуков, 1981; Юрьева, Кокорева, 1981, 1992; Кокорева, 1982; Тарасова, Кокорева, 1982; Комиссаров, Кокорева, 1984; Тарасова, Кристен, 1984; Юрьева, Титова, 1984; Титова и др., 1987 и другие). Как правило, у межвидовых гибридов лука наблюдается промежуточное проявление морфологических признаков или доминируют признаки дикого вида. Для гибридных геномов характерны нечетность хромосом кариотипических групп и наличие хромосомных аббераций (Кокорева, 1982). Например, при проведении межвидовых скрещиваний у пасленовых, часто приходится сталкиваться с такими проблемами, как: существование барьеров про- и постгамной несовместимости, ингибирование процессов рекомбинации у отдаленных гибридов, элиминация рекомбинантных гамет и зигот, стерильность гибридов Fi (Жученко, 1980). Причины, лежащие в основе несовместимости связаны с геномными различиями по числу хромосом, их структуре и морфологическим особенностям, а также по характеру распределения гетерохроматина.

Скрещивания лука репчатого с плосколистными луками {Allium nutans, Allium odorum) и с дудчатолистным луком Allium schoenoprasum проводили с целью интрогрессии генов устойчивости к ложной мучнистой росе (пероноспорозу) от диких видов. Несовместимость видов лука в различных гибридных комбинациях выражалась по-разному. При гибридизации лука репчатого с душистым луком (А. сера х A. odorum) несовместимость проявлялась уже в прогамный период, гибридные семена не завязывались (Титова, 1986). В гибридных комбинациях А. сера х А. schoenoprasum и А. сера х A. nutans наблюдались аномальные процессы в ходе эмбрио- и эндоспермогенеза в постгамный период. Семена имели недифференцированные или слабо дифференцированные зародыши, эндосперм либо отсутствовал, либо был сильно редуцирован (Титова, 1986). Обычно при постгамной несовместимости происходит дегенерация зародыша и его отмирание. Для преодоления постгамной несовместимости были разработаны методы культивирования изолированных зародышей in vitro и культуры эмбриогенного

каллуса, с последующей регенерацией растений (Титова и др., 1987; Титова, 1989). При использовании культуры недоразвитых гибридных зародышей получены гибриды F, А. сера х A. schoenoprasum и А. сера х A. nutans. Растения гибридных популяций характеризуются многолетним циклом развития и зимостойкостью, высокой степенью ветвления и хорошо выраженным корневищем. Настоящей луковицы они не образовывали. Гибриды лук репчатый х шнитт-лук легко размножаются вегетативно, обладают нежными, долго негрубеющими листьями и превосходят шнитт-лук по урожайности. По степени поражения пероноспорозом растения гибридных популяций Fj различались как внутри, так и между комбинациями скрещивания. Наибольшую устойчивость показывали растения комбинации лук репчатый х слизун. Доля невосприимчивых растений колебалась по годам от 80 до 89%. В популяции гибрида Fj лук репчатый х шнитт-лук доля невосприимчивых растений при оценке листьев и стрелок составляла 74% и 51% соответственно (Титова и др., 1995). Однако дальнейшее использование в селекционной практике полученных гибридов лука было затруднено вследствие их полной стерильности. Как показали результаты цитоэмбриологических исследований, проводимых на других комбинациях скрещивания, в основе этого явления лежат аномалии процесса мейоза и нарушения в развитии пыльцы и зародышевых мешков (Шевченко, Тимин., 1994; Шевченко, Полумордвинова, 1995). Другой причиной стерильности межвидовых гибридов может быть несовместимость ядра и цитоплазмы у родительских форм, что наблюдалось при интрогрессии генов Allium fistulosum в геном Allium сера. По мнению авторов (Ulloa et al., 1993) ядерно-цитоплазматическая несовместимость вызвана явлением, описанным как «геномный шок» или стресс (McClintock, 1984; Graves, 1988). Преодоление стерильности межвидовых гибридов возможно через полиплоидизацию (Марьяхина и др., 1983; Титова, 1989). У амфидиплоидов наблюдается нормализация процесса мейоза и частичное или полное восстановление фертильности (Марьяхина и др., 1986). Проблема получения стабильных форм в гибридных популяциях, расщепляющихся по ряду селекционно-ценных признаков, может быть решена методом индуцированного апомиксиса или через культуру неоплодотворенных семяпочек (Тимин, Титова, 1995). Рекомбинантные формы межвидовых гибридов лука представляют значительный интерес как источники хозяйственно-ценных признаков в селекционной практике.

2. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛУКА В АНАЛИЗЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ И ПРИКЛАДНЫХ АСПЕКТАХ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА.

Таксономическим группам свойственны определенные молекулярно-биохимические признаки, передающиеся по наследству, которые могут быть не менее важными, чем морфологические или цитологические. Благодаря высокой специфичности молекул белка и нуклеиновых кислот, они могут существенно дополнить и обогатить таксономические исследования, позволяют оценить размах внутривидовой изменчивости и результаты межвидовой гибридизации. Изоферменты и ДНК-маркеры могут служить ценным источником информации для селекции на основе маркерных признаков.

Запасные белки семян лука использовались в таксономических исследованиях (Гаврилова, 1969; Maaß, 1992). По результатам изоферментного анализа проведена оценка филогенетических связей между отдельными представителями рода Allium (Hadacova et al., 1983). Изоферментные спектры Allium sativum не имели значимых отличий от спектров предполагаемого предкового вида Allium longicuspis, что ставит под сомнение таксономическое разделение этих двух видов (Simon, 1993). Изоферменты были также использованы при изучении триплоидных вивипарных луков в связи с их происхождением (Maaß, 1997). Данные изоферментного анализа позволили автору установить, что одним из возможных предков триплоидных луков является либо лук репчатый, либо лук Ошанина, либо лук Вавилова. Лук батун, ранее считавшийся возможным предком вивипарного лука H.I. Maaß исключает из возможных предковых форм.

В филогенетических исследованиях высших растений с успехом используется метод электрофоретического анализа рестрикционных фрагментов хлоропластной ДНК (Palmer, 1986; Palmer et al., 1988). Линейное расположение генов хлоропластной ДНК (хлДНК) является высококонсервативным (Palmer, Stein, 1986) и анализ изменчивости сайтов рестрикции хлДНК может быть успешен для установления филогенетических связей между отдельными видами (Havey, 1991). По результатам RFLP анализа хлДНК предложена классификация 49 видов рода Allium, включающая пять подродов (Amerallium, Allium, Melanocrommium, Rhizirideum и Bromatorrhizä), 29 секций с подразделением их на подсекции, а также построена дендрограмма,

отражающая генетические связи между отдельными таксонами (Linne von Berg et al., 1996).

RFLP анализ ядерной ДНК проведен на видах секции Сера в связи с их таксономией (Bradeen, Havey, 1995). Однако, как показали исследования, представители рода Allium характеризуются значительными размерами генома. У лука репчатого размер генома составляет 31,7 пг ДНК на диплоидную клетку (Bennett, Smith, 1976). В пределах рода это значение варьирует в широких пределах от 17,96 (у видов секции Shoenoprasum) до 46,48 у видов секции Molium (Fritsh, 1996). Такие размеры генома, по всей вероятности, связаны с высоким содержанием повторяющихся последовательностей ДНК, поэтому RFLP анализ ядерной ДНК в филогенетических исследованиях с зондами кДНК (Bark, Havey, 1995), мини- и микросателлитами (Sharon et al., 1995) был затруднен.

Попытка использования RAPD метода для анализа меж- и внутривидовых связей на некоторых видах рода Allium (Wilkie et al., 1993) показала пригодность данного метода в сочетании с гибридизацией для детального изучения филогенетических связей между видами лука и для анализа родословных культурных сортов лука репчатого.

Изучение внутривидового разнообразия лука с помощью молекулярно-биохимических методов направлено на систематизацию коллекционного материала, его сохранение и использование. Внутривидовая классификация чеснока в настоящее время остается все еще проблематичной. Существовавшие ранее классификации этого вида по морфологическим и физиологическим признакам с учетом географического распространения были несовершенны (Казакова, 1978). Данные по изоферментному анализу различных ферментных систем коллекции чеснока и его предкового вида Allium longicuspis свидетельствуют о значительном уровне генетической изменчивости между отдельными образцами различного географического происхождения (Pooler, Simon, 1993; Simon, 1993; Maaß, Klaas, 1995). Результаты, полученные при анализе 300 образцов по изоферментам, продуктам амплификации ДНК (RAPD метод), в сочетании с данными по морфологии и физиологии позволили оценить степень сходства и генетические расстояния между образцами (Maaß, Klaas, 1995). Авторами предложена внутривидовая классификация форм чеснока с разделением на четыре основные группы: sativum, ophioscorodon,

longicuspis и subtropical. Последняя группа образцов из субтропических областей Южной и Юго-Восточной Азии наиболее отличается от всех остальных групп как по изоферментам, так и по RAPD маркерам. ДНК-анализ в сочетании с результатами более ранних исследований показал, что культурные формы чеснока произошли от форм гетерогенной группы longicuspis.

Лук репчатый (Allium сера) - одна из самых древних овощных культур. Современное разнообразие форм этой культуры явилось результатом длительной селекционной работы. Для создания новых высокопродуктивных сортов необходимо всестороннее изучение биоразнообразия лука репчатого. Учитывая хозяйственную ценность этой культуры, Международный Совет по Генетическим Ресурсам растений (IBPGR) в 1981 году поместил лук репчатый во вторую группу приоритетных исследований (Stein, Nothnagel, 1995). Изучение генетического разнообразия лука репчатого методами молекулярно-биохимических исследований проводили с помощью изоферментного анализа (Peffley, Orozco-Castillo, 1987; Rouamba et al., 1993). Однако, установление различий между сорто-популяциями лука репчатого затруднено вследствие значительной генетической гетерогенности (Weeden,1989). Поэтому в последнее время все чаще в изучении внутривидового полиморфизма используются методы исследования ДНК. RFLP анализ ядерной ДНК с клонами кДНК был предпринят в 1995 году (Bark, Havey, 1995). Оценку биоразнообразия проводили на популяциях лука контрастных по чувствительности к длине светового дня (короткодневные, длиннодневные). Рестрикционный анализ ядерной ДНК лука обнаружил неожиданно низкое количество полиморфных фрагментов ДНК среди популяций. Оценка генетических дистанций и взаимосвязей между популяциями лука репчатого и лука шалота с помощью RFLP ДНК позволила авторам сделать вывод об общности их происхождения. Предковые формы лука, вероятно, были короткодневными, а популяции длиннодневных луков с повышенной лежкостью появились в результате отбора для производства в северных высоких широтах. Шалот на полученной дендрограмме находится рядом с гетерогенной группой короткодневных луков, тем самым указывая на тесную связь с ними. Больший уровень полиморфизма на уровне ДНК среди короткодневных луков, по сравнению с длиннодневными важен для сохранения генетического разнообразия лука репчатого. Исследование биоразнообразия лука репчатого и форм шалота было предпринято с

помощью RAPD технологии (Le Thierry D'Ennequin et al., 1997). Установлена географическая структура генетического разнообразия вида Allium сера и затронуты эволюционные аспекты возникновения форм лука с вегетативным и половым способом размножения.

Дальнейшее улучшение лука, повышение эффективности селекционного производства и осуществление генетического контроля на каждом его этапе возможно с использованием селекции на основе маркерных признаков. Для генетического маркирования наиболее пригодны молекулярные маркеры (изоферменты и ДНК-маркеры, детектируемые RFLP и RAPD методами). Однако использование молекулярных маркеров в селекции лука пока очень ограничено из-за недостаточного числа таких маркеров, связанных с наследованием хозяйственно ценных признаков и определенных трудностей, связанных с выделением ДНК из растительных тканей.

Изоферменты нашли применение в анализе дополненных линий лука и контроле за уровнем интрогрессии в гибридных комбинациях батун - лук репчатый, полученных с целью передачи луку репчатому холодоустойчивости и устойчивости к корневой розовой гнили от лука батуна (Peffley et al., 1985; Cryder et al., 1991; Peffley, 1993; Ulloa, 1993). Молекулярные маркеры на основе изоферментов и их хромосомная локализация были установлены в 1988 году (Peffley, Currah, 1988). С помощью изоферментов установлена хромосомная локализация генов, кодирующих некоторые ферментные локусы лука шалот (Shigyo et al., 1994; 1995а; 19956). У чеснока {Allium sativum) обнаружена тесная корреляция между особенностями изоферментного состава и морфологическими признаками строения цветка (Simon, 1993). Попытки маркирования холодоустойчивости у лука батуна с помощью изоферментов оказались безуспешны (Peffley, 1993). Для расширения рамок генетического маркирования необходимо привлечение молекулярных методов исследования ДНК.

Изучение молекулярно-генетических основ цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) у лука репчатого и характера ее наследования было осуществлено с помощью RFLP анализа ДНК митохондрий и хлоропластов (Courcel et al.,1989; Holford et al., 1991; Havey, 1993). RFLP анализ выявил ДНК-маркеры, связанные с признаком ЦМС. Это позволяет значительно сократить объем работ и

тестировать ЦМС на ранних фазах развития растения. Позже, для упрощения процедуры детекции признака ЦМС, использован метод полимеразной цепной реакции (Havey, 1993; 1995). Для поддержания линий с ЦМС необходим поиск и выделение из популяций линий закрепителей стерильности. Идентификация типа цитоплазмы с помощью молекулярных маркеров позволяет значительно сократить количество скрещиваний для поиска экземпляров с генотипом закрепителя стерильности (Nmsms) в популяциях лука репчатого (Havey, 1995).

Неограниченные возможности для молекулярного маркирования и решения практических задач селекции лука открылись с разработкой RAPD технологии. Этот метод был использован для оценки устойчивости (De Vries et al., 1992), сортовой идентификации короткодневных сортов лука репчатого (Roxas, Peffley, 1993), для оценки степени гомозиготности линий двойных гаплоидов (Campion et al., 1995), для подтверждения гибридности форм от межвидовых скрещиваний (Dubouzet et al., 1996). Bradeen J.M и Havey M.J.(1995) использовали RAPD технологию в оценке генетической чистоты инбредных линий лука репчатого, однако, им не удалось установить четких отличий между инбредными линиями. Несмотря на развитие молекулярных методов исследования и успехи в создании генетических карт культурных растений, до сих пор не разработана генетическая карта для Allium сера. Первые шаги в этом направлении сделаны в работе по маркированию всех 8 хромосом Allium сера с помощью RAPD метода (Shigyo et al., 1997).

3. АНДРОГЕНЕЗ И ГИНОГЕНЕЗ В СОЗДАНИИ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГЕТЕРОЗИСНОЙ СЕЛЕКЦИИ МОРКОВИ И МЕТОДЫ ЕГО ОЦЕНКИ НА ВЫРАВНЕННОСТЬ.

Одним из направлений в селекции овощных культур является создание гетерозисных гибридов F] на основе цитоплазматической мужской стерильности. Для получения гибридов Fj у такой важной овощной культуры как морковь разработаны методы создания исходного линейного материала путем длительного инбридинга и аутбридинга фертильных и стерильных растений (Тимин, 1982; 1984; 1986;

Методические указания......1987; Методические рекомендации.... 1991; Угарова, 1992

и др.), а также изучена генетика наследования целого ряда признаков (Тимин, 1997). Повышение гомозиготности инбредных линий осуществляется с помощью

индуцированного нерегулярного апомоксиса (Тимин и др., 1994). Такой способ создания линейного материала - трудоемкий и длительный путь.

В последние десятилетия большой интерес и широкое практическое применение в генетических исследованиях и селекции растений получили работы по экспериментальной гаплоидии (схема 2 см. приложение). С помощью биотехнологических методов первые гаплоидные растения были получены в 1964 году из культуры пыльников дурмана (Guha, Maheshvary, 1964). Как правило, гаплоиды обладают низкой жизненной силой и стерильны, поэтому, для дальнейшего их использования, число хромосом должно быть удвоено. При определенных условиях культивирования этого можно достичь уже на самых ранних фазах регенерации путем спонтанного удвоения.

Экспериментальные данные по андрогенезу показали низкий уровень гетерозиготности среди дигаплоидов. У капусты брокколи из 762 андрогенных растений только одно было гетерозиготно (Orton, Bowers, 1985), тогда как у рапса 7% растений были гетерозиготны (Cardy, 1986; цит.по Morrison, Evans, 1988), а дигаплоиды перца все были гомозиготны (Morrison et al., 1986). Эти факты говорят о том, что экспериментальное получение дигаплоидов можно рассматривать как альтернативный путь к достижению гомозиготности. Особенно важно это для перекрестноопыляемых культур, обладающих высоким уровнем генетического полиморфизма. Такой способ позволяет значительно ускорить селекционный процесс и повысить его эффективность. В этой связи в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК был разработан метод экспериментального получения дигаплоидов моркови в культуре in vitro из пыльников и неоплодотворенных семяпочек (Тюкавин и др., 1989; Таганов, 1991; Тюкавин, 1993; Tjukavin, 1994; Shmikova, Tjukavin, 1994).

Основные стадии развития изолированных микроспор в культуре in vitro и пути получения гаплоидных форм были рассмотрены в работе Сандерленда и Данвелла (Sunderland, Dunwell, 1977). Установлено, что образование гаплоидных растений возможно как через прямой эмбриогенез, так и через каллус. Однако, как показали многочисленные исследования, каллусообразование часто сопряжено с явлением сомаклональной изменчивости (Karp, Bright, 1985; Шамина, 1988; Данвелл, 1989; Сидоров, 1990; Атанасов,1993 и др.). Некоторые ученые (Evans et al., 1984), несмотря на сходство изменений, наблюдаемых у растений-регенерантов из культуры

соматической или генеративной ткани, различают понятия «сомаклональная изменчивость» и «гаметоклональная изменчивость». Предложенный ими термин «гаметоклональная изменчивость» связан с изменчивостью среди растений-регенерантов, когда в качестве экспланта выступают генеративные органы растений (пыльники, пыльца, неоплодотворенные семяпочки, зародыши). В отличие от сомаклональной изменчивости, изменчивость у гаплоидов или дигаплоидов способна различать доминантные и рецессивные мутации уже в поколении Ro, процессы рекомбинации являются результатом не митотического, а мейотического кроссинговера. Это различение, тем не менее, носит довольно условный характер, так как установить строгие границы между этими двумя явлениями сложно (Morrison, Evans, 1988).

Природе сомаклональной изменчивости и результатам ее исследования посвящены работы Karp A., Bright S. (1985), Morrison R.A., Evans D.A. (1988), Сидорова B.A. (1990), Скаукрофта У.П. (1990). Было установлено, что в основе этого явления лежат изменения по числу и структуре хромосом, активизация мобильных элементов, амплификация и редукция генов, изменения сайтов метилирования, а также делеции пластидной ДНК, ведущие к появлению альбиносов среди андрогенных растений. Степень изменчивости растений-регенерантов зависит от исходного генотипа, природы и стадии развития экспланта, уровня плоидности и степени гетерозиготности исходного материала, условий культивирования (состав питательных сред, световой и температурные режимы, длительность культивирования), а также от способа регенерации. Мутации, происходящие в культуре in vitro, затрагивают как качественные, так и количественные признаки. Они не всегда носят негативный характер. В ряде случаев наблюдается появление таких хозяйственно ценных признаков, как устойчивость к патогенам.

Несомненный интерес к получению дигаплоидов представляет метод индуцированого гиногенеза. Это связано с тем, что культивирование неоплодотворенных семяпочек мужски стерильных растений является единственным способом получения у них гаплоидных или дигаплоидных форм. Женский гаметофит может быть альтернативным источником гаплоидных растений в тех случаях, когда индукция эмбриогенеза из андрогенных тканей затруднена или когда необходимо снизить число растений-альбиносов среди гаплоидов (Павлова, 1987). Образование

эмбриоидов в культуре неоплодотворенных семяпочек протекает либо через стадию каллуса, либо через прямой эмбриогенез и по сравнению с культурой пыльников в меньшей степени зависит от стадии развития зародышевого мешка. Работы по экспериментальному гиногенезу проводились на мужски стерильных линиях сахарной свеклы (Hoseman, Bossoutrot, 1983), на луке репчатом (Muren, 1989; Campion, Alloni, 1990; Keller, 1990; Patritey, Ledovskiy, 1994; Шмыкова, 1995), а также луке порее (Smith et al., 1991), моркови, огурце (Shmikova, Tjukavin, 1994) и на ряде других культур.

При культивировании пыльников или неоплодотворенных семяпочек в условиях in vitro нельзя исключить вероятность развития эмбриоидов из соматических клеток тканей пыльника или тканей, окружающих зародышевый мешок. Кроме того, имеет место явление гаметоклональной изменчивости. Все это требует проведения анализа полученного материала на стабильность и однородность (выравненность). Анализ растений-регенерантов обычно проводят с помощью цитологических и молекулярно-биологических методов. Экспериментальные данные, полученные в результате цитологических исследований, показали, что среди регенерантов встречаются не только гаплоиды или дигаплоиды, но и формы с различными аномалиями как по числу хромосом, так и по их структуре (Karp, Bright, 1985). Так, среди андрогенных растений капусты белокочанной, полученных через индукцию прямого эмбриогенеза в культуре in vitro, количество гаплоидов составило 42,3%, диплодов - 47,4%, триплоидов - 5,2% и тетраплоидов - 5,2% (Семова, 1992). У дигаплоидных растений табака ряд авторов отмечали существенное увеличение содержания ДНК в клетках без увеличения числа хромосом (de Раере et al., 1982; Dhillon et al., 1983). Содержание гетерохроматина в клеточных ядрах увеличивалось в среднем на 12%.

Для оценки выравненное™ материала из культуры пыльников и неоплодотворенных семяпочек использовали также изоферментный анализ. С помощью этого метода был проведен анализ андрогенных растений капусты брокколи (Orton, Browers, 1985), капусты белокочанной (Семова, 1992), гиногенных растений лука репчатого (Bohanec et al., 1995). У андрогенных линий рапса была установлена изменчивость в электрофоретических спектрах кислой фосфатазы и лейцинаминопептидазы и выделены линии гомозиготные по анализируемым признакам (Curn, 1995). Однако, число изоферментных вариантов ограничено и

результаты анализа зависят от условий среды и фазы развития растений. Поэтому в последние годы для изучения генетической изменчивости растений-регенерантов используются методы анализа ДНК.

При обширном анализе дигаплоидных растений Nicotiana sylvestris, образовавшихся в результате последовательного андрогенеза удалось обнаружить наследственные количественные и качественные изменения ядерной ДНК. Увеличение доли сателлитной ДНК с 1,703 г/см свидетельствует об увеличении GC-богатых последовательностей или о возможном увеличении степени метилирования. Тепловая денатурация также показала увеличение АТ-богатых последовательностей. Отмечено, что у дигаплоидных растений имеет место увеличение инвертированных повторов в последовательностях ДНК длиной 200-400 пн. Из этого следует, что в процессе регенерации происходит амплификация или деамплификация определенных последовательностей ДНК (Скаукрофт, 1990).

RFLP анализ обнаружил делеции хпДНК у альбиносных андрогенных растений (Day, Ellis, 1984; Anil, Noel, 1985; Ананьев и др., 1986), генетическую изменчивость по сайтам метилирования ДНК (Хвырлева и др., 1986) и по распределению гипервариабельных последовательностей («минисателлитов») (Гилязетдинов и др., 1990).

Возможность использования RAPD технологии для анализа растительного материала на каждой стадии культуры ткани была показана Brown с соавторами (Brown et al., 1993). Позже эта технология использована в анализе расщепления популяций рапса, полученных из микроспор, по ДНК-маркерам (Tanhuanpaa et al., 1993/1994), для молекулярной оценки дигаплоидных линий кукурузы (Murigneux et al., 1993; Ting, 1994) и гиногенных линий лука репчатого (Bohanec et al., 1995; Campion et al., 1995).

Таким образом, обобщая материал литературного обзора можно сделать следующие выводы: использование молекулярных методов исследования призвано существенно повысить эффективность селекционного процесса, стать средством идентификации и паспортизации селекционного материала, сертификации семенного материала в семеноводстве. Анализ литературных данных показывает, что молекулярно-генетические исследования такой ценной овощной культуры как лук носят все еще фрагментарный характер. Наследование хозяйственно важных

признаков лука с помощью молекулярных методов изучено очень мало. Единичные сведения имеются в литературе по сортовой идентификации и паспортизации инбредных линий и гетерозисных гибридов Б!. В большинстве случаев они были мало успешны. Использование запасных белков и изоферментов в качестве маркерных признаков у лука ограничено в силу значительной гетерозиготности и зависимости результатов исследования от внешних факторов (изоферменты). ДНК-технологии могут существенно расширить возможности молекулярных исследований и быть эффективными для решения множества как фундаментальных проблем, так и практических задач селекции. В последние годы наибольшую популярность среди методов исследований получили ИАРЭ технология и методы, созданные на ее основе. КАРБ технология - это быстрый и простой в исполнении, высокочувствительный метод анализа генома растений, не требующий дорогостоящих материалов и оборудования. Она может быть с успехом использована для изучения как тонких перестроек генома, происходящих в культуре ткани, так и для характеристики селекционного материала, включая линии, сорта, межвидовые гибриды и виды в целом. Использование этого метода позволяет проводить анализ на ранних стадиях развития растений, сохраняя их для дальнейшей селекционной работы. Анализ геномной ДНК с помощью ИАРБ метода дает возможность значительно снизить затраты по сортовой идентификации сельскохозяйственных растений и проводить оценку выравненное™ или степени гетерозиготности исходного селекционного материала; отслеживать изменения генома и оценивать уровень интрогрессии при межвидовой гибридизации.

Настоящая диссертация посвящена разработке методов молекулярной оценки селекционного материала и семян овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе ИАРБ технологии.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. РАСТИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ.

В работе был использован следующий растительный материал: Луки:

Лук репчатый (Allium сера), сорта: Веселка, Даниловский, Луганский, Мячковский, Одинцовец и Ялтинский, а также семенной материал из 3 коммерческих партий сорта «Одинцовец» и 1 партии сорта «Луганский».

Лук шалот (A. ascolonicum), сорт «Кущевка харьковская».

Лук батун (А. ßstulosum).

Лук многоярусный (A. proliferum)

Лук душистый (A. odorum).

Шнитт-лук (A. shoenoprasum).

Чеснок посевной (А. sativum), сорта: Дубковский и Юбилейный грибовский.

Межвидовые гибриды лука репчатого и шнитт-лука (А. сера х A. schoenoprasum), лука репчатого и слизуна (А. сера х A. nutans), растения-регенеранты, полученные in vitro на среде с колхицином из ткани соцветия растения Fi (А. сера х A. nutans), растение BQ от скрещивания А. сера х (Fi А. сера х A. nutans), полученное в культуре зародыша in vitro, растение ВС2 от скрещивания А. сера х ВСЬ полученное в культуре зародыша in vitro. Материал получен из лаборатории генетики и цитологии ВНИИССОК.

Капуста белокочанная {Brassica oleracea, var. capitata), сорта: Трансфер, Подарок 2500, Надежда и Зимовка 1474, а также 7 образцов из коммерческих партий семян. Семена элитных сортов предоставлены лабораторией капустных культур ВНИИССОК.

Морковь (Daucus carota), сорта: Московская зимняя А-515, Нантская-4; инбредные линии №144, №145, №166, №213, №214 (лаборатории генетики ВНИИССОК); андрогенные линии, полученные в культуре пыльников: №52, №80 (прямой эмбриогенез), №26 (каллус), №81 (суспензионная культура) и гиногенная линия, полученная из линии №166 (ЦМС петалоид) прямым эмбриогенезом через культуру неоплодотворенных семяпочек. Андрогенные и гиногенная линии моркови получены в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК.

Растения были выращены в полевых условиях, в теплице и в лабораторных условиях.

2.2. ЗОБ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

Экстракция суммарного белка.

Отдельные семена растирали в 50 мкл экстракционного буфера (0,0625 М трис-НС1, рН 6,8; 0,1% БОБ) Экстракцию суммарного белка проводили в течении ночи при температуре 4°С. Далее в каждую пробирку добавляли равный объем буфера для образца (0,0625 М трис-НС1, рН 6,8; 4% БББ; 10% сахароза; 2,5% ДТТ (дитиотрейтол) или 10% Р - мер капто этанол; 0,05% бромфеноловый синий). Пробы оставляли на 20 мин, периодически перемешивая содержание пробирок встряхиванием, а затем центрифугировали при 10000 % 10 мин. Супернатант инкубировали на кипящей водяной бане в течение 2 мин и белковые препараты объемом 10 мкл использовали для электрофореза.

Электрофорез в полиакршамидном геле.

Электрофорез белков проводили в двух-слойном геле (5% концентрирующем и 10% разделяющем) с использованием трис-глицинового электродного буфера (0,025 М Трис, 0,192 М глицин, 0,1% БОБ) по методу Леммли (1970) с модификациями.

Приготовление растворов для 5% концентрирующего и 10% разделяющего гелей осуществляли с использованием матричных растворов: 30% раствора акриламида (при соотношении акриламид/метиленбисакриламид 30:0,8); 0,5 М буфера трис-НС1 рН-6,8; 1,5 М буфера трис-НС1 рН-8,8; 10% раствора БЭЗ и 1% раствора персульфат аммония. Ниже приведена схема приготовления гелей (табл. 2).

В кассеты для заливки гелей вносили раствор разделяющего геля. Для формирования ровной границы поверх этого раствора наслаивали небольшое количество дистиллированной воды. Время полимеризации составляет 20 мин при комнатной температуре. После образования четкой границы между гелем и слоем воды, воду удаляли фильтровальной бумагой, а на разделяющий гель наслаивали раствор концентрирующего геля и вставляли гребенку. По окончании полимеризации удаляли гребенку и промывали лунки электродным буфером. Затем с помощью микрошприца в каждую лунку вносили белковые препараты.

Таблица 2. Изготовление полиакриламидных гелей из матричных растворов.

Матричные растворы Концентрирующий гель Разделяющий гель

30% акриламид 2,5 мл 10 мл

0,5 М трис-НС1 1,87 мл

рН-6.8

1,5 М трис-НС1 7,50 мл

рН-8,8

10% SDS 0,15 мл 0,3 мл

1% персульфат аммония 0,4 мл 1,1 мл

ТЕМЕД 4 мкл 80 мкл

н2о до 15 мл до 30 мл

Электрофорез запасных белков семян выполняли в камере для вертикального электрофореза 2001-001 фирмы LKB (Швеция). В камеру помещали две пластины с полиакриламидными гелями и заливали электродный буфер (0,025 М трис; 0,192 М глицин; 0,1% SDS; рН - 8,3). Электрофорез проводили в следующем режиме: 20 мин при силе тока 20 тА, затем силу тока увеличивали до 40 тА. Когда лидирующий краситель доходил до границы разделяющего геля силу тока повышали до 60 тА и устанавливали ограничение по напряжению электрического тока - 340 В на обе пластины. Продолжительность электрофореза составляла 2 ч 30 мин - 3 ч (до выхода бромфенолового синего из геля).

Фиксация и окраска гелей

Полиакриламидные гели осторожно снимали со стекол и фиксировали в растворе 12,5% трихлоруксусной кислоты в течение 20 мин. Окрашивание гелей производили в растворе Кумасси (Brilliant Blue R-250; Serva) (0,25% Кумасси; 45% этанол; 10% уксусная кислота) в течение 1 часа. Избыток красителя удаляли 7% раствором уксусной кислоты. Гели сканировали или фотографировали в проходящем свете на фотопленку «Микрат-орто».

2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК 1. Высечку листа, полученную при закрытии крышки пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл или 10-14 мг ткани, интенсивно гомогенизировали в 400 мл экстракционного буфера (200 мМ Трис-HCl рН-7,5, 250 мМ NaCl, 25 мМ ЭДТА, 0,5% SDS) с помощью тефлонового пестика. 2. Пробирки с гомогенатом встряхивали 5 сек на Vortex. 3. Помещали пробирки в ультратермостат и инкубировали при 65°С 15 мин., периодически перемешивая содержимое пробирки мягким покачиванием. 4. Добавляли в пробирки по 200 мкл 5 М ацетата калия (предварительно охлажденного) и тщательно перемешивали содержимое пробирок легким встряхиванием. 5. Инкубировали пробы на ледяной бане 15 мин. 6. Центрифугировали пробы в настольной центрифуге при 13000 g 20 мин при комнатной температуре. 7. Осторожно отбирали 400 мкл супернатанта в чистые пробирки и осаждали двумя объемами 96% этанола (охлажденного), осторожно перемешивая. Оставляли пробирки на столе на 5 мин. 8. Центрифугировали пробы в настольной центрифуге при 14000 об/мин 10 мин при комнатной температуре. 9. Осадок ДНК промывали охлажденным при -20°С 70% этанолом и центрифугировали, как это указано в предыдущем пункте. В ряде случаев эту процедуру повторяли еще раз. 10. Сливали надосадочную жидкость и с помощью микропипетки максимально удаляли остатки жидкости из пробирки. 11. Осадки ДНК подсушивали и растворяли в 100 мкл стерильной бидистиллированной и деионизованной воды. 12. Измеряли концентрацию ДНК в пробах. 13. Качество препаратов ДНК (полимерность) и их концентрацию контролировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

2.4. АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК. Амплификацию геномной ДНК проводили в 25 мкл реакционной смеси (67 мМ Трис-HCl рН-8,8; 16 мМ (NH4)2S04; 2mM MgCl2; 0,01% Tween-20; по 200 мМ каждого dNTP; 0,2 мМ праймера; 25 мкг геномной ДНК и 0,5 ед. Taq-полимеразы). Все компоненты, кроме ДНК, входят в набор для амплификации фирмы Biomaster (Biomaster - S.r.l. - Italy-Russia, Москва ). В одной из пробирок формировали реакционную смесь последовательно добавляя компоненты, как это указано в примере (табл.3).

Таблица 3. Пример составления реакционной смеси.

Заключение диссертации по теме «Селекция и семеноводство», Лаптева, Марина Николаевна

ВЫВОДЫ:

1. Разработана экономичная RAPD технология, направленная на быструю идентификацию генотипов ряда основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная).

2. Подтверждена возможность использования предложенного варианта RAPD технологии при изучении филогенетических взаимоотношений среди представителей рода Allium и внутривидового полиморфизма на молекулярном уровне.

3. Впервые с помощью RAPD технологии проведена геномная идентификация межвидовых гибридов: А. сера х A. schoenoprasum и А. сера х A. nutans, а также форм, полученных в системе последующих беккроссов на последней комбинации скрещивания. Установлено, что RAPD анализ позволяет контролировать долю родительских геномов при беккроссировании.

4. На основании полученных RAPD спектров проведена сортовая идентификация лука репчатого, чеснока посевного, капусты белокочанной и показана эффективность использования RAPD технологии в анализе коммерческих партий семян лука репчатого и капусты белокочанной.

5. Впервые с помощью RAPD технологии проведено тестирование на генетическую стабильность и однородность линейного материала моркови, полученного путем андрогенеза и гиногенеза в культуре in vitro. Молекулярный анализ андрогенных растений моркови показал, что степень гетерогенности зависит от способа получения материала в культуре in vitro.

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Лаптева, Марина Николаевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Алексеева М.В. Культурные луки.- М.: Колос, I960.- 303 с.

2.Ананьев Е.В., Бочканов С.С., Сонина Н.В. и др. Измененная структура хлоропластного генома в регенерантах тритикале из культуры пыльников// Всесоюз.конф.по генет.сомат.кл.в культ., Звенигород, 19-22.10.1986/ Тез. докл.- М.-1986,- С.89-90.

3.Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве/ Пер.с болг. Е.В. Дейнеко.-Новосибирск.- 1993.- 241с.

4.Брежнев Д.Д., Луковникова Г.А., Генейди Г.С. и др. Исследование белков семян сортов и гибридов Allium сера L. методами электрофореза и ИК-спектроскопии// Физиол.раст,- 1971.- Т. 18.- Вып.2.- С.306-313.

5.Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко Н.В. и др. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика.- 1992,- Т.28.- № 5.- С. 19-28.

6.Вахтина Л.И. Сравнительно-кариологическое исследование некоторых видов лука секции Mollium Don.// Бот.журнал - 1969.- Т.54.- №1.- С. 143.

7.Введенский А.И. Allium L.// Флора СССР.- Л.: Изд-во АН СССР, 1935,- Т.4.-С. 112-280.

8.Гавриленко Т.А., Павлов A.B. Цитогенетический и изоферментный анализ межродовых соматических гибридов// Сб.научн.трудов по прикл.бот., генет. и селекции.-1992.-Т. 148.-С.З8-44.

9.Гаврилова В.П. К хемотаксономическому исследованию луков// Сб.трудов аспир.и мол.науч.сотр.- 1969.- Т. 10.- №14.- С.431-438.

Ю.Гилязетдинов Ш.Я., Геращенко Г.А., Рысков А.Г. и др. Различное содержание минисателлитных последовательностей, гомологичных ДНК М13, в удвоенных гаплоидах кукурузы//Генетика.- 1990.- Т.26.-№4.- С.760-764.

П.Глухов А.И., Трофимова М.Е., Гордеев С.А. и др. Амплификация последовательностей ДНК фага X методом полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы// Молек.биол.- 1991.- Т.25.- №6.-С.1602-1609.

12.Грант В. Видообразование у растений.- М.: Мир.- 1984.- 528 с.

13.Данвелл Дж.М. Культура гаплоидных клеток.- В кн.: Биотехнология растений: культура клеток// Пер. с англ. В.И. Негрука/ Под ред. Р.Г. Бутенко.- М.: Агропромиздат.- 1989.-С.33-51.

14Джинчарадзе А.Г., Иванов П.Л., Рысков А.П. Геномная «дактилоскопия». Характеристика клонированной последовательности генома человека, обладающей в составе вектора М13 свойствами высокополиморфного маркера ДНК// Докл.АН СССР.- 1987.- Т.295.- №1.- С.230-233.

15 Дорохов Д.Б. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации генотипов томата// Известия АНРМ.- 1993.- № 4.- С.19-22.

16.Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов// Генетика.- 1997.- Т.ЗЗ.- С.476-483.

17.Ершов И.И., Абрахина Ю.В. Межвидовая гибридизация лука// Отдаленная гибридизация растений и животных.- М.: Колос, 1970.- С.344-348.

18.Ершов И.И., Юрьева H.A. Случай экспериментального получения многоярусного лука в результате межвидовой гибридизации// Селекция овощных культур/ Сб.науч.тр.- М.: ВНИИССОК- 1985.- Вып.20.- С. 117-119.

19.Ершов И.И., Агафонов А.Ф., Сундукова М.В. Проявление некоторых признаков в первом поколении у гибридов, полученных от скрещивания лука шалота с репчатым луком// Тр.по селекции овощ.культур: Сб.ВНИИССОК- 1979.- Вып.9.- С.31-35.

20.Жученко A.A. Экологическая генетика культурных растений (адаптация, рекомбиногенез, агробиоценоз).- Кишинев: Штиинца, 1980.- 588 с.

21.Иванов П. Л. Геномная дактилоскопия: гипервариабельные локусы и генетическое маркирование//Молек.биология.- 1989.- Т.23.- Вып.2.~ С.341-347.

22.Казакова A.A. Распространение и история систематики рода Allium L.// Тр.по прикл.ботан., генет.и селекц.- 1975.- Т.55. - Вып.2.- С.18-28

23.Казакова A.A. Лук// Культурная флора СССР.- Л.: Колос, 1978.- Т. 10.- 262 с.

24.Калинина Л.М., Шманаева Т.Н., Соханова Л.М. и др. Идентификация сортообразцов овощного гороха методом электрофореза глобулинов семян// Семеноводство овощных культур/ Сб.науч.тр.- 1988.- Вып.27.- С.132-137.

25.Калинина Л.М., Шманаева Т.Н., Попова Т.Л. Исследование сортовых популяций моркови методом электрофореза запасных белков семян// Молекулярные механизмы

генетических процессов/ Тез.докл. VII Всесоюз.симпоз. 20-23 марта, 1990 г. Москва -М.-1990.- С.147-148.

26.Кокорева В.А. Особенности межвидовой гибридизации лука репчатого с дикорастущими видами: Автореф.дис.... канд.с.-х.наук.- М., 1982.- 17 с.

27.Комиссаров В.А., Кокорева В.А. Межвидовые гибриды лука// Известия ТСХА,-1984,- Вып.1.- С.125-133.

28.Комиссаров В.А., Раскатов В.А., Черных О.И. Особенности микрорельефа поверхности семени у различных видов рода Allium L.// Известия ТСХА.- 1986.-Вып.5.- С.95-101.

29.Комиссаров В.А., Тарасова Е.М. Сравнительный кариологический анализ лука репчатого (А. сера L.) и лука шалота (A. ascalonicum L.)// Изв.ТСХА.- 1985.- №6.-С.176-178.

30.Конарев В.Г. Принципы белковых маркеров в геномном анализе и сортовой идентификации пшеницы // Тр. По прикл.бот.,генет.и селек. - 1973.- Т.49.- Вып 3.-С.46-58

31.Конарев В.Г. Белки пшеницы.- М: Колос.- 1980.- 350 с.

32.Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры.- М: Колос,- 1983.- 320

с.

33.Конарев В.Г. Проламины пшеницы и родственных ей злаков (обзор)// Прикл. биохим. и микробиол.- 1987.- Т.23.- Вып.4.- С.435-446.

34.Кононков П.Ф., Одинцова Т.И., Дегтяренко JI.B. Электрофорез кукурбитина как метод сортового семенного контроля тыквенных// Докл.ВАСХНИЛ.- 1989.- № 1,-С.17-19.

35.Кривенко A.A. Работа цитологической лаборатории Грибовской станции (19331935 гг)// Селекция и семеноводство овощных растений. Грибовская селекционная станция 1920-1935/ Под ред. Г.Т. Задина, В.В. Ордынского.- М.: Сельхозгиз.- 1936.-С.289-297.

36.Кривенко A.A. Межвидовые скрещивания луков// Вестник с.-х.науки. Овощеводство и картофель.- 1941.- Вып.1- С.70-78.

37.Кузнецов A.B., Туголуков В.П. Изменчивость морфологических признаков у межвидовых гибридов луков// Тр.Кубан.СХИ,- 1981.- №197/225,- С.99-107.

38.Левитес E.B. Генетика изоферментов растений.- Новосибирск: Наука.- 1986.145 с.

39.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.- М.: Мир, 1984.- 543 с.

40.Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Козлова Н.М. Клональное размножение растений лука и формирование полиплоидных форм in vitroll С.-х.биол.- 1983.- №6.-С.16-21.

41.Марьяхина И .Я., Полумордвинова И.В., Московкин Л.И. и др. Полиплоидизация растений рода Allium методом культуры ткани: результаты и перспективы// С.-х.биол.- 1986.- №4,- С.10-13.

42.Мол екулярно-био логические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции// Под ред.В.Г.Конарева.- М.: Колос, 1993.- 447 с.

43 .Методические рекомендации по селекции столовой моркови/М.- 1991.- 28 с.

44.Методические указания по анализу белков семян и изоферментов методом электрофореза для контроля сортовой чистоты и селекции капустных и тыквенных культур/ М: ВАСХНИЛ, 1990.- 48 с.

45.Методические указания по селекции сортов и гетерозисных гибридов корнеплодных растений (морковь, свекла, редис, редька, репа, брюква, пастернак)/ М.- 1987.- 84 с.

46.Нарбут С.И., Войлоков A.B., Махлина A.M. Изоферментные спектры пероксидазы у сортов и инбредных линий редиса// Вестн.ЛГУ,- 1974.- №15.- С.125-130.

47.Павлова М.К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспективы (обзор)// С.-х.биология.- 1987.- №1.- С.27-33.

48.Пенева Т.Н., Мартыненко Н.М. Полиморфизм секалина и его использование в изучении генофонда культурной ржи // Тр.по прикл.бот.,генет.и селек. - 1987.- Т.114.-С.48-50.

49.Пивоваров В.Ф., Балашова H.H., Лебедева А.Т. и др. Состояние отечественной селекции овощных культур на гетерозис// Гетерозис сельскохозяйственных растений: Мат-лы докл., сообщ. междунар. сипоз., 1-5.12.1997.- М., 1997.- С.75-82.

50.Погосян А.И. Числа хромосом некоторых видов рода Allium L. (Alliaceae), распространенных на территории Армении и Ирана// Ботан.журн.- 1983.- Т.68.- №5.-С.652-660.

51.Погосян А.И. Цитотаксономические исследования кавказских луков подрода Allium// Флора, растительность и растительные ресурсы Армении/ Сб.науч.тр.-Ереван: Изд-во АН Армении, 1991.- Вып.13.- С.135-153.

52.Поморцев A.A. Генетически обусловленный полиморфизм гордеина и возможности его использования в селекции озимого ячменя: Автореф.дис... канд.биол.наук.- Немчиновка, Московск.обл.- 1982.- 16 с.

53.Поморцев A.A., Нецветаев В.П., Созинов A.A. Полиморфизм культурного ячменя (Hordeum vulgare) по гордеинам// Генетика.- 1985.- Т.21.-№4.- С.629-639.

54.Семова Н.Ю. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников: Автореф.дис.... канд.биол.наук.- Москва.- 1992.- 17 с.

55.Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Чеботарь C.B. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами// Цитология и генетика.- 1994.- Т.28.- №6.- С.54-61.

56.Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.- Киев: Наукова Думка.- 1990.- 280 с.

57.Скаукрофт У.П. Сомаклональная изменчивость: миф о клональном единообразии.- В кн.: Мобильность генома растений/ Пер.с англ. С.А. Гостимского и Г.П. Мирошниченко/ Под ред. Ю.П. Винецкого.- М.ВО: Агропромиздат.- 1990.-С.228-260.

58.Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции.- М: Наука.-1985.-272 с.

59.Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов ДНК. Методология и свойства (обзор)// С.-х. биология.- 1989.- №1.- 60-67.

60.Сулимова Г.Е., Слюсаренко А.Г. Выделение дезоксирибонуклеиновых кислот из тканей высших растений// Строение ДНК и положение организмов в системе/ Под ред. А.Н. Белозерского и A.C. Антонова.- М., 1972.- С.19-34.

61.Таганов Б.О. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений моркови in vitro: Автореф.дис....канд с.-х.наук.-М.-1991.- 21 с.

62.Тарасова Е.М. Морфологические особенности спутничных хромосом у видов рода, Allium L.// Бюл.ВИР.- 1972.-Вып.22.- С.72-81.

63.Тарасова Е.М. Исследование кариотипов девяти видов рода Allium L.// Бюл.ВИР.- 1973.- Вып.29.- С.74-87.

64.Тарасова Е.М. Цитологические аспекты изучения луковых растений в селекции// Прогрессивные приемы в селекции плодовоовощных культур: Сб.ст.- М., 1984.- С.83-88.

65.Тарасова Е.М. Кариосистематика некоторых видов лука в связи с филогенезом и селекционным использованием// Прогрессивные приемы в овощеводстве, селекции и семеноводстве овощных культур.- М.: 1986.- С. 120-127.

66.Тарасова Е.М., Кокорева В.А. Биолого-морфологическая и кариологическая характеристика межвидового гибрида Fi А. сера L. х A. pskemense B.Fedtsch.// Известия ТСХА.- 1982,- Вып.З.- С.102-109.

67.Тарасова Е.М., Кристен П. Кариологические результаты межвидового скрещивания А. сера L. х A. oschanini O.Fedtsch.// Прогрессивные приемы в селекции плодоовощных культур.- М.: 1984.- С.88-93.

68.Тарлаковская A.M. Идентификация сортов гороха по электрофоретическим спектрам глобулинов// Тр.по прикл.бот.,генет.и селек.- 1987.- Т.114.- С.100-106.

69.Тахтаджан A.JL Семейство луковые (Alliaceae). В кн.: Жизнь растений. М., 1982, Т. 6, 94-102.

70.Тимин Н.И. Создание и оценка линий моркови для гетерозисной селекции// Тр.по селекц.и семенновод. овощных культур.- М.- 1982.- Вып.15.- С.40-46.

71.Тимин Н.И. Особенности гетерозисной селекции овощных культур// Селекция овощных культур/ Сб.науч.тр.- 1984.- Вып.18.- С.38-43.

72.Тимин Н.И. Методические особенности мужски стерильных и мужски фертильных линий моркови для гетерозисной селекции// Бюл.ВИР.- JL- 1986.-Вып. 161.-С. 19-23.

73.Тимин Н.И. Методы создания и идентификация генетических источников ценных признаков овощных растений (морковь, лук, салат): Дис. в виде науч.докл....докт.с.-х.наук.- С.-Петерб., 1997.- 61 с.

74.Тимин Н.И., Василевский В.А. Исследование генетики признаков моркови// Науч. тр. по селек.сем-ву.- 1995.- Т.1.- С.82-91.

75.Тимин Н.И., Титова И.В. Особенности получения и использования рекомбинантных форм моркови и лука// Генетические основы селекции сельскохозяйственных растений.- М.- 1995.- С. 102-106.

76.Титова И.В. Преодоление постгамной несовместимости в скрещиваниях лука репчатого с дикими видами методом культуры зародышей// Культура клеток растений и биотехнология: Сб. ст. - М.: Наука, 1986.- С.195-199.

77.Титова И.В. Межвидовая гибридизация лука с использованием культуры in vitro: Автореф. дис.... канд. с.-х. наук.- М.- 1989.- 23 с.

78.Титова И.В., Тимин Н.И., Юрьева H.A. и др. Методические указания по использованию культуры in vitro при межвидовой гибридизации лука. - М., 1987-14 с.

79.Титова И.В., Тимин Н.И., Юрьева H.A. Межвидовая гибридизация лука// Науч. тр. по селек.сем-ву.- 1995.- Т.1.- С.91-101.

80.Турков В.Д., Шелепина Г.А., Казакова A.A. и др. Кариотипический полиморфизм лука и чеснока// Вестн. с.-х. науки.- 1979.- №5.- С.49-54.

81.Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Буракова И.А. Использование методов культуры тканей растений in vitro в селекции моркови// Научно-технич.бюл.ВИР.- JL- 1989.-Вып.192.- С.57-60.

82.Тюкавин Г.Б. Получение растений в культуре пыльников моркови in vitro// Plant biotechnology and molecular biology/ Тез. докл. II Российск.симпоз. «Новые методы биотехнологии растений» Пущино, 18-20 мая 1993 г.- Пущино. 1993.- С.172.

83.Угарова C.B., Жидкова Н.И., Квасников Б.В. Оценка исходных родительских форм моркови по потомству гибридов Fi// Агротехника и селекция овощных культур.-М.- 1992.- С.145-154.

84.Фризен Н.В. Луковые Сибири (систематика, кариология, хорология).-Новосибирск: Наука. Сиб.отд-ние, 1988.- 185 с.

85.Фурст Г.Г. Анатомическое и гистохимическое исследование вегетативных органов некоторых видов лука Allium L.: Автореф.дис. ...канд.биол.наук.- М., 1973.20 с.

86.Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве// С.-х.биол.- 1997.- №5.-С.3-21.

87.Хвырлева Ц.Д., Рыжик М.В., Ананьев Е.В. и др. Деметилирование рДНК в каллусной ткани ячменя, культивируемой in vitro// Докл.АН СССР.- 1986.- Т.290.-№5.- С.1249-1252.

88.Цвелев H.H. О таксономическом ранге членов полиплоидных рядов у высших растений// Тез.совещ.по объему вида и внутривидовой систематике.- JL: Наука.-1967.- С.59-60.

89.Черемушкина В.А. Эволюция жизненных форм в подроде Rhizirideum рода Allium (Alliaceae)// Бот.журн.- 1992.- Т.77.-№8.- С.107-116.

90.Чешмеджиев И.В. Цитотаксономическое исследование видов родов Allium L. и Nectaroscordum Lindl, флоры Болгарии: Автореф. дис....канд.биол.наук.- Л.,1972,- 23с.

91.Шамина З.Б. Развитие биотехнологии в СССР - клеточная инженерия и культура тканей растений.- М., 1988.- 11 с.

92.Шевченко Г.С., Полумордвинова И.В. Система цитологического контроля при отдаленной гибридизации луков// Науч.тр.по селек.сем-ву.- 1995.- Т.1.- С.104-110.

93.Шевченко Г.С., Тимин Н.И. Цитоэмбриологические особенности межвидовых гибридов лука// Селекция овощных культур: Сб.науч.тр.ВНИИССОК.- 1994.-Вып.34.- С. 17-23.

94.Шмыкова H.A. Культура пыльников, неопыленных завязей и семяпочек лука репчатого// Научные тр. по селекц., сем-ву/ Под ред. В.Ф. Пивоварова.- М.: РАСХН/ ВНИИССОК- 1995.- Т.1.- С. 164- 170.

95.Юрьева P.A., Кокорева В.А. О межвидовых гибридах Fi лука репчатого, полученного от скрещивания с луком алтайским и луком Вавилова// Прогрессивная технология выращивания овощных культур/ М., 1981.- С.41-48.

96.Юрьева H.A., Кокорева В.А. Многообразие луков и их использование.- М.: Изд-во МСХА, 1992.- 160 с.

97.Юрьева H.A., Титова И.В. Результаты скрещивания репчатого лука с луком-слизуном и душистым луком// Селекция овощных культур: Сб.науч.тр.ВНИИССОК,-1984.- Вып. 18.- С.67-70.

98.Akkaya M.S., Bhagwat A.A., Cregan P.B. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean// Genetics.- 1992.- V.132.- P.1131-1139.

99.Anil D., Noel E.T.H. Deleted forms of plastid DNA in albino plants from cereal anther culture// Curr.Genet.- 1985.- V.9.- N8.- P.671-678.

100.Arus P. Genetic purity of commercial seed lots// Isozymes in plant genetics and breeding. Part A/ S.D.Tanksley, T.J.Orton (eds.).- Amsterdam: Elsevier.- 1983.- P.415-423.

101.Arus P., Tanksley S.D., Orton T.J. et al. Electrophoretic variation as a tool for determining seed purity and for breeding hybrid varities of Brassica oleraceaell Euphytica.-1982.- V.31.-417-428.

102.Arus P., Orton T.J. Inheritance patterns and linkage relationships of eight genes of celery//J.Hered.- 1984.-V.75.- P. 11-14.

103 .Bailey D.S. Isozymic variation and plant breeder rights// Isozymes in plant genetics and breeding. Part A./ S.D.Tanksley, T.J.Orton (eds.).- Amsterdam: Elsevier.- 1983.- P.425-441.

104.Badr A., ElkingtonT. Numerical taxonomy of species in Allium subgenus Molium// New Phytol.- 1978.- V.81.- P.401-417.

105.Bark O.H., Havey M.J. Similarities and relationships among populations of the bulb onion as estimated by nuclear RFLPs// Theor.Appl.Genet.- 1995.- V.90.- P.407-414.

106.Bennett M., Smith J. Nuclear DNA amounts in angiosperms// Philos.Trans.R.Soc.-London.- 1976.-Ser.B.- V.274.- P.227-274.

107.Bernatzky R., Tanksley S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozymes and random cDNA sequences// Genetics.- 1986.- V.l 12.- P.887-898.

108.Bohanec B., Jakse M., Ihan A. et al. Studies of gynogenesis in onion {Allium cepa L.) - induction procedures and genetic analysis of régénérants// Plant Science.- 1995.- V.104.-N2.-P.215-224.

109.Botstein D., White R.L., Skolnick M. et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms// Amer.J.Hum.Genet.- 1980.- V.32.-P.314-331.

110.Boury S., Lutz I., Gavalda M-C. et al. Empreintes genetiques du chou-fleur per RAPD et verification de la purete hybride Fj d'un lot de semences// Agronomie.- 1992.-V.12.- P.669-681.

111.Bowditch B.M., Albright D.G., Williams J. G.K. et al. Use of randomly amplified polymorphic DNA markers in comparative genome studies// Methods in Enzymology.-Academic Press.- 1993.- V. 224.- P.294-309.

112.Bradeen J.M., Havey M.J. Restriction fragment length polymorphisms reveal considerable nuclear divergence within a well-supported maternal clade in Allium section Cepa (Alliaceae)// Am.J. Bot.- 1995.- V.82.- P.1455-1462.

113.Brewbaker J.L. Enzyme fingerprints for the plant detective// Hawaii Bot.Soc.Newsl.-1966.-P.1-3.

114.Brown P.T.H., Lange F.D., Kranz E. et al. Analysis of single protoplast and regenerated plants by PCR and RAPD technology// Mol.Gen.Genet.- 1993.- V.237.- P.311-317.

115.Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Bio/Technol.-1991.- V.9.- P.553-557.

116.Caetano-Annoles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition// Bio/Technol.- 1992.- V.10.- P.937.

117.Caetano-Annoles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. Enhanced detection of polymorphic DNA by multiple arbitrary amplicon profiling of endonuclease digested DNA: identification of markers linked to the supernodulation locus of soybean// Mol.Gen.Genet.-1993.-V.241.-P.57-64.

118.Caetano-Annoles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. Multiple arbitrary amplicon profiling using short oligonucleotide primers// Plant Genome Analysis/ P.M. Gresshoff (ed.).- CRC Press: Boca Raton, 1994.- P.29-46.

119.Cai Q., Guy C.L., Moore G.A. Detection of cytosine methylation and mapping of gene influencing cytosine methylation in the genome of Citrus// Genome.- 1996.- V.39.-P.235-242.

120.Campion B., Alloni C. Induction of haploid plants in onion (Allium cepa L.) by in vitro culture of unpollinated ovules// Plant Cell Tissue Org.Cult.- 1990,- V.20.- P. 1-6.

121.Campion B., Bohanec B., Javornik B. Gynogenic lines of onion {Allium cepa L.): evidence of their homozygosity// Theor.Appl.Genet.- 1995.- V.91.- P.598-602.

122.Charlesworth B., Sniegowski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes//Nature.- 1994.- V.371.- P. 215-220.

123.Chen X., Xiangyun Z., White B.N. et al. Analysis of genetic relationship among lilacs 0Syringa) by RAPD// Acta Hortic.Sinica.- 1995.- V.22.- P. 171-175.

124.Chungwongse J., Martin G.B., Tanksley S.D. Pre-germination genotypic screening using PCR amplification of half-seeds// Theor.Appl.Genet.- 1993,- V.86.- P.694-698.

125.Coulhart M., Denford K.E. Isozyme studies in Brassica. I.Electrophoretic techniquies for leaf enzymes and comparison of B. napus, B. campestris and B. oleraceae using phosphoglucomutase// Canad.J.Plant Sei.- 1982.- V.62.- P.621-630.

126.Courcel A. de, Veder F., Boussac J. DNA polymorphism in Allium cepa cytoplasms and its implication concerning the origin of onion// Theor.Appl.Genet.- 1989.- V.U.- P.793-798.

127.Cryder C., Corgan J., Urquhart N. et al. Isozyme analysis of progeny derived from (Allium flstulosum x Allium cepa) it Allium cepall Theor.Appl.Genet.- 1991.- V.82.- P.337-345.

128.Curn V. Acid phosphatase and leucine aminopeptidase isozymes as biochemical markers of homogeneity in oil seed rape androgenetic lines// Plant Growth Regul.- 1995.-V.16.-N1.- P.59-65.

129.Day A., Ellis T.H.N. Chloroplast DNA deletions associated with wheat plants regenerated from pollen: possible basis for maternal inheritance of chloroplasts// Cell.-1984,- V.39.- P.359-368.

130.Deilaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version II// Plant Mol.Biol.Rep.- 1983.- V.l.- P.19.

131.de Paepe R., Prat D., Huguet T. Heritable nuclear DNA changes in doubled haploid plants obtained by pollen culture of Nicotiana sylvestris!I Plant Sci.Lett.- 1982.- V.18.-P.11-28.

132.Dhillon S.S., Wernsman E.A., Miksche J.P. Evaluation of nuclear DNA content and heterochromatin changes in anther-derived dihaploids of tobacco {Nicotiana tabacum) cv Coker 139// Can.J.Genet.Cytol.- 1983.- V.25.- P.169-173.

133.De Vries J.N., Jongerius R., Sandbrink H. et al. RAPD markers assist in resistance breeding// Prophyta.- 1992.- V.46.- P.50-51.

134.Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quatities of fresh leaf tissue// Phytochem.Bull.- 1987.- V.19.- P.l 1.

135.Dubouzet J.G., Etoh T., Arisumi K. et al. A diagnostic test to confirm interspecific Allium hybrids using random amplified polymorphic DNA from crude leaf DNA extracts// J.Jpn.Soc.Hortic. Sei.- 1996.- V.65.-P.321-326.

136.Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis// Nucleic Acids Res.- 1991.- V.19.-№6.-P. 1349.

137.Esquinas J.T. Alloenzyme variation and relationships among Spanish land-races of Cucumis melo LJt Kulturpflanze.- 1981,- V.29.- P.337-352.

138.Evans D.A., Sharp W.R., Medina-Filho H.P. Somaclonal and gametoclonal variation// Amer.J.Bot.- 1984.- V.71.- P.759-774.

139.Fabbri A., Hormaza J.I., Polito V.S. Random amplified polymorphic DNA analysis of olive (Olea europeae L.) cultivars// J.Amer.Soc.Hortic.Sci.- 1995.- V.120.- N3.- P.538-542.

140.Foolad M.R., Jones R.A., Rodriguez R.L. RAPD markers for constructing intraspecific tomato genetic maps// Plant Cell Rep.- 1993.- V.12.- P.293-297.

141.Ford-Lloyd B.V., Munthali M., Newbury H.J. The use of RAPD for the identification of sugar beet varieties// J.of Sugar Beet Res.- 1993.- V.30.- P.291-298.

142.Fritsh R.M. New results of taxonomic and evolutionary research on Allium L.// Schriften zu Genet.Ressour.- 1996.- B.4.- P.19-46.

143.Garcia G.M., Stalker H.T., Shroeder E. et al. Identification of RAPD, SCAR, and RFLP markers tightly linked to nematode resistance genes introgressed from Arachis cardenasii into Arachis hypogaeall Genome.- 1996.- V.39.- P.836-845.

144.Gelfand D.H. Taq DNA polymerase// PCR technology. Principles and Applications for DNA amplification/ H.A.Erlich (ed.) - Stockton Press, 1989.- P. 17-22.

145.Gidoni D., Rom M., Kunik T. et al. Strawberry-cultivar identification using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers// Plant Breed.- 1994.- V.113.-P.339-342.

146.Grandillo S., Tanksley S.D. QTL analysis of horticultural traits differentiating the cultivated tomato from the closely related species Lycopersicon pimpinellifolium// Theor.Appl.Genet.- 1996.- V.92.- N8,- P.935-951.

147.Graves J.A.M. Genome instability in interspecific cell hybrids. I. Unstable expression of genes in divergent cell hybrids// J.Genet.- 1988.- V.67.- P.9-22.

148.Grzebelus D., Szklarczyk M., Michalik B. The use of RAPD markers for genotype identification of carrot lines and Fi hybrids// J.Appl.Genet.-1997.- V.38A.- P.33-41.

149.Gu K.W., Weeden N.F., Yu J. et al. Large-scale, cost-effective screening of PCR products in marker-assisted selection applications// Theor.Appl.Genet.- 1995.- V.91.-P.465-470.

150.Guha S., Maheshvary S.C. In vitro producing of embryoids from anter culture of Datura// Nature.- 1964.- V.204.- P.497.

151.Hadacova V., Svachulova J., Klozova et al. Use of isozymes revealed by gel isoelectric focusing as an aid in chemotaxonomical study of the genus Allium// Biol.Plantar.- 1983.- V.25.-P.36-42.

152.Hallden C., Nilsson N.-O., Rading I.M. et al. Evaluation of RFLP and RAPD markers in a comparison of Brassica napus breeding lines// Theor.Appl.Genet.- 1994.-V.88.- P.123-128.

153.Hamada H., Petrino M.G., Kakunago T. A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionary diverse eukaryotic genomes// Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1982.- V.79.- P.6465-6469.

154.Hanelt P., Schultze-Motel J., Fritsch R. et al. Infrageneric grouping of Allium - the Gatersleben approach.// Genus Allium - Taxonomic problems and genetic resources, Proceed.of an Internat.Symp./ P.Hanelt, K.Hammer and H.Knupffer (eds.).- Gatersleben.-1992,-P. 107-123.

155.Hashizume T., Sato T., Hirav M. Determination of genetic purity of hybrid seed in watermelon (Citrullus lanatus) and tomato (Licopersicon esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD)// Japan J.Breed.- 1993.- V.43.- P.367-375.

156.Havey M.J. Phylogenetic relationships among cultivated Allium species from restriction enzyme analysis of the chloroplast genome// Theor.Appl.Genet.- 1991.- V.81.-752-757.

157.Havey M.J. A putative donor of S-cytoplasm and its distribution among open-pollinated populations of onion// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.86.- P.128-134.

158.Havey M.J. Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion// Theor.Appl.Genet.- 1995.- V.90.- N2.- P.263-268.

159.Helentjaris T.A. A genetic linkage map for maize based on RFLPs// Theor.Appl.Genet.- 1987.- V.3.- P.217-221.

löO.Hoisington D., Fisher M., Nunes C. et al. RFLP analysis using nonradioactive techniques// 1991 Annual Meet.ofthe Amer.Soc.of Agron.: Agron.Abstr.- 1991.- P.196.

löl.Holford P., Croft J., Newbury H. Differences between and possible origins of, the cytoplasms found in fertile and male-sterile onion (Allium cepa L.)// Theor.Appl.Genet.-1991.- V.82.- P.737-744.

162.Hoseman D., Bossoutrot D. Induction of haploid plants from in vitro culture of unpollinated beet (Beta vulgaris L.)// Z.Pflanzenzucht.- 1983.- V.91.- N1.- P.74-77.

163.Hu J., Quiros C.F. Identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers// Plant Cell Rep.- 1991.- V.10.- P.505-511.

164.Hunt J.S., Barnes M.F. Molecular diversity and plant disease resistance: An electrophoretic comparison of near-isogenic lines of wilt-resistante or -susceptible Pisum sativum L. cv. William Masseull Euphytica.-1982.- V.31.- P.341-348.

165.1gnart F., Weeden N.F. Allozyme variation in cultivars of Cucurbita pepo L.II Euphytica.- 1984.- V.33.- P.779-785.

166.1nnis M.A., Gelfand D.H. Optimization of PCRs// In: PCR Protocols: a guide to methods and application.- Acad.Press., 1990.- P.3-12.

167.1nnis M.A., Myambo K.B., Gelfand D.H. et al. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA// Proc.Natl.Acad.Sci. USA.- 1988.- V.85.- P.9436-9440.

168.Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable «minisatellite» regions in human DNAII Nature.-1985a.-V.314.- N6006,- P.67-73.

169.Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific «fingerprints» of human DNA//Nature.- 19856.- V.316.- N6023.- P.76-79.

170.Karp A., Bright S.W.J. On the cauces and origins of somaclonal variation// Oxford Surv.of Plant Molec.Cell Biol.- 1985,- V.2.- P.199-234.

171.Keller J. Culture of unpollinated ovules, ovaries and flower buds in some species of genus Allium and haploid induction via gynogenesis in onion (Allium cepa L.)// Euphytica.-1990.- V.47.- P.241-247.

172.Kennard W.S., Poetter K., Dijkhuizen et al. Linkages amoung RFLP, RAPD,

isozyme, disease resistance, and morphological markers in narrow and wide crosses of

/

cucumber// Theor.Appl.Genet.- 1994.- V.89.- P.42-48.

173.Khadari B., Lashermes P., Kjellberg F. RAPD fingerprints for identification and genetic characterization og fig (Ficus carica L.) genotypes// J.Genet.Breedg.- 1995.- V.49.-P.77-85.

174.Kim H.J., Park H.G. Application of electrophoresis in testing the genetic purity of Fi hybrid seeds of radish (Raphanus sativus)// J.Korean.Soc.Hort.Sci.- 1984.- V.25.- 256-262.

175.Klein-Lankhorst R.M., Vermunt A., Weide R. et al. Isolation of molecular markers for tomato (.L. esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD)// Theor.Appl.Genet.- 1991.- V.83.- P.108-114.

176.Knerr L.D., Staub J.E. Inheritance and linkage relationships of isozymes loci in cucumber (Cucumis sativus L.)ll Theor.Appl.Genet.- 1992.- V.84.- P.217-224.

177.Koller B., Lehmann A., Mcdermott J.M. et al. Identification of apple cultivars using RAPD markers// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.85.- P.901-904.

178.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4// Nature.- 1970.- V221.- P.680-685.

179.Landry B.S., Kesseli R., Farrara B. et al. A genetic map of lettuce {Latuca sativa L.) with restriction fragment length polymorphisms, isozymes, disase resistance and morphological markers// Genetics.- 1987.- V.l 16.- P.331-337.

180.Lanham P.G., Brennan R.M., Hackett C. et al. RAPD fingerprinting of blackcurrant CRibes nigrum L.) cultivars// Theor.Appl.Genet.- 1995.- V.90.- P.166-172.

181.Lavi U., Cregan P., Schaap T. et al. Application of DNA markers for identification and breeding of perennial fruit crops// Plant Breed.Rev.- 1994.- V. 112,- P. 195-226.

182.Lefebvre V. Molecular markers and polygenic resistances: interaction pepper (Capsicum annuum L.) - Phytophthora capsici// Leon.Ph.D.Thesis.- Univer.of Orsay, France.- 1993.

183.Lefebvre V., Palloix A., Rives M. Nuclear RFLP between pepper cultivars (Capsicum annuum L.)ll Euphytica.- 1993.- V.71.- P. 189-199.

184.Lefebvre V., Palloix A., Caranta C. et al. Construction of an intraspecific integrated linkage map of pepper using molecular markers and double-haploid progenies// Genome.-1995.= V.38.-N1.- P.l 12-121.

185.Le Thierry D'Ennequin M., Panaud 0., Thierry R. et al. Assessment of genetic relationships among sexual and asexual forms of Allium cepa using morphological traits and RAPD markers//Heredity.- 1997.- V.78.- P.403-409.

186.Levan A. Cytological studies in Allium. IV. The chromosome morphology of some diploid species of Allium// Hereditas.-1935.-Bd.20.- N3.- S.289-330.

187.Linne von Berg G., Samoylov A., Klaas M. et al. Chloroplast DNA restriction analysis and the infrageneric grouping of Allium (Alliaceae)// Plant Syst.Evol.- 1996.-V.200.- P.253-261.

188.Lioi L. Geographical variation of phaseolin patterns in an old world collection of Phaseolus vulgarisII Seed Sci.Technol.- 1989.- V.17- N2.- P.317-324.

189.Liu Z., Furnier G.R. Comparison of allozyme, RFLP and RAPD markers for revealing genetic variation within and between Trembling aspen and Bigtooth aspen// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.87.- P.97-105.

190.Maap H.I. Electrophoretic study of storage proteins in the genus Allium L.// The genus Allium - taxonomic problems and genetic resources/ Proceed.internat.sympos., 1113.06.1991, Gatersleben. Germany.- Gatersleben.- 1992.-P.183-189.

191.Maa(3 H.I. Studies on triploid viviparous onions and their origin// Genetic.Resour.Crop Evol.-1997.- V.44.- N2.- P. 95-99.

192.Maa(3 H.I., Klaas M. Infraspecific differentiation of garlic (Allium sativum L.)by isozyme and RAPD markers// Theor.Appl.Genet.- 1995.- V.89.- P.89-97.

193.Macpherson J.M., Eckstein P.E., Scoles G.J. et al. Variability of the random amplified polymorphic DNA assay among thermal cyclers, and effects of primer and DNA concentration// Mol.Cell.Probes.- 1993.- V.7.- P.293-299.

194.Mandolino G., Faeti V., Ranalli P. Caratterizzazione genotipica in Beta spp. mediante marcatori molecolari// Semen.Elet.- 1996.- V.42.- P.73-75.

195.Marsan P.A., Maddaloni M., Monfredini G. et al. Tecnologie avanzate per L'identificazione di linee pure, inbridi e varieta// Semen.Elet.- 1993.- V.39.- P.51-54.

196.Martin G.B., Williams J.G.K., Tanksley S.D. Rapid identification of markers linked to Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near isogenic lines// Proc.Natl.Acad Sci. USA.-1991.- V.88.- P.2336-2340.

197.McClintock B. The significance of responses of the genome to challenge// Scince.-1984.- V.226.- P.792-801.

198.McCollum G. Hybrid origin of top onion, Allium cepa var. viviparumll Z.Pflanzenzucht.- 1974.- V.71.- P.222-232.

199.McDonald M.B., Elliot L.J., Sweeney P.A. DNA extraction from dry seeds for RAPD analyses in varietal identification studies// Seed Sci.Technol.- 1994.- V.22.- P.171-176.

200.Meglik V.V., Horejsi T.F., McCreight J.D. et al. Genetic diversity and inheritance and linkage of isozyme loci in melon (Cucumis melo L.)// HortScience.- 1994.-V.29.- P.449.

201.Melotto M., Afanador L., Kelly J.D. Development of a SCAR marker linked to the I gene in common bean// Genome.- 1996.- V.39.- P.1216-1219.

202.Meunier J.R., Grimont P. Factors affecting reproducibility of random amplified polymorphic DNA fingerprinting// Res.in Microbiol.- 1993,- V.144.- P.373-379.

203.McDonald M.B., Elliot L.J., Sweeney P.A. DNA extraction from dry seeds for RAPD analyses in varietal identification studies// Seed Sci.,Technol.- 1994.- V.22.- P. 171176.

204.Michelmore R.W., Paran I., Kesseli R.V. Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions using segregating populations// Proc.Natl.Acad Sei. USA.- 1991.- V.88.-P.9828-9832.

205.Morgante M., Olevieri A.M. PCR amplified microsatellites as markers in plant genetics// Plant J.- 1993.- V.3.- P.175-182.

206.Morrison R.A., Evans D.A. Haploid plants from tissue culture: new plant varieties in a shortened time frame// Bio/Technol.- 1988.- V.6.- N7,- P.684-670.

207.Morrison R.A., Koning R.E., Evans D.A. Anther culture of an interspecific hybrid of Capsicum// J.Plant Physiol.- 1986,- V.126.- P.l-9.

208.Mullis K.B., Faloona F.A., Scharf S.J. et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the Polymerase Chain Reaction// Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.-1986.- V.51.- P.263-273.

209.Mullis K.B. The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodioxyribonuclear fusions// PCR Meth.Applic.- 1991.- V. 1.- P. 1 -4.

210.Muren R. Haploid plant induction from unpollinated ovaries in onion// HortScience.-1989,- V.24.- P.833-834.

211.Murigneux A., Baud S., Beckert M. Molecular and morphological evaluation of doubled-haploid lines in maize. 2. Comparison with single-seed-descent lines// Theor.Appl.Genet.- 1993,- V.87.- P.278-287.

212.Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight DNA// NucLAcids Res.- 1980.- V.8.- P.4321-4325.

213.Nakamura S., Tahara M. Studies on the determination of the species and cultivars on the basis of electrophoresis patterns of seed proteins and seed enzymes. II. Allium ssp., Cucumber and Melon, Pea and Garden Bean// J.Jap.Soc.Hort.- 1977.- V.46.- P.233-244.

214.Naqvi N.I., Chattoo B.B. Development of a sequence characterized amplified region (SCAR) based indirect selection method for a dominant blast-resistance gene in rice// Genome.- 1996.- V.39.- P.26-30.

215.Nei M., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restrictions endonucleases// Proc.Natl.Acad.Sci.USA.- 1979.- V.76.- P.5269-5273.

216.Neuhausen S.L. Evaluation of restriction fragment length polymorphisms in Cucumis meloli Theor.Appl.Genet.- 1992.- V.83.- P.379-384.

217.Nielsen G. The use of isozymes as probes to identify and label plant varieties and cultivars// Isozymes: Current topics in biological and medical research/ M.C. Rattazzi, J.G. Scandalios, G.S. Whitt (eds.).- 1985.- V.12.- P.l-132.

218.Nybom H., Rogstad S.H., Shaal B.A. Genetic variation detected by use of M13 «fingerprint» probe in Malus, Prunus and Rubus (Rosaceae)// Theor.Appl.Genet.- 1990.-V.79.- N.2.- P.153-156.

219.0rton T.J. Spontaneous electrophoretic and chromosomal variability in callus cultures and regenerated plantsof celery// Theor.Appl.Genet.- 1983.- V.67.- P.17-24.

220.0rton T.J., Bowers M.A. Segregation of genetic markers among plants regenerated from cultured anthers of broccoli (Brassica oleracea var. italica)ll Theor.Appl.Genet.-

1985.- V.69.- P.637-643.

221.Palmer J. Isolation and structural analysis of chloroplast DNA// Methods Enzymol.-

1986.- V.l 18.- P.167-186.

222.Palmer J., Stein D. Conservation of chloroplast genome structure among vascular plants// Curr.Genet.- 1986.- V.10.- P.823-833.

223.Palmer J., Jansen R., Michaels H. et al. Chloroplast DNA variation and plant phylogeny//Arm.Mo.Bot.Gard.- 1988.- V.75.- P.1180-1206.

224.Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.85.- P.985-993.

225.Parent J.G., Fortin M.G., Page D. Identification of raspberry cultivars by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis// Canad.J.Plant Sci.- 1993.- V.73.- N4,-P.l115-1122.

226.Patritey T.V., Ledovskiy S.Ya. Embryogenesis of onion// Plant Biotechnology and Genetic Engineering/ Abstr.of Internation.Symp.3.-6.10.1994, Kiev, Ukraine.- Kiev.- 1994.-P.105.

227.Pecchioni N., Peveri C., Monetti A. et al. Uso di tecniche molecolary (RFLP e PCR) per il riconoscimento varietale di specie di interesse agrario// Semen.Elet.- 1993.- V.39.-P.55-60.

228.Peffley E.B. Molecular markers in Allium: a review// Proc.Nat.Onion Res.Confer.-Ithaca, N.Y., 1993,- P.115-120.

229.Peffley E.B., Corgan J.N., Horak K.E. et al. Electrophoretic analysis of Allium alien addition lines// Theor. Appl. Genet.- 1985.- V.71.- P.176-184.

230.Peffley E.B., Currah L. The chromosomal locations of enzyme coding genes Adh-1 and Pgm-1 in A. fistulosum L.// Theor.Appl.Genet.- 1988.- V.75.- P.945-949.

231.Peffley E.B., Orozco-Castillo C. Polymorphism of isozymes within plant introductions of Allium cepa L. and A. fistulosum ~L.II HortScience.- 1987.- V.22.- P.956-957.

232.Perl-Treves R., Zamir D., Navot N. et al. Phylogeny of Cucumis based on isozyme variability and its comparison with plastome phylogeny// Theor.Appl.Genet.-1985.- V.71.-P.430-436.

233.Phippen W.B., Kresovich S., Candelas F.G. et al. Molecular characterization can quantify and partition variation among genebank holdings: a case study with phenotypically similar accessions of Brassica oleraceae var.capitata L. (cabbage) «Golden Acre»// Theor.Appl.Genet.- 1997.- V.94.-P.227-234.

234.Pooler M.R., Simon P.W. Characterization and classification of isozyme and morphological variation in a diverse collection of garlic clones// Euphytica.-1993.- V.68.-P.121-130.

235.Powell W.5 Morgante M., Andre C. et al. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis// Mol.Breed.- 1996.- V.2.- P.225-238.

236.Prince J.P., Pochard E., Tanksley S.D. Construction of a molecular linkage map of pepper and a comparison of synteny with tomato// Genome.- 1993.- V.36.- P.404-417.

237.Prince J.P., Lackney V.K., Angeles C. et al. A survey of DNA polymorphism within the genus Capsicum and the fingerprinting of pepper cultivars// Genome.- 1995.- V.38.-N2.-P.224-231.

238.Rafalski A., Tingey S., Williams J.G.K. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers// Plant Mol.Biol.Man.- 1993.- C8.- P. 1-9.

239.Ragot M., Hoisington D.A. Molecular markers for plant breeding - comparisons of RFLP and RAPD genotyping costs// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.86.- P.975-984.

240.Ramser J., Lopez-Peralta C., Wetzel R. et al. Genomic variation and relationships in aerial yam (Dioscorea bulbifera L.) detected by random amplified polymorphic DNA// Genome.- 1996.- V.39.- P. 17-25.

241.Ramser J., Weising K., Chikaleke V. et al. Increased informativeness of RAPD analysis by detection of microsatellite motifs// BioTechniq.- 1997.- V.23.- P.285-290.

242.Rick C.M. Tomato// Enzyme in plant genetics and breeding. Part B./ S.D. Tanksley and T.J. Orton (eds.). - Amsterdam.-Elsevier.- 1983.- P.147-165.

243 .Rick C.M., Fobes J.F. Association of an allozyme with nematode resistance// Rept Tomato. Genet.Coop.- 1974.- V.24.- P.25.

244.Richardson T., Cato S., Ramser J. et al. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers// Nucl.Acids Res.- 1995.- V.23.- P.3798-3799.

245.Rogers S.O. Philogenetic and taxonomic information from herbarium and mummified DNA// Conservation of plant genes II: Utilization of ancient and modern DNA/ R.P. Adams, J.S. Miller, E.M. Golenberg, J.E. Adams (eds.) - Missouri Bot.Gard., 1994,-P .47-67.

246.Rogstad S.H., Patton II J.C., Schaal B. M13 repeat probe detects DNA minisatellite-like sequences in gymnosperms and angiosperms// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.- 1988.-V.85.- P.9176-9178.

247.Rom M., Bar M., Rom A. et al. Purity control of Frhybrid tomato cultivars by RAPD markers// Plant Breed.- 1995.- V.l 14.- N2,- P.188-190.

248.Rouamba A., Ricroch A., Sarr A. Collecting onions germplasm in west Africa// FAO/IBPRG Plant Genetic Resources Newsl.- 1993.- V.94/95.- P.15-17.

249.Roxas V.P., Peffley E.B. Short-day onion varietal identification using molecular (RAPD) markers// Allium Newsletter.- 1993.- V.2.- P. 15-17.

250.Rychlik W., Spencer W.Y., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro// Nucl.Acids Res.- 1990.- V.18.- P.6400-6414.

251.Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A. et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics//Proc.Natl.Acad.Sci.USA.- 1984,- V.81.- P.8014-8018.

252.Saharan B.S., Samimy C., Malik A.S. Identification of varieties of radish (Raphanus sativus L) by isozyme phenotypes// Plant Variet. and Seeds.- 1991.- V.4.- N2.- P.87-88.

253.Saiki R.K. Amplification of genomic DNA// PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.- N.Y.: Acad.Press.- 1990.- P. 13-20.

254.Saiki R.K., Gelfand D.H. Introduction AmpliTaq DNA polymerase// Amplifications.- 1989.- V.I.- P.4-6.

255.Schierwater B., Ender A. Different thermostable DNA polymerases may amplify different RAPD products// Nucl.Acids Res.- 1993.- V.21 .-N19.- P.4647-4648.

256.Sharon D., Adato A., Mhameed S. et al. DNA fingerprints in plant using simple-sequence repeat and minisatellite probes// HortScience.- 1995.- V.30.- N1.- 109-112.

257.Shatters R.G., Schweder M.E., West S.H. et al. Environmentally induced polymorphisms detected by RAPD analysis of soybean seed DNA// Seed Sci.Res.- 1995.-V.5.- P.109-116.

258.Schlotterer C., Tautz D. Slippage synthesis of simple sequence DNA// Nucl.Acids Res.- 1992.- V.20.- P.211-215.

259.Shigyo M. Miyazaki S., Isshiki S. et al. Assignment of randomly amplified polymorphic DNA markers to all chromosomes of shallot (A. cepa L. Aggregatum group)// Gen.Genet.Syst.- 1997.- V.72.- N4.- P.249-252.

260.Shigyo M., Tashiro Y., Miyazaki S. Chromosomal locations of glutamate oxaloacatate transaminase gene loci in Japanese bunching onion (Allium fistulosum L.) and shallot (A. cepa L. Aggregatum group)// Jpn.J.Genet.- 1994.- V. 69.- P.417-424.

261.Shigyo M., Tashiro Y., Isshiki S. et al. Chromosomal locations of five isozyme gene loci (Lap-1, Got-1, 6-Pgdh-2, Adh-1 and Gdh-1) in shallot (A. cepa L. Aggregatum group)// Jpn.J.Genet. - 1995a.-V.70.- P.399-407.

262.Shigyo M., Tashiro Y., Isshiki S. et al. Chromosomal locations of isocitrate dehydrogenase and phosphoglucoisomerase gene loci in shallot (A. cepa L. Aggregatum group)//JpnJ.Genet.- 19956,- V.70. - P.627-632.

263.Shmikova N.A., Tjukavin G.B. Culture of unpollinated ovaries and ovules in bulb onion, carrot and cucumber// Plant Biotechnology and Genetic Engineering/ Abstr.of Internation.Symp.3.-6.10.1994, Kiev, Ukraine.- Kiev.- 1994,- P.114.

264.Shoemaker R.C. Role of molecular technologies in the seed industry// Proceed.of the 14th Annual Seed Technol.Conf./ Knapp A.D.(ed.).- Iowa, 1992.- P.43-74.

265.Schulz B., Westhal L., Wrike G. Linkage groups of isozymes, RFLP and RAPD markers in carrot (Daucus carota L. sativus)// Euphytica.- 1993/1994.- V.74.- N1/2.- P.67-76.

266.Simon P.W. Genetic variation in garlic// Proceed.of Nation.Onion Reseach conf.-Ithaca, N.Y.- 1993.- P. 184-191.

267.Simon P.W., Roberts P.A., Boiteux L.S. Germplasm sources, inheritance, and marker assisted selection for southern and northern nematodes in carrot// J.Appl.Genet.- 1997.-V.38A.- P.57-59.

268.Smith B.M., Godwin R.M., Harvey E. et al. Gynogenesis from whole flower buds in bulb onions {Allium cepa L.) and leeks {Allium porrum L.)// J.Genet.Breed.- 1991.- V.45.-P.353-358.

269.Smith J.S.C. Plant breeder's rights in the USA; changing approaches and appropriate technologies in support of germplasm enhancement// Plant Varieties and Seeds.- 1992.-V.5.- P.183-199.

270.Song K.M., Osborn T.C., Williams P.H. Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). 1.Genome evolution of diploid and amphidiploid species// Theor.Appl.Genet.- 1988 a.- V.75.- P.784-794.

271.Song K.M., Osborn T.C., Williams P.H. Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). 2.Preliminary analysis of subspecies within B. rapa (syn. campestris) and B. oleraceall Theor.Appl.Genet.- 1988 6.- V.76.-P.593-600.

272.Stallings R.L., Torney D.C., Hildebrand C.E. et al. Physical mapping of human chromosomes by repetitive sequence fingerprinting// Proc.Natl.Acad. Sci.USA.- 1990.-V.87.- P.6218-6222.

273.Staub J.E., Meglik V. Molecular genetic markers and their legal relevance for cultigen discrimination: A case study in cucumber// HortTechnology.- 1993.- V.3.- P.291-300.

274.Staub J.E., Box J., Meglic V. et al. Comparison of isozyme and random amplified polymorphic DNA data for determination intraspecific variation in Cucumis// Genet.Res.Crop Evol.- 1997.- V.44.- N2.- P.257-269.

275.Stuber C., Wendel J., Goodman M. et al. Techniques and scoring procedures for starch gel electrophoresis of enzymes from maize (Zea mays L.)H North.Carolina Agric.Res.Serv.Techn. Bull.- 1988.- V.286.- P.36-43.

276.Sunderland N., Dunwell J.M. Anter and Pollen culture// Tissue Culture and Plant Science. - Oxford.- 1977,- 233 p.

277.Tanhuanpaa P.K., Vilkki J.P., Vilkki H.J. Segregation and linkage analysis of DNA markers in microspore derived and F2 populations of oilseed rape (Brassica napus L.)// Euphytica.- 1993/1994.- V.74.- N1/2.- P.59-65.

278.Taylor B., Powell A. Isolation of plant DNA and RNA// Focus.- 1982.- V.4.- P.4.

279.Tanksley S.D., Miller J., Paterson A. et al. Molecular mapping of plant chromosomes// Chromosome structure and function/ Gustafson J.P., Appels R. (eds.).- New York: Plenum Press.-1987.- P. 157-173.

280.Tanksley S.D., Ganal M.W., Prince J.P. et al. High density linkage maps of tomato and potato genomes// Genetics.- 1992,- V.132.- P.l 141-1160.

281.Tanksley S.D., Grandillo S., Fulton T.M. et al. Advanced backcross QTL analysis in a cross between an elite processing line and its wild relative L. pimpinellifolium// TheorAppl.Genet.- 1996,- V.92.- N2,- P.213-224.

282.Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers// Nucl.Acids Res.- 1989,- V.17.- P.6463-6471.

283.Ting Y.C. Molecular markers of anther culture-derived plants// Maize Genet. Cooper. Newsletter.- 1994,- V.68.- P. 19-20.

284.Tjukavin G.B. Anter culture of carrot// Plant Biotechnology and Genetic Engineering/ Abstr.of Internation.Symp. 3.-6.10.1994, Kiev, Ukraine.- Kiev.- 1994.- P.158.

285.Traub H. The subgenera, sectiones and subsectiones of Allium L.// Ibid.- 1968.-V.24.- P.147-163.

286.Truksa M., Prochazka S. Potential use of RAPD markers in verification of cucumber hybrids//Rostl.Vyroba.- 1996,- V.42.- P.241-244.

287.Ulloa M. A cytogenetic, isozyme and morphological study on interspecific progenies from Allium fistulosumx A. cepa crosses: Ph.D.dissert.- New Mexico State Univer., 1993.

288.Ulloa M., Corgan J.N., Dunford M. Abnormailites and difficulties for gene introgression in A. fistulosum x A. cepa generated progenies// Proc.Nat.Onion Res.Confer.-Ithaca, N.Y., 1993.- P.137-144.

289.Vassart G., Georges M., Monsier R. et al. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA// Sci.- 1987.- V.235.- N4789.-P.683-684.

290.Vos P., Hogers R., Bleeker et al. AFLP: a new concept for DNA fingerprinting// Nucl.Acids Res.- 1995,- V.23.- P.4407-4414.

291.Vosa C. Heterochromatic patterns in allium. I The relationship between the species of the cepa group and its allies// Heredity.- 1976.- V.36.- P.3 83-392.

292.Vosman B., Arens P., Rus-Kortekaas W. et al. Identification of highly polymorphic DNA regions in tomato// Theor.Appl.Genet.- 1992.- V.85.- P.239-244

293 .Wang H., Qi M., Cutler A.J. A simple method of preparing plant samples for PCR// Nucl.Acids Res.- 1993,- V.21.- P.4153-4154.

294. Wang Z., Weber J.L., Zhong G. et al. Survey of plant short tandem repeats// Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.88.- P. 1-6.

295.Weeden N.F. Applications of isozymes in plant breeding// Plant Breedg.Revs./ JJanick (ed.). - 1989,- V.6.- P. 11-54.

296.Wei J.-Z., Campbell W.F., Wang R.R-C. Genetic variability in Russian wildrye (Psathyrostachys juncea) assessed by RAPD// Genet.Res.Crop Evol.- 1997.- V.44.- N2,-P.117-125.

297. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers// Nucleic Acids Res.- 1990.- V.18.- № 22,- P.7213-7218.

298.Westphal L., Wricke G. Genetic analysis of DIA, GOT and PGI isozyme loci in Daucus carota L. sativall Plant Breeding.- 1989.- V.102.- P.51-57.

299.Westpnal L., Wricke G. Genetic and linkage analysis of isozyme loci in Daucus carotaL.il Euphytica.- 1991.-V.56,- P.259-267.

300.Westphal L., Wricke G. Construction of a linkage map of Daucus carota L. sativus and its application for the mapping of disease resistance and restorer genes// J.Appl.Genet.-1997.- V.38A.- P.13-19.

301.Wetter L., Dyck J. Isozyme analysis of cultured cell and somatic hybrids// Handbook of plant cell culture/McMillan (ed.).- 1983.- V.L- P.607-628.

302.Wilkie S.E., Isaac P.G., Slater R.J. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.86.- P.497-504.

303.Williams C.E., St. Clair D.A. Phenetic relationships and level of variability detected by restriction fragment length and random amplified polymorphic DNA analysis of cultivated and wild accessions of Licopersicon esculentumll Genome.- 1993.- V.36.- P.619-630.

304.Williams J.G.K., Kubelik A.P., Livak K.J. et al. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res.- 1990.- V.18.- № 22.-P.6531-6535.

305.Wolff K., Zietkiewicz E., Hofstra H. Identification of chrysanthemum cultivars and stability of DNA fingerprint patterns// Theor.Appl.Genet.- 1995,- V.91.- P.439-447.

306.Xiaoying Zh., Yan L. Inbred testing of Chinese cabbage F1 varieties by peroxidase and esterase isozyme analysis//Acta Hort Sinica.- 1994.- V.21.- N1.- P.59-64.

307.Yang X., Quiros C.F. Identification and classification of celery cultivars with RAPD markers// Theor.Appl.Genet.- 1993.- V.86.- P.205-212.

308.Yang X., Quiros C.F. Construction of a genetic linkage map in celery using DNA-based markers// Genome.- 1995.- V.38.-N1.- P.36-44.

309.Yiang C., Lewis M.E., Sink K.C. Combined RAPD and RFLP molecular linkage map of asparagus// Genome.- 1997.- V.40.- P.69-76.

310.Yong-Ha P., Russell K. Effect of concentration of MgCl2 on random amplified DNA polymorphism// Bio/Technol.- 1994.- V.16.- P.652-656.

31 l.Yu K., Pauls K.P. Optimization of the PCR program for RAPD analysis// Nucl. Acids Res.- 1992.- V.20.- N10,- P.2606.

312.Zhu H., Qu F., Zhu L.-H. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using bensil chloride// Nucl.Acids Res.- 1993.- V.21.- N22,- P.5279-5280.

313.Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification// Genomics.- 1994,- V.20.-P.176-183.

ускорение селекции и уменьшение количества селекционного материала

4

генетический анамнез

гаметическая сегрегация

стабильные линии, выделенные из расщепляющихся генераций

гетерозисная селекция

гибридизация с диплоидными видами

полигаплоиды /

гетерозис (Зх)

моногаплоиды

моносомики

удвоение числа хромосом !

ГАПЛОИДЫ

карликовые и привлекательные формы декоративных видов

картирование генов

t

стабильные линии с мутантными _признаками_

определение рецессивных мутации

мутагенез

культура протопластов и клеток

1

мутагенез и селекция in vitro

регенерация растении

JE-

новые генотипы для селекции

Приложение 1. Схема 2. Гаплоиды в культуре тканей и их использование в генетике и селекции растений