Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Наумкина, Марина Алексеевна

• Наумкина, Марина Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Наумкина, Марина Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура генома вируса бешенства

2.2. Антигенные свойства вируса бешенства

2.3.География распространения бешенства

2.4. Эпизоотическая обстановка по бешенству

2.5. Диагностика бешенства

2.5.1. Диагностические методы, применяемые

для выявления вируса бешенства

2.5.2. Гибрццизация

2.5.3. Принцип метода ОТ-ПЦР

2.5.4. Практическое применение метода ПЦР

в диагностике бешенства

2.5.5. Альтернативные методы ПЦР

2.6. Филогенетический анализ генома лиссавирусов

2.6.1. Применение филогенетического анализа в

молекулярной эпизоотологии

2.6.2. Полиморфизм гена нуклеопротеина

вируса бешенства

2.6.3. Филогенетический аналго изолятов

первого генотипа вируса бешенства

2.6.4. Полиморфизм РиМгенов

вируса бешенства

2.6.5. Полиморфизм в-Ь генов

вируса бешенства

2.6.6. Сравнительный анализ Ь протеина

Мопопе|*а\лга1е8

2.7. Заключение по обзору литературы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.1.1. Штаммы

46

3.1.2. Ферменты

3.1.3. Реактивы

3.1.4. Среды

3.1.5. Лабораторное оборудование

3.2. Методы

3.2.1. Очистка вируса бешенства

3.2.2. Фенольно-детергегапый метод выделения РНК

3.2.3. Выделение РНК по Р. Chomezynski и Sacchi

3.2.4.Выделение РНК горячим фенолом

3.2.5. Синтез кДНК и клонирование

3.2.6. Трансформация в Е coli с применением СаС12

3.2.7. Постановка дот-тбридизации

3.2.8. Постановка ОТ-ПЦР

3.2.9. Компьютерный анализ, расчет олигонуклеотидов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЯВДОВАШЙ

4.1. Очистка вируса бешенства

4.2. Исследование полипептидного состава вируса бешенства

4.3. Результаты отработки методов выделения РНК

4.4. Клонирование фрагментов генома вируса

бешенства в плазмидаых векторах

4.5. Исследование экспрессии в клетках

Е coli гена нуклеопротеина

4.6. Разработка «Набора препаратов...» для выявления РНК

вируса бешенства методом дот-гибридизации

4.6.1. Конструирование ДНК-зондов, оптимизация

условий проведения дот-гибридизации

4.6.2. Определение чувствительности ДНК-зондов для

выявления РНК вируса бешенства

4.6.3. Определение специфичности ДНК-зондов для

выявления РНК вируса бешенства

4.6.4.Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт.ТС-80) в культуре клеток почки сайги с

помощью дот-гибридизации

4.6.5. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт.ТС-80) в мозге инфицированных мышей

с помощью дот-гибридизации

4.6.6. Выявление РНК вируса бешенства в пробах головного мозга инфицированных мышей, хранившихся при

температуре 8° -10° С, с помощью дот-гибрщщзации

4.6.7. Выявление РНК вируса бешенства в патологическом

материале с помощью дот-гибридизации

4.7. Разработка «Набора препаратов...» для идентификации вируса

бешенства с помощью ПЦР

4.8. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт. ТС-80)

в культуре клеток почки сайги методом ПЦР

4.9. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт. ТС-80)

в головном мозге инфицированных мышей с помощью ПЦР

4.10. Выявление РНК вируса бешенства в пробах головного мозга инфицированных мышей, хранившихся при

температуре 8° -10° С, с помощью ПЦР

4.11. Выявление РНК вируса бешенства в патологическом

материале с помощью ПЦР

4.12. Дифференциация полевых изолятов от вакцинных штаммов

вируса бешенства

4.13. Дифференциация вакцинных штаммов вируса бешенства

4.14. Стабильность генома вируса бешенства (штамм ТС-80)

при пассировании в культурах клеток ВНК-21 и ПС

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

9. ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. к. - аминокислота

Био-11-дУТФ- биотинилированный дезоксиуридин трифосфат БСА - бычий сывороточный альбумин ВБ - вирус бешенства ВБА - вирус болезни Ауески

ВНК-21 - культура клеток почки новорожденного хомяка ВСВ - вирус везикулярного стоматита г/м - головной мозг ДНК-аза - дезоксирибонуклеаза ДСН - додецилсульфат натрия дНТФ - дезоксинуклеотид трифосфаты ИПТГ - юопропил-бета-Д-тиогалактопиранозид ИФА - иммуноферментный анализ кДа - килодальтон кДНК - комплементарная ДНК к.кл. - культура клеток КЧС - классическая чума свиней МонАТ - моноклональные антитела ОТ-ПЦР - обратно транскриптазная ПЦР ОРТ - открытая рамка трансляции пкг - пикограмм п.о. -пар оснований ПС - культура клеток почки сайги ПЦР - полимеразная цепная реакцияп РНК-аза - рибонуклеаза СТЕ - Трис-ЭДГА-натриевый буфер т.п.о. - тысяч пар основашш тРНК - транспортная РНК ТЕ - трис-ЭДТА буфер ФСБ - фосфатно-солевой буфер ЭДТА - этилендиамннотетроацетат

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства»

1. ВВЕДЕНИЕ

Контроль за распространением бешенства продолжает оставаться актуальной проблемой во всем мире. Хотя диагностика бешенства за последние несколько десятилетий значительно усовершенствовалась, она все еще нуждается в разработке новых более чувствительных лабораторных методов. Классическая гистопатология оказалась недостаточно надежной. Внутримозговое заражение мышей все еще остается наиболее широко применяемым методом в диагностике бешенства. Однако главным недостатком биопробы остается длительный инкубационный период уличного бешенства у мышей (7-18 суток).

М.А. Селимовым, H.A. Хисматулиной, Р.Х. Юсуповым было показано, что в культуре клеток НГУК-1 (клетки невриномы Гассерова узла крысы) уличный рабический вирус может быть выделен в более ранние сроки (24-72 ч.), с последующим анализом по МФА. Данный метод выделения уличного вируса бешенства в культуре клеток НГУК-1 был рекомендован для внедрения в практику ветеринарных лабораторий

Одним из эффективных методов быстрой диагностики бешенства является иммуноферменгаый метод определения вирусных антигенов с использованием поликлональных и моноклональных антител. При использовании сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином пластин результат может быть получен спустя 3-4 часа после внесения исследуемого антигена. Метод ИФА позволяет выявлять рабический антиген с титром инфекционного вируса не менее 3,3 lg МЛД50/мл и процент выявления вируса бешенства составляет 94,2%. Следует отметить, что основным недостатком серологических методов и биопробы является то, что они не позволяют работать с деградированным патологическим материалом.

В последние годы, в связи с широким распространением арктического бешенства за пределы полярного круга, возрастает актуальность этой проблемы. А. Д. Ботвинкиным с сотрудниками с помощью набора моноклональных антител (36 МонАТ института Вистар, США, Wiktor et al., 1980; 36 МонАТ центральной ветеринарной лаборатории, Великобритания, King et al., 1990; МонАТ Р-41 исследовательского института вирусных болезней животных, Германия, Schneider et al., 1985), исследована антигенная вариабельность изолятов вируса бешенства, выделенных от животных и человека с 1969 по 1991 гг. из различных ландшафтно-географических зон России. Изоляты вируса бешенства первого серотипа были классифицированы на 9

антигенных вариантов, большинство которых связано с определенной территорией. Изоляты вируса бешенства, циркулирующею на северо-востоке нашей страны, имели общие эпитопы с изолятами с Аляски и северо-западных территорий Канады. Изоляты, имеющие маркер арктического варианта вируса бешенства, впервые были обнаружены в умеренных широтах России в виде отдельных очагов, наиболее крупный из которых находится в Прибалтийском регионе.

В Азиатской части Российской Федерации арктический вариант вируса бешенства обнаружены в горных районах на удалении до 1700 км от Северного полярного круга (Забайкалье, Тува, Якутия), в северо-западных районах России (Калининградская, Псковская, Ленинградская области), в Прибалтике и Белорусии - до 1000 км (А. Д. Ботвинкин, 1992 г.). На американском континенте арктический вирус бешенства также обнаружен не только на Аляске, Северо-Западных территориях Канады, но и в умеренных широтах - в штатах Онтарио, Квебек, Нью-Йорк, то есть до 50° северной широты (Smith, 1989).

Хотя вирус арктического бешенства не патогенен для человека, однако, дифференциация штаммов и изолятов классического и арктического бешенства, а также поиск генетических маркеров является важной задачей.

Анализ данных литературы показывает, что, несмотря на все преимущества традиционных методов даашостики бешенства, во многих лабораториях за рубежом и в нашей стране все шире и шире для лабораторной диагностики используются методы молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции. Преимуществом этих методов является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота и безопасность.

Методы ПЦР и молекулярной гибридизации имеют преимущество перед серологическими методами в тех случаях, когда выявление специфического антигена не дает четких результатов или невозможно выделить вирус в культуре клеток и лабораторных животных при исследовании деградировавших патматериалов.

В настоящее время ПЦР технологию применяют в комбинации с секвенированием, что делает ее незаменимым и очень чувствительным методом идентификации вируса и определения его родства в отношении других штаммов. Для сравнительной характеристики геномов штаммов вирусов также проводят рестрикционный анализ ПЦР продуктов.

Исходя из вышесказанного нами были поставлены следующие цели и задачи исследования. Целью данной рабош является разработка методов идентификации вируса бешенства на основе молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- провести клонирование фрагментов кДНК вируса бешенства в составе плазмидных векторов и отобрать клоны для конструирования ДНК-зондов;

оптимизировать условия проведения дот-гибридизации, определить специфичность ДНК-зондов и чувствительность метода молекулярной гибридизации для выявления РНК вируса бешенства в культуре клеток н в патологическом материале;

- подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома вируса бешенства, отработать методы подготовки проб и оптимизировать условия проведения ПЦР;

- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства;

- провести дифференциацию вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса бешенства на основе рестрикционного анализа ПЦР продуктов.

Научная новизна работы состоит в том, что:

- клонированы нуклеотидные последовательности генома вируса бешенства штамма ТС-80, разработаны условия постановки дот-гибридизации для идентификации вируса бешенства.

- определены праймеры и разработаны условия постановки ПЦР, позволяющие идентифицировать вирус бешенства в пробах патматериала.

- проведена дифференциация вакцинных штаммов вируса бешенства на основе рестрикционного анализа ПЦР продуктов. Установлена принадлежность штамма ТС-80 к генетической группе ERA.

- показана возможность дифференциации полевых изолятов арктического бешенства методом ПЦР.

Практическая значимость. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработаны: «Набор препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной гибридизации», «Набор препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом ПЦР». Проведены комиссионные испытания «Наборов препаратов...» для выявления РНК вируса

бешенства, разработаны методические указания по применению методов молекулярной гибридизации и ПЦР, которые утверждены на заседании ученого совета и подписаны директором ВНИИВВиМ (протокол № 6 от 09.07.98). «Наборы препаратов...» могут быть рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики болезни. Предложен способ дифференциации вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью рестрикционного анализа ПЦР - продуктов, который может быть использован для паспортизации производственных штаммов и контроля за изменениями вакцинных штаммов в процессе их хранении и культивирования.

На защиту выносятся следующие положения:

результаты разработки «Набора препаратов...» на основе метода молекулярной гибридизации для выявления РНК вируса бешенства;

результаты разработки «Набора препаратов ....» на основе полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса бешенства с использованием праймеров, комплементарных консервативной и вариабельной областям генома вируса бешенства;

результаты дифференциации вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью рестрикционного анализа ПЦР продуктов;

результаты исследований арктических изолятов вируса бешенства, выделенных из патологических материалов, и дифференциация их от вакцинных штаммов вируса бешенства методом ПЦР.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1996 -1998 г.г. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями (тема 01.03.02.М),

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседании ученого совета ВНИИВВиМ, 1998 г.; научных конференциях: ВНИИВиМ 1998г, институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН, г. Москва 1998г.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ в материалах научных конференций.

В выполнении отдельных разделов работы оказали помощь научный сотрудник лаб. Биофизики, кандидат биологических наук Пантюшенко М.С., младший научный сотрудник лаб. Диагностики Недосеков В.В., зав. отделом Республиканской ветеринарной лаборатории Саха (Якутия) Романова У.Н., которым автор выражает искреннюю признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 2.1. Структура генома вируса бешенства.

Вирус бешенства относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae, его геном представлен одноцепочечной негативной РНК длиной около 12 т.п.о. и кодирует 5 основных белков (Феннер Ф. 1977; Сюрин В.Н., 1991, 1998; Conzelmann К.К., 1990; Coslett D. G., 1980; Murphy F. A., 1995).

Общая схема организации генома вируса бешенства представлена на рис.1 (Murphy F. А., 1995; Conzelmann К.К., 1990).

Последоватльность генов вируса бешенства дидерная РНК

0123 45678 9 10 11 12 I_I_I_I_I_I_!_I I_[111

Размер генома вируса бешенства, т.п.о.

Рис.1. Структура генома вируса бешенства (F.A. Murphy 1995; К.К. Conzelmann 1990).

Белки вируса бешенства подразделяются на три функциональные группы: оболочечные (G u М), нуклеокапсидный белок (N) и РНК полимеразный комплекс, состоящий из L u NS белков. Белки N, NS, и L вместе с вирионной РНК образуют нуклеокапсвд, который окружен мембраной, содержащей трансмембранный гликопротеин G, ответственный за антигенные свойства вируса. Белок М локализован на внутренней стороне мембраны и связывает нуклеокапсид с цитоплазматическим доменом гликопротеина G (Сох J.H., 1981). Существование псевдогена (Т-пси), находящегося между G и L цистронами, является отличительной особенностью вируса бешенства от вируса везикулярного стоматита (Tordo N., 1986b, 1988).

3'

ч?

На З'-конце генома расположена лидерная РНК размером 57-58 нуклеотидов, обогащенная адениновыми остатками, которая участвует в транскрипции и в регуляции макромолекулярного синтеза хозяйских клеток (Meslin F.X., 1996; Rupprecht С.Е., 1994; Tordo N., 1986a).

За лидерной РНК расположен ген нуклеопротеина, кодирующий полипептид длиной в 450 аминокислот, который в позиции 389 п. о. содержит фосфорилированный остаток серина (Borhy Н., 1993; Kissi В., 1995; Meslin F.X., 1996; Sokol F., 1973; Tordo N., 1986a). Данный белок синтезируется в большом количестве при репродукции вируса бешенства в клетках и имеет значительную гомологию с N белком вируса везикулярного стоматита (Dietzschold В., 1987а; Tufferead С., 1985). N белок состоит из трех отдельных доменов - двух концевых и наиболее консервативного - центрального (Mannen К., 1991;

Crysler J.G., 1990; Nadin-Davis S. А., 1993). Во время морфогенеза вируса N белок тесно связан с вирионной РНК, защищая ее от действия рибонуклеаз, при этом он связывается как с позитивной, так и с негативной геномной РНК, формируя позитивный и негативный РНП (Meslin F.X., 1996; Sokol F., 1969; Wiktor T.J. 1973). В зрелом вирионе N белок является главным компонентом внутреннего спирального нуклеокапсида и участвует в регуляции транскрипции и репликации (Patton J.Т., 1984; Tordo N., 1986а)

Клонирование и секвестрование N гена лиссавирусов показало, что первичная структура N гена наиболее консервативна по сравнению с другими генами вируса бешенства, что свидетельствует о высоком уровне антигенной гомологии (Arai Y. Т., 1997; Dietzschold В., 1987b; Kissi В., 1995; Mannen К., 1991).

N белок играет важную роль в формировании клеточного иммунитета, в частности, взаимодействует с Т-хелперами (Dietzscold В., 1989; Ertl С. J., 1989,1991; Perrin P., 1991). Установлено, что вакцина, состоящая из N белка, может защищать животных, зараженных как гомо-, так и гетерологичными штаммами лиссавирусов (Fang Fu Z., 1991; Fekadu M., 1992; Lodmel D.L., 1992; Montanohirose J.A. 1995; Sumner J.W., 1991). Установлено, что N белок обладает свойствами суперантигена «Superantigen», который способен стимулировать иммунную систему организма без внутриклеточного процессинга (Lafon J., 1992;

Astoul E. 1996; Martinezarends A., 1997). Суперантигены - особая группа антигенов, характерной особенностью которых является способность вызывать активацию Т-лимфоцитов в дозах на несколько порядков ниже, чем известные митогены. Суперантигены отличаются от обычных антигенов способностью индуцировать пролиферацию всех Т-лимфоцитов, несущих соответствующий им тип TCR (тип Т-клеточного рецептора) независимо от их антигенной специфичности. В то время, как обычные антигены индуцируют пролиферацию 0,01% популяции Т-лимфоцитов, суперантигены - 20%, что обусловливает мощное воздействие последних на иммунную систему и их участие в патогенезе многих заболеваний (Васильева Г.И., 1998). Он может связываться с МНС 2 класса и Т клеточными рецепторами (Martinezarends А., 1995).

С помощью моноклональных антител (МонАТ) установлены 4 антигенных сайта N белка, при этом антигенные сайты 1 и 4 представляют собой линейные эпитопы, а сайты 2 и 3 N белка вируса бешенства являются конформационно зависимыми. МонАТ против N белка могут быть использованы для дифференциации, классификации диких изолятов вируса бешенства и типировании лиссавирусов (Minamoto N., 1994).

Вирус бешенства содержит высокогидрофильный фосфопротеин (NS или Ml) длиной в 297- 303 аминокислоты (Nadin-Davis S.A., 1997; Rupprecht С.Е., 1994). Полагают, что NS белок взаимодействует с РНК полимеразой и участвует в репликции вируса (Chenik М., 1994; Fu Z.F., 1994; Wunner W.H. 1991). NS-белок подразделяется на 2 вида NS-1 и NS-2. Молекулярная масса мажорного NS-1 белка равна 38 кДа, a NS-2 - 41 кДа, при этом аминокислоты - серии и треонин NS-1 белка содержат почти в 3 раза больше фосфата, чем у NS-2 белка (Larson J.K., 1990; Meslin F.X., 1996; Sagara J., 1992). Фосфорилирование сильно увеличивает общий отрицательный заряд бежа, который также повышается за счет высокого содержания кислых аминокислот (аспарагановой и глутаминовой). Аминокислотная последовательность NS белка представителей серотипов 1, 2, 4, 5 и 6 вируса бешенства имеет низкую гомологию с NS белком вируса Mokola (3 серотип) (Nadin-Davis S.A., 1997).

Два антигенных сайта NS бежа локализованы в позиции 75-90, а иммунодоминантные цитотоксичные эпитопы были идентифицированы в позициях 191206 (Chenik М., 1995; Larson J.K., 1990).

Матриксный (М или М2) белок длиной в 202 аминокислоты расположен между рибонуклеокапсидом и вирусной мембраной, и взаимодействует с цитоплазматическим доменом гликопротеина (Wunner W.H., 1991). На N-конце М белка находятся 40 аминокислотных остатков, обогащенные пролином, которые ингибируют транскрипцию и репликацию перед сборкой рибонуклеокапсида (Ito Y., 1996). Мажорная антигенная детерминанта, расположенная между 1 и 72 аминокислотными остатками, участвует в формировании иммунного ответа, а 19 гидрофобных ал^-шокпслотных остатков нейтральной области (позиции 89 -107) участвуют в закрепления бежа с мембраной вириона (Hiramatsu К. 1992; Meslin F.X., 1996; Nadin-Davis S.A. 1997). Кроме М белка в состав внутреннего слоя оболочки вириона входит белок А - клеточный актин с молекулярной массой 43 кДа, содержание которого составляет 1-5% от массы вирионных бежов (Sagara J., 1992).

Гликопротеин (G) является единственным гликозилированным белком, имеет молекулярный массу 65 кДа и составляет 44-47% от общего количества бежа вируса бешенства. Гликопротеин расположен на поверхности вируса и преставлен 450 тримерами, которые формируют шипы вириона (Gaudin Y.H., 1992; Schneider L.G.,1976). Гликопротеин является главным антигеном, который индуцирует вируснейтрализующие антитела и способен вызывать протективный иммунный ответ у животных от летальных доз уличного вируса бешенства (Сох 1977; Kawano 1990; Macfarlan 1984; Wiktor 1973).

Предшественник гликопротеина состоит из 524 аминокислот, от которого с N-конца отщепляется сигнальная последовательность из 19 аминокислот, формируя зрелый гликопротеин из 505 аминокислот. Гликопротеин вируса бешенства имеет 2-6 потенциально гликозилированных сайта, 12-16 высококонсервативных цистеиновых остатка, 2-3 гидрофобных повтора длиной в 7 а.к. (Coll J.M., 1995). Локализация сайтов гликозилирования варьирует в зависимости от штамма вируса ( Anilionis 1981; Gaudin 1991а; Conzelman 1990; Morimoto 1989; Tordo 1986b; Yelverton 1983).

Картирование функциональных доменов гликопротеина показано на рис.2 (ИирргесЫ С,Е., 1994).

(-19)-О

сигнальный антигенный антигенные

сегмент сайг II (34-42) сайт I сайт IV сайт III

ный домен

* - сайты гликозилированш (440 - 461)

Рис.2. Картирование функциональных доменов гликопротеина (Rupprecht С.Е.,1994)

Гликопротеин содержит три домена: N-концевой участок бежа (эктодомен) расположен до позиции 439; трансмембранный домен локализован между 440 и 461 а.к.; и С-концевой участок (эндодомен) расположен с 462 по 505 а. к. (Dietzschold 1983а). Эктодомен и эндодомен являются растворимой фракцией гликопротеина. Основные функциональные регионы, включая нейтрализуемые эпитопы, локализованны на эктодомене. Трансмембранный домен ацешлирован и, кроме выполнения функций мембранного заякоривания и внутриклеточного транспорта гликопротеина, необходим для формирования функциональной целостности белка, так как растворимые домены гликопротеина не способны индуцировать протективный иммунитет (Dietzschold 1983а). Эндодомен выполняет функции взаимодействия с М белком и внутриклеточного транспорта гликопротеина (Rupprecht С.Е.Д994).

Эктодомен гликопротеина (1-439) играет главную роль при взаимодействии вируса с рецепторами клеточной поверхности, как иницшфующий шаг вирусной инфекции, и связывание с нейтрализующими антителами. Три конформационных нейтрализуемых

эпитопа, картированных на эктодомене гликопротеина, обозначены как антигенные сайты I, П, III (Lafon et al. 1983). Исследование этих эпитопов выявило, что Ш сайт ответственен за патогенность вируса (Dietzschold et al. 1983b; Seif et al. 1985). Dietzschold et al. 1983b; Tuffereau et al., 1989 выяснили, что присутствие положительно заряженной аминокислоты (аргинин или лизин) в позиции 333 является необходимым условием для поражения нервных клеток. Замена аргинина в позиции 333 на глютамин или изолейцин понижает нейропатогенность и способность pH независимого слияния мембран (Dietzschold et al. 1983b, 1985; Gaudin Y.,1996; Momnoto et al. 1992 ; Seifet al. 1985).

Исследование аминокислотной последовательности гликопротеина вируса бешенства показало, что белок имеет регион, который определяет нейротропную природу вируса (Lentz et al. 1984,1985) (рис.2). Lentz с сотрудниками в 1984 году впервые отметили, что регион гликопротеина (189-214 а.к.) структурно напоминает токсическую петлю (петля 2) нейротоксина змеиного яда, которая связывается с сайтом ацетилхолина молекулы никотин-ацетилхолинового рецептора (nAChR). Полагают, что регион nAChR служит в качестве рецептора вируса бешенства (или кофактор рецептора) in vivo и подобный нейротоксину регион гликопротеина может участвовать в связывании или облегчать инвазию в nAChR чувствительные клетки.

2.2. Антигенные свойства вируса бешенства.

Вирион вируса бешенства содержит два главных антигена, один из которых представляет собой гликопротеин вирусной оболочки, второй - внутренний нуклеопротеид вириона. Гликопротеин оболочки вириона является структурным компонентом, индуцирующим образование вируснейтрализующих антител, которые имеют важное значение в иммунопрофилактике и обнаружении протективного вирусного антигена.

Исследованиями последних двух десятилетий установлены «классические» штаммы вируса бешенства и некоторые изоляты, выделенные на Африканском континенте, содержащие общий нуклеопротеиновый антиген, который обнаруживается

во всех серологических реакциях. Однако эти вирусы бешенства различаются при сравнении их в реакциях нейтрализации и перекрестной защиты, что свидетельствует об их антигенном различии. На основе данных анализа антигенных свойств и структуры генома Комитет экспертов ВОЗ по бешенству разделил все вирусы на 6 серотипов и генотипов (Murphy, С.М.1995). Патогенностью для человека из представителей рода Lissavirus обладают вирусы серотипов 1, 3—б (Пиле Р., 1996; Alexander R. А., 1972).

Прототипом первого серотипа является штамм CVS. Серотип I включает в себя полевые и лабораторные штаммы вируса классического бешенства, выделенные в разных частях мира, а также гооляты, полученные от грызунов в Центральной Европе.

Серотип П - Lagos bat virus. Впервые вирус был изолирован в 1956 г. от больной плотоядной летучей мыши Eidolon helvum в Нигерии. В 1974 г. аналогичный вирус был выделен от летучей мыши Micropterus pusillus в Центрально-Африканской республике. В Южно-Африканской республике имела место вспышка «бешенство-подобного» заболевания среди собак, причиной которой был вирус летучих мышей Lagos. Случаи выделения вируса летучих мышей Lagos от человека не описаны (Селимов М. А., 1978; Сюрин В.Н., 1998; Rupprecht С.Е.,1994). Вирус летучих мышей Lagos невозможно отличить от вируса бешенства по реакции иммунофлюоресценции (Rupprecht С.Е.Д994). Поэтому с целью дифференциальной диагностики необходимо выделение вируса с последующей постановкой реакции нейтрализации на мышах. Антирабические вакцины не создают иммунитета против вызываемой вирусом летучих мышей Lagos инфекции (King 1993).

Серотип III - Mokola virus. Вирус был впервые изолирован в Нигерии в 1968 г. из спинномозговой жидкости ребенка при легко протекавшем менингите (Aghomo H. О., 1990; Mercier, Y. J. 1997). Затем он был выделен в той же стране из мозга умершей девочки и из внутренних органов землеройки (Crocidura sp.), одного из своих естественных хозяев. Вирус Mokola имеет общий с классическим вирусом бешенства

нуклеопротеиновый антиген, но отличается по поверхностным антигенам. Поэтом}' он реагирует с сыворотками против вируса бешенства в РОС, реакциях преципитации и иммунофлюоресценции, но не в реакции нейтрализации (King 1988; Rupprecht С.Е.Д994). Установлена способность вируса Mokola вызывать напоминающее бешенство заболевание при экспериментальном заражении собак и обезьян. В нейронах головного мозга формируются структуры типа телец Негри. Вирус обнаруживается у инфицированных животных в слюнных железах (King 1991). У человека вирус Mokola может вызывать неврологические заболевания различной тяжести. Иммунизация антирабической вакциной не создает устойчивости к заражению вирусом Mokola.

Серотип IV - Duvenhage virus. Вирус впервые был изолирован в 1971 г. в ЮжноАфриканской республике из мозга человека, укушенного летучей мышью и погибшего от заболевания, по клинике неотличимого от бешенства (Cumming 1982). Позже вирус был обнаружен в той же стране у насекомоядной летучей мыши Minopterus schreibersi, а также в Зимбабве от летучей мыши Nicterus thebaica. С помощью РСК и реакции иммунофлюоресценции у вируса Duvenhage обнаруживаются общие антигены с вирусом Mokola и вирусом летучих мышей Lagos , от которых он отличается по реакции нейтрализации. С целью диагностики вирус изолируют заражением в мозг мышей-сосунков. Дифференцировать изолят от вируса бешенства необходимо в реакции нейтрализации с моноклональными антителами (Ruprecht 1991).

Серотипы V и VI - European bat virusl (EBV 1) и European bat viras2 (EBV 2). Циркуляция лиссавирусов среди плотоядных, насекомоядных и плотоядных летучих мышей в Южной и Северной Америке установлена давно. При этом все полученные до настоящего момента таоляты были идентифицированы как штаммы вируса бешенства. В Европе случаи выделения лиссавирусов от летучих мышей регистрируются с 1954 г., когда была обнаружена летучая мышь неидентифицированного вида с «бешенство-подобным» заболеванием в Гамбурге (Германия) (Amengyal В., 1997). Затем было описано выделение лиссавируса от летучей мыши Nyctalus noctula в Югославии, от Rhinolopus

ferramequinum в Турции, от Nyctalus noctula и Vespertilio murinus в бывшем СССР (Селимов М.А. 1987). Всего в 1954—1984 гг. в странах Западной Европы было зафиксировано 11 случаев «бешенство-подобных» заболеваний у летучих мышей. Начиная с 1985 г. инфекция начала распространяться в европейских странах -Нидерландах, Германии, Испании (1987 г.), Югославии и Франции (1989 г.), приняв характер эпизоотии (Bourhy Н.,1992). Если в 1985 г. было выявлено 15 инфицированных летучих мышей, то в 1986 г. —122, в 1987 г.— 142, в 1988 г. - 53, в 1989 г.-42 и в 1990 г. -40. Было установлено, что в Европе среди летучих мышей циркулируют два типа лиссавирусов — ЕВVI и EBV2. Они были обозначены как серотипы 5 (EBVI) и 6 (EBV2) группы бешенства и «бешенство-подобных» вирусов. При анализе генома лиссавирусов, EBVI оказался ближе вирусу Duvenhage, чем EBV2. Циркуляция EBVI была установлена среди 9 видов летучих мышей. Однако, основными носителями ЕВVI являются летучие мыши Eptesicus serotinus. Данный вирус был обнаружен в Германии, Нидерландах, Испании, Франции, Польше и на территории бывшего СССР. EBV2 циркулирует в основном среди летучих мышей рода Myotis (М. dasycneme, М. myotis, М. daubentoni); он был обнаружен в Нидерландах и Финляндии. На территории бывшего СССР случаи заболевания летучих мышей, вызванные EBVI, регистрировались на Украине и в России — в 1961 г. в Киеве, в 1981 г. в Новосибирской области, в 1985 г. в Омске, в 1991 г. - в Волынской области Украины (Селимов М.А. 1987).

Изучение способности антирабических вакцин создавать устойчивость к заражению вирусом, выделенным от летучей мыши в Гамбурге (EBV1), показало, что иммунитет к этому вирусу создает антирабическая вакцина из штамма Пастер, но не из штаммов Pitman-Moore и Fluiy НЕР (Lafon 1988).

2.3. География распространения бешенства.

В настоящее время бешенство известно на всех континентах земного шара и установлено у животных, относящихся более чем к 30 видам (Селимов М.А. 1987; Сюрин В.Н., 1998).

По оценкам специалистов, бешенство среди животных неодинаково широко распространено в странах мира и не везде в равной степени представляет опасность для сельскохозяйственных и промысловых животных и человека (Ведерников В.А., 1976). Сегодня известны районы мира, наиболее опасные по бешенству: значительные территории в Южной Америке, обширные районы США, Канады, Центральной Европы, некоторые регионы Африки и Среднего Востока (Ведерников В. А., 1974; Щербак Ю. Н. 1985). В зависимости от резервуара, особенностей течения, распространение бешенства в мировом масштабе условно принято делить на несколько ареалов (Селимое М.А. 1985; Ботвинкин А.Д., 1992).

1) Полярный ареал включает арктическую территорию бывшего СССР, Гренландию, Аляску, где в 60-90% случаев носительство вируса бешенства проявляется дикованием (у песцов). Известны случаи заболевания с летальным исходом людей, контактировавших с больными песцами (Чернявский В.Ф., 1985). 2) Западная,

Центральная Европа, азиатская часть бывшего СССР, США, Мексика входят в зону, характеризующуюся многочисленными резервуарами инфекций (куницы, лисы, волки, грызуны). Южная и Центральная Америка рассматриваются как самостоятельный тип природной очаговости, где резервуарами являются летучие мыши. 3) В Африканском ареале основным носителем вируса являются мангусты (Таршис 1990).

Ареал распространения вируса шире ареала болезни и очаги ее проявляются только там, где экономические условия обеспечивают его передачу. Известно также, что наряду с так называемым природным или «лесным» бешенством, на всем пространстве нозоареала в большей или меньшей степени распространено так называемое «городское» или «собачье» бешенство, очаги которого регистрируются в городах, поселках и сельских населенных пунктах. Основными носителями бешенства в этих очагах являются собаки. Нозоареал бешенства, так же как и отдельные его участки, занимающие различные по размерам территории, постоянно эволюционируют. Они увеличиваются или уменьшаются, периодически меняют форму - пульсируют (Ботвинкин А. Д., 1992).

Аналогичная ситуация имеет место и в других регионах мира. Страны, в которых собаки продолжают быть главным источником заражения человека бешенством, - это почти все страны Латинской Америки. Среднее годовое число сообщений о заболевании человека бешенством увеличилось от 258 в 1970-1979 гг. до 293 в 1980-1989 гг. Между 1990 и 1994 в трех странах - Бразилии, Мексике и Перу - насчитывалось 65% случаев бешенства человека от общего количества случаев в других странах (Ботвинкин А.Д., 1992; Селимов М.А. 1985). В ряде стран передача бешенства вампирными летучими мышами имеет важное значение для общественного здравоохранения и экономики. В Шри-Ланке отмечается высокая заболеваемость бешенством людей. За 1950-1975 гг. умерло 528 человек (Ведерников В. А., 1976).

Для большинства видов диких носителей вируса характерны как внутрипопуляционные, так и внутриареальные и даже межзональные миграции. Современная ситуация сложилась именно так потому, что основным носителем вируса вместо волка и собаки оказалась многочисленная популяция лисиц в связи со значительными антропогенными изменениями на континенте, вызванными Второй мировой войной и послевоенными урбаническими явлениями. Аналогичные явления имеют место и на многих территориях Северной Америки, где скунсы-носители вируса сменили во многих районах животных других видов (Тарпшс 1990).

2.4. Эпизоотическая обстановка по бешенству.

Современная эпизоотическая обстановка по бешенству характеризуется снижением роли собак как источника инфекции и значительным распространением этого заболевания среди диких плотоядных животных, в особенности лисиц. Имеются 2 формы эпизоотии бешенства: городская и лесная. При второй форме возбудитель циркулирует среда диких плотоядных по типу природно-очаговой инфекции. С 60-х гг. бешенство диких плотоядных снова стало преобладающим. Основным резервуаром и источником инфекции оказались рыжие лисицы, тогда как остальные дикие животные играют второстепенную роль. Чрезмерному увеличению численности лисиц способствовало истребление их естественных врагов - волков, рысей, медведей, орлов и других хищников. Установлено, что высокий

уровень поддержания и распространения эпизоотии бешенства среди лисиц появляется прежде всего на территориях с массовым распространением грызунов - основного источника корма для них. КРС заражается исключительно на пастбищах, входящих в ареалы проживания зараженных лисиц.

При лесном бешенстве у лисиц (40-80%) болезнь часто протекает хронически и латентно, обеспечивая персистенцию вируса в естественных условиях. Наоборот, бешенство собак в городских условиях, как правило, заканчивается их гибелью, так как механизм поддержания вируса иной и сводится к коротким циклам репродукции в организме и быстрой передаче восприимчивому организму.

В европейской части России, особенно в Центральном, Центрально-Черноземном, Поволжском и Уральском регионах, определяющую роль в распространении бешенства в настоящее время играют животные дикой фауны (Полюшкина Г. С., 1991, 1998). Калабековым М.И. приведена эпизоотическая ситуация по бешенству в Кабардино -Балкарии (Калабеков М.И., 1998), которая характеризуется периодичностью процесса эпизоотии, сезонной зависимостью (осень - весна) и явным преобладанием бешенства среди крупного рогатого скота.

Ситуация по бешенству в Московской области складывалась следующим образом. С 1950 по 1961 г. бешенство регистрировали регулярно среди собак и сельскохозяйстенных животных. Пик заболеваемости за указанные 10 лет пришелся на 1952 г. — было зарегистрировано 1129 случаев заболевания собак и 96 — сельскохозяйственных животных. Постепенно ситуация улучшилась: в 1958 г. отмечено всего 9 случаев, а в 1961 г.—1. С 1962 по 1975 г. случаи бешенства в Московской области не регистрировали. Однако с 1976 г. до настоящего времени область опять характеризуется неблагополучием по бешенству (Полюшкина Г. С., 1991, 1998).

Расширение объемов профилактической иммунизации и упорядочение содержания собак позволили в определенной мере сократить количество случаев бешенства среди них. В 1991 - 1995 годах в неблагополучных и угрожаемых по заболеванию районах внедрили пероральную вакцинацию диких плотоядных

животных, которую проводили в осенне-зимний период антирабической вирусвакциной для пероральной иммунизации диких плотоядных животных.

Таким образом, дикие плотоядные в настоящее время являются основным источником инфекции и определяют эпизоотическую ситуацию по бешенству. Поэтому, метод пероральной иммунизации диких плотоядных животных является эффективным средством борьбы с диким бешенством и применяется в неблагополучных по этому заболеванию местностях.

2.5. Диагностика бешенства.

2.5.1. Диагностические методы, применяемые для выявления вируса бешенства.

В течение последних 30 лет произошел значительный прогресс в диагностике бешенства (Бучнев КН., 1971; Сюрин В.Н., 1991, 1998; Хэритоненков И. Г., 1992; Ermine et al 1987; ВОЗ 1994; Grandien M., 1975; Bourhy et al., 1989; Sacramento 1991,1992). Классическая гистопатология не достаточно надежна (Atanasiu, 1975; Johnson, 1985). Внутримозговое заражение мышей (биопроба) все еще остается наиболее широко применяемым методом диагностики бешенства (Johnson 1973, 1985). Главный недостаток биопробы - это длительность, так как инкубационный период уличного бешенства у мышей обычно составляет 7-18 суток, поэтому мыши должны наблюдаться еще в течение 2-3 недель после развития симптомов бешенства. Кроме того, процент отрицательных результатов при постановке биопробы колеблется от 1,3 до 12 (Сюрин В.Н., 1991, 1998; Martin M., 1975). Для быстрой диагностики бешенства используются методы, основанные на выявлении вирусных антигенов с помощью поли-и моноклональных антител (Хисматуллина H.A., 1991; Ботвинкин А.Д., 1992; Мовсесянц A.A., 1991; Соло1уб Т.В., 1992а; ВОЗ 1994). Выявление нуклеопротеинового антигена в тканях мозга, определяемого методом флюоресцирующих антител (МФА) считается лучшим методом диагностики бешенства (Мовсесянц A.A., 1991; Соло1уб Т.В., 1992а; ВОЗ 1994; Davis С., 1997; Bourhy H., 1989; Hostnik P., 1997; Zavadova J., 1996;

Atanasiu, 1973; Last R.D.,1994). Выделение уличного бешенства из мозговых проб может также проводиться с помощью высоко чувствительных клеточных культур мышиной нейробластомы (Татаров А.Г., 1985; Meslin F.X.,1996). Однако выделение вируса бешенства при помощи культуры клеток в основном используется для подтверждения других диагностических тестов.

Одним из наиболее перспективных лабораторных методов обнаружения антител и индикации самого вируса является иммунно-ферментный анализ (Ботвинкин А.Д., 1987, 1988; Валшшша Т.В. 1992; Вишняков И.Ф., 1983; Цетлин Е.М., 1996; Esterhuysen J.J., 1995; Gamoh К., 1996; Jayakumar R., 1995,1996; Rooijakkers E.J.M., 1996). Данный тест пригоден для лабораторной диагностики бешенства у животных, его еще применяют для выявления антигена вируса бешенства в тканевых парафиновых срезах, фиксированных формалином (Sang Е., 1996). В 1987 году создан набор для быстрой иммуноферментной диагностики бешенства, приемлемый для эпизоотологических и лабораторных исследований (Сологуб Т.В., 1992b; Meslin F.X.,1996; ВОЗ 1994; Penin P., 1986). Вместе с тем следует отметить, что основным недостатком перечисленных серологических методов является то, что они не позволяют работать с разложившимся патологическим материалом.

Для типирования штаммов вируса бешенства вначале использовали метод серонейтрализации на мышах (Johnson et al., 1973; Smith et al., 1973). Однако данный метод не позволял получить точное различие между классическим бешенством и близкородственными вирусами. Только использование моноклональных антител сделало возможным более точное определение различий между серотипами и даже субтипами вируса бешенства (Грибенча С. В., 1991а, 1991b; Селимов М.А, 1987; Dietzschold, 1988; Flamand, 1980а, 1980b; Hamir A.N., 1995, 1996; King A.A., 1993; Montanohirose J.A., 1993; Smith, 1989; Vincent 1988; Wiktor, 1978, 1980). Применение клонирования и секвенирования генов вируса бешенства позволило существенно продвинуться вперед в изучении молекулярной структуры и механизмов изменчивости вируса (Conzelmann, 1990; Mercier P., 1997; Rayssiguer С., 1986; Tordo, 1988; Wunner,

1988). В настоящее время эти методы все шире используются для диагностических целей.

2.5.2. Гибридизация.

Метод молекулярной гибридизации успешно используется для диагностики различных инфекционных болезней (Ambinder, 1985; Berninger, 1982; Chou. 1983; Durst 1983; Flores, 1983; Hyppia,1985; Lowe, 1986; Myercon, 1984; Redfield, 1983; Roíbarí, 1925). Сущность метода основана та выявлении и идентификации вирусов с использование специфических ДНК зондов.

Alain Ermine, Noel Toedo и Henri Tsiang использовали метод дот-гибридизации для лабораторной диагностики с целью определения РНК вируса бешенства в головном мозге экспериментально зараженных мышей и мозговом патматериале (Ermine А., 1988). В качестве ДНК зонда использовали меченый Р32 фаг Mí3> несущий вставки размером 200-400 п.о., комплементарные различным генам вакцинного штамма вируса бешенства (PV штамм).

Была выявлена сильная перекрестная гибридизация между фиксированным штаммом вируса бешенством и уличными вирусами, что дало возможность использования ДНК зондов фиксированного штамма для выявления РНК полевых изолятов. Чувствительность метода составляла 80 нг суммарной РНК, выделенной из мозга мышей, инфицированных фиксированным вирусом. Была установлена корреляция данных по выделению вируса в клетках мышиной нейробластомы, выявлению антигена методами флуоресцирующих антител и дот-шбридизации.

Alan С. Jacson с сотрудниками использовали метод дот-гибридизации in situ для выявления РНК вируса бешенства в гистосрезах головного мозга (Jacson А. С., 1989). В качестве РНК зонда авторы использовали, меченные S35 и Н3 рекомбинантную пдазмиду, содержащую 96% кодирующей последовательности нуклеопротеина вируса бешенства (штамм ERA). Для конструирования РНК зонда фрагмент, размером 1,28 т.п. о. был встроен по Pst I u Асс I сайтам рестрикции в pGEM-2 вектор под контроль

промотора Т7 РНК-полимеразы. Была проведена сравнительная оценка результатов обнаружения РНК вируса бешенства при помощи гибридизации in situ. Выявление РНК вируса бешенства методом гибридизации in situ соответствует выявлению антигена, оцененного иммунопероксидазньш методом. Гибридизация in situ позволяет определять малое количество инфицированных клеток из общего числа. Это дает преимущество в диагностике на ранней стадии инфекции, когда в инфекционный процесс вовлечено малое количество клеток.

Таким образом, в этом исследовании показано, что РНК вируса бешенства может быть выявлена в парафиновых фиксированных срезах тканей при использовании чувствительного и специфичного метода гибридизации in situ.

В следующей статье Alan С. Jacson с сотрудниками пишут об использовании метода гибридизации in situ для изучения репродукции вируса бешенства в инфицированном мозге мыши и человека (Jacson А. С., 1991). Они использовали меченые Н1 одноцепочечные РНК зонды, комплементарные генам 5-ти белков вируса бешенства (N, NS, М, G и L). Исследование проводили с фиксированным штаммом (CVS) и уличными штаммами вируса бешенства.

В этом исследовании обнаружился высокий уровень репликации в мозге мышей, инфицированных штаммом CVS. Сигналы, полученные с зондами, специфичными к мРНК, распределялись диффузно в дендритах инфицированных нейронов, тогда как сигналы, полученные с зондами, специфичными к геномной РНК, имели локальное распределение в инфицированных нейронах.

Основное различие, наблюдаемое при инфицировании мышей уличными штаммами вируса бешенства, было связано с уменьшением количества инфицированных нейронов и снижением сигналов гибридизации для мРНК и геномной РНК. Для уличного вируса количество сигналов для мРНК было также больше, чем для геномной РНК, что отражает эффективность транскрипции. Недостаток локального распределения геномной РНК для уличного вируса бешенства может также являться фундаментальным отличием в вирусной репликации.

Авторы использовали гибридизацию in situ для ретроспектавной диагностики -выявление РНК вируса бешенства в мозге людей, умерших от бешенства, в гистологических срезах, хранившихся несколько лет и получили неожиданные результаты - количество вирионной РНК было больше, чем мРНК. Это может объясняться тем, что после смерти идет деградация мРНК в результате действия РНКаз или лизиса клеток во время подготовки срезов, в то время как вирионная РНК защищена нуклеокапсидным бежом. Ermine et al. методом гибридизации определили, что значительная деградация РНК вируса бешенства в мозге инфицированных мышей начинается не раньше, чем через 120 ч после смерти (Ermine et al., 1987).

Таким образом, гибридизация in situ может применяться в отдельных случаях, когда выявление специфического ангагена не дает четких результатов и невозможно выделить вирус в культуре клеток или на лабораторных животных. Кроме того, фиксированные формалином образцы тканей могут храниться в течение многих лет. Поэтому гибридизацию in situ можно применять для ретроспективной диагностики, а также в исследовании молекулярных механизмов патогенеза инфекции in vivo с использованием РНК зондов, комплементарных различным генам вируса бешенства.

2.5.3.Принцип метода ОТ-ПЦР.

В настоящее время ОТ-ПЦР уже широко используется в мире в диагностических целях (Belak S., 1993; Benmansour А., 1992; Heaton P.R., 1997; Kamolvarin N., 1993; Mccoll К.A., 1993; Nadin-Davis S.A., 1993, 1994, 1996; Sacramento D., 1991, 1992; Tordo N., 1993; Whitby J.E.,1997). Обратно-транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР) состоит из двух этапов. Первый - это синтез комплементарной ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы и затравки, второй - амплификация гена или его фрагментов при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы и коротких олигонуклеотидных 20-30 членных затравок (праймеров), комплементарных 3' - концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена. Повторяя стадии денатурации, отжига праймеров и полимеризации (достройка праймеров) 30 -35 раз за 2-3 часа

получают миллионы копий специфического участка генома вирусов и бактерий (Федоров H.A., 1996).

2.5.4. Практическое применение метода ПЦР в диагностике бешенства.

ПЦР становится важным диагностическим инструментом в ветеринарной вирусологии (Belak S., 1993). Ранее применяемые лабораторные методы диагностики бешенства остаются трудоемкими и недостаточно эффективными. Кроме того, ПЦР позволяет проводить молекумрно-зпизоотологические исследования при анализе инфекционных штаммов без предварительной адаптации к клеточным культурам (Benmansour А., 1992). За последние годы накапливается все больше сообщений о применении ПЦР в диагностике бешенства (Belak S., 1993; Benmansour А., 1992; Heaton P.R., 1997; Kamolvarin N., 1993; Mccoll KA., 1993; Nadin-Davis S.A., 1993, 1994, 1996; Tordo N., 1993; Whitby J.E., 1997).

Kamolvarin N., Tirawatnpong Т., Rattanasiwamoke R., Tirawatnpong S., Panpanich Т., Hemachudha Т. сообщили о диагностике бешенства с использованием гнездовых праймеров (Kamolvarin N., 1993). Суммарную РНК выделяли из мозга животных и человека фенол-хлороформ экстракцией с использованием гуанидин тиоционата. Для амплификации использовали гнездовые праймеры, фланкирующие ген нуклеопротеина вируса бешенства. Для исследования использовали пробы мозга 95 собак и 3 человек, для которых диагноз был подтвержен методами МФА и биопробой. В качестве отрицательных контролей использовали пробы мозга 110 собак и двух человек. Весь процесс занимал менее 24 часов. Выявление РНК вируса бешенства было также возможным в мозговом материале, который хранился при комнатной температуре в течение 72 часов. Чувствительность метода составляла 8 пикограмм РНК вируса бешенства. Этот метод был предложен для применения в диагностических центрах по бешенству вместо МФА (Kamolvarin N., 1993).

Исследователи Mccoll К. A. et al. сообщили о сравнительной оценке метода ПЦР с другими лабораторными методами при анализе проб крови и посмертных образцов

тканей 10 - летней девочки (Mccoll К.А., 1993). Клинические признаки и гистопатологоанатомические результаты наводили на мысль, что это бешенство, но необычайно длинный инкубационный период (в течение 5 лет) не позволял поставить этот диагноз. Серологические исследования, проведенные во время 10 - дневного периода в госпитале, и посмертный анализ проб мозга методом МФА также подтверждали диагноз бешенства. Для подтверждения этих результатов использовали метод ПНР с праймерами комплементарными последовательностям нуклеопротеина и гликопротеина штамма Pasteur virus. ПЦР продукты, размером 513 и 403 и.о. исследуемой пробы были затем секвенированы. При сравнении последовательностей опытного образца и втамш. PY вируса бешенства удалось точно поставить диагноз бешенства. Таким образом, этот случай продемонстрировал, что в сложных случаях диагностики бешенства применение ПЦР с последующим секвестрованием позволяет точно поставить диагноз.

Метод ПЦР применяют также и для штаммовой дифференциации вируса бешенства (Arai Y. Т., 1997; Nadin-Davis S.A., 1993,1994,1996; Sacramento D., 1992). В частности, Nadin-Davis S.A. et al. сообщили о применении ПЦР для исследования штаммов вируса бешенства, выделенных от енотов, в Онтарио (Nadin-Davis S.A., 1996). В начале 50-х бешенство енотов определили как отдельный эпизоотический вирус во Флориде, затем он широко распространился по всему восточному побережью США и сейчас угрожает выйти в южные регионы Канады. Для более детальной характеристики этих штаммов провели секвенирование нуклеотидных последовательностей N и G генов. На основе анализа этих последовательностей провели физическое картирование N гена, что позволило с помощью молекулярной техники идентифицировать этот штамм. При сравнении нуклеотидных и аминокислотных последовательностей нуклеопротеина и гликопротеина, исследуемых штаммов бешенства, были выявлены различия в консервативной области генома для штамма бешенства енотов. Эта информация была использована для подбора специфических

праймеров к ген}' нуклеопротеина, что позволило легко и быстро различать бешенство енотов в Онтарио.

Метод ПНР был использован и для определения б генотипов рода лиссавирусов, распространенных на большинстве континентах мира (Tordo N., 1993). Heaton P.R, et al. описали чувствительный и быстрый метод ОТ-ПЦР для определения бешенства и родственных бешенству вирусов (Heaton P.R., 1997). Шестьдесят изолятов, относящихся к 6 генотипам лиссавирусов, были успешно определены при помощи ОТ-ПЦР и Саузерн блот гибридизации. Сравнение результатов, полученных с помощью стандартного метода флюоресцирующих антител (МФА) и ОТ-ПЦР показало, что МФА не выявляет вирусный антиген в тканях мозга после 72 часов хранения его при 37°С, в то время как ОТ-ПЦР выявляет вирусную РНК даже через 360 часов инкубации мозга при той же температуре (Heaton P.R., 1997).

Таким образом, из приведенных сообщений можно сделать вывод, что метод полимеразной цепной реакции является чувствительным, высокоспецифичным и быстрым. Он незаменим в трудных случаях диагностики и позволяет проводить дифференциальную диагностику и типирование штаммов. Все вышеприведенные данные позволяют нам рекомендовать метод ПЦР для лабораторной диагностики.

2.5.5. Альтернативные методы ПЦР.

В последнее время появилось множество модификаций ПЦР.

1. Лигазная цепная реакция (ЛЦР). Принцип аналогичен ПЦР, но вместо Taq-ДНК-полимеразы и дНТФ используется термостабильная лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу, одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов. Для

быстрого количественного обнаружения лишрованных олигонуклеотидов применяют 2 метки: биотин на одном конце, а флуоресцеин - на другом конце лишрованных олигонуклеотидов, поэтом}7 они связываются антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета. Нелигированные олигонуклеотиды с флуоресцеиновой меткой будут фиксироваться антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности, но они лишены биотина, который содержат другие нелигированные олигонуклеотиды, не фиксирующиеся на поверхности, и поэтому они детектироваться не будут (Lee Н., 1992).

2. Каталитическая амплификационная система, или циклическая зондовая технология (ЦЗТ), является противоположной ЛЦР, поскольку принцип состоит не в сшивании двух ожтгонуклеотидных зондов, а напротив, в расщеплении рибонуклеотидной комплементарной вставки при помощи фермента РНК-азы Н и получении из одного длинного ДНК-РНК-ДНК-зонда двух коротких ДНК-овых олигонуклеотидов, которые затем детектируются одним универсальным дезоксинуклеотидньш зондом, коньюгированным с маркерным ферментом. Достоинства метода заключаются в изотермальности реакции, исключении возможности перекрестной контаминации, быстроте проведения (менее 1 часа) и, наконец, в осуществимости полной автоматизации. Метод разработан канадской фирмой Ш Biomedical Corporation (8855 Northbrook Court, Burnaby BCV 5J5G1, Canada). Аналогичный вариант был описан Р. Duck, G. Alvarado-Urbina, B. Burdick и В. Collier в 1990 г (P.Duck, 1990).

3. Фирма Gen-Trak разработала автоматическую систему для детектирования инфекционных агентов путем амплификации специфического РНК-вого зонда со специфической вторичной структурой (это короткие молекулы РНК, появляющиеся в инфицированных РНК-овыми фагами Е. coli). Выделенная специфическая Q-beta-репликаза из Т7 фашнфицированных Е. coli экспоненциально реплицирует такие короткие РНК с разветвленной вторичной структурой очень быстро: 100000000 копий менее, чем за 15 секунд.

Р.М Lizardi и F.R. Kramer создали рекомбинантную молекул)' РНК, которая в

составе MDV-1 РНК содержала 30-нуклеотидную вставку-зонд, комплементарную РНК HTV-1, способную реплицировать Q-beta-репликазой в количестве, пропорциональном количеству присутствующих копий HTV-1. Показана линейная зависимость между числом копий HTV-1 и временем, необходимым для синтеза 1,6 нг РНК (P.M.Lizardi, 1991).

4. Совершенно оригинальным и наиболее универсальным методом амплификации как ДНК, так и РНК-матриц, является разработанный за последние несколько лет NASBA-метод (Nucleic Acids Seaquence Based Amplification), который запатентован канадской фирмой Cangene corporation, уже предложившей ряд NASBA-диагностических тест-систем, производимых фирмой «Organon Teknika» (Kitvits Т., 1991).

NASBA - метод, в отличие от ПЦР, является изотермальным, и амплификация матриц РНК или ДНК производится при 41° С. Детекция амплифицированной РНК осуществляется гибридизацией с конъюгатом зонда с пероксидазой и последующим разделением электрофорезом в полиакриламидном геле. Чувствительность NASBA -теста на HTV-1 РНК составляет 10-100 молекул в пробирке, время - 5 часов, включая подготовку материала (Kievits Т. et al., 1991). NASBA в 1000 раз более эффективна, чем ПЦР. Основными компонентами NASBA-системы являются ферменты Т7 РНК-полимераза, РНК-аза Н и обратная транскриптаза AMV (avian myeloblastosis virus), два специфических праймера нуклеозид-трифосфаты и буфер с добавками, праймер 1 длиной около 45 оснований, примерно 20 из которых на З'-конце комплементарны концу матрицы, а 5'-конец праймера содержит последовательность промотора, которая распознается Т7 РНК-полимеразой, и праймер 2 длиной около 20 оснований, комплементарный антипараллельной цепи матрицы (5'-направлсние).

Уменьшение числа циклов с 20-30 (ПЦР) до 5 (NASBA) уменьшает накопление повреждений матриц и ферментов, а значит, и накопление ошибочных копий.

2.6. Филогенетический анализ генома лиссавирусов.

2.6.1. Применение филогенетического анализа в молекулярной эпизоотологии.

В последнее десятилетие метод полимеразной цепной реакции, с последующим анализом нуклеотидной последовательности широко используется для точной идентификации вирусов и определения их родства в отношении других штаммов (Hass L., 1997). Для сравнительной характеристики геномов различных штаммов вирусов также проводят рестрикционный анализ ГЩР продуктов. Обычно для построения филогенетического дерева используются данные последовательностей нуклеиновых кислот (Felsenstem, 1988). Филогенетическое дерево очень ясно показывает родство между вирусами, если анализируется большое количество изолятов, для этих целей существует много компьютерных программ. Наиболее популярные пакеты программ -PHYLIP (PHYLogeny Inference Package; Felsenstein, 1993); PAUP (Phylogentic Analysis Using Parsimong; Swofford, 1991); CLUSTAL (Higgins and Sharp, 1989) и MEGA (Kumar et al, 1994).

В настоящее время существует большое количество литературы по молекулярной эпизоотологии, особенно инфекций, вызванных РНК-содержащими вирусами. Прежде всего, это вызвано большими генетическими различиями в РНК- содержащих вирусах, которые существуют как гетерогенные популяции (Holland et al., 1992). Геном РНК-содержащих вирусов по сравнению с ДНК- содержащими вирусами более генетически пластичен, что служит основой для их эволюции, и объясняется это недостаточной системой репарации (Domingo et al., 1996а). Средняя частота ошибок при репликации вирусной РНК или обратной транскрипции составляет 10"3 - 10"5. Генетическая гетерогенность, быстрая эволюция, и в результате антигенное расхождение, является для вируса бешенства значительной возможностью, чтобы занять новую экологическую нишу.

2.6.2. Полиморфизм гена нуклеопротеина вируса бешенства.

Ряд исследователей провели филогенетический анализ представителей лиссавирусов, используя каждый из 5 генов (Arai Y. Т., 1997; Bemnansour М., 1992; Bourhy

H., 1992, 1993, 1995; Heaton-PR 1997; Kisse В., 1995; Lemercier P., 1997; Mccoll K.A., 1993; Mebatsion T, 1993; Moiimoto K., 1996; Nadin-Davis S, A., 1993, 1994, 1996, 1997; Ne! L.H., 1993; Qian Aidong, 1997; Sacramento D.,1992; Tordo N. 1993; Vonteichman B.F., 1995; Whitby J.E., 1997). Предварительные исследования N и G антигенов ясно показали антигенные различия в штаммах вируса бешенства (Bourhy H., 1992; King A.A., 1993; Montanohirose J.A., 1993; Sureau P., 1983; Wiktor T.J., 1980).

S. A. Nadin-Davis et al. исследовали варианты вируса бешенства в канадской провинции Онтарио (Nadin-Davis S. А., 1993, 1994, 1996). Для этих целей использовали амплификацию N гена нескольких независимых изолятов и проводили рестрикционный анализ ПЦР продуктов, а в некоторых случаях -секвенирование. Этот анализ выявил большую зависимость различий в геноме от географической локализации, чем от хозяйской специфичности.

Бешенство в Канаде носило персистентный характер только с конца 1940-х и до конца 1950-х при передвижении лис на юг, из Арктики в Канадские провинции (Rosatte R.C. 1988).

С помощью панели моноклональных антител к эпитопам вируса бешенства провели видо-специфическую дифференциацию вируса распространенного среда наземных животных в Онтарио (Webster et al., 1985). Преобладающий вирус в Онтарио назван «Canadian Arctic». В течение ряда лет в этой области были выявлены несколько антигенных вариантов вируса, которые в некоторых клеточных линиях демонстрировали различные ростовые характеристики (Webster W. А., 1986).

Mannen К. et al, 1991г. определили большую зависимость различий в N гене от географической локализации, чем от хозяйской специфичности (Mannen К., 1991). В Онтарио вирус бешенства, который описан как единственный «Арктический» тип, разделили на 4 основных типа. Эти типы филогенетически разветвляются на две основные ветви, одна из которых составляет 1 тип, вторая три остальных типа, что отражает историческое передвижение вируса в регионе. От середины к концу 1950-х эпизоотия передвигалась на юг Онтарио с Севера Онтарио и Quebec. Изменения в последовательности N гена, определенных для 4 вирусных типов могут представлять

генетический маркер для более существенных изменений в других частях вирусного генома.

Kissi et al представили первое сравнение между генотипами и молекулярными различиями N гена внутри первого генотипа (Kissi В., 1995). Филогенетический анализ гена нуклеопротеина 82 лиссавирусов подтвердил существование б генотипов лиссавирусов (Bourhy et al., 1993), и также выделил изоляты бешенства 1-го генотипа в отдельные генетические линии. Из представленных в их статье сведений о N гене, можно сделать заключение, что изоляты с меньшей чем 80% нуклеотидной и 92% аминокислотной гомологией относятся к различным генотипам. В их исследовании также показано, что два коротких региона из 400 нуклеотидов, кодирующих аминоконец N протеина, и 93 нуклеотида, кодирующих N-M1 регион, могут быть использованы для определения географического распределения основных вирусных линий. Эти короткие и вариабельные регионы могут быть рекомендованы для упрощенного филогенетического анализа большого числа проб, когда требуется получение быстрой информации.

Сравнение последовательностей гена нуклеопротеина 50 изолятов и 11 лабораторных штаммов, подтвердили существование 6 различных генотипов лиссавирусов.

Выявлено два региона, имеющих наименьший уровень гомологии: участок длинной в 199 пар оснований (нуклеотиды от 1080 до 1278) и более протяженный фрагмент, расположенный между 99 и 405 нуклеотидами. Филогенетическое дерево построили, используя пакет программ MEGA (Kumar et al., 1994). С их помощью получили дерево с ветвями, делящимися на 6 кластеров, которые соответствуют 6 генотипам, описанных в предыдущих сообщениях (Bourhy et al., 1993) (рис.3). Сравнение изолятов показало, что в генетическом плане наиболее близкими оказались 4 и 5 генотипы, у которых уровень различий составил 79,8% (нуклеотидный уровень) и 93,3% (аминокислотный уровень) [Duvenhage virus (4 генотип) и EBL1 (5 генотип)]. Внутри генотипа 1, наименьшее сходство среди изолятов из Азии и Латинской Америки - 83,3%; и наибольшее сходство в изолятах из Африки и Латинской Америки - 92,2%.

5 2

Рис.3. Филогенетическое дерево лиссавирусов на основе нуклеотадной и аминокислоной последовательностей N-гена и N-белка, соответственно (Kissi В., 1995). (слева - на основе нуклеотадной последовательности N гена; справа - на основе аминокислотной последовательности N белка).

Совсем недавно были классифицированы лиссавирусы европейских летучих мышей (Anon, 1995; Bourhy et al., 1992, 1993; Kappeler, A. 1989; King, A. 1988, 1990; Selimov, M. A., 1989, 1990). Amengyal В., et al. провели работу по изучению эволюции этих лиссавирусов (Amengyal., 1997). Были отобраны сорок семь лиссавирусов от Европейских насекомоядных летучих мышей и Африканских насекомоядных летучих мышей для сравнения их эволюционного родства. Исследование было основано на прямом секвенировании ПЦР продуктов - 400 нуклеотидов, кодирующих амино-конец нуклеопротеина. Анализировали как нуклеотидные, так и аминокислотные последовательности этих вирусов, выделенных в три кластера, названных генотип 4, (Duvenhage), генотип 5 (EBL1) и генотип 6 (EBL2). Эволюционный анализ нуклеопротеинового гена генотипов EBL1 и EBL2 выявил низкую внутреннюю гетерогенность, обусловленную, главным образом, синонимическими заменами. Вдобавок, оба генотипа, EBL1 и EBL2, развивались в двух наименее генетически различимых линиях (а и в), следуя географическому дрейфу. Возможно, что эти линии EBLla и EBLIb были занесены в часть северной Европы из двух различных географических направлений: EBLIb, полагают, был внесен совсем недавно из Северной

Африки. Eptesicus serotinus - основной резервуар для EBL1 и Myotis dasycheme и М. dacbentoniu - резервуары для EBL2.

2.6.3. Филогенетический анализ изолятов первого генотипа вируса бешенства.

Kissi et al. идентифицировали 11 филогенетических линий, взятых в соответствии с их географическим происхождением и видом хозяина. Эти линии были названы в соответствии с их географическим распределением: Африка 1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азия, Арктика, Европа / Средний Восток, Латинская Америка 1 и Латинская Америка 2 и две группы вакцинных штаммов. Филогенетическое дерево строилось на основании сравнения фрагмента или целого N гена (King et al., 1994).

Этот анализ позволил более точно определить циркуляцию по зонам и установить происхождение и распространение бешенства для некоторых линий, которые, возможно, произошли независимо на этом континенте различных предшественников. Хотя циркуляция Африканских вирусов 1а и 1в была отлична от вирусов, распространенных в Европе и Среднем Востоке, однако выявлена генетическая связь между ними, что свидетельствует об общем предке. (Smith et al., 1992, Clark and Wiktor, 1972, Lafon et al., 1988, Sacramento et al., 1992, Smith et al., 1992).

Исследование вариабельности последовательности из 1443 оснований, включающей полный ген нуклеопротеина и смежные некодируемые последовательности, обнаружило три высоковариабельных региона. Два из них, кодирующих амино- и карбокси- концевые регионы нуклеопротеина, окружающих высококонсервативный центральный регион - общая черта для всех рабдовирусов, ранее исследованных (Tordo et al., 1986а, Bourhy et al., 1993). Третий регион, который был наиболее вариабелен, соответствовал 3' некодируемой последовательности N мРНК, N-M1 интергенный регион, с 5' конца некодируемую последовательность Ml мРНК и включал транскрипционные сигнальные последовательности, которые соответствовали консенсусным последовательностям у ранее изученных лиссавирусов (Tordo et al., 1986а, Bourhy et al., 1993). Эта некодируемая последовательность характеризовалась частотой мутаций выше в

1,9 раз, чем у N кодируемой последовательности, что привело к повышению транскрипции в 3,1 раза. Подобный высокий уровень мутаций уже наблюдался в некодируемом регионе, отделенном G u L цистронамн, сравниваемый со смежным L протеин кодирующим регионом (Sacramento et al., 1992). Высокий уровень нуклеощдгшх замен, найденных в некодируемых последовательностях генома бешенства, согласовался с менее строгими требованиями для этих регионов и с нейтральными гипотетичными мутациями (Kimura, 1991; Li et al., 1981, Gojobori et al., 1990). Однако основа РНК замен в каждой генерации вируса бешенства была не случайна и согласно филогенетическим анализам происходила, как на кодируемых, так и на некодируемых регионах, и не подтверждала независимой эволюции этих регионов, в отличие от ранее опубликованных данных (Yamamoto and Yoshikura, 1986).

Данные по нуклеопротеину вируса бешенства, представленные Kissi et al, наводят на мысль, что он скорее подвержен стабилизирующей селекции, которая сохраняет оптимально приспособленный фенотип (Hughes and Nei, 1989). Накопление большинства нейтральных мутаций в географически разделенных вирусных популяциях привело к значительным расхождениям в нуклеотидной последовательности нуклеопротеина. Кумулятивный эффект несинонимических мутаций не ведет к изменениям эпитопов внутри каждого кластера, что подтверждает строгое торможение эволюции N гена. Это подтверждается для капсидных генов и у других РНК вирусов: везикуловирусы (Bilsel et al., 1990); восточный вирус энцефаломиелита (Weaver et al., 1991); ящур (Martínez et al., 1992) и лентивирусы (Myers et al., 1992). Однако, бешенство не следует образу эволюции N гена вируса гриппа A (Gorman et al., 1990,1991; Shu et al., 1993).

Результаты, полученные Kissi et al., подтвердили в своем исследовании группа ученых из Японии Y. Т. Arai, К. Yamada, Y. Kameoka, Т. Horimoto, К. Yamamoto, S.Yabe, M. Nakavama, and M. Tashiro (Arai Т., 1997). При исследовании гена нуклеопротеина 11 вирусов бешенства было выявлено 9 отдельных кластеров по гомологии < 90% региона N гена.

Кластер 1 - (4 изолята выделенные от енотов в США) наиболее отдален от других кластеров, полагают, что существует независимый трансмиссивный цикл в этом виде.

Кластер 2 сравнивался с двумя изолятами от летучих мышей вампиров в Бразилии и от собаки из Франции. Кластер 3 включал изолят из Египта и вакцинные штаммы SAD В 19 и PV. Изоляты из кластера 4 были наиболее географически разбросаны. Фиксированные штаммы, исключая Komatsugawa, включены в 4-й кластер. Вакцинные шт. HEP и LEP и CVS имеют высокую гомологию. Штамм М512 высоко гомологичен Европейским штаммам (из Польши, Франции, Германии). Штамм из Замбии был включен в кластер 4.

Интересно, что штамм Komatsugawa, который считают японским штаммом отнесен к 5 кластеру, куда входят вирусы из Арктики, Северной Америки и вирус выделенный от собаки в Непале.

Кластер 6 содержит 17 изолятов из Африки. Кластер 7 содержит 1 изолят от желтого мангуста, выделенный в Южной Африке (полагают, что он имеет независимый трансмиссивный цикл в этом виде животных).

Изоляты уличного бешенства из Тайланда, Малайзии формируют независимый кластер 8. Кластер 9 содержит единственный изолят от собаки из Шри-Ланки. Анализ этих данных с помощью компьютерной программы привел к заключению, что кластеры 8 и 9 наиболее сильно отличаются от кластеров 1,2,3,4,5,6,7, и к тому, что бешенство в Южной Азии образует уникальную групп}'.

Таким образом, варианты вируса бешенства, сгруппированые в соответствии с их географическим распространением, могут быть использованы для исследования эволюционного развития вируса бешенства.

2.6.4. Полиморфизм Р и М генов вируса бешенства.

В исследовании S.A. Nadin-Davis et al, 1997г. проанализированы Р и М гены вирусов бешенства, ответственных за эпизоотии в трех отдаленных регионах Северной Америки. Эти данные свидетельствуют, что М ген и его продукт более консервативны, чем Р reH(S.A. Nadin-Davis., 1997). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, полученных в этом исследовании, с данными предыдущих

исследований N u G генов, выявил такое же эволюционное родство, независимо от участков исследуемого генома (Hiramatsu, 1992).

Вариабельность Р и М генов для изолятов вирусов бешенства не была исследована, информация для этих генов имеется только для небольшого количества лабораторных штаммов (Hiramatsu К., 1993; Larson Ж.,1990), и Мокола вируса, который является представителем 3 серотипа (Bourhy Н., 1993). Nadm-Davis et al. охарактеризовали эти два гена для изолятов трех отдельных штаммов вируса бешенства. Туда включены образцы, названные арктическими штаммами вируса бешенства, которые циркулируют в популяциях красных и полярных лис в арктической зоне Северной Америки и в популяции красных лис в южном Онтарио (Tabel Н,1974); бешенство скунсов из Западной Канады, которое близко родственно к штаммам бешенства скунсов, преобладающих на севере центральных штатов США (Chariton К.М., 1988) и изолятам бешенства енотов, которое широко распространено в популяции енотов на восточном побережье США (Winkler W.G., 1991). Сравнение этих данных с последовательностями Р и М генов подтвердили ранее полученные филогенетические данные с другими регионами генома вируса бешенства.

2.6.5. Полиморфизм G - L генов вируса бешенства.

Teichman et al. (1995 г.) исследовали молекулярную эпизоотологию вируса бешенства в Южной Африке. Так как последовательность N гена использовалась для анализа более отдаленных вирусов, то авторы выбрали другие вариабельные последовательности для анализа более близкородстсвенных вирусов. Они амплифицировали и секвенировали G-L интергенный регион, который содержал псевдоген, обозначенный пси. Этот некодирующий регион показал высокий уровень случайных мутаций. Филогенетический анализ последовательности выявил два кластера. Первый кластер содержал вирусы, выделенные от представителей семейства собачьих (домашние собаки, шакалы, лисицы); второй кластер содержал вирусы, выделенные от

желтых мангустов. Три атипичных изолята, выделенных от собак, включили в группу вирусов, выделенных от мангустов. Авторы объяснили это ответвлением второй группы из первой.

Псевдорегион до этого использовался для эпидемиологических исследований вирусов бешенства, изолированных во Франции (Sacramento et al., 1992). Сравнение между 12 последовательностями полевых вирусов бешенства выявило сильную консервативность в этом регионе, независимо от хозяина и места выделения. В противовес внутренней гомогенности среди полевых изолятов (2% расхождения), авторы отметили значительные расхождения для вакцинных штаммов (14,7%).

Гомогенность среди полевых изолятов неожиданна, но логично предположить, что лисы являются переносчиками бешенства во Франции не более 20 лет. Обычно быстрая эволюция вирусной популяции происходит во время адаптации к новой окружающей среде, но в течение малочисленых пассажей в новых хозяевах изменения незначительны (Domingo et al., 1985; Holland et al 1989; Martinez etal., 1991).

Несмотря на очень низкое расхождение (в основном 1,8%, максимум 3,4%) гипервариабельного региона, окружающего псевдоген (приблизительно 7% генома), 12 полевых изолятов ясно различимы. Это подтверждает, что красные лисы во Франции ответственны за перенос вируса бешенства другим видам животных. Изоляты показали родство в соответсвии с их географическим распределением.

По сравнению с полевыми изолятами вакцинные штаммы отличались большим расхождением (около 14,7%) для ERA-SAD и PV-PAS групп. Такое расхождение не являлось неожиданным, потому что большинство вакцинных штаммов выделены 40-100 лет назад. Отмечено, что французские изоляты более близки к ERA-SAD и PV-PAS группам, чем к CVS (AvOl)-PM группам. Эти исследования также полезны для стран, где распространены лиссавирусы 2-4 серотипов, но безуспешно вакцинируют вакцинными штаммами 1 серотипа (Агау, 1989; Bock et al, 1988; Bourhy et al., 1988; Lafon et al., 1988; Tignor et al., 1972).

2.6.6. Сравнительный анализ L протеина Mononegavirales.

Интересное исследование провели P. Le Mercier, Y. Jacob and N. Tordo по сравнению L протеина вируса Мокола с другими полимеразами Mononegavirales (Mercier, Y. 1997). Особое внимание отведено большому, некодирующему белок - Y региону (504 нк), предшествующему L гену, найденному в геномах всех Лиссавирусов, остаточная функция которого неизвестна (Torio et al., 1986b). Профили, полученные при сравнении геномов вирусов Мокола и бешенства (PV штамм), показали, что некодирующие белок регионы менее консервативны, чем кодирующие (рис.4). Из кодирующих регионов самый консервативный N ген (81,7% а.к. гомологии), за ним L ген (77,9% гомологии), M (76,3%), G (58,4%) и Р (47,4%) гены.

Г еном

Положение нуклеотидов

Рис.4. Сравнительный анализ геномов вирусов бешенства (шт. PV) и Мокола (Mercier, Y. 1997).

Выведенная аминокислотная последовательность L протеина вируса Мокола размером (2126-2127), очень сходна с последовательностями 1 генотипа: вируса бешенства PV штамма (Tordo et al., 1988) u S AD В19 (Conzelman et al., 1990). Такое родство открывает новые перспективы для описания консервативных доменов и

понимания сущности функщюнальных мотивов в полимеразной активности. Предварительное сравнение L протеинов Mononegaviraîes ясно показало, что консервативность неравномерно распределяется по L гену, и выявлено б консервативных блоков (I -VI) (Tordo et al., 1988; Poch et al., 1990). На рисунке 5 показаны сравнительные карты L протеинов двух Лиссавирусов, 4 рабдовирусов и 7 Mononegaviraîes. Несмотря на понижение средних значений гомологии от 78% (Лиссавирусы) до 47% (Рабдовирусы) и 23% (Мононегавирусы), общий профиль остается похожим, и выделяет три принципиальных домена, определяющих высококонсервативные регионы.

(1) Наиболее дивергентный амино-конечный домен, имеет самый низкий уровень при сравнении мононегавирусов. Однако, этот домен включает в себя консервативный мотив - XNSPL" (позиции 38), радом с амино-концом (Poch et al., 1990). (2) Большой центральный «полимеразный» домен содержит Б-V блоки. Этот домен наиболее консервативный, хотя в блоке отмечены небольшие различия между профилями. (3) Большой карбокси-концевой домен, включающий блок VI, состоит из трех консервативных блоков в профиле Лиссавирусов, но становится очень дивергентным в профилях рабдовирусов и Mononegaviraîes, где только центральный домен сохраняет относительно высокий уровень. Такой регион, показывающий консервативность между семействами, наиболее вероятен для кодирования геноспецифических функций или определения специфических взаимодействий с различными генами или протеинами. В этом контексте, следовало бы отметить, что связывание L полимеразы с кофактором (вариабельным Р протеином) включает карбокси-концевой домен в VSV (Canter and Perrault, 1996) и дивергентный амино-концевой домен в вирусе кори (Horikami et al., 1994).Высококонсервативный L протеин, разделенный большой генетической дистанцией, является лучшей мишенью для филогенетических исследований. Например, L и N протеины почти равно консервативны среди Лиссавирусов (77,9% и 81,% ), но только L сохраняет значительную гомологию среди Mononegaviraîes.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей консервативного

L белок

1.0—LNSPL flllif ЕЙ^^ШЩ

IftlIiM

о

с о s

2

J3

X

©

m О

О S •

о.о-

•ЪЩттЛ' v-,

iwm

Лj У v

:||||||i ^fV- ~ - ---^aii^fu. ....... _

1V. : : XVtV.Î >ч>. Л l'ïi' . .taf iJ Vb

гЦ.

fi ^

Ki^Bi »

. iliheiivilsllffiw'l ^ l|i ш litaewi» /'

V

11 RI IV;

""г'Г.....

Ш

500 1000 1:500

Положение аминокислот

îûOO

Рис.5. Сравнительный анализ L протеина среди лиссавирусов (бешенства (PV шт.) и Мокола вирусов); рабдовирусов (лиссавирусов и везикуловирусов) и Mononegavirales (рабдовирусов, вируса Udem, болезни Ньюкасла и вируса Сендай) (Mercier, Y. 1997).

о

III блока Ь протеинов представителей Мопопе§а\ги'а1е& представлен на рис. 6. Филогенетическое дерево получено при сравнении семейств Мошл^алтгаЬБ: Рабдовирусов, Парамиксовирусов, Филовирусов и неклассифицированных вирусов болезни Борта. Интересно, что уровень расхождений Ъ протеинов значительно меньше среди лиссавирусов (22,1% между бешенством и Мокола), чем у везикуловирусов (34,8% между Индиана и Нью Джерси). sЭтo наводит на мысль, что Лиссавирусы могли более легко обмениваться белками без изменения функциональности. И наоборот, обмен протеинов, включенных в транскрипцию и репликацию, почти невозможен между везикуловирусами Нью Джерси и Индиана (Зта11шоой е(; а1., 1994). Такая возможность генетических замш в роде Лиссавирусов открывает интересные перспективы в развитии обратного генетического приближения при использовании рекомбинантной технологии.

SV41 HPIV2 . SV 5

NDV

Sendai Enders Sendai Z HPIV3

CDV

meas Udem meas AIK-C

Род Семейство Rubula-virus

Paramyxo-vims

Morbilli-

virus

Paramyxo-viridae

rabies PV rabies SADB19 Mokola

VSVNJ Hazel VSV NJ Ogden VS V Indiana

— Lyssa-virus

Vesiculovirus

Rhabdo-viridae

Рис. 6. Филогенетическое древо Mononegavirales (Merrier, Y. 1997).

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Наумкина, Марина Алексеевна

6. ВЫВОДЫ

1. Методом молекулярного клонирования получены две рекомбинантные плазмиды, содержащие полный ген нуклеопротеина размером 1500 п. о. и фрагменты G-L генов, фланкирующие псевдоген размером 3200 п. о. штамма ТС-80 вируса бешенства,

2. Использование в качестве ДНК-зондов рекомбинантных плазмид, содержащих ген нуклеопротеина и фрагменты G-L генов при температуре гибридизации 65° С позволяет обнаружить РНК вируса бешенства в пробах головного мозга и культур клеток при инфекционной активности вируса 100 и 1000 МДД>о/мл, при применении радиоактивной и нерадиоакшвной меток, соответственно.

3. Праймеры, комплементарные гену нуклеопротеина при оптимальных условиях проведения ПЦР (концентрация MgCl2 2,5 мМ, температура отжига 50° С) выявляют РНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса бешенства в пробах головного мозга и кулыур клеток при инфекционной активности вируса 1 -10 МЛДзо/мл.

4. Рестрикция вариабельного участка генома вируса бешенства (псевдогена) специально подобранными ферментами (Hind III, Bam Н I, Rsa I, Taq I ) позволяет провести дифференциацию вакцинных штаммов вируса бешенства, Установлено, что вакцинные штаммы ТС-80, Внуково-32 и ERA принадлежат к одной генетической группе.

5. При рестрикционном анализе ПЦР продуктов, комплементарных гену нуклеопротеина, установлены различия исследованных вакцинных штаммов и полевых изолятов из Якутии. Этот метод может быть использован для дифференциации изолятов арктического бешенства.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ. ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- «Набор препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной гибридизации», «Набор препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом ПЦР», которые могут быть рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики болезни.

- Способ дифференциации вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью рестрикционного анализа ПЦР продуктов псевдогена, который может быть использован для паспортизации производственных штаммов и контроля за изменениями вакцинных штаммов в процессе их хранения и культивирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Наумкина, Марина Алексеевна, 1999 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 8.1. Список русской литературы.

1. Ботвинкин А.Д., Чернов С.М., Грибанова Л. Я. Обнаружение вируса бешенства в головном мозге и слюнных железах животных с помощью иммуноферментного метода. // Вопросы вирусологии. - 1987, - N -6 - с, 747-750.

2. Ботвинкин А.Д., Наволокин О.Ц. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ELISA в пробах крови, собранных на бумажные диски. // Лаб. дело. - 1988.-N 3. - с. 73-74.

3. Ботвинкин А.Д. Особенности эпидемиологии гидрофобии и экология вируса бешенства в условиях преобладания очагов природаого типа: Дис. ... д-ра мед. наук в форме научного доклада: 14.00.30. - Москва, 1992.

4. Валипшна Т.В. Дисс. кацд. биол. наук. - Покров, 1992. - Хранится во ВНИИВВиМ.

5. Васильева Г.И., Мишанькин М.Б., Козловский В.Н. и др. Цитокининдуцирующая активность "мышиного" токсина Yersinia pestis. // ЖМЭйИ, 1998, № 1, с. 61-64.

6. Ведерников В.А., Седов В.А., Ивановский Э.В. Бешенство животных - М.: Колос, 1974,-с. 112.

I. Ведерников В. А., Седов В. А. Современные особенности эпизоотологии бешенства. // Ветеринария.-1976,- N 8.- с. 57-61.

8. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л. Я., Молчанова Т. В., Вергун Л.Ю. Иммуноферменгаый анализ при диагностике инфекционных болезней с/х животных. // В сб.: Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.-Покров, 1983.- с. 66-76.

9. Грибанова Л.Я., С. В. Грибенча, Г, Б, Мальков, И.Ф. Баринский. Изучение биологических свойств вариантов уличного вируса бешенства.// Вопросы вирусологии. 1988, № 2/201-206.

10. Грибенча С. В., К. А. Ванаг, И. Ф. Баринский. Получение двух вариантов вируса бешенства из одного штамма. // Вопросы вирусологии, 1981, № 3, с. 315-318.

II. Грибенча С, В., К. А. Ванаг, И. Ф. Баринский. Изучение биологических вариантов популяции ряда штаммов уличного вируса бешенства. // Вопросы вирусологии, 1982, № 6, с. 98-103.

12. Грибенча С. В., Л.Я. Грибанова, Г. Б. Мальков, И.Ф. Баринский. Абортивное и возвратное бешенство у собак, зараженных в мозг уличным вирусом бешенства. // Вопросы вирусологии, 1989, № 2, С. 217-220.

13. Грибенча С. В., Василенко О. В., Фуралев В. А., Клюшник С. Ю., Кузьмицкая Т. М., Свешников П. Г., Баринский И. Ф. Получение и характеристика гибридом,

продуцирующих моноклональные антитела к структурным бежам вируса бешенства, штамм Внуково-32, //Вопросы вирусологии, 1991а, N-4,c318-320.

14. Грибенча С.В., Василенко О.В., Кузьмицкая Т.М., Фуралев В.А., Свешников П. Н., Татаров А. Н., Колотвина П. В., Баринский И. Ф. Взаимодействие моноклональных антел к структурным белкам вакцинного вируса Внуково-32 с другими вирусами группы бешенства. // Вопросы вирусологии, 1991b, N- 5, с. 399-402.

15. Калабеков М.И. Характеристика эпизоотического процесса бешенства животных. // Вестник Российской Академии Сельскохозяйственных Наук. 1998, № 4, с. 62-64.

16. Kaplan М. М., Шагу Koprowski. Методы лабораторных исследований по бешенству.// ВОЗ, Женева, 3-е издание, 1975, изд. "Медицина", рус., с. SO-¡С.

17. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству. Восьмой доклад.// ВОЗ, Женева, 1994, Мин. здравоохр. РФ "Медицина" р о. 112.

18. Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование.// под. Редак. А.Баева. Москва «Мир», 1984, ^ • 3 7 9

19. Мовсесянц A.A., Григорьева Л.В., Кривицкая Е.Е.. Изучение локализации и распределения антигена фиксированного вируса бешенства в центральной нервной системе животных с помощью метода флюоресцирующих антител. // Ж. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1991, N 10, с 36-40.

20. Пиле Р. Лиссавирусы. // Вопросы вирусологии. 1996, № 1, с. 2-6.

21. Полюшкина Г. С., Ивановский Э.В. // Всесоюзная конференция по эпизоотологаиб 3-я: Тезисы докладов. - Новосибирск, 1991, с. 387-388.

22. Полюшкина, A.A. Горкунов. Эпизоотическая ситуация по бешенству в Московской области и пути ее улучшения. // Вопросы вирусологии, 1998, № 1, с. 47-48.

23. Селимов М. А. Бешенство - М.: Медицина - 1978, с. 203.

24. Селимов М.А. К эволюции природных очагов рабической инфекции. // Актуал. пробл. вирусол. Тез. докл. Конф., Москва, 21-23 мая, 1985. М., 1985,с.164-165.

25. Селимов М.А. Моноклональные антитела и антигенный анализ лиссавирусов. // Серия эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. Выпуск 4. Современные достижения в обл. рабиологаи - Москва, 1987.- с.32-36.

26. Сологуб Т.В., Вишняков И.Ф., Никишин И.В. Совершенствование МФА для обнаружения антигена вируса бешенства. // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Материалы научн. конф. / ВНИИВВиМ.-Покров, 1992а,- с. 260.

27. Сошиуб Т.В., Никишин И.В., Вишняков И.Ф. Выявление антител к вирусу бешенства методом ингибирования ТФ ИФА. // В сб.: Вопросы вет. вирус., микробиол. и эпизоотологии. - Покров, 1992Ь, с. 261.

28. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. // Справочник, Москва ВО «Агропромиздат», 1991, стр. 254-270.

29. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных.// Москва, ВНИТИБП, 1998, с. 294-319

30. Таршис М.Г., Ковалев Н.А., Кузнецов П.П. Бешенство животных. // Минск "Ураджай" 1990, с. 65-80.

31. Татаров А.Г., Селимов М.А., Кармышева В.Я., Хисматуллина Н.А. Экспресс-диагностика бешенства в линии клеток невриомы-Гассенова узла крысы (НГУК-1).// Акту ал. пробл. вирусол. Тез. докл. Конф., Москва, 21-23 мая, 1985. М., 1985р.172-173.

32. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).// Москва, 1996, с. 36

33. Харигоненков И. Г. Тенденции развития методов диагностики в вирусологии. // Соврем, методы иммунохим. и молекулярнобиол. диагност, в мед., АМН СССР. НИИ вакцин сывороток., М. 1992, с. 12-20.

34. Хисматулина Н.А. Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства. // Д иагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных. Материалы международной научно-практической конференции посвященной 40-летию ВННИИВиМ. г Покров, 1998г.- с. 77.

35. Цетлин Е.М., Волкова P.A. Отработка оптимальной схемы учета результатов при применении имммуноферментной тест-системы для определения антигенной активности культуральной антирабической вакцины.// Вопросы вирусологии, 1996, N-1, с.21

36. Чернявский В.Ф., Егоров И.Я., Тугутов Л.Д., Строева Н.Р., Карпов B.C. Основные результаты изучения бешенства в Якутии.// Актуал. пробл. вирусол. Тез. докл. Конф., Москва, 21-23 мая, 1985. М., 1985^.168-169.

37. Черных Н.В., Сологуб Т.В., Никишин И.В., Вишняков И.Ф., Чевелев С.Ф., Аверина H.H. Влияние ДЕАЕ-декстрана на выращиввание вируса бешенства в культуре клеток почки сайги. // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Материалы научн. конф. / ВНИИВВиМ.-Покров, 1992.- с. 147-148.

38. Щербак Ю. Н., Дзюблик H.A., Антонова JI. А., Моргунов О.И. Итоги борьбы с гидрофобией на Украине (к 100 летию пастеровских прививок).// Актуал. пробл. вирусол. Тез. докл. Конф., Москва, 21-23 мая, 1985. М., 1985,с152-153.

39. Феннер Ф,, Мак-Ослен Б., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных. // "МИР" Москва, 1997, стр 171-176.

8.2. Список иностранной литературы.

40. Agchomo Н.О., Tomori О., Oduye О.О., Rupprecht С.Е. Detection of Mokola virus neutralizating antibodies in Nigerian dogs. // Res. Vet. Sci, 1990, 48, 264

41. Alexander R.A. Rabies in South Africa: a raview of the present position. // J. S. Air. Vet. Assoc. 1972, 23,135-139

42. Ambinder F., Wingard J.R., Burns W.H. et al., Detection of Epstein-Barr virus DNA in mouthwashes by hybridization.// Journal of Clinical Microbiology, 1985, 21, 353-6.

43. Amengyal В., Whitly J.E., King A., Serra Cobo J. and Bourhy H.. Evolution ofEuropean bat lyssavirusses. //of General Virology (1997), 78, 2315-2328.

44. Anilionis A., Wunner W.H., Curtis P.J. Structure of the glycoprotein gene in rabies virus.// Nature, 1981, 294, 275-278

45. Anon. (1995). Summary of rabies in Europe. Rabies Bulletin Europe 19 (4), 3-4.

46. Arai Y. Т., К. Yamada, Y. Kameoka, T. Horimoto, K. Yamamoto, S.Yabe, M. Nakayama, and M. Tashiro. Nucleoprotein gene analysis of fixed and street rabies virus variants using RT-PCR. // Arch Virol (1997) 142:1787-1796.

47. Aray S.C. Failures of post-exposure rabies and other immunotherapies in developing countries. // Vaccine, 1989, 7, 372.

48. Astoul-E Lafage-M Lafon-M Rabies Superantigen as a V-Beta T-Dependent Adjuvant.// JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE 1996, Vol 183, Iss 4, pp 1623-1631

49. Atanasiu P. The immunoperoxidase reaction for demonstration of rabies virus. In Laboratory Techiques in Rabies. 1973. (Kaplan M.M., Koprowski H. eds) pp. 358-60. Geneva: World Health Organization.

50. Atanasiu P. Animal inoculation and Negri body. In The History of Rabies. 1975. (Baer, G.M., ed.) pp. 374-98. London, New York, San Francisko: Academic Press.

51. Belak-S Ballagipordany-A. Application of the Polymerase Chain-Reaction (PCR) in Veterinaiy Diagnostic Virology.// VETERINARY RESEARCH COMMUNICATIONS 1993, Vol 17, Iss 1, pp 55-72

52. Benmansour, M. Brahimi, C. Tuffereau, P. Coulon, F. Lafay and A. Flamand. Rapid Sequence Evolution of Street Rabies Glycoprotein is Related to the Highly Heterogeneus of the Viral Population. // Virology, 1992, 187, N 1, 33-45.

53. Berninger M., Hammer M., Hoyer В., Cerin J. An assay for the detection of the DNA genome of hepatitis В virus in serum. // Journal of Medical Virology, 1982, 9, 57-68.

54. Bilsel P.A., Rowe J.A., Fitch W.M., Nichols S.T. Phosphoprotein and nucleocapsid protein evolution of visicular stomatitis virus New Jersey. // J. Virol. 1990, 64, 2498-2504.

55. Bock H.L., Barth R., Hendenstrom M. Rabies despite post-exposure vaccine treatment with cell culture vsccines a review of published cases. In Progress in Rabies Control. 1988, pp 435-440. Edited by O. Thraenhart, H Koprowski, K. Bogel, P. Sureau. England: Wells Medical.

56. Bourhy H.F., Lafon M., Berthonneau M.C., Renner Y., Rollin P.E., Sureau P. Rabies in vaccinated dogs in Gabon. // Veterinary Record, 1988, 122, 361-362.

57. Bourhy H.5 Rollin P.E., Vincent J., Sureau P. Comparative field evalution of the fluorescent-antibody test, virus isolation from tissue culture, and enzyme immunodiagnosis for rapid laboratory diagnosis of rabies. // Journal of Clinical Microbiology, 1989, 27,519-23.

58. Bourhy H., Kissi B., Lafon M., Sacramento D. and Tordo N. Antigenic and molecular characterization of bat rabies virus in Europe. // Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30, 2419-2426.

59. Bourhy-H Kissi-B Tordo-N Taxonomy and Evolutionary Studies on Lyssaviruses with Special Reference to Africa.// ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1993, Vol 60, Iss 4, pp 277-282

60. Borhy H., Kissi B., Tordo N. Molecular diversity of the Lyssavirus Genus.// Virology 1993, 194, 70-81;

61. Bourhy-H Kissi-B Tordo-N Badrane-H Sacramento-D Molecular Epidemiologic Tools and Phylogenetic Analysis of Bacteria and Viruses with Special Emphasis on Lyssaviruses.// PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE 1995, Vol 25, Iss 2, pp 161-181

62. Canter, D. M. & Perrault, J. (1996). Stabilization of vesicular stomatitii virus L polymerase protein by P protein binding: a small deletion in th( C-terminal domain of L abrogates binding. Virology 219, 376-386.

63. Chariton KM, Webster WA, Casey GA, Rupprecht CE (1988) Skunk rabies. Rev Meet Dis 10: S626-S628

64. Chenik M., Chebli K., Gaudin Y., Blondel D. In vivo interaction of rabies virus phosphoprotein (P) and nucleoprotein (N): existence of two N-binding sites on P protein.// J.Gen. Virol. 1994, 75, 2889-2896

65. Chenik M, Chebli K, Blondel D (1995) Translation initiation at alternate in-frame AUG codons in the rabies virus phosphoprotein mRNA is mediated by a ribosomal leaky scanning mechanism. J Virol 69:707-712

66. Chou S.„ Merigan T.C. Rapid detection and quantitation of human cytomegalovirus in urine through DNA hybridization. New England Journal of Medicine, 1983, 308, 921-5.

67. Clark H. F., Wiktor T.J. Rabies virus. In " Strains of Human Viruses" (Majer M., Plotkin S.A. Eds) 1972, pp 177-182, Karger, Basel.

68. Coll-JM The Glycoprotein-G of Rhabdoviruses. // Archives of virology 1995, Vol 140, Iss 5, pp 827-851

69. Conzelmann K.K., Cox J. H., Schneider L.G., and Thiel H.J. Molecular Cloning and Complete Nucleotide Sequence of the Attenuated Rabies Virus SAD B19. // Virology (1990)175,485-499.

70. Coslett D. G., Holloway B.P., and Obueski J.F. The structural proteins of rabies virus and evidence for their synthesis from separate monocistronic RNA species. // J.Gen. Virol. 1980, 49, 161-180; Holloway B.P., and Obijeski J.F. Rabies virus-induced RNA synthesis in BHK-21 cells. // J. Gen. Virol. 1980, 49, 181-195

71. Cox J.H., Dietzcxhold B., Schneider L.G. Rabies virus glycoprotein n. Biological and serological characterization. // Infect. Immun. 1977, 16, 754-759

72. Cox J.H., Weiland F., Dietzschold B., and Schneider L.G. Reevalution of the structural proteins Mj and M2 of rabies virus. (1981) // In "The Replication of Negative Strand Viruses"(D.H.L. Bishop and R. W. Compans, Eds.) Amer. Elsevier, New York

73. Crysler J.G., Lee P., Reinders M.s Prevec L. The sequence of the nucleocapsid protein (N) gene of Piiy virus: possibble domains in the N protein of vesiculoviruses. // Journal of General Virology, 1990, 71, 2191-2194

74. Cumming D.H.M. A case history of the kspread of rabies in an African country. // S. Air. J. Sci 1982, 78, 443-447

75. Davis-C Neill-S Raj-P Microwave Fixation of Rabies Specimens for Fluorescent-Antibody Testing.// JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS 1997, Vol 68, Iss 2, pp 177-182

76. Dietzschold B., Wunner W.H., Vanichird A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. // Virology 1983a, 124, 330-337.

77. Dietzschold B., Wunner W.H., Wiktor T.J. et al. Characterization of antigen determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983b, 80, 70-74

78. Dietzschold B., Wiktor T.J., Trojanowski J.Q., et al. Differrences in cell-to-cell spread of pathogenic and apatogenic rabies virus in vivo and in vitro. // J. Virol. 1985, 56, 12-18

79. Dietzschold B., Lafon M., Wang H-H., Otvos L JR., Celis E., Wunner WH., Koprowski H. Localozation and immunological characterization of antigenic domain of the rabies virus internal N and NS proteins. // Virus Res. 1987a, 8, 103-125;

80. Dietzschold B., Wang H-H., RupprechtC.E., Celis E., Tollis M., Heber-Katz E., Koprowski H. Induction of kprotective immunity atgainst rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein.// Proc Natl Acad Sci USA 1987b, 84, 9165-9169

81. Dietzschold B., Rupprecht C.E., Tollis M., Lafon M., Mattel J., Wiktor T.J., Koprowski H. Antigenic diversity of the glycoprotein and the nucleocapsid proteins of rabies and rabies-related viruses: implications for epidemiology and control of rabies. // Reviews of Infectious Diseases, 1988, 10, S 785-98.

82. Dietzscold B., Core M., Ertl H., Celis E,, Otvos L., KoprowsM H. Analysis of protective immune mechanism induced by rabies nucleoprotein.// In "Genetics and Pathogenicity of Negative Strand Viruses" (D. Kolakofsky and B.W.J. Mahy, Eds.) 1989, pp. 295-305, Elsever Science Publ BV, Amsterdam

83. Domingo E., Martinez-Sala E., Sobrino F., Carlos De La Torre J., Portela A., Ortin J., Lopez-Galindez C., Perez-Brena P., Villanueva N., Najera R., Vande Pol S., Steinhauer D., DePolo N., Holland J. The quasispecies (extremely heteroheneous) nature of viral RNA henome populations: biological relevance - a review. // Gene, 1985, 40, 1-8.

84. Domingo D., Escarmis C., Sevilla N., Moya A., Elena S.F., Quer J., Novella I.S., Holland J.J. Basic concepts in RNA virus evolution.// Faseb J., 1996a, 10, 859-864.

85. Duck P., Alvarado-Urbina G., Burdick B., Collier B. Probe amplifier system based on chimeric cyclic oligonucleotides. // Biotechniques, 1990, v. 9, N 2, p. 142-147.

86. Durst M., Gissman L., Ikenberg H., Zur Hausen H. A papillomavirus DNA from cervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samples from différents geographic regions. // Prociidings of the National Academy of Sciences,US A, 1983, 80, 3812-15.

87. Ermine A., Noel Toedo and Henri Tsiang. Rapid diagnosis of rabies infection by means of a dot hybridization assay. // Molecular and Cellular Probes (1988), 2, 75-82.

88. Ertl HCJ., Dietzschold B., Gore M., Otvos L.Jr., Larson J.K., Wunner H., KoprowsM H. Induction of rabies virus-specific T-helper cells by synthetic peptides that cany dominant T-helpler cell epitopes of the viral ribonucleoprotion.// J. Virol 1989, 63, 2885-2892

89. Ertl H C J., Dietzschold B., Otvos L. T Helper cell epitope of rabies virus nucleoprotein defined by tri- and tetrapeptides.//Eur. J. Immunol. 1991, 21, 1-10

90. Esterhuysen-JJ Prehaud-C Thomson-GR A Liquid-Phase Blocking ELISA for the Detection of Antibodies to Rabies Virus.// JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS 1995, Vol 51, Iss 1, pp 31-42

91. Fang Fu Z., Dietzschold B., Schumacher C.L,, Wunner W. H., Ertl H.C.J., Koprowski H. Rabies virus nucleoprotein expressed in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine.// Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 2001-2005;

92. Felsenstein J. Fhylogenies from molecular sequences: inference and reliability. // Ann. Rev. Genet. 1988, 22, 521-565.

93. Felsenstein J. PHYLIP: phylogeny inference package, version 3.52c.// University of Washington. Washington 1993.

94. Fekadu M., SummerJ.W,, Shaddock J.H., Sanderlin D.W., Baer G.M. Sickness and recovery of dogs challenged with a street rabies virus after vaccination with a vaccinia virus recombinant expressing rabies virus N protein. // J. Virol. 1992, 66, 2601-2604

95. Flamand A., Delagneau J.F. Transcriptional mapping of rabies virus in vivo. // J. Virol. 1978, v. 28, 518-523

96. Flamand A., Wiktor T.J., Koprowski H. Use of hybiidoma monoclonal antibodies in the detection of antigenic differences between rabies and rabies-related virus proteins. H The glycoprotein. // Journal of General Virology, 1980, 48,105-9.

97. Flores J., Boeggeman E., Purcell R.H. et al., A dot hybridization assay for detection rotavirus. // Lancet, 1983, 24, 555-9.

98. Fu Z.F., Zheng Y., Wunner W.H., Koprowski H., Dietzshold B. Both the N- and the C-terminal domains of the nominal phosphoprotein of rabies virus are invilved in binding to the nucleoprotein.// Virology, 1994, 200, 590-597

99. Gamoh-K Senda-M Itoh-O Muramatsu-M Hirayama-N Koike-R Endoh-YS Minamoto-N Use of ELISA for in-Vitro Potency Test of Rabies Vaccines for Animal Use.// BIOLOGICALS 1996, Vol 24, Iss 2, pp 95-101

100.Gaudin Y.H., Tuffereau C., Benmansour A., Flamand A. Fatty acylation of rabies virus proteins. //Virology 1991a, 184, 441-444

101.Gaudin Y.H., Rugrok R.H., Tuffereau C., et al. Rabies virus glycoprotein is a trimer. // Virology 1992, 187, 627-632

102.Gaudin-Y Raux-H Flamand-A Ruigrok-RWH. Identification of Amino-Acids Controlling the Low-pH-Induced Conformational Change of Rabies Virus Glycoprotein.// JOURNAL OF VIROLOGY 1996, Vol 70, Iss 11, pp 7371-7378

103. Gojobori T., Moriama E.N., Kimura M. Molecular clock of viral evolution, and the neutral theoiy. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87,10015-10018.

104. Gorman O. T., Bean W.J., Kawaoka Y., and Webster R.G. Evolution of the nncleoprotion gene of enfluenza A virus. // J. Virol. 1990, 64, 1487-1497.

105. Gorman O. T., Bean W.J., Kawaoka Y., Donatelli L., Guo Y., and Webster R.G. Evolution of influenza A virus nucleoprotein genes: implications for the origin of H 1N1 human and classical swine viruses. /7 J.Virol. 1991, 65, 3704-3714.

106. Grandien-M Viral Diagnosis by Antigen-Detection Techniques.// CLINICAL AND DIAGNOSTIC VIROLOGY 1996, Vol 5, Iss 2-3, pp 81-90

107. Gribencha, S.V., Vanag K.A., Obukhova V.R., Barinsky I.F., Shubladze A.K. Experimental studies of chronic rabies.// Ann Virol (Inst Pasteur) 1980, 131 E: 301-312.

108. Gribencha, S.V., Vanag K.A., Barinsky I.F. Separation of two street rabies virus strain population into two biological variants.// Acta Virol (1981) 25:168.

109.Giibencha S.V., Gribanova L. Ya., Malkov G.B., and Barinsky I.F.. Population structure of some street rabies virus strains.// .Arch Virol (1989) 104: 347-350.

110.Hass L. Molecular Epidemiology of Animal Diseases. // J. Vet. Med., 1997, Vol. 44, 257272.

111.Hamir-AN Moser-G Fu-ZF EHetzschold-B Rupprecht-CE Immimohistochemical Test for Rabies - Identification of a Diagnostically Superior Monoclonal-Antibody.// VETERINARY RECORD 1995, Vol 136, Iss 12, pp 295-296

112. Hamir-AN Moser-G Wampler-T Hattel-A Dietzschold-B Rupprecht-CE. Use of a Single Anti-Nucleocapsid Monoclonal-Antibody to Detect Rabies Antigen in Formalin-Fixed, Paraffin- Embedded Tissues.// VETERINARY RECORD 1996, Vol 138, Iss 5, pp 114-115

113.Harrison P. J., Pearson R.C.A. In situ hybridization histochemistiy and the study of gene expression in the human brain..// Prog. Neurobiol. 1990, v. 34, 271-312.

114.Heaton-PR Johnstone-P Mcelhinney-LM Cowley-R Osullivan-E Whitby-JE. Heminested PCR Assay for Detection of 6 Genotypes of Rabies and Rabies-Related Viruses. // JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 1997, Vol 35, Iss 11, pp 27622766

115.Higgins D.G., Sharp P.M. Fast and sensitive multiple sequence aligments on a microcomputer. //Cabios, 1989, 5, 151-153.

116. Hiramatsu K. Mifune K. Mannen K, Nishizono A, Kawano H. Ito Y, Kawai A (1992) Mapping of the antigenic determinants recognised by monocional antibodies asamsi; the M2 protein of rabies virus. Virology 187: 472—479

117. Hiramatsu K. Mannen K, Mifune K, Nishizono A, Takita-Sonoda Y Comparative sequence analysis of the M gene among rabies virus strains and its expression by recombinant vaccinia virus. Virus Genes (1993) 7: 83-88 .

118. Holland J.J., Carlos Torre, Steinhauer D.A., Clarke D., Durte E., Domingo E. Virus mutation frequencies can be greatly understimated by monoclonal antibody neutralization of virions. // Journal of Virology, 1989, 63, 5030-5036.

119. Holland J.J., Torrey J.C., Steinhauer D.A. RNA virys populations an quasispecies. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992, 176, 1-20.

120. Horikami, S. M., Smallwood, S., Bankamp, B. & Moyer, S. A. (1994). An amino proximal domain of the L protein binds to the P protein in the measles virus RNA polymerase complex. Virology 205, 540-545.

121.Hostnik-P Grom-J. An Indirect Immunofluorescent Test for Detection of Rabies Virus-Antibodies in Foxes. JOURNAL OF WILDLIFE DISEASES 1997, Vol 33, Iss 1, pp 143145

122. Hughes A.L., Nei M. Nucleotide substitution at major histocompatibility complex class II loci: Evidence for overdominant selection.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 958-962.

123.Hyppia T. Detection of adenovirus in nasopharyngeal by radioactive and nonradioactive DNA probes. // Journal of Clinical Microbiology, 1985, 21, 730-3.

124.Ito Y. Nishizono A. Mannen K. Iiiramatsu K. Mifune K (1996) Rabies virus M protein expressed in Escherichia coli and its regulatory role in virion-associated transcriptase activity. Arch Virol 141: 671-683

125. Iversion L.E., Rose J.K. Localized attenuation and discontinuous synthesis during vesicular stomatitis virus transcription. // Cell, 1981, v. 23, 477-484.

126. Jacson A. C., Dorothy L. Reimer and William H. Wunner. Detection of rabies system of experimentally infected mice using in situ hybridization with RNA probes. // Journal of Virological Methods, 25 (1989) 1-12.

127.Jacson A. C,, and William H. Wunner. Detection of Rabies Virus Genomic RNA and mRNA in Mouse and Human Brains by Using In Situ Hybridization. // Journal of Virology, 1991, vol. 65, N 6.

128. Jayakumar-R Nachimuthu-K Padmanaban-VD A Dot Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (Dot ELISA) - Comparison with Standard Fluorescent-Antibody Test (Fat) for the Diagnosis of Rabies in Animals.//COMPARATIVE IMMUNOLOGY MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES 1995, Vol 18, Iss 4, pp 269-273

129. Jayakumar-R Thirumuragan-G Nachimuthu-K Padmanaban-VD

Detection of Rabies Virus-Antigen in Animals by Avidin- Biotin Dot ELISA. /7 ZENTRALBLATT FUR BAKTERIOLOGIE-INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY VIROLOGY PARASITOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES 1996, Vol 285, Iss 1, pp 82-85

130Johnson H.N. The virus neutralization index test in mice. In Laboratory Techniques in Rabies 1973 (Kaplan M.M., Koprowski H., eds) pp 94-7. Geneva: World Health Organization.

131. Johnson H.N., Emmons R.W. Rabies virus. In Laboratory Diagnosis of viral Infections. 1985. (Lennette E.H., eds) pp. 425-40. New York, Basel: Marcel Dekker, Inc.

132. Kamolvarin-N Tirawatnpong-T Rattanasiwamoke-R Tirawatnpong-S Panpanich-T Hemachudha-T. Diagnosis of Rabies by Polymerase Chain-Reaction with Nested Primers.//JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES 1993, Vol 167, Iss 1, pp 207-210

133.Kappeler, A. (1989). Bat rabies surveillance in Europe. Rabies Bulletin Europe 13 (4), 1213.

134. Kawano H., Mifune K., Manen K., et al. Protection against rabies in mice by a cytotoxic T cell clone recognizing the gltcoprotein of rabies virus. // J. Gen. Virol. 1990, 71, 281-287

135. Kimura M. Recent development of the neutral theory viwed from the Wrightian tradition of theoretical population genetics. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 5969-5973.

136. King A.A., Crick J. Rabies-related viruses. In: Campbell J.B., Charlton K.M. (eds) Developments in veterinary virology: rabies. 1988. Kluwer, Dordrecht

137. King, A., Davies, P. & Lawrie, A. (1990). The rabies viruses of bats. Veterinary Microbiology 23,165-174.

138. King A.A. Studies of the antigenic relationships of rabies and rabies-related viruses using anti-nucleocapsid monoclonal antibodies. // Thesis 1991, University of Surrey

139.King-AA Monoclonal-Antibody Studies on Rabies-Related Viruses.// ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1993, Vol 60, Iss 4, pp 283-287

140.King A. A. African overview and antigenic variation. In: King A (ed) Proceedings of the international conference on epidemiology control and prevention of rabeis in eastern and southern Africa. 1993. Fondation Marcel Merieux

141.King-AA., Meredith C.D., Thomson G.R. Canid and viverrid rabies viruses in South Africa. // Onderstepoort J. Vet. Res. 1994, 60, 295-299.

142.Kissi B., TordoN., Bourhy H. Genetic Polymorphim in the Rabies Virus Nucleoprotein Gene. //Virology, 1995, 209, 526-537, 1995.

143. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers. //Cabios, 1994, 10, 189-191.

144.Kissi B., Noel Tordo, Herve Bourhy. Genetic Polymorphism in the Rabies Virus Nucleoprotein Gene. //Virology (1995) 209, 526-537

145. Kitvits T., Gemed B., Strijpetal D. NASBA TM isothermal enzymatic in vitro nucleic acids amplification optimized for diagnosis of HTV-1 infection. // J. Virol Methods, 1991, v. 35, p. 273-286.

146. Lafon M., Wiktor T. J., Macfarlan R.I. Antigenic sites on the CVS rabies virus glycoprotein: analysis with monoclonal antibodies. // J. Gen. Virol. 1983, 64, 843-861

147. Lafon M., Sureau P. Identification of two rabeis-related viruses isolated from bats in Poland and in Senegal by means of monoclonal antibodies. In: Thongcharoen P., Kurstak E. (eds) Virus diseade in Asia. Mahidol University Press Bangkok 1988, pp. 341-344

148.Lafon M., Boruhy H., Sureau P. Immunity against the European bat rabies (Duvenhage) virus induced by rabies vaccines: An experimental study in mice. // Vaccine 1988, 6, 362368.

149. Lafon J., Lafage M., Martinez-Arendz A., Ramirez R., Vullier F., Charron D., Lotteau V., Scott-Algara D. Evidence for viral superantigen in humans.//Nature 1992, 358, 507-510

150. Larson J.K., Wunner W.H. Nucleotide and deduce amino acid sequences of the nominal nonstructural phosphoprotein of the ERA, PM and CVS-11 strain of rabies virus.// Nucleic Acids Res (1990), 18, 7172

151. Last-RD Jardine-JE Smit-MME Vanderlugt-JJ Application of hnmunoperoxidase Techniques to Formalin-Fixed Brain-Tissue for the Diagnosis of Rabies in Southern Africa.// ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1994, Vol 61, Iss 2, pp 183-187

152. Lee H. Infection Disease testing by ligase chain reaction. // Clin. chem. 1993, v.30, p. 729730

153. Lemercier-P Jacob-Y Tordo-N The Complete Mokola Virus Genome Sequence -Structure of the RNA-Dependent RNA-Polymerase.// JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY1997, Vol 78, Iss JUL, pp 1571-1576

154.Lentz T.L., Wilson P.Т., Hawrot E., et al. Amino acid sequence similaiyty between rabies virus glycoprotein and snake venom curaremimetic neurotoxons. // Science 1984, 226, 847848

155.Lentz Thomas. Rabies virus receptors. // Trends Neurosci., 1985, 8, № 8, 360-364.

156. Li W.H., Gojobori Т., Nei M. Pseudogenes as a paradigm of neutral evolution. // Nature, 1981, 292, 237-239.

157.Lizardi P.M., Kramer F.R. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnostics using DNA polymerase and RNA replicases. // Trends in Biotechnol. 1991, v.9, p. 53-59.

158. Lodmel D.L., Sumner J.W., Esposito J.J., Bellini W.J., and Ewalt L.C. Raccoon poxivirus recombinants expressing the rabies virus nucleoprotein protect mice against lethal rabies virus infection.// J. Virol. 1992, 65, 3400-3405;

159. Lowe J.B. Clinical applications of gene probes in human genetic disease, malignancy, and infectious disease. // Clinica et Chemica Acta, 1986, 157, 1-32.

160. MacFarlan R.I., Dietzschold В., Wiktor T.J., et al. T cell responses to cleaved rabies virus glycoprotein and to sythetic peptides. // J. Immunol 1984, 133, 2748-2752

161.Mannen K., Niramatsu K., Mifune K., Sakamoto S. Consserved nucleotide sequence of rabies virus cDNA encoding the nucleoprotein.// Virus Genes 1991, 5, 69-73

162. Martin M. Kaplan, Hilary Koprowski. Методы лабораторных исследований по бешенству.// ВОЗ, Женева, 3-е издание, 1975, изд. "Медицина", рус.

163.Martinez M.Z., Carrfflo С., Gonzalez-Candelas F., Моуа A., Domingo Е., Sobrino F. Fitness alteration of foot-and-mouth disease virus mutants: measurement of adaptability of viral quasispecies. II Jounal of Virology, 1991, 65, 3954-3957.

164. Martinez M. A., Dopazo J., Hernandez J., Mateu M. G., Sobrino F., Domingo E., Knowles N.J. Evolution of the capsid protein gene of foot-and-mouth disease vims: Antigenic

variation without accumulation of amino acid substitution over six decades, // J.Virol. 1992, 66, 3557-3565.

165.Martinezarends-A Astoul-E Lafage-M Lafon-M Activation of Human Tonsil Lymphocytes by Rabies Virus Nucleocapsid Superantigen.// Clinical Immunology and Immunopathology,

1995, Vol 77, Iss 2, pp 177-184

166. Martinezarends-A Superantigen Properties of the Rabies Virus Nucleocapsid.// INTERCIENCIA 1997, Vol 22, Iss 2, pp 68-72

167. Mccoll-KA Gould-AR Selleck-PW Hooper-PT Westbuiy-HA Smith-JS. Polymerase Chain-Reaction and Other Laboratoiy Techniques in the Diagnosis of Long Incubation Rabies in Australia// AUSTRALIAN VETERINARY JOURNAL 1993, Vol 70, Iss 3, pp 84-89

168. Mebatsion-T Cox-JH Conzelmann-KK Molecular Analysis of Rabies-Related Viruses from Ethiopia.// ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1993, Vol 60, Iss 4, pp 289-294

169. Mercier, Y. Jacob and N. Tordo. The complete Mokola vims genome sequence: structure of the RNA-dependent RNA polymerase. // Journal of General Virology (1997), 78, 15711576.

170. Meslin F.X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory Techniques in Rabies. // World Healf Organization, 1996, 4-th edition, Geneva.

171. Minamoto-N Tanaka-H Hishida-M Goto-H Ito-H Naruse-S Yamamoto-K Sugiyama-M Kinjo-T Mannen-K Mifune-K Linear and Conformation-Dependent Antigenic Sites on the Nucleoprotein of Rabies Virus.// MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 1994, Vol 38, Iss 6, pp 449-455

172. Montanohirose-JA Lafage-M Weber-P Badrane-H Tordo-N Lafon-M. Protective Activity of a Murine Monoclonal-Antibody Against European Bat Lyssavirus-1 (Ebll) Infection in Mice.// VACCINE 1993, Vol 11, Iss 12, pp 1259-1266

173 .Montanohirose-JA Lafage-M Lafon-M Measurement of Rabies Virus N-Protein in Rabies Vaccines.// Research in virology 1995, Vol 146, Iss 3, pp 217-224

174. Morimoto K,, Ohkubo A., Kawai A. Structurt and transcription of the glycoprotein gene of attenuated HEP-Flury strain of rabies virus. // Virology 1989, 173, 46-477

175. Morimoto K., Ni Y-J., Kawai A. Syncitium formation is induced in the murine neuroblastoma cell cultures which produce pathogenic type G proteins of the rabies virus. // Virology, 1992, 189, 203-216

176. Morimoto-K Patel-M Corisdeo-S Hooper-DC Fu-ZF Rupprecht-C-E Koprowski-H Dietzschold-B Characterization of a Unique Variant of Bat Rabies Virus Responsible for Newly Emerging Human Cases in North-America.// PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA

1996, Vol 93, Iss 11, pp 5653-5658

177. Myers G., Machines K., Korber B. The emergence of simian/human immunodeficiency viruses.// .AIDS Res. Hum. Retrovir. 1992, 8, 373-386.

178. Myerson D., Hackmsn R.C., Meyers J.D. Diagnosis of eytomegaloviral pnemonia by in situ hybridization. Journal of Infectious Diseases, 1984, 150, 272-7.

179. Murphy, C.M. Fauquet, D.H. L. Bishop, S.A. Ghabrial, A.W. Jarvis, G.P. Martelli, M.A. Mago, M.D. Summers (eds). Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. // Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. 1995. Virology Division International Union of Microbiological Societies, pp. 275-289.

180. Nadin-Davis S. A., G.A. Casey and Wandeler. Identification of regional variants of the rabies virus within the Canadian of Ontario. // Journal of General Virology (1993), 74, N 5, 829-837

181. Nadin-Davis-SA Casey-GA Wandeler-AI A Molecular Epidemiologic-Study of Rabies Virus in Central Ontario and Western Quebec.// JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY 1994, Vol 75, Iss 10, pp 2575-2583

182. Nadin-Davis SA Huang-W Wandeler-AI. The Design of Strain-Specific Polymerase Chain-Reactions for Discrimination of the Raccoon Rabies Virus-Strain from Indigenous Rabies Viruses of Ontario. // JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS 1996, Vol 57, Iss 2, pp 141-156

183. Nadin-Davis S.A., Huang W., Wandeler A. I. Polymorphism of rabies viruses within the phosphoprotein and matrix protein genes. // Arch Virol (1997) 142: 979-992

184.Nel-LH Thomson-GR Vonteichman-BF Molecular Epidemiology of Rabies Virus in South-Africa.// ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1993, Vol 60, Iss 4, pp 301-306

185. Patton J.T., Davis N.L., Wertz G.W. N protein alone satisfies the requirement for protein synthesis during RNA replication of vesicular stomatitis wus.// J. Virol. 1984, 49, 303-309

186. Perrin P., Rollin P.E., Sureau P. A rapid rabies enzyme immuno-diagnosis (RRIED): a useful and simple technique for the routine diagnosis of rabies. // Journal of Biological Standardization 1986, 14, 217-22

187. Perrin P., Joffret M. L., Zanetti C., Bourhy H., Goneir C., Fritzell C., Leclerc C., Sureau P. Rabies-speciffic production of interleukin-2 by peripheral blood lymphocytes from human rabies vaccines.// Vaccine, 1991, 9, 549-558

188.Poch, 0., Blumberg, B.M., Bougueleret, L. & Tordo, N. (1990). Sequence comparison of five polymerases (L proteins) of unsegmented negative-strand RNA viruses: theoretical assignments of functional domains. Journal ofGeneml Virology 71, 1153—1162.

189. Rayssiguer C., Livia Cioe, Elizabeth Withers, William H. Wunner and Peter J. Curtis. Cloning of rabies virus matrix protein mRNA and determination of its amino acid sequence. // Virus Research, 5 (1986) 177-190.

190. Rooijakkers-EJM Uittenbogaard-JP Groen-J Osterhaus-ADME. Rabies Vaccine Potency Control - Comparison of ELISA Systems for Antigenicity Testing.// JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS 1996, Vol 58, Iss 1-2, pp 111-119

191. Rosatte R.C. Rabies in Canada: history, epidemiology and control. // Canadian Veterinary Journal, 1988, 29, 362-365

192. Rotbart H.A., Levin M.J., Villareal L.P., Tracy S.M., Semler B.L. Wimmer E. Factors affecting the detection of enteroviruses in cerebrospinal fluid, with coxsackievirus B 3 and poliovirus 1 cDNA probes. // Journal of Clinical Microbiology, 1985, 22, 220-4.

193. Rupprecht C.E., Dietzschold B., Wunner W.H., Koprowski H. Antigenc relationships of lyssaviruses. In: Baer G.H. (ed) The natural hystory of rabies, 2nd edn. 1991, CRC, Boca Raton

194. Rupprecht C.E., Dietzschold B., Koprowski EL Lyssaviruses. // Springer-Verlad (1994) Berlin Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest

195. Sacramento-D Bourhy-H Tordo-N. PCR Technique as an Alternative Method for Diagnosis and Molecular Epidemiology of Rabies Virus. // Molecular and Cellular probes, 1991, Vol 5, Iss 3, pp 229-240;

196. Sacramento D., Hassan Badrane, Herve Bourhy and Noel Tordo. Molecular epidemiology of rabies virus in France: comparison with vaccine strains. // Journal of General Virology (1992), 73, N 5, 1149-1158.

197. Sagara J., Kawa A. Identification of heat shock protein in the rabies virion. // Virol. 1992.-v.190, N-2. -p. 845-848.

198. Sang-E Farr-RW Fisher-MA Hanna-SD. Antemortem Diagnosis of Human Rabies.// JOURNAL OF FAMILY PRACTICE 1996, Vol 43, Iss 1, pp 83-87

199.Schneider L.G., Diringer H. Structure and molecular biology of rabies virus. // In: Compans RW, Cooper M., Koprowski H. et al. (eds) Current topics in microbiology and immunology, 1976, vol. 75. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp 153-180

200. Seif I., Coulon P., Rollin P.E., Flamand A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affection antigenic site in of the glycoprotein. // J. Virol 1985, 53, 926-934

201. Selimov, M. A., Tatarov, A. G„ Botvmkin, A. D., Klueva, E. V„ Kulikova, L. G. & Khismatullina, N. A. (1989). Rabies-related Yuli virus: identifica-tion with a panel of monoclonal antibodies. Rabies Bulletin Europe 6, 690-692.

202. Selimov, S. A., Botvinkin, A. D., Khozinski, V. V., Klyieva, E. V., King, A., Petrenko, L. G., Doizhanov, P. B., Chernyavski, V. F., Kolotvina, P. V., Machitidze, C. Z., Korneeva,

S. A., Barinova, L. 1. & Kor-zhenkova, A. A. (1990). Lyssavirus characterization with monoclonal antibodies on strains of certain regions of the USSR. Rabies Bulletin Europe 14, 8-9.

203. Shu L.L., Bean W.J., Webster R.G. Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990. // J. Virol. 1993, 67, 2723-2729.

204. Smallwood, S., Sumners, E. R. & Mayer, S. A. (1994). Determinants of serotype specificity in transcription of vesicular stomatitis virus synthetic nucleocapsids. Virology 199,11-19.

205. Smith J.S., Yager P.A., Baer G.M. A rapid tissue culture test for detemiining rabies neutralizing antibody. In Laboratoiy Techniques in Rabies 1973 (Kaplan M.M., Koprowski H., eds) pp 354-7. Geneva: World Health Organization.

206.Smith J.S. Rabies virus epitopic variation: use in ecologic studies. In Advances in Virus Research (Maramorosch K., Murphy F.A., Shatkin A. J., eds) 1989, pp 215-53. San Diego: Academic Press.

207. Smith J.S., Orciari L.A., Yager P., Seedel H.D., Warner C.K., Epidemiologic and historical relationships among 87 rabies virus isolates as determined by limited sequence analysis. // J. Infect. Dis. 1992, 166, 296-307.

208. Sokol F., Schlumberger H.D., Wiktor T.J., Koprowski H. and Humeler K. Biochemical and biophysical studies on the nucleocapsid and on the RNA of rabies virus.// Virology, 1969, 38, 651-665;

209. Sokol F., Clark F. Fosphoproteins, structural components of rhabdoviruses.// Virology 1973, 52, 246-263;

210. Sumner J.W., Fekadu M., Shaddock J.H., Esposito J.J., and Bellini W.J. Protection of mice with vaccinva virus recombinants that express the rabies nucleoprotein. // Virology, 1991, 183, 703-710

211. Sureau P., Rollin P., and Wiktor T.J. Epidemiodogic analysis of antigenic variantions of street rabies virus: Detection by monoclonal antibodies. // Am. J. Elidemiol. (1983) 117, 605-609.)

212. Tabel H, Comer AH. Webster WA, Casey GA (1974) Histoiy and epizootiology of rabies in Canada. Can Vet J 15:271-281

213.Tignor G.H., Smith A.L. Vaccination and Challenge of mice with viruses of the rabies group. // Journal of Infectious Diseases, 1972, 125, 322-324.

214. Thoulouze-MI Lafage-M Montanohirose-JA Lafon-M. Rabies Virus Infects Mouse and Human-Lymphocytes and Induces Apoptosis.// JOURNAL OF VIROLOGY, 1997, Vol 71, Iss 10, pp 7372-7380

215. Tordo N., Poch O., Ermine A., Keith G. Primary structure of leader RNA and nucleoprotein genes of the rabies genome: segmented homology with VSV.// Nucleic Acid Res 1986a, 14, 2671-2683

216. Tordo N., Poch Q., Ermine A., Keit G., and Rougeon F. Walking along the rabies genome: Is the lage G-L intergenic region a remnant gene? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986b, 83, 3914-3918;

217. Tordo N., Poch O., Ermine A., Keit G., and Rougeon F. Completion of the rabies virus genome sequence determination: Highly conserved domains among the L (Polymerase) proteinsof unsegmented negative-strand RNA viruses. //Virology 1988, 165, 565-567

218. Tordo N., Poch O. Structure of rabies virus. In Rabies (Campbell J.B., Charlton K.M., eds)1988, pp. 25-45. Boston: Kluwer Academic Publishers.

219. Tordo-N Badrane-H Bourhy-H Sacramento-D. Molecular Epidemiology of Lyssaviruses -Focus on the Glycoprotein and Pseudogenes. // ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1993, Vol 60, Iss 4, pp 315-323

220. Tordo-N Badrane-H Bourhy-H Sacramento-D. Molecular Epidemiology of Lyssaviruses -Focus on the Glycoprotein and Pseudogenes // ONDERSTEPOORT JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH 1993, Vol 60, Iss 4, pp 315-323

221. Tufferead C., Fischer S., Flamand A. Phosphoiylation of the N and Mi proteins of rabies virus.// J Gen Virol 1985, 66, 2285-2289;

222. Tuffereau C., Leblois H., Benejean J., Coulon P., Lafay F., Flamand A. Arginine of Lisine in position 333 of ERA anl CVS glicoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice. // Virology. 1989, 172, № 2, 206-212.

223. Umoh J.U., Ezeokoli C.D. Immunofluorescent staining of trypsinized formalin-fixed brain smears for rabies antigen: results compared with tlioss obtained by standard nethods for 221 suspect animal cases in Nigeria, // Journal of Hugiene, 1985, v.94, 129-34.

224. Villareal L.P., Breindl M., Holland J.J. Determination of molar ratios of vesicular stomatitis virus induced RNA species in BHK 21 cells. // Biochemistry, 1976, v. 15, 1663-1667.

225. Vincent J., Bussereau F., Sureau P. Immunological relationships between rabies virus and rabies-ralated viruses studied with monoclonal antibodies to Mokola virus. // Annals de I'lnstitut Pasteur/ Virologie, 1988, 139, 157-73.

226. Vonteichman-BF Thomson-GR Meredith-CD Nel-LH Molecular Epidemiology of Rabies Virus in South-Africa - Evidence for 2 Distinct Virus Groups.// JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY 1995, Vol 76, Iss JAN, pp 73-82

227. Warner C.K., Schurr T.G., Fekadu M. Molecular characterization of carrief rabies isolates. // Virus Res. (19%) 41, 133-140.

228. Weaver S.C., Scott T.W., Rico-Hesse R. Molecular evolution of Eastern equine encephalitis virus in North America. // Virology, 1991, 182, 774-784.

229. webster W.A., casey G.A., charlton K.M., wiktor t. J. Antigenic variants of rabies virus in isolates from eastern, central and northern Canada. // Canadian Journal of Comparative Medicine (1985), 49, 186-188.

230. Webster W.A., casey G.A., charlton K.M. Major antigenic groups of rabies virus in Canada determined by antinucleocapsid monoclonal antibodies. // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases (1986) 9, 59-69.

231. Whitby-JE Johnstone-P Sillerozubiri-C. Rabies Virus in the Decomposed Brain of an Ethiopian Wolf Detected by Nested Reverse Transcription-Polymerase Chain-Reaction. JOURNAL OF WILDLIFE DISEASES 1997, Vol 33, Iss 4, pp 912-915

232. Wiktor T.J., Gyorgy E., Schlumberger H.D., Sokol F., Koprowski H. Antigenic properties of rabies virus components. // J. Immunol 1973a, 110, 269-276

233. Wiktor T.J. and Clark H.F.Comparison of rabies virus strains by means of the plaque reduction test. // Ann. Microbiol. 1973b, 124A, 283-287

234. Wiktor T.J., Koprowski H. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cell hybridization: detection of antigenic variants. // Prociidings of the National Academy of Sciences, USA, 1978, 75, 3938-42.

235. Wiktor T.J., Flamand A., Koprowski H., Use of monoclonal antibodies in diagnosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related viruses. // Journal of Virological Methods, 1980, 1, 33-46.

236. Wiktor T.J., and Koprowski H. Antigenic variants of rabies virus. // J. Exp. Med. (1980) 152, 99-112.

237. Winkler WG, Jenkins SR (1991) Raccoon rabies. In: Baer GM (ed) The natural history of rabies, 2nd ed. CRC Press. Boca Raton, pp 325-340

238. Wunner W.H., Larson J.K., Dietzschold B., Smith C.L. The molecular biology of rabies viruses. // Reviews of Infectious Diseases, 1988, 10, S771-84.

239. Wunner WH (1991) The chemical composition and molecular structure of rabies viruses. In: Baer GM (ed) The natural history of rabies, 2nd ed. CRC Press. Boca Raton, pp 31-67

240. Yamamoto K., Yoshikura H. Relation between genomic and capsid structures in RNA viruses.// Nucleic Acids Res. 1986, 14, 389-396.

241. Yelverton E., Norton B., Obijeski J.F., Geoddel D.V. Rabies virus glycoprotein analogs: biosynthesis in Esherihia coli. // Science 1983, 219, 614-620

242. Zavadova-J Svrcek-S Madar-M Durove-A. Titration of Antibodies by Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (Rffit).// VETERINARNI MEDICINA 1996, Vol 41, Iss 7, pp 225-230

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРСЮСИЙСЙИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

1 ';

¡1 V

| , УТВЕРЖДАЮ

Директор ВНИИВВиМ член-корреспондеиг РАСХН

, / Л ,... . _ : ^Р^ВиШНЯКОВ

МЕТОДИЧЕСЬСИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПОСТАНОВКЕ ПОЛИМЕРАЗНОР1 ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ БЕШЕНСТВЕ.

ПОКРОВ 1998г.

Методические указания по- постановке полимеразной цепной реакции при бешенстве разработаны в лабораториях Биофизики.« Диагностики ВНИИВВиМ!

кандидат биологических щук -аспирант-

член-корр. РАСХН, доктор ветеринарных наук, щюфессор доктор биологических наук! -аспирант- '

М.С. Пантгошенко МА. Наумкина

И.Ф. Вишняков С.Ж. Цыбанов В.В. Недосеков

Материалы по разрабо^е методических указаний рассмотрены! и одобрены на заседании ученого совета ВНИИВВиМ 1

протоколы £ от 09101 1998 г.

Ученый секретарь, кандидат ветеринарных наук

Г.П. Федоров

НАУК

УТВЕРЖДАЮ 1 Директор ВНИИВВиМ чпеи-корреспондекг РАСХН и(] ¿^{¿г^^^ишняков

1998г

• ^ \ «

Ч'

Г Ь ¿Г

Г/

ПОКРОВ 1998 г.

№.. указания Що выявленвйао РНК вируса бешенства методом ; доте йШШЩШёШ нерадиоактивных ДНК-зондов разработаны в и Диагностики ВНИИВВйМ '

кандидат биологических наук -член-корр. РАСХК, доктор ветерйнарных наук, профессор

аспирант-

M.A. Наушсин» МС, ШйШйШсо

И.Ф. Вшшшсов

Материалы по разработке методических указаний рассмотрены и утверждены на заседаШи ученого совета ВЙИИВВиМ, протоколы 6 от 0 3.07. 199?г.

Ученый секретарь, I кандидат ветеринарных наук

Г.П. Федоров

УТВЕРЖДАЮ Директор ВНИИВВиМ член-корреётшдент РАСХН

uimâçcb

eïf

"Й

АКТ

комиссионных испытаний набора препаратов для выявйеНи^^К-^ вируса бешенства с помощью полимеразной цепной реакции

ОСНОВАНИЕ: Выполнение НИР по теме 01.02.03.М. и указание директора ВНИИВВиМ № 13 от 21 апреля 1998 г.

Акт составлен комиссией в составе зам. зав. лабораторией "Диагностики" Ку-ринновым В.В., членов комиссии - ст. научным сотрудником лаб. "Музейных штаммов" Щетниковой Л. А,, научным сотрудником лаб. «Биофизики» Пантюшенко М.С., аспирантом лаб. «Биофишш» Шудоиной М.А. штржиж лаб. «Диашошши» НвДО» сековым В.В.

Комиссия в период с 12 по 20 мая 1998 г. провела проверку "Набора препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом ПЦР" и "Набора препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной тбридизацгш" в соответствии программы комиссионных испытаний, утвержденной директором ВНИИВВиМ 21 апреля 1998 г.

Комиссионные испытания проведены на базе лаборатории "Биофизики".

1. ЦЕЛЬ ИСПЫТАНИЙ

Оценить чувствительность и специфичность методов молекулярной шбридиза-ции и полимеразной цепной реакции с использованием "Набора препаратов для выявления РНК вирусов бешенства с помощью ПЦР" и "Набора препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной гибридизации" для обнаружения РНК вакцинных штаммов вируса бешенства в кулыуральной жидкости и пробах мозга мышей.

Результаты испытаний представлены в прилагаемом протоколе.

2. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. В результате исследования 18 проб, в том числе 13 содержащие вирус бешенства, 3 пробы, содержащие гетерогенные вирусы и 2 интактные пробы методом молекулярной гибридизации с использованием представленного "Набора препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной гибридизации" РНК вакцинного штамма ТС-80 обнаружена при его концентрации Ю4,0 МЛД50/Л; полимеразной цепной реакцией с использованием "Набора препаратов для выявления РНК вирусов бешенства с помощью ПЦР" РНК вируса бешенства обнаружена при содержании вируса 1-10 МЛДданп. Вирусспецифические нуклеиновые кислоты гетерогенных вирусов, интактных перевиваемых клеток почки сайт и мозга мышей не обнаружены.

2. При амплификации РНК различных вакцинных штаммов вируса бешенства («Акатлан», «ТС-80», «CVS», «Внуково-32», «SAD-B19», «Pasteur virus») и элект-рофоретическом разделении полученные продукты ПЦР и фрагменты рестрикции, по-

лученные с использованием эндонуклеаз Bam HI, Hind Ш, Rsal, TaqI, соответствуют расположению фрагментов рестрикции исследуемых штаммов вируса бешенства, представленных в схеме проекта «Методических указаний по постановке полимеразной цепной реакции при бешенстве»

3. Использование разработаишх "Набора препарате» для выявления РНК вирусов бешенства с помощью ПЦР" и нормативной документации позволяет дифференцировать вакцинные штаммы вируса бешенства. Вакцинные штаммы «Акатлан», «ТС-80» и «Внуково -32» относятся к группе ERA, вакцинный штамм . «CVS» - относится к группе С VS. Продукты амплификации РНК, выделенные из инактивированной вакцины «Rabican» к группе PV; из вакцины для оральной иммунизации диких животных против бешенства «Лисвульпен» относятся к группе SAD.

1. Учёному Сове1у ВНИИВВнМ одобрить проведённую комиссией и разработчиками работу по испытаниям "Набора препаратов для Шявления РНК вируса бешенства методом ПЦР" и "Набора препаратов для выявления РНК вируса бешенства методом молекулярной гибридизации". Директору института утвердить временные нормативные документы по изготовлению, контролю и применению испытанных наборов.

2. Провести межведомственные комиссионные испытания наборов с целью их практического применения в схеме диагностики и дифференциальной диагностики бешенства.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Члены комиссии:

ЩетниковаЛ.А. .г*}***? Пантюшенко М.С. 'V^' ^

Наумкина М. Недосеков В.