Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат фармацевтических наук Сенченко, Сергей Петрович

• Сенченко, Сергей Петрович
• кандидат фармацевтических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Сенченко, Сергей Петрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Биологическая роль лактобактерий.

1.1.1. Иммуностимулирующая активность лактобактерий.

1.1.2. Лекарственные препараты и применение ИМП.

1.2. Способы получения микробных гидролизатов.

1.3. Общая характеристика и методы анализа основных биологически активных веществ микробных гидролизатов.

1.3.1. Общая характеристика и методы анализа белковых веществ, входящих в состав микробных гидролизатов.

ГЛАВА 2 РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ГИДРОЛИЗАТОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ.

2.1. Разработка методики количественного определения общего белка.

2.2. Разработка методики количественного определения общего содержания пептидов с молекулярной массой менее 1500.

2.3. Разработка методики количественного определения общего содержания аминокислот.

2.4. Разработка методики количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий методом капиллярного электрофореза.

Выводы к главе 2.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ.

3.1. Получение гидролизатов методом термокислотного гидролиза.

3.2. Получение гидролизатов методом ферментативного гидролиза.

3.3. Выбор оптимального консерванта.

3.4. Разработка методики качественного и количественного определения нипагина методом ВЭЖХ.

Выводы к главе 3.

ГЛАВА 4. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ («Биолактон»).

4.1. Описание.

4.2. Сухой остаток.

4.3. Подлинность.

4.4. Потенциометрическое определение раствора (рН).

4.5. Номинальный объем.

4.6. Микробиологическая чистота.

4.7. Количественное определение.

4.8. Определение срока годности «Биолактона».

Выводы к главе 4.

ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА «Биолактон».

5.1. Методы исследования.

5.1.1. Моделирование интоксикации.

5.1.2. Определение малонового диальдегида ТБК.

5.1.3. Определение активности лизоцима в сыворотки крови.

5.1.4. Определение активности [3-лизинов в сыворотке крови.

5.1.5. Определение БАСК.

5.1.6. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови.

5.2. Результаты исследования.

5.2.1. Влияние курсового введения лекарственных препаратов на массу тела подопытных животных в условиях экспериментальной нормы и при интоксикации четыреххлористым углеродом.

5.2.2. Изучение эффективности профилактического введения препаратов с целью коррекции нарушений, обусловленных интоксикацией четыреххлористым углеродом.

Выводы к главе 5.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий»

Актуальность. Современная отечественная промышленность для получения лекарственных препаратов, как правило, использует лекарственное растительное сырье и продукты химического синтеза, и значительно реже для этих целей применяются бактерии. Вместе с тем, использование бактерий в качестве сырья может быть достаточно перспективным, ввиду высокого содержания в них важных биологически активных веществ. Кроме того, высокая скорость роста бактерий позволяет культивировать их в больших количествах за достаточно короткое время, что делает использование бактерий в качестве сырья рентабельным.

Среди биологически активных веществ бактерий особую ценность представляют белки, пептиды, аминокислоты, а также аминосахара, органические кислоты, витамины и т.д.

Белковые вещества бактерий могут служить источником лечебного питания, а продукты их полного гидролиза (смесь всех аминокислот) применяться для парентерального питания.

Особое значение имеют углевод-белковые биополимеры или пептидогликаны, в которых сравнительно короткие олигопептидные фрагменты присоединены к полисахаридной цепи. Примером может служить пептидогликан клеточной стенки бактерий, построенный из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенными между собой (3 (1—>4) - гликозидными связями. Линейный полисахарид связан с олигопептидными цепями через лактильные остатки мурамовой кислоты, создавая, таким образом, защитный каркас бактериальной клетки.

Заслуживает внимания также тот факт, что данные структуры и вещества содержатся только в бактериальной стенке, у животных и растений они отсутствуют. Кроме того, у грам-положительных бактерий (род Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus и др.) доля пептидогликана составляет до 70% от сухой массы клеточной стенки, тогда как у грам-отрицательных бактерий этот показатель составляет максимум 10%.

Расщепление протеогликана приводит к смеси гликопептидов, обладающих адъюваитной и противоопухолевой активностями. Наименьшей структурной единицей, проявляющей такого рода активности, является мурамилдипептид - MurNAc-L-Ala-D-GluNH2.

Мурамилдипептид и его производные обладают широким спектром биологических эффектов, наиболее важным, из которых, является плейотропное иммуномодулирующее действие. Именно с иммуномодулирующим действием связано применение производных мурамилдипептида для стимуляции естественных защитных реакций организма против опухолей и болезнетворных микроорганизмов. Кроме иммуноадъювантной, мурамилдипептид обладает противоопухолевой и антиинфекционной активностью, а также снотворными свойствами.

Производные мурамилдипептида входят в состав виросомной противогриппозной вакцины. В настоящее время существует ряд препаратов на основе производных мурамилдипептида. Например: «Ромуртид» (Япония) - иммуностимулятор после радиотерапии рака; «Мурабутид» - применяется при вторичных иммунодефицитах; «Ликопид» (Россия) - при иммунодефиците разной природы.

Благодаря этим свойствам гликопептиды бактериальной клетки привлекают пристальное внимание исследователей как потенциальные компоненты лекарственных средств.

Использование бактерий для получения гидролизных препаратов в нашей стране ранее не применялось, хотя накоплен значительный опыт культивирования бактерий в больших масштабах.

Особый интерес представляет культивирование молочнокислых бактерий. Они используются для получения эубиотических препаратов, которые находят широкое применение в медицине. Однако клиническая практика показала, что применение в нативном виде лактобактерий, зачастую оказывалось неэффективным, вследствие низкой приживаемости у рецепиентов, а также их частичной инактивации в желудке. В данном случае клинически более оправдано может быть применение продуктов гидролиза молочнокислых бактерий, которые содержат короткоцепочечные жирные кислоты, целый комплекс пептидов, аминокислоты и другие биологически активные вещества.

К числу таких препаратов можно отнести терапевтический раствор для носоглотки «ИРС-19» (Сарбах, Франция), представляющий собой лизаты различных видов бактерий (диплококки, стрептококки, стафилококки, нейссерия и др.), применяемый для стимуляции местного иммунитета. Капсулы «Бронхо-мунал» (Лек, Словения) - лиофилизированный лизат бактерий симбионтов слизистой оболочки дыхательных путей, также применяемый как иммуностимулятор.

Однако в нашей стране аналогов данным препаратам не существует. Это связано с тем, что не разработаны эффективные способы получения гидролизатов бактерий, а также нет валидированных методик оценки их качества.

В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке препарата на основе гидролизата лактобактерий, изучение его качественного и количественного состава, стабильности и биологической активности.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка методик анализа основных биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий, стандартизация и первичная фармакологическая оценка лекарственного препарата на основе гидролизата бактерий Lactobacillus acidophilus.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку спектрофотометрических методик количественного анализа общего содержания белков и пептидов на возможность их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий.

2. Изучить возможности использования методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза для качественного и количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида в гидролизатах молочнокислых бактерий, полученных различными способами и использовать данные методы для оценки их стабильности.

3. Изучить факторы, влияющие на разделение фенилизотиокарбамил-производного глюкозаминилмурамилдипептида от сопутствующих фенилизотиокарбамил-производных других пептидов и аминокислот.

4. Обосновать параметры пригодности системы для электрофоретического разделения фенилизотиокарбамил-производного глюкозаминилмурамилдипептида от сопутствующих фенилизотиокарбамил-производных других пептидов и аминокислот.

5. Выбрать оптимальный способ получения гидролизата с помощью методов термокислотного и ферментативного гидролиза и предложить эффективный консервант.

6. Провести исследования по стандартизации лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий («Биолактон») и обосновать сроки его годности.

7. Провести первичную фармакологическую оценку действия препарата «Биолактон» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных.

Научная новизна. Впервые проведена валидационная оценка фотометрических методик количественного определения белков, низкомолекулярных пептидов и аминокислот. При этом установлено, что максимальную точность и воспроизводимость результатов определения общего содержания белков и пептидов обеспечивает методика с реактивом Бенедикта, а для определения общего содержания аминокислот - методика количественного определения с суспензией меди фосфата (II).

Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены условия электрофоретического определения фенилизотиокарбамил-производного глюкозаминилмурамилдипептида в присутствии фенилизотиокарбамил-производных других пептидов и аминокислот. Показано, что полное разделение может быть достигнуто с использованием мицелярного капиллярного электрофореза, где в качестве мицеллообразующей добавки использовался натрия додецилсульфат. Установлено, что основными факторами, влияющими на электрофоретическое разделение, являются ионная сила буферного раствора, формирующая ^-потенциал, а также добавка мицеллообразующего компонента.

Изучены показатели для определения пригодности электрофоретической системы. Впервые использована величина диффузного потенциала электролита в качестве критерия пригодности системы.

При проведении выбора условий получения гидролизата молочнокислых бактерий штамма L. acidophilus В 2505 установлено, что максимальное накопление биологически активных веществ обеспечивает метод термокислотного гидролиза.

Обоснованы показатели и нормы качества лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий. С использованием физико-химических методов установлены сроки его годности - 2 года. Выбран оптимальный консервант, обеспечивающий микробиологическую стабильность в ходе хранения препарата.

В опытах на животных показано положительное влияние разработанного лекарственного препарата на общее физиологическое состояние (массу тела животных), а также на показатели клеточного иммунитета (фагоцитарная активность лейкоцитов, процент клеток с завершенным фагоцитом на 100 нейтрофилов и фагоцитарный индекс лейкоцитов). Кроме того, установлено, что в условиях желудочно-кишечных и легочных инфекционных патологий ягнят разработанный препарат в 80% случаев способствует полному выздоровлению подопытных животных.

Практическая значимость. Доказана возможность использования методов количественного определения общего содержания белков, пептидов и аминокислот при их совместном присутствии. Впервые разработана методика количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида методом капиллярного электрофореза в присутствии других пептидов и аминокислот. Предлагаемые методики могут использоваться в практике анализа любых объектах, содержащих белки пептиды и аминокислоты.

Предложены способы оценки пригодности электрофоретической системы, которые могут быть использованы для анализа других веществ методом капиллярного электрофореза.

Оптимизированы способы ферментативного и термокислотного гидролиза бактериальной массы, которые могут быть широко использованы для глубокой переработки микробиологических объектов. На основании сравнительного изучения указанных способов для практического использования рекомендован термокислотный способ гидролиза.

Внедрение результатов исследований в практику. Разработан проект ФСП на лекарственный препарат «Биолактон», представляющий собой термокислотный гидролизат молочнокислых бактерий, который передан для внедрения на опытном производстве НИИ комплексного использования молочного сырья (НИИКИМ), г. Ставрополь.

Апробация и публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены на:

1) XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005г.);

2) II конференции по медицинской биотехнологии (Анапа, 2005г.);

3) Научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.)

4) Ежегодных научных конференциях ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (Пятигорск, 2005 и 2006г.).

По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№ 06/1049).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 45 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 116 источников, из которых 3 8 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Сенченко, Сергей Петрович

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведена сравнительная оценка фотометрических методик для количественного анализа общего содержания белков и пептидов с целью их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий. Показано, что оптимальной является методика количественного определения белков и пептидов с реактивом Бенедикта.

2. Доказана возможность использования метода КЭ для количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий, полученных различными способами, а также для оценки их стабильности.

3. Определены факторы, влияющие на разделение ФТК-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных других пептидов и аминокислот.

4. Обоснованы параметры пригодности системы для электрофоретического разделения ГМДП. Показано, что одним из основных параметров пригодности электрофоретической системы является коэффициент диффузии.

5. Проведены исследования по выбору оптимального способа получения гидролизата молочнокислых бактерий. Показано, что оптимальным являлся метод термокислотного гидролиза, который применер для создания лекарственного препарата «Биолактон». Выбран консервирующий компонент - нипагин и проведена вадидационная оценка методики его количественного определения в полученном гидролизате.

6. Проведены исследования по стандартизации лекарственного препарата «Биолактон». Для нормирования качества полученного продукта, использованы следующие показатели: описание, подлинность, сухой остаток, рН, номинальный объем, количественное определение и микробиологическая чистота. В условиях естественного хранения установлен срок годности «Биолактона», который равен два года;

7. Проведена фармакологическая оценка действия «Биолактона» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных. Установлено, что «Биолактон» оказывает существенное влияние только на показатели клеточного иммунитета.

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Сенченко, Сергей Петрович, 2007 год

1. Шлегель, Г. Общая микробиология: пер. с нем. / Г. Шлегель М.: Мир, 1987.-567 с.

2. Глушанова, Н. А. Биологические свойства лактобацилл / Н.А. Глушанова // Бюл. сиб. медицины. 2003. - №4. - С.50-58.

3. Квасников, Е. И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е. И. Квасников, О.Л. Нестеренко. М.: Наука, 1975. - 389 с.

4. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Пробиотики и функциональное питание: в 3 т. /Б.А. Шендеров. М.: Грантъ, 2001. - Т. 3. - 288 с.

5. Andersson, R.E. Characteristics of the bacterial flora isolated during spontaneous lactic acid, fermentation of carrots and red beets / R.E. Andersson, // Lebensm. Wiss. + Technol. - 1984. Vol. 17. - P. 282 - 286.

6. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека / Б.А. Ефимов и др. // Журн. микробиологии 2002. - № 5. -С. 98- 104.

7. Использование молочнокислых бактерий для профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний у беременных и родильниц / Саядян О.Б. и др. // Акушерство и гинекология. 1984. - № 9. - С. 53 -55.

8. Лактофлора и колонизационная резистентность / Ленцнер А.А. и др. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - Т. 32, №3. - С. 173 - 179.

9. О специфичности микробных лизоцимов / Максимов В.И. и др. // Успехи биологии и химии. 1988. - Т. 29. - С. 218 - 230.

10. Condon, S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen / S. Condon // FEMS Microbiol. Rev. 1987. № 46. - P. 269 - 280.

11. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М.В. Тюрин и др. // Журн. микробиологии 1989. - №2. - С. 3 - 8.

12. Andersson, R.E., Daechel, М.А., Hassan, Н.М. Antibacterial activity of plantaricin SIK-83, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum / R.E.

13. Andersson, M.A. Daechel, H.M. Hassan // Biochimie. 1988. - Vol. 70. -№3. - P. 381 -390.

14. Klaenhammer, T.R. Bactericins of lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer // Biochimie. 1988. - Vol. 70, №3. - P. 337 - 349.

15. Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain / M. Silva et al. // Antimicrob. Agents and Chemother. 1987. Vol. 31, №8. - P. 1231-1233.

16. Jay, J.M. Antimicrobial properties of diacetyl / J.M. Jay // Appl. Environ. Microbiol. 1982. №44. - P. 525 - 532.

17. Антибиотические свойства Lactobacillus acidophilus «Наринэ» и пути их повышения / Г.Б. Гукасян и др. // Журн. микробиологии 2002. -№5.-С. 63-65.

18. Bjork, L. The lactoperoxidase system / L. Bjork // Natural Antimicrobial Systems. Brussels, 1985.-P. 18-30.

19. Gilliland, S.E. Antagonistic action of Lactobacillus acidophilus toward intestinal and food borne pathogens in associative cultures / S.E. Gilliland, M.L. Speck // J. Food Protect. 1977. - Vol. 40, №12. P. - 820 - 823.

20. Price, R.J. Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli / R.J. Price, J.S. Lee // J. Milk Food Technol. 1970. -Vol. 33, № 1.-P.13- 18.

21. Доронин, А.Ф. Фунуциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. М.: Грантъ, 2002. - 296с.

22. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / под. ред. Г.Г. Онищенко и др. М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. - 608 с.

23. Binding of mutagenic heterocyclic amines by intestinal and lactic acid bacteria / K. Orrhage et al. // Mutation Res. 1994. Vol. 311. - P. 239 -248.

24. Antiproliferative effect of fermented milk on the growth of a human breast cancer cell line | A. Biffi et al. // Nutr. Cancer. 1997, № 28. - P. 93 - 99.

25. Brashears, M.M. Bilesalt decohjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei / M.M. Brashears, S.E. Gilliland, L.M. Buck // J. Dairy Science. 1998. Vol. 36, №3. - P. 281 - 301.

26. Antihypertensive effect of extract of Lactobacillus casei in patients with hypertension / K. Nacajima et al. // J. Cekin. Biochem. Nutr. 1995. - Vol. 18.-P. 181 - 187.

27. Purification and characterization of an antihypertensive compound from Lactobacillus casei / H. Sawada et al. // Agric. Biol. Chem. 1990. - Vol. 54. - P. 3211 -3216.

28. Anticholesteremic and antimicrobial properties of Lactobacillus acidophilus selective by isolated from porcine sources / A.D. Danielsonet al. // J. Dairy Sci.- 1987.-Vol. 70, № i.p. 82.

29. Тюрин, M.B, Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: дис. . канд. мед. наук: 14.00.25 / М.В. Тюрин.-М., 1990.- 146 с.

30. Совместное развитие бифидобактерий и молочнокислых микроорганизмов в молоке / Т.М. Эрвольдер и др. // Биологические и физ.-хим. исследования в маслоделии и сыроделии. -.Углич, 1986. С. 87-91.

31. Иммуномодулирующее действие препаратов-эубиотиков / А.Ю. Лопатина и др. // Вест. РАМН. 1997. - №3. - С. 30 - 34.

32. Лактофлора и колонизационная резистентность / А. А. Ленцнер и др. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - Т. 32. №3. - С. 173 - 179.

33. Hajime, S. Effects of Lactobacillus casei on Pseudomonas aeruginosa infection in normal and dexamethasone treated mice / S. Hajime, W.

34. Takashi, H. Yoshiya // Microbiol. And immunol. 1986. Vol. 30, №3. - P. 249-259.

35. Farkas-Himsley, H. Bacterial proteinaceous products as cytotoxic agents of neoplasia / H. Farkas-Himsley, R. Cheung // Cancer Res. 1976. - Vol. 36, №10.-P. 3561 -3567.

36. Иммуностимулирующее действии лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков / В.М. Бондаренко и др. // Журн. микробиологии 1998. - №5. - С. 107 - 112.

37. Ericsson, K.L. Probiotic immunomodulation in health and disease / K.L. Ericsson, N.E. Hubbard // J. Nutr. 2000. - Vol. 130, №2. - P. 403 - 409.

38. Effect of administration of milk fermrmented with Lactobacillus acidophilus LA-2 on fecal mutagenicity and microflora in human intestine / M. Hosoda et al. // J. Dairy Sci. 1996. - Vol. 79, №5 - P. 745 - 749.

39. Matsuzaki, T. Augmentation of antimetastatic effect of Lewis lung carcinoma in C57B1/6 mice by priming with Lactobacillus casei / T. Matsuzaki, Y. Shimizu, T. Yokokura. // Med. Microbiol. Immunol. 1990. -Vol. 79.-P. 161 - 162.

40. Lactobacillus and Bifidobacterium mediated antigenotoxicity in the colon of rats / B.L. Pool-Zobe et al. // Nutr. Cancer. - 1996, Vol. 26, №3. - P. 365 -380.

41. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденльной патологии у детей / Е.А. Лыкова и др. // Журн.микробиологии 1996. - №2. - С. 88 - 90.

42. Роль цитокинов в модуляции иммунореактивности организма бактериями рода Lactobacillus / Т.Н. Николаева и др. // Журн. микробиологии 2004. - №6. - С. 101 - 106.

43. Ершов, Ф.И. Эра цитокинов или язык клеток / Ф.И. Ершов // Вести. РАЕН. 2002. - №2 (3). - С. 24 - 26.

44. Потапнев, М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М.П. Потапнев // Иммунология. 2002. - №4. - С. 237 -243.

45. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. 1997. - №5. -С. 7- 14.

46. Кетлинский, С.А. Роль Т-хелперов типа 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета / С.А. Кетлинский // Иммунология. 2002. -№2. -С. 11- 80.

47. Bengmark, S. Ecological control of the gastrointestinal tract / S. Bengmark // The role of probiotic flora. Gut. 1998. - Vol. 42, №1 - P. 2 - 7.

48. Boone, D. Connecting the dots from Toll-like receptors to innate immune cells and inflammatory bowel disease / D. Boone, A. Ma // J. Clin. Invest. -2003.-Vol. Ill, №9.-P. 1284- 1286.

49. Смирнов, B.C. Иммунодефицитные состояния / B.C. Смирнов, И.С. Фрейдлин. СПб: Фолиант, 2000. - 568с.

50. Модуляция клеток иммунной системы лактобактериями / В.В Зорина и др. // Журн. микробиологии 2004. - №6. - С. 57 - 60.

51. Козлов, И.Г. Лекарственные воздействия через рецепторы врождённого иммунитета Электронный ресурс. Электрон. дан.(1 файл).-М.,2004.-Режим flocTyna:http://www.peptek.ru. Загл. с экрана.

52. Иммуномодулятор ликопид в комплексном лечении заболеваний: сб. науч. ст.: в 2 ч. /ЗАО «Пептек»,- М.: Тактик-Студио, 2004. Ч. I. - 112.

53. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников.- М.: Просвещение, 1987.-815 с.

54. Zurabyan, S.E. Fundamental of bioorganic chemistry / S.E. Zurabyan, 2 nd ed. - M.: GEOTAR-MED, 2004. - 320p.

55. Медицинская микробиология / гл. ред. В.И. Покровский, O.K. Поздеев М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998. - 1200 е.: ил.

56. Маркова, Т.П. Бактериальные иммуномодуляторы / Т.П. Маркова, Д.Г. Чувиров Электронный ресурс.-Электрон, дан. (1 файл).-М., 2001.-Режим доступа: http: // www.rmj.ru /rmj/t9/nl6-17//703.htm. Загл. с экрана.

57. Биомедсервис. Имуномодуляторы Электронный ресурс.-Электрон, дан. (4 файла).-М., 2001.-Режим доступа: www.biomedservice.ru. Загл. с экрана.

58. Профилактика и лечение воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей препаратом ИРС-19 / J1.A. Лучихин и др. // Вестн. оториноларингологии. 2000. - №1. - С. 71 - 73.

59. Андронова, А. Мурамилдипептиды иммунотропные лекарственные средства нового поколения / А. Андронова, Б. Пинегин Электронный ресурс.-Электрон, дан. (1 файл).-М., 2004.-Режим доступа: http: // www.medi.ru /doc/629031 l.htm. - Загл. с экрана.

60. Henderson, В. Bacterial modulins: a novel class of virulence factors which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis / B. Henderson, S. Poole, M. Wilson // Microbiol. Mol. Biol. 1996. - Vol. 60, №2. - P. 316-341.

61. Калюжин, О.В. Производные мурамилдипептида в эксперименте и клинике / О.В. Калюжин // Журн. микробиол. 1998. - №1. - С. 104 -108.

62. Иммуномодулятор ликопид в комплексном лечении заболеваний: сб. науч. ст.: в 2 ч. / ЗАО «Пептек».- М.: Тактик-Студио, 2004. Ч. II. -132.

63. Чумакова, М.М. Ликопид эффективное и безопасное иммунотропное средство / М.М. Чумакова // Фармация. - 2002. - №3. - С. 34 - 35.

64. Клинико-иммунологическая эффективность лечения ликопидом больных хроническим бронхитом / A.M. Борисова и др. // Терапевт, арх. 1998. - Т. 70, №3. - С. 38 - 40.

65. Пептидные препараты / С.В. Ковалева и др. // Вопросы биологич. мед. и фарм. химии. 2003. - №3. - С. 5 - 12.

66. Активация клеточного иммунитета у мышей в норме и при опухолевом росте под действием глюкозаминилмурамилдипептида / А. А. Пименов и др. // Вопросы мед. химии. 1990. - Т. 36, №1. - С. 58 - 60.

67. Телишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Телишевская Л.Я. М.: Аграрная наука, 2000. - 295 с.

68. Различия в иммунном ответе, фагоцитозе и детоксицирующих свойствах под влиянием пептидных и аминокислотных препаратов / Г.А. Белокрылов и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1996. - Т. 121, №5.-С. 509-512.

69. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. 1. Изучение ростостимулирующей активности ферментативного гидролизата казеина / А.С. Пригода и др. // Биотехнология. 1990. - №2. - С. 35 -39.

70. О специфичности микробных лизоцимов / В.И. Максимов и др. // Успехи биологии и химии. 1988. - Т. 29. - С. 218 - 230.

71. Pidoux, М. Characterization of the polysaccharides from a Lactobacillus brevis and from sugary kefir grans / M. Pidoux, J.M. Brillionet, B. Qwemener // Biotechnol. Let. 1988. - Vol. 10. - P. 415-420.

72. Обзор методов определения белка с иллюстацией на медицинских препаратах / С.В. Ковалева и др. // Фармация.- 1988.- Т.37, №6.- С.72-77.

73. Использование MALDI-MS для количественного анализа пептидов и белков / О.А. Миргородская и др. // Биоорганич. химия. 2000. - Т. 26, №9.-С. 662-671.

74. Определение активности ферментов Электронный ресурс.-Электрон, дан. (1 файл).-М., 2005,-Режим доступа: http: // www.zoohall.com /ua/leftframes/referats/5.htm. Загл. с экрана.

75. Справочник биохимика: пер. с англ. / Р. Досон и др.. М.: Мир, 1991. - 544с.

76. Государственная фармакопея СССР: вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989.-400 с.

77. Гааль, Э. Электрофорез в разделении макромолекул: пер. с англ. / Э. Галь, Г. Медьеши, Л. Верецкей. М.: Мир, 1982. - 448 с.

78. Система капиллярного электрофореза. Основа метода. Аппаратура. Примеры использования систем капиллярного электрофореза «Капель-103, -104, -105». СПб: Петрополис, 2001. - 65с.

79. Рогов, А.В. Получение пептидных комплексов стресс-протективной направленности из растительного сырья: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.23 / Рогов Антон Владимировоч.-М., 2004.-24с.

80. Брещенко Е.Е. Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологической активности: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.04 / Брещенко Е.Е.-М., 2003.-24с.

81. Твердофазный синтез пептидов, содержащих аргинин с незащищенной гуанидиновой группой / А.Ю. Рубина и др. // Биоорганич.химия.-2000.-Т.26, №4.- С.263-272.

82. Применение метода ВЭЖХ в фармацевтическом анализе лекарственных средств пептидной природы / Д.М. Каширин и др. // Хим. фармац. журн. - 2000. - Т. 34, №3. - С. 45 - 47.

83. Выделение и характеристика С-пептида из генно-инженерного проинсулина человека / JT.C. Жигис и др. // Хим. фармац. журн. -1992.-№10.-С. 28-34.

84. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Ч. I. -СПб.: Мир и Семья, 2002. 964 с.

85. Фотолиз аминокарбоксилатных комплексов кобальта (III) / A.JI. Позняк и др. // Журн. неорган, химии. 1978.-Т.23, вып.8. - С. 2105 - 2112.

86. Даванков В.А. Лигандообменная хроматография / В.А. Даванков, Дж Навратил, X. Уолтон.-М.: Мир, 1989.-294с.

87. Комарова Н.В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ» / Н.В. Комарова, Я.С. Каменцев СПб.: Веда, 2006. - 212с.

88. Validation of analytical procedures: methodology Q2B / Intern, conf. on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. Geneva: ICH Secretariat, 1996. - 8 p.

89. Государственная фармакопея СССР: вып. 1. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989.-400 с.

90. Бронхо-мунал®, капсулы 7,0 мг: НД 42-8044-97 фармакоп. ст..

91. United States Pharmacopoeia. Validation of compendial methods. 2000. Vol. 24. P. 2149-2152.

92. Эпштейн, H.A. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтической анализе (обзор) / Н.А. Эпштейн // Хим. фармац. журн. 2004. - Т.38, № 4. - С 40-56.

93. British Pharmacopoeia, (2001), Vol. 11, Appendix III, A141 A144.

94. Improving the Use of CE in a chromatography world / Schmitt-Kopplin H. et al. // LC GC. 2001. - Vol. 7. - P. 384-388.

95. Muijselaar, P.G. Application of the retention index concept in micellar electrokinetic capillary chromatography / P.G. Muijselaar, H.A. Claessens, C.A. Cramers // Anal. chem. 1994. - Vol. 66. - P.635-644.

96. Nissenbaum, A. On the possible role of organic melanoidin polymers as matrices for prebiotic activity / A. Nissenbaum, D.H. Kenyon, J. Oro // J. Mol. Evol. 1975. - Vol. 6, №4. - P. 253-270.

97. Kenyon, D.H. Melanoidin and aldocyanoin microspheres: implications for chemical evolution and early precambrian micropaleontology / D.H. Kenyon, A. Nissenbaum // J.MoI. Evol. 1976. - Vol. 7, № 3. - P. 245-251.

98. Morales, F.J. Melanoidins exert a weak antiradical activity in watery fluids / F.J. Morales, M.B. Babbel. // J. Agric. Food Chem. 2002. - Vol. 50, № 16. -P. 4657-4661.

99. Antioxidative properties of products from amino acids or peptides in the reaction with glucose / N.V. Chuyen et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. -Vol.434. P.-201-212.

100. Заявка 2005103818/13 Российская Федерация, 2005103818 A. Выявление микроорганизмов / Хенкель КГаА (DE).-№ 2005103 818/13: заявл. 16.07.03: опубл. 10.11.05.-10с.

101. Заявка 2002119413/15 Российская Федерация, 2262943 С2. Сомногенная активность непатогенных молочнокислых бактерий / М.Д. Крюгер, М.Д. Пабст (US).-№ 2002119413/15: заявл. 20.12.00: опубл. 27.10.05.-14с.

102. Заявка 2004102191/13 Российская Федерация 2004102191 А. Способ получения комплекса мурамилдипептидных веществ из бактерий / B.JI. Львов, Б. В. Пинегин (РФ).-№ 2004102191/13: заявл. 28.01.04: опубл. 10.07.05.-2c.

103. Заявка 4356848/13 Российская Федерация 2023723 С1. Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных Bacillus-продуцент сериновой протеазы / Н.В. Гист-Брокейдс, А. Г. Кристиан Ван Экелен (NL).-№ 4356848/13: заявл. 26.10.88: опубл. 30.11.94.-Зс.

104. Заявка 3770904/13 SU 1732815 A3. Способ получения гипотриглициридно-активных полисахаридов / К.Э. Кабусики, К. Каихацу (8и).-№3770904/13:заявл. 26.07.84: опубл. 05.07.92.-12с.

105. Заявка 3682599 SU 1423002 A3. Способ получения белка, понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных / К.Э. Кабусики, К. Каихацу (SU).-№ 3682599: заявл. 27.12.83: опубл. 07.09.88.-6с.

106. Заявка 97116922/13 Российская Федерация, 2139348 С1. Средство для лизиса клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов / О.А. Степная, JT.A. Ледова (РФ).-№ 97116922/13: заявл. 10.06.97: опубл. 10.10.99.-9с.

107. Микробные ингибиторы лизоцима / О.В. Бухарин, А.В. Валышев // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. - №4. -С.8- 13.

108. ОСТ 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения.- Введ.2000.-01.03.-М.: Изд-во стандартов. 2000.-36с.

109. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / Меньшиков В.В. и др. / под. ред. В. В.Меньшикова.— М.: Медицина, 1987. —361с.

110. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. 2-е изд., перераб. и доп. - М., Медицина, - 2005. -832 с.

111. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура. М., 2000. - 352 с.

112. Дорофейчук, В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом / В.Г. Дорофейчук // Лаб. Дело. 1968. -№ 1.-С 28-30.

113. Бухарин, О.В. Система бета-лйзина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине// Бухарин О.В., Васильев Н.В. — Томск, изд-во Томского ун-та, 1977. С. 54-55.

114. Бухарин, О.В. Фотонефелометрический метод определения активности сыворотки крови/Бухарин О.В., Созыкин В.А.//Факторы естественного иммунитета. Оренбург, 1979. - С. 43-45.

115. Иванов, А.И. К методике определения поглотительной и переваривающей способсности нейтрофилов /Иванов А.И., Чухдлвин Б.А.//Лаб. Дело- 1967.-№ 10.-С. 108-107.г