Разработка методик и систем ввода наноколичеств образцов в масс-спектрометр для решения задач поиска и идентификации аддуктов фосфорорганических соединений с сывороточным альбумином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.01, кандидат технических наук Краснов, Илья Александрович

• Краснов, Илья Александрович
• кандидат технических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат технических наук Краснов, Илья Александрович

Цели и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы:.

Апробация работы:.

Публикации:.

Структура и объем работы:.

1. Обзор литературы.

1.1. Масс-спектромегрия. Принципы работы масс-спектрометрических приборов.

1.1.1. Общие положения.

1.1.2. Основные принципы работы времяпролетного масс-спектрометра.

1.1.3. Методы ионизации.

1.2. Фосфорорганическис соединения (ФОС).

1.3. Сывороточный альбумин, аддукты альбумина с ФОС.

1.4. Идентификация белков методами установления первичной последователыюсти.

1.4.1. Биохимические методы.

1.4.2. Масс-спектрометрические методы.

1.5. Металл-аффинная хроматография.

2. Материалы и методы.

2.1. Методы выделения сывороточного альбумина крови.

2.1.1. Аффинная хроматография.

2.1.2. SDS гель-электрофорез в ПАА.

2.2. Ферментативный гидролиз с использованием трипсина.

2.2.1. Ферментативный гидролиз белков трипсином в растворе.

2.2.2. Ферментативный гидролиз белков трипсином в геле

2.3. Металл-аффинная хроматография.

2.4. Масс-спектрометрический анализ и обработка данных.

2.4.1. Масс-спектрометрический анализ методом ESI-TOF.

2.4.2. Масс-спектрометрический анализ методом MALDI-TOF.

2.4.3. Проведение масс-спектрометрического анализа.

2.4.4. Обработка данных масс-спектрометрического анализа.

2.4.5. Анализ с помощью тандемной масс-спектрометрии.

2.5. Наноэлектроспрей (нано-ЭС).

2.6. Изготовление ВЭЖХ насадочных колонок и сборка системы ввода наноколичеств пробы в МХ-5310 на их основе.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование сывороточного альбумина человека, модифицированного RVX

3.2. Разработка методики обнаружения модифицированных ФОС аминокислот в сывороточном альбумине крови крысы.

3.2.1. Исследование альбумина сыворотки крови крысы, после добавления параоксона in vitro.

3.3. Исследование сыворотки крови крысы, после добавления параоксона in vitro.

3.4. Наноэлектроспрей.

3.5. Разработка системы ввода наноколичеств пробы в режиме хроматографирования.

3.6. Поиск аддуктов сывороточного альбумина крысы с параоксоном с использованием разработанного оборудования.

4. Основные результаты.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методик и систем ввода наноколичеств образцов в масс-спектрометр для решения задач поиска и идентификации аддуктов фосфорорганических соединений с сывороточным альбумином»

Актуальность темы.

Фосфорорганические соединения (ФОС) используются как пестициды в сельском хозяйстве, антигельминты в медицине, добавки к гидравлическим жидкостям и масло для реактивных двигателей в авиации. Эти соединения токсичны для насекомых, рыб, птиц, млекопитающих и человека. ФОС также производили для вооруженных сил многих стран мира как химическое оружие, которое в настоящее время уничтожается в соответствии с конвенцией о запрещении химического оружия.

При определении степени и самого факта воздействия на организм ФОС наиболее простыми и распространенными являются биохимические методы измерения активности холинэстераз [1]. Однако эти методы не являются специфичными, т.е. не дают информации о том, что именно послужило причиной снижения активности холинэстераз - отравление ФОС, другим веществом или заболевание нетоксикологического генеза. В случае, когда имеются веские основания полагать, что причиной снижения активности холинэстераз является отравление ФОС, часто необходимо определить, какое именно соединение вызвало отравление. Одним из стандартных методов качественного определения некоторых продуктов распада ФОС в организме (например, метилфосфоновой кислоты в случае поражения зарином, зоманом или веществом типа VX) является хромато-масс-спектрометрия в режиме статического парофазного анализа с предварительной дериватизацией. Однако этот метод имеет низкую чувствительность и предполагает многоэтапную и трудозатратную пробоподготовку, что является его существенным недостатком. Еще одна существующая методика по определению возможных модификаций белков фосфорорганическими соединениями предполагает стадию реактивации, она также очень трудоемка, но главное - она не позволяет с большой точностью определить, какое именно соединение является причиной отравления, поскольку идентифицируется только продукт гидролиза (реактивации). Поэтому в аналитической химии существует необходимость разработки новых, более удобных и эффективных методик, которые позволяли бы определять ФОС без стадии их предварительного элиминирования в смесях, обогащенных искомыми пептидами. Альтернативным подходом для идентификации воздействия ФОС на организм может служить поиск белков и пептидов внутренних сред организма, модифицированных токсичным агентом либо его метаболитами, причем наиболее удобным объектом исследования представляется сывороточный альбумин. Альбумин является мажорным компонентом белковой фракции крови, это важнейший белок-переносчик, способный транспортировать соединения различной химической природы, что дает основания предполагать образование аддуктов с токсичными агентами, в том числе с ФОС.

Однако поиск пептидов, модифицированных фосфорсодержащими соединениями, затруднен малым числом сигналов модифицированных пептидов в спектре по отношению к немодифицированным и их низкой интенсивностью. В связи с этим требуется тщательная разработка новых подходов и методик обогащения пептидных смесей фосфорсодержащими пептидами с использованием таких методов как аффинная и металл-аффинная хроматография.

Следует отметить, что основными проблемами при исследовании биологических проб являются: малое количество анализируемого вещества; несовершенство классических систем ввода пробы, используемых в отечественном масс-спектрометрическом оборудовании. Разработка новых систем на основе таких методов как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и нано-электроспрей (нано-ЭС) является необходимым условием для успешных исследований в области модификаций белков и пептидов.

В настоящее время существуют решения по созданию комплексов нано-ЖХ-ЭС-МС как в нашей стране, так и за рубежом. Эти комплексы оказываются либо слишком дороги, либо обладают рядом недостатков, к которым относятся размывание пробы после элюирования ее с колонки и высокая скорость потока (100-150 мкл/мин), требуемая для успешного хроматографического анализа, но усложняющая работу источника ионов ЭС.

На сегодняшний день единственным отечественным комплексом, сочетающим жидкостной хроматограф и масс-спектрометр, снабженный источником ионов ЭС, является тандем Милихром А2 (Институт Хроматографии,

Новосибирск) - MX 5310 (ИАП РАН СПб). Данный комплекс позволяет успешно анализировать сложные смеси при условии, что в пробе содержится примерно 200 пкМ анализируемого вещества, при этом минимальная скорость потока элюента, обеспечивающая эффективное разделение соединений, составляет 150 мкл/мин. Для того чтобы получить качественное распыление такого потока, требуется нагрев спутного газа в источнике ионов до 150°С. Все перечисленное значительно усложняет процедуру анализа и не позволяет проводить анализ образцов, содержащих единицы пикамоль соединений.

Таким образом, наряду с разработкой новых методов по обнаружению и идентификации аддуктов альбумина с ФОС, возникает необходимость создания отечественного масс-спектрометрического оборудования, которое позволяло бы эффективно проводить анализ сложных биологических проб, отличалось простотой в использовании, было экономично в расходных материалах. Примерами таких систем могут быть сочетание источников ионов нано-ЭС с времяпролетным масс-спектрометром и комплекс нано-ЖХ-ЭС-МС.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - разработать системы ввода наноколичеств жидких образцов в масс-спектрометр и методику определения аддуктов фосфорорганических соединений с сывороточным альбумином на примере вещества типа YX (RVX) и параоксона.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработать систему ввода наноколичеств пробы в отечественный масс-спектрометр МХ-5310;

2. Разработать методику обогащения образцов фосфорсодержащими пептидами, с использованием металл-аффинных сорбентов;

3. Разработать методику, позволяющую обнаруживать аддукты белков с ФОС в биопробах. Провести апробацию методик обнаружения аддуктов ФОС сывороточных альбуминов с помощью комплекса разработанных систем ввода пробы и МХ-5310;

4. Обнаружить и идентифицировать триптические пептиды сывороточного альбумина, содержащие модификации ФОС. Методом тандемной масс-спектрометрии определить точные сайты модификации белков фосфорорганическими соединениями.

Научная новизна работы.

Предложена и реализована новая система ввода наноколичеств анализируемых соединений в масс-спектрометр, совмещающая преимущества ВЭЖХ хроматографии и метода ионизации наноэлектроспрей, в которой колонка является наноэмитгером. Показана возможность использования нового комплекса наноЭС-МС для решения задач, связанных с выявлением аддуктов белков крови с фосфорорганическими соединениями.

Впервые с помощью метода металл-аффинной хроматографии проведено обогащение образцов пептидами, модифицированными фосфорорганическими соединениями.

Предложена и впервые разработана универсальная методика выделения фосфорсодержащих пептидов из биологических образцов.

Впервые обнаружены и идентифицированы аддукты сывороточного альбумина человека с RVX и сывороточного альбумина крысы с параоксоном.

Практическая значимость работы:

Система ввода наноколичеств анализируемых соединений в масс-спектрометр может быть состыкована с масс-спектрометром и применена в протеомных исследованиях.

Разработанная методика поиска аддуктов сывороточных альбуминов с фосфорорганическими соединениями может быть использована при разработке новых методик поиска маркеров интоксикации ФОС.

Основные положения, выносимые на защиту:

Источник ионов наноЭС, совмещенный с системой ввода на основе наноЖХ для масс-спектрометра МХ-5310, колонка-наноэмитгер. Результаты экспериментального сравнения разработанного источника ионов с имеющимся отечественным приборным комплексом Миллихром А02 - МХ-5310.

Методика обогащения образцов пептидами, содержащими модификации ФОС с помощью металл-аффинной хроматографии.

Универсальная методика, позволяющая обнаруживать аддукты ФОС с белками в биологических образцах.

Методика определения модификации ФОС, включающая детектирование ранее идентифицированных аддуктов с помощью разработанных систем.

Результаты экспериментального исследования сывороточных альбуминов и сывороток крови крысы и человека, обработанных соединениями, входящими в состав группы ФОС. Идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с RVX и сывороточного альбумина крысы с параоксоном.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных семинарах ИАП РАН, на 9 симпозиуме, посвященном защите от химического и биологического оружия (Гетеборг, Швеция, 2007), 5 российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), 5 съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2008), 56 конференции Американского масс-спекггрометрического общества (Денвер, США, 2008), на конференциях: «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, Россия, 2007), "МЕТРОМЕД - 2007" (Санкт-Петербург, Россия, 2007), «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, Россия, 2010).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 - в реферируемых журналах, 1 - монография, 1 - методические рекомендации, 10 статей и тезисов по материалам научно-практических конференций.

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы. Она изложена на 115 страницах и включает 44 рисунка, 9 таблиц и 101 наименование списка литературы.

Заключение диссертации по теме «Приборы и методы экспериментальной физики», Краснов, Илья Александрович

4. Основные результаты

Предложена новая отечественная система ввода наноколичеств анализируемых соединений в масс-спектрометр, совмещающая преимущества ВЭЖХ хроматографии и метода ионизации нано-электроспрей. Разработана методика получения ВЭЖХ нано колонок. Показана высокая эффективность и чувствительность разработанного комплекса нано-ЖХ-ЭС-МС по сравнению с комплексом Милихром А02 - МХ-5310.

Впервые предложена и разработана методика, позволяющая обогащать образцы фосфорсодержащими пептидами с помощью методов металл-аффинной хроматографии.

Разработана универсальная методика выделения фосфорсодержащих пептидов из биологических образцов.

Показана возможность использования комплекса нано-ЭС-МС для решения задач, связанных с выявлением аддуктов белков крови с фосфорорганическими веществами.

Впервые обнаружены и идентифицированы триптические пептиды сывороточного альбумина человека, модифицированные остатком RVX по Y411 и Y150.

Впервые обнаружены и идентифицированы триптические пептиды сывороточного альбумина крысы, модифицированные остатком параоксона по Y411 и Y150.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Краснов, Илья Александрович, 2010 год

1. Worek F, Koller M, Thiermann H, Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning. //Toxicology. 2005. 214(3):182-9

2. Thomson, J. J.: Rays of Positive Electricity and their Application to Chemical Analyses // Longmans Green: London, 1913.

3. Johnson E.G., Nier A.O. Angular aberrations in sector-shaped electromagnetic lenses for focusing beams of charged particles // Phys. Rev., 1953. 91:10.

4. Paul. Apparatus For Separating Charged Particles Of Different Specific Charges // US patent 2939952, Jun 1960.

5. Prise D., Williams J.E. Time of Flight Mass Spectrometry // Pergamon, Oxford,1969.

6. Baldeschweiler J.D. Ion cyclotron resonance spectroscopy. Cyclotron double resonance provides a new technique for the study of ion-molecule reaction mechanisms // Science, 1968. 158:263.

7. W.C. Wiley and I. H. McLaren, Time of flight mass spectrometer with improved resolution Ц Rev. Sci. Instrum. 1955. 26:1150-1151.

8. А.Т.Лебедев «Масс-спектрометрия в органической химии». Москва, Бином, 2003, С 496.

9. Мамырин Б.А., Каратаев В.И., Шмикк Д.В., Загулин В.А. // Эксп. и теор. физика. 1973. Т. 64. С. 82-89.

10. Mamyrin, В.А. Laser assisted reflection time-of-flight mass spectrometry // International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 1994. 131:1-19.

11. Spengler, В., Kirsch, D. & Kaufmann, R. Fundamental aspects of postsource decay in matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. 1. Residual gas effects // J. Phys. Chem. 1992. 96:9678-9684.

12. A. F. Dodonov, I. V. Chernushevich, V. V. Laiko, in Time-of-Flight Mass Spectrometry (Chapter 7), Ed. by R. J. Cotter, ACS Symposium Series 549, Washington, DC, 1994. 108.

13. J. H. J.Dawson, M. Guilhaus. Orthogonal acceleration time of flight mass spectrometer // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1989. 3:155- 159

14. S.M. Younger, T.D. Mark. Electron impact ionization // Berlin: Springer-Verlag. 1985.

15. Kenichi Sakata. Inductively coupled plasma mass spectrometer and method // US patent 6265717 Bl.

16. R. J. Waugh, J. H. Bowie, M. L. Gross, Austr. J. Chem. 1993. 46: 693.

17. F. W. McLafferty, Ge, S. K. Sze, Han Bin Oh, H. Zhai, M. EINagger, V. Zabrouskov, Proc.50th ASMS Conf. On Mass Spectrometry & Allied Topics', Orlando, 2002. A020721.

18. Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics // Nature. 2003. 422:198-207.

19. Александров M.JT., Галль JT.H., Краснов H.B., Николаев В.И., Шкуров В.А. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый метод масс-спектрометрического анализа // Доклады Академии наук СССР. — М.: 1984. Т. 277. № 2. С. 379-383.

20. Zaikin VG, Halket JM. Derivatization in mass spectrometry—8. Soft ionization mass spectrometry of small molecules // European journal of mass spectrometry (Chichester, England) 2006. 12 (2): 79-115.

21. Karas M., Bachmann D., Bahr D. and Hillenkamp F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987. 78:53-68.

22. Macfarlane R.D., Torgerson D.F., Chung K. et al. // Cyclotron Institute Progress Report. Texas A&M University, 1973-1974:78-80.

23. Sundqvist В, Macfarlane RD. 252Cf-Plasma Desorption Mass Spectrometry. Mass Spectrom Rev. 1985;4:421-460.

24. Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler A.N. Fast Atom Bombardment of solids as an ion source in mass spectrometry // Nature. 1981. 293:270-275.

25. Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler A.N. Fast Atom Bombardment (F.A.B.): A new Ion source in mass spectrometry // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1981. 7:325-327.

26. Caprioli R.M., Fan Т., Cottrell J.S. Continuous-flow sample probe for fast atom bombardment mass spectrometry // Anal. Chem. 1986. 58:2949-2954.

27. Iribarne J.V., Dziedic P.J. and Thomson B.A. Atmospheric Pressure Ion Evaporation Mass Spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1983. 50: 331-347.

28. Hunt D.F., Yates J.R., Shabanowitz J., Winston S. and Hauer C.R. Protein sequencing by tandem mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. 83:62336237.

29. F. Hillenkamp, M. Karas. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biopolymers. //Anal. Chem. 1991. 63(24): 1193A-1202A.

30. Michael Karas, Matthias Gluckmann and Jiirgen Schefer. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors. //J. Mass Spectrom. 2000. 35: 1-12.

31. R. Knochenmuss, A. Stortelder, K. Breuker and R. Zenobi. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization. // J. Mass Spectrom. 2000. 35(11): 1237-1245.

32. Zenobi,R. and Knochenmuss,R. Ion formation in MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 1998. 17:337-366.

33. Peschke M,Verkerk UH,Kebarle P. Features of the ESI mechanism that affect the observation of multiply charged noncovalent complexes and the determination of the association constant by the titration method. J. Am Soc Mass Spectrom. 2004. 15:14241434.

34. Winger B.A., Light-Wahl KJ. Ogorzalek Loo RR, Udseth HR, Smith RD. Observations and implications of high mass-to-charge ratio ions from electrospray ionization mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 1993. 4:536-545.

35. Chernuschevich I.V., Ens W., Standing K.G. New methods for the study of biomolecular complexes. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers. 1998. p 101.

36. Fernandez de la Mora J. 2000. Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole's charged residue mechanism. Anal Chim Acta 406:93-104.

37. Kaltashov IA, Mohimen A. 2005. Estimates of protein areas in solution byelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem 77:5370-5379.

38. Ferguson L.D., Alice M.B., M.Dole, L.L.Mack, R.L.Hines, L.D.Mobley. Molecular Beams of Macroions // J. Chem. Phys. 1968. 49(16) :2240—2256.

39. Clegg G.A., Dole M. Molecular Beams of Macrions-III // Biopolymers, 1971. 10(8):821—826.

40. M.Dole, H.L.Cox, J.Gienic. Electrospray Mass Spectrometry // Adv.Chem. Ser. 1975. 1255:73—84.

41. Kantorowitz A., Grey J. High Intensity Source for the Molecular Beam, Part I //Rev.Sci.Instrum. 1951. .22:328.

42. Blades A.T., Ikonomou M.G.,Kebarle P. Mechanism of electrospray mass spectrometry. Electrospray as an electrolysis cell //Anal Chem. 1991. 63:2109-2114.

43. Van Berkel G.J., Zhou F., Aronson J.T. Changes in bulk solution pH caused by the inherent controlled-current electrolytic process of an electrospray ion source // Int J Mass Spectrom Ion Proc. 1997. 162:55-67.

44. Smith DPH. The electrohydrodynamic atomization of liquids // Trans Ind Appl. 1986. 22:527-535.

45. Taylor G.I. The stability of horizontal fluid interface in a vertical electric field // J Fluid Mech. 1965. 2:1-15.

46. Wampler F.W., Blades A.T., Kebarle P. Negative ion electrospray mass spectrometry of nucleotides: Ionization from water solution with SF6 discharge suppression // J Am Soc Mass Spectrom. 1993 4: 289-295.

47. Wilm M., Mann M. Electrospray and Taylor-Cone Theory, Dole's beam of macromolecules at last? // Int J Mass Spectrom Ion Proc. 1994. 136: 167-180.

48. Wilm M., Mann M. Analytical properties of the nanoelectrospray ion source // Anal Chem. 1996. 68:1-8.

49. Juraschek R, Dulks T, Karas M. 1999. Nanoelectrospray—More than just a minimized-flow electrospray ion source. J Am Soc Mass Spectrom. 10:300-308.

50. Schmidt, Karas, and Dulks (2003) Effect of different solution flow rates on analyte signals in nano-ESI-MS, or: when does ESI turns in nano-ESI. J. Am. Soc. Mass-spectrom. 14:492-500.

51. Chernushevich I. V., Bahr U., Karas M. Nanospray ^taxation' and how to avoid it. Rapid Comm. in Mass Spectrom. 18(20):2479 2485.

52. Osamu Suzuki, Kanako Watanabe. Drugs and Poisons in Humans. A Handbook of Practical Analysis. // Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2005.

53. Лебедев A.T., Лебедев K.C. и др., Массспектрометрическая идентификация высокотоксичных алкилфторфосфонатов. МАСССПЕКТРОМЕТРИЯ 3 (4)' 2006. 277-283.

54. Liu J., Suzuki O., Kumazawa T. et al. Rapid isolation with Sep-Pak C18 cartridges and wide-bore capillary gas chromatography of organoposphate pesticides // Forensic Sci Int. L989. 41:67-72.

55. Hayasaka M., Kawabata S., Haba A. et al. Analysis of malathion metabolites in biological samples // Jpn J Forensic Toxicol 1994. 12:15-25.

56. Cho Y., Matsuoka N., Kamiya A. Determination of organophosphorus pesticides in biological samples of acute poisoning by HPLC with diode-array detector // Chem Pharm Bull. 1997. 45:737-740.

57. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. Jr, and Feather-Stone R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. 7:88-95.

58. Degenhardt C.E., Pleijsier K, van der Schans M.J., Langenberg J.P., Preston K.E, Solano M.I., Maggio V.L., Barr J.R. Improvements of the fluoride reactivation method for the verification of nerve agent exposure // J Anal Toxicol. 2004. 28:364-371.

59. Worek F., Thiermann H., Szinicz L., Eyer P. Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes // Biochem Pharmacol. 2004. 68:2237-2248.

60. Aurbek N., Thiermann H., Szinicz L., Eyer P., Worek F. Analysis of 'nhibition, reactivation and aging kinetics of highly toxic organophosphorus compounds with human and pig acetylcholinesterase // Toxicology. 2006. 224:91-99.

61. Black R.M., Harrison J.M., Read R.W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site // Arch Toxicol. 1999. 73:123-126.

62. Williams N. H., Harrison J. M., Read R. W., Black R. M. Phosphylated tyrosine in albumin as a biomarker of exposure to organophosphorus nerve agents. // Arch. Toxicol. 2007. 81:627-639.

63. Peeples E. S., Schopfer L. M., Duysen E. G., Spaulding R., Voelker Т., Thompson С. M., Lockridge O. Albumin, a New Biomarker of Organophosphorus Toxicant Exposure, Identified by Mass Spectrometry // Toxicological sciences. 2005. 83:303-312.

64. Ortigoza-Ferado J., Richter R. J., Hornung S. K., Motulsky A. G., Furlong C. E. Paraoxon hydrolysis in human serum mediated by a genetically variable arylesterase and albumin. // Am. J. Hum. Genet. 1984. 36:295-305.

65. Sanger F. Sequences, Sequences, and Sequences. Annual Review of Biochemistry. 1988. 57:1-29.

66. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. 1975. 250:4007-4021.

67. Shevchenko A., Jensen O.N., Podtelejnikov A.V. et al. Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. 93:14440-14445.

68. Mann M., Hojrup P. and Roepstorff P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases // Biol. Mass Spectrom. 1993. 22:338-345.

69. Лютвинский Я.И., Макаров В. В., Савельев С. К., Веренчиков А. Н., Краснов Н. В. Алгоритм извлечения аналитически значимой информации из масс-спектрометрических данных экспериментов протеомики // Научное приборостроение. 2006. 16(2):92-101.

70. Лютвинский Я.И., Веренчиков А. Н., Макаров В. В. Алгоритм IPEX-2D для извлечения информации о компонентах пробы из массивов данных (ВЭЖХ-МС)-экспериментов протеомики//Научное приборостроение. 2006. 16(3):107-114.

71. Aston F.W. The distribution of intensity along the positive ray parabolas of atoms and molecules of hydrogen and its possible explanation. Proc. Cambridge Philos. Soc. 1919. 19:317.

72. McLafferty F. W., Bente P. F., Kornfeld R., Tsai S. C, Howe I. J. Collisional activation spectra of organic ions // J. Am. Chem. Soc. 1973. 95:2120.

73. Busch K. L., Glish G. L., McLuckey S. A. Mass spectrometry/mass spectrometry. Techniques and applications of tandem mass spectrometry, VCH Publishers, Inc., USA, 1988:333.

74. Opiteck G.J., Lewis K.C., Jorgenson J.W. and Anderegg R.J. Comprehensive on-line LC/LC/MS of proteins // Anal. Chem. 1997. 69:1518-1524.

75. Deterding L.J., Moseley M.A., Tomer K.B. and Jorgenson J.W. Nanoscale separations combined with tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. 1991. 554:7382.

76. Лютвинский Я.И., Краснов H. В. Разработка CrystalTag алгоритма частичного распознавания фрагментных масс-спектров пептидов // Научное приборостроение. 2005. 15(3): 108 -114.

77. Oda Y., Nagasu Т., Chait B.T. Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome // Nat. Biotechnol. 2001. 19:379-382.

78. Chaga G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. 49:313-334.

79. Block H., Maertens В., Spriestersbach A., Brinker N., Kubicek J., Fabis R., Labahn J., Schafer F. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. // Methods in Enzymology. 2009. 463:439-473.

80. Porath J. Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography // Protein Expression and purification, 1992. 3:263-281.

81. Holmes L. D., Schiller M. R. Immobilized Iron(III) Metal Affinity Chromatography for the Separation of Phosphorylated Macromolecules: Ligands and Applications. // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 1997. 20(1):123-142.

82. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970. 227:680-685.

83. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels // Anal Chem. 1996. 68(5):850-858

84. Smith D. The electrohydrodynamic atomization of liquids // Trans Ind Appl, 1986. 22:527-535.

85. Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data // Electrophoresis. 1999. 20(18):3551-3567.

86. Pappin D.J., Hojrup P., Bleasby A.J. Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting // Curr Biol. 1993. 3(6):327-332.

87. Исия Д., Введение в микромасштабную высокоэффективную жидкостную хроматографию, Мир, 1991.101 . Chichester E.D. High performance liquid Chromatography: Principles and Methods in Biotechnology. UK: John Wiley & Sons. 1996. P.522.