Разработка метода выделения и изучение характеристик антитромбина III как основы антитромботического лекарственного препарата тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Кряжевских, Ирина Сергеевна

• Кряжевских, Ирина Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кряжевских, Ирина Сергеевна

Оглавление

Стр

Введение

Литературный обзор

Строение AT III и особенности его

функционирования

Способы выделения AT III и методы его

определения в концентрате

Лекарственные препараты на основе

белка антитромбина III

Основная часть

Материалы и методы

Обсуждения и результаты

Изучение сорбционных свойств аффинных

носителей

Разработка условий колоночной хроматографии

на Toyopearl AF-Heparin

Измерение специфической активности AT III

Оценка степени десорбции гепарина с матрицы

сорбента

Вирусная инактивация

Диализ концентрата AT III

Лиофилизация концентрата AT III

Изоэлектрофокусирование

Материальный баланс

Выводы

Список литературы

Список сокращений

СЗП - свежезамороженная плазма

ППУ - плазма после удаления факторов свертывания FVIII и FIX

КСН - криосупернатант

КП - криопреципитат

AT III - антитромбин III

FVIII - фактор свертывания VIII

FIX - фактор свертывания IX

PC - протеин С

PS - протеин S

APC - активированный протеин С

vWF - фактор фон Виллебранда

TF - тканевой фактор

TFPI - ингибитор пути тканевого фактора

Fg - фибриноген

Fn - фибрин

t-PA - альтеплаза

НМГ - низкомолекулярный гепарин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода выделения и изучение характеристик антитромбина III как основы антитромботического лекарственного препарата»

Введение *

Циркуляцию крови в организме человека можно сравнить с течением реки по плодородной равнине. Высыхание реки становиться причиной увядания долины. Аналогично и в нашем организме, большие потери крови опасны для жизни человека. В этом случае его может спасти только одно -переливание крови. Но переливание цельной крови часто приводит к серьезным осложнениям, поэтому ученые последнего столетия задались вопросом: а можно ли разделить кровь на различные компоненты, чтобы избежать тяжелых осложнений? Над воплощением этой идеи в реальность стали работать ученые разных направлений: химики, биологи, медики. Так появилась отрасль науки, называемая трансфузиологией. Благодаря их усилиям сейчас лечатся многие заболевания крови, связанные с изменениями ее состава, спасаются многие жизни людей с сильными кровотечениями и гематологическими заболеваниями.

Первое переливание крови человеку от человека осуществил английский профессор акушерства и гинекологии Дж. Бланделл (1819). Он произвел переливание крови роженице, умиравшей от кровопотери. В 1832 г. подобная операция была проведена в России акушером Г. С. Вольфом. Его пригласили к женщине, которая находилась на краю гибели от массивной кровопотери после «искусственных» родов. Вольф решил, что единственная надежда спасти больную - новая пионерская операция, названная трансфузией крови. Лишь два года назад в Лондоне он узнал о трансфузии от знаменитого акушера и физиолога Джеймса Бланделла. По возвращении в Россию Вольф привез с собой одно из трансфузиологических приспособлений Бланделла и небольшой желудочковый насос Рида. С этим оснащением Вольф и выполнил трансфузию крови женщине, обозначенной как «М.Гл.», которая впоследствии выздоровела [1]. Но не все переливания

* Работа выполнена при участии к.х.н. Берковского А.Л.

крови заканчивались выздоровлением, многие больные погибали по непонятным для врачей причинам. Медицина вплотную подошла к выяснению вопроса о несовместимости человеческой крови.

Второй период в истории переливания крови связан с развитием учения об иммунитете. Очень важную роль сыграло открытие групп крови, в результате чего были вскрыты причины некоторых посттрансфузионных осложнений, что дало возможность предупредить их. Оказалось, что осложнения при переливании крови животных человеку происходят потому, что сыворотка крови человека склеивает (агглютинирует) и разрушает кровяные тельца животных. Используя эти данные, венский бактериолог К. Ландштейнер (1901 г.) открыл законы взаимодействия эритроцитов одного человека с сывороткой другого и установил, что по свойствам крови всё человечество можно разделить на 4 группы: 0(1), А(П), В(III), АВ(1У). С открытием групп крови, её переливание как лечебный метод стал быстро развиваться. Первое переливание с учётом групп крови по совместимости произвёл в 1909 г. американский хирург Дж. Крайл. Это открытие резко сократило число осложнений. В 1940 г. был открыт резус-фактор (И1-фактор), положительный и отрицательный, названный так по имени обезьян, у которых было выявлено наличие определенных антигенов в эритроцитах.

В 1926 г. профессор Александр Александрович Богданов (Малиновский) создал первый в мире Институт переливания крови. Институту был выделен особняк бывшего купца Игумнова на Большой Якиманке. Первая операция переливания крови сотрудниками Института была проведена в том же году. Богданов писал, что переливание крови может быть не только полезным, но и единственным способом спасения человеческой жизни при сильном кровотечении. Еще в 1908 г. в романе «Красная звезда» Богданов описывает метод обменного переливания крови [2].

По мере развития медицины ученые нашли причины многих заболеваний крови, таких как гемофилия, болезнь Виллебранда, различные тромбозы и др. Выяснилось, что они связаны с врожденным недостатком или отсутствием определенного белка в плазме крови больного. Поэтому при лечении этих заболеваний пациенту показаны переливания плазмы донорской крови, в которой в норме содержатся все белки. Однако наряду с необходимым для выздоровления компонентом крови при таких переливаниях больной получает весь комплекс белков плазмы крови, осложняющих процесс лечения. Крайнюю степень осложнений больной приобретает при так называемом синдроме массивных трансфузий. При трансфузии умеренных доз плазмы фаза угнетения физиологических реакций не всегда проявляется клинически, но ее всегда можно обнаружить лабораторными методами. При массивной трансфузии плазмы донорской крови неблагоприятные эффекты многократно усиливаются. Все эти проблемы привели к развитию методов разработки лекарственных препаратов из плазмы донорской крови.

В настоящее время известно большое количество белков плазмы донорской крови. Но лишь немногие из них обладают лечебными свойствами.

Европейская схема получения препаратов плазмы

1. Раствор альбумина 5 %, 10 %, 20 %;

2. Внутривенные иммуноглобулины;

3. Гипериммунные иммуноглобулины;

4. Антитромбин III;

5. Активированный белок С;

6. Гаптоглобин;

7. Фактор IX;

8. Фактор VIII;

9. Фактор VIII-vWF;

10. Фактор X;

11. Фактор XI;

12. Фактор XIII;

13. а-кислый гликопротеид.

Препараты антитромбина III (AT III) занимают одно из ведущих мест в современной медицинской практике. Это связано с тем, что риск развития тромбозов различной этиологии возникает не только вследствие наследственных изменений, но и в процессе лечения ряда различных сложных заболеваний и постоперационной реабилитации. Образование тромба после операционного вмешательства и риск его «отрыва» является очень острой проблемой в современной медицине.

Цель данной работы заключается в разработке такого метода выделения AT III, который позволил бы получать целевой белок из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX (ППУ) с хорошим выходом без дополнительной переподготовки сырья. Это требуется для того, чтобы соблюдалась непрерывность потока исходного сырья, необходимая для обеспечения стерильности процесса фракционирования плазмы донорской крови, существующего на базе производственного отдела ГУ Гематологического научного центра.

Задачи исследования заключались в следующем:

1. Разработать метод получения антитромбина III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX в рамках расширения выпускаемых препаратов из плазмы донорской крови на базе Гематологического научного центра;

2. Оценить сорбционные свойства двух аффинных сорбентов по отношению к белку антитромбину III;

3. Разработать условия колоночной хроматографии выделения AT III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX на выбранном сорбенте;

4. Подобрать условия для вирусной инактивации AT III;

5. Выбрать стабилизаторы для лиофилизации готового концентрата AT

Научную новизну этой работы можно сформулировать следующим образом: разрабатываемая схема выделения AT III может рассматриваться как модуль, который можно встроить в любой процесс фракционирования плазмы донорской крови. Создание таких модулей для различных белков плазмы позволяет расширить количество получаемых субстанций в процессе фракционирования и снизить затраты на фракционирование плазмы и дополнительное исходное сырье. Также в работе показано преимущество использования малоизвестного сорбента Toyopearl AF-Heparin НС-650М по сравнению с популярным носителем Heparin-Sepharose FF. Использование данного аффинного носителя на стадии очистки пастеризованного концентрата AT III от продуктов деградации позволяет очистить белок на 97 % и сохранить активность белка в процессе вирусной инактивации на 83 %.

Практическая значимость состоит в том, что в настоящее время на территории России не производят препараты AT III. Их недостаток компенсируется исключительно за счет приобретения зарубежных аналогов препарата. Потребность в препаратах на основе белка AT III возрастает с каждым годом, потому что риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, трансплантация искусственных органов и сосудов и увеличение раковых больных приводят к проблемам с тромбообразованием. Разработанная нами технология применяется на базе опытно-промышленного производства препаратов плазмы в ФГБУ Гематологическом научном центре. Поэтому разработка и получение препарата AT III является актуальной проблемой в современной российской биофармацевтической промышленности.

Литературный обзор Строение AT III и особенности его функционирования

Одной из важных функций плазмы крови является поддержание системы гемостаза, которая включает в себя процессы свертывания крови и фибринолиза и обеспечивает нормальную циркуляцию крови.

Явление гемостаза, в том числе свертывание крови, представляет собой функцию организма, призванную сохранять кровь (жидкую внутреннюю среду), и обеспечивать ее циркуляцию в организме. Кровь, вытекающая из сосудов при их повреждении, в течение нескольких минут свертывается -образуется тромб, состоящий из фибриновой сетки, в петлях которой задерживаются форменные элементы и сыворотка. Все реакции, обеспечивающие образование фибринового сгустка находятся в тесной взаимосвязи.

В 1876 г. А. Шмидт опубликовал первый вариант созданной им ферментативной теории свертывания крови. Основным положением этой теории являлось признание существования фермента (фибрин-фермент), катализирующего реакцию взаимодействия фибриногена с «фибринопластическим веществом». Образование фибрина рассматривалось как следствие этой реакции. Впоследствии фибрин-фермент был переименован А. Шмидтом в тромбин. При этом было экспериментально показано, что в циркулирующей крови тромбин отсутствует, он появляется в крови, излившейся из кровеносных сосудов путем активации неактивного предшественника - протромбина, являющегося белком плазмы крови.

В зависимости от источника образования тромбопластина (кровь или ткани) предложено различать «внутреннюю» и «внешнюю» свертывающие системы. Это разделение дает возможность дифференцированного подхода к анализу процессов, совершающихся при свертывании крови, и к выяснению дефектов в этом процессе при различной патологии. В 1975 г. Б.А. Кудряшов привел следующую схему процесса свертывания крови [3]:

Внутренняя система Взаимодействие факторов V, VIII, IX, X, XI, XII,

Внешняя система Взаимодействие тканевого предшественника с факторами

V, VII, X

Протромбин

I

Тромбин + фибриноген —> фибрин

Решающей стадией, по мнению автора, является взаимодействие тромбина с фибриногеном, приводящее к образованию волокон фибрина.

Наряду с факторами, обеспечивающими свертывание крови, существенное значение имеют вещества (антикоагулянты), приводящие к инактивации тромбина или препятствующие его образованию. Эта система белков плазмы называется противосвертывающей системой. В 1957 г. Я.В. Велик [4] приводит в качестве антикоагулянтов плазмы крови гепарин, антитромбин и антитромбопластин. В совокупности антикоагулянты регулируют концентрацию активного тромбина в кровеносном русле и препятствуют образованию фибринового сгустка внутри сосудов.

Завершение процесса свертывания крови характеризуется растворением фибринового сгустка. Этот процесс называется фибринолизом. Принцип фибринолитической системы основан также на ферментативных реакциях. Белок плазминоген фибринолитической системы активируется активаторами плазминогена, образуя специфический фермент плазмин, который подобно другому ферменту системы свертывания - тромбину, катализирует превращение одной формы белка в другую [5]. Действие этих двух ферментов на один и тот же субстрат - фибриноген, изменяет его свойства в противоположных направлениях: тромбин превращает фибриноген в фибрин-мономер, а плазмин лишает фибриноген способности

свертываться ферментом. Антиплазмин, в свою очередь, взаимодействует с плазмином, нейтрализуя его.

Достижения биохимии, молекулярной и клеточной биологии последних лет привели к открытию нового семейства рецепторов, активируемых протеиназами - факторами свертывания крови, новых функций известных адгезивных белков, новых ингибиторов каскада свертывания и развитию новых знаний о функциях гемостаза. В современном представлении механизм свертывания крови определяется «триггерными» взаимодействиями [6], т.е. экспрессия тканевого фактора (TF) на поверхность эндотелия в месте повреждения сосуда запускает каскад реакций по внешнему пути свертывания крови [7]. Решающей реакцией свертывания крови по внешнему пути является активирование фактором Ха фактора II (протромбина), который приводит к образованию тромбина. Пикомолярные количества тромбина, в свою очередь, активируют факторы V и VIII, которые со-локализуются на тромбоцитах и представляют собой внутренний путь свертывания крови (рис. 1). Прикрепление тромбоцитов в месте повреждения сосуда обеспечивается с помощью мультимерной молекулы фактора фон Виллебранда (vWF), который всегда находится в комплексе с фактором VIII. Таким образом, фактор VIII закрепляется в месте повреждения и запускается внутренний путь свертывания крови.

Рис. 1. Каскад свертывания крови

В процессе свертывания крови значительную роль играют ионы кальция и фосфолипидные поверхности клеточных мембран [8]. Фактически, весь каскад осуществляется на их поверхности. Это очень важный момент, который объясняет локализацию коагуляционного каскада в зоне повреждения сосуда, то есть именно в том месте, где он необходим для остановки кровотечения. На отрицательно заряженных фосфолипидных поверхностях образуется теназный комплекс между факторами 1Ха и Villa в присутствии ионов кальция, подобным образом происходит формирование протромбиназного комплекса между факторами Ха и Va. Со-локализация этих факторов приводит к увеличению скорости превращения протромбина (фактор II) в тромбин (фактор На) почти в 300 раз [9].

С учетом данных о локализации и контроле коагуляционных реакций на различных клеточных поверхностях процесс свертывания крови в настоящее время представляется в виде трех перекрывающих друг друга фаз [10]:

1. Первая фаза - инициация свертывания крови. Развивается в тот момент, когда происходит повреждение целостности сосудистой стенки, и тканевой фактор экспрессируется на поверхности мембран. Контакт тканевого фактора с кровью приводит к образованию активного комплекса TF:VIIa, что является критическим событием для активации всего коагуляционного каскада. Малое количество тромбина, которое образуется на клетках, несущих TF, хотя и недостаточно для образования гемостатически полноценного количества фибрина, однако существенно для формирования последующих фаз свертывания крови.

2. Вторая фаза - усиление процесса свертывания, микромолярные количества тромбина, которые образуются на клетках, несущих тканевой фактор, обеспечивают в течение второй фазы усиление процесса свертывания крови за счет активации тромбоцитов и трансформации в активную форму факторов IX, XI, VIII и V.

3. Третья фаза - распространение процесса свертывания крови. Во время этой фазы происходит формирование теназного и протромбиназного комплексов. Образование теназного комплекса приводит к активации фактора X со скоростью, превышающей в 50-100 раз активацию фактора X под влиянием комплекса TF:VIIa. Протромбиназный комплекс инициирует протеолиз протромбина с образованием большого количества тромбина. Тромбин расщепляет фибриноген (Fg) и активирует фактор XIII (фибринстабилизирующий фактор), что приводит к образованию нерастворимого фибрина (Fn), необходимого для образования гемостатически эффективного сгустка.

Аналогичным образом работает и тромболитическая система крови, включая в себя ингибиторы внешнего (AT III и TFPI) и внутреннего (PC и PS) путей.

В настоящее время взаимосвязь основных белков, принимающих участие в процессе свертывания крови, всесторонне описана в научной

литературе. Роль белков тромболитической системы была предметом исследований во многих научных работах, но их взаимосвязь до сих пор до конца не определена.

Тромболитическая система представлена несколькими белками: антитромбином III (АТ III), ингибитором тканевого фактора (ТРР1), протеином С (РС) и протеином 8 (Р8). Их содержание в плазме различно [7]: Таблица 1. Содержание белков тромболитической системы в плазме:

Название белка Молекулярная масса, кДа Содержание в плазме, мкг/мл Функция

Антитромбин III 58,0 200 Ингибитор

Протеин S 69,0 21 Ингибитор / кофактор

Протеин С 62,0 3,7 Зимоген

TFPI 40,0 0,1 Ингибитор

Наибольшее по сравнению с другими ингибиторами содержание AT III в плазме обуславливает его первостепенную важность в ингибировании тромбина.

Впервые антитромбин III был выделен и описан норвежской ученой U. Abilgaard в 1967 году [11]. Для выделения она использовала адсорбцию на гидроокиси алюминия, гель-проникающую хроматографию и ионообменную хроматографию.

Антитромбин III входит в семейство антитромбинов:

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Кряжевских, Ирина Сергеевна

Выводы

1. Разработан метод получения АТ III из ППУ в соответствии с возможностью реализации его на базе ГНЦ.

2. Batch-методом выявлено преимущество использования Toyopearl AF-Heparin по сравнению с Heparin-Sepharose FF в качестве сорбента для разработки процесса хроматографического выделения АТ III. Эти результаты были подтверждены и в условиях колоночной хроматографии.

3. Оптимизированы условия колоночной хроматографии на сорбенте Toyopearl AF-Heparin:

- нагрузка на сорбент 25 МЕ/мл сорбента;

- скорость нанесения 113 см/час;

- скорость элюции 15 см/час;

- уравновешивающий буфер 0,01 М Tris, 0,06 М Na3Cit, рН 7,8;

- промежуточный буфер 0,01 М Tris, 0,06 М Na3Cit, 0,15 М NaCl рН 7,8;

- элюирующий буфер 0,01 М Tris, 0,06 М Na3Cit, 1 М NaCl рН 7,8.

4. Вирусную инактивацию концентрата АТ III предпочтительно проводить в присутствии 0,6 М цитрата натрия без предварительного диализа белка.

5. В качестве стабилизаторов лиофилизации готовой субстанции АТ III был выбран состав 1 % глицин, 0,5 % NaCl, 0,2 % Na3Cit, рН 7,4, который позволяет сохранить активность АТ III на 71,9 %.

6. Выход по белку составил 33 %;

Соотношение изоформ аф - 91:9.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кряжевских, Ирина Сергеевна, 2012 год

Список литературы

1. Исторический очерк, Первое переливание крови в России// Новое в трансфузиологии. - 2005. - выпуск 40. - стр. 88-89.

2. Вехи. К 80-летию Гематологического Научного Центра РАМН// Новое в трансфузиологии. - 2006. - выпуск 42. - стр. 69.

3. Кудряшов Б.А./ Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания// Из-во «Медицина», М. -1975.-487 с.

4. Белик Я.В., Ходорова E.JI./ Биохимия свертывания крови// Из-во Академии наук Украинской ССР, Киев. - 1957. - 171 с.

5. Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н./ Белки плазмы крови// Из-во «Беларусь», Минск - 1986. - 80 с.

6. Струкова С.М./ Свертывание крови: триггерные механизмы и регуляция// Новое в трансфузиологии. - 2004. - №38. - С.65.

7. Butenas S., Mann K.G./ Blood coagulation// Biochemistry. - 2002.

- vol. 67, No 1.- P. 5-15.

8. Henri M.N. Spronk, Jose W.P. Govers-Riemslag, Hugo ten Cate/ The blood coagulation system as a molecular machine// BioEssays.

- 2003. - vol. 25. - P. 1220-1228.

9. Mann KG., Butenas S., Brummel K./ The dynamics of thrombin formation// Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2003. - vol. 23. - P. 17-25.

10. Папаян Л.П./ Современная модель гемостаза и механизм действия препарата НовоСэвен// Проблемы гематологии. -2004.-№ 1.-е. 11-17.

11. Abildgaard, U./ Binding of thrombin to antithrombin III// Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1969. - vol. 24. - P. 23-27.

12. Абдулкадыров K.M./ Гематология: новейший справочник// Изд-во Эксмо, М.; Изд-во Сова, СПб. - 2004. - с. 238-239.

13. Fuminori Tokunaga, Tamami Goto, Sadao Wakabayashi, Takehiko Koide/ Amino Acid Sequences of Porcine Antithrombin III// J. Biochemistry. - 1994. - vol. 116. - P. 1164-1170.

14. A. Plematl/ Determination of the site-specific and isoform-specific glycosylation in human plasma-derived antithrombin by IEF and capillary HPLC-ESI-MS/MS// Proteomics. - 2005. - vol. 5. - P. 4025-4033.

15. Winge/ Purification of antithrombin-III-.alpha, and .beta.// US Patent 6.451.978.-2002.

16. Jürgen Römisch/ Quantification of Antithrombin Isoform Proportions in Plasma Samples of Healthy Subjects, Sepsis Patients, and in Antithrombin Concentrates// Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis. - 2002. - vol. 32. - P. 143-150.

17. Lei Jin, Jan Pieter Abrahams, Richard Skinner, Maurice Petitou, Robert N. Pike, Robin W. Carrell/ The anticoagulant activation of antithrombin by heparin// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1997. - vol 94.-P. 14683-14688.

18. Olson S.T., Richard В., Izaguirre G., Schedin-Weiss S., Gettins P.G.W./ Molecular mechanisms of antithrombin-heparin regulation of blood clotting proteinases. A paradigm for understanding proteinase regulation by serpin family protein proteinase ingibitors// Biochimie. - 2010. - vol. 92. - Issue 11. - P. 15871596.

19. Timothy H. Carlson/ Behavior of Antithrombin III Isofrms on Immobilized Heparins// The Journal of Biological Chemistry. -1988. - vol. 263, № 5. - Issue 15. - P. 2187-2194.

20. Jonathan Langdown, Klara J. Belzar, Wendy J. Savory, Trevor P. Baglin, James A. Huntington/ The Critical Role of Hinge-Region Expulsion in the Induced-Fit Heparin Binding Mechanism of Antithrombin// Journal of Molecular Biology. - 2009. - vol. 386. -Issue 5.-P. 1278-1289.

21. Mohamad Aman Jairajpury/ Antithrombin III Phenylalanines 122 and 121 Contribute to Its High Affinity for Heparin and Its Conformational Activation// The Journal of Biological Chemistry. -2003.-vol. 278, № 18.-Issue 2.-P. 15941-15950.

22. Daniel J D Johnson/ Antithrombin-S195A factor Xa-heparin structure reveals the allosteric mechanism of antithrombin activation// Journal of European Molecular Biology Organization.-2006. - vol. 25, №9. - P. 2029-2037.

23. Langdown J., Carter W.J., Baglin T.P., Hundington J. A J Allosteric activation of antithrombin Ulis independent of charge neutralization or reversal in the heparin binding site// Federation of European Biochemical Societies. - 2006. - vol. 580. - P. 4709-4712.

24. Dubani A.K./ Plasminogen and Tissue Plasminogen Activator interact with Antithrombin III// Thrombosis Research. - 2000. - vol 99.-Issue 6.-P. 635-641.

25. Dahm. A., Van Hylckama Vlieg A., Bendz B., Rosendaal F., Bertina RM., Sandset PM./ Low levels of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) increase the risk of venous thrombosis// Blood. -2003. - vol. 10. - P. 4387-4392.

26. Ellen Brodin, Hege Appelbom, Bjarne Osterud, Ida Hilden, Lars C. Petersen, John-Bjare Hansen/ Regulation of thrombin generation by TFPI in plasma without and with heparin// Translation Research. -2009.-vol. 153. - Issue 3,-P. 124-131.

27. Bruley DF., Duane F./ Anticoagulant blood factor deficiencies (Protein C)// Advances in experimental medicine and biology. -2007.-vol. 599.-P. 1-6.

28. Philip J. Fay, Therese M. Smudzin, Frederick J. Walker/ Activated Protein C-catalyzed Inactivation of Human Factor VIII and Factor Villa// The Journal of Biological Chemisry. - 1991. - vol. 266. - № 30. - Issue 25. - P. 20139-20145.

29. Lisa M. Regan/ Factor IXa Protects Factor FVIIIa from Activated Protein C// The Journal of Biological Chemistry. - 1994. - vol. 269, No 13, issue of April 1. - P. 9445-9452.

30. Garcia de Frutos, Pablo; Fuentes-Prior, Pablo; Hurtado, Begona; Sala, Nura/ Molecular basis of protein S deficiency// Thrombosis and Haemostasis. - 2008. - vol. 98. - Issue 3. - P. 543-556.

31. Frederick J.Walker/ Regulation of activated protein C by a new protein// The Journal of Biological Chemistry. - 1980. - vol. 255, No 12, issue of June 25. - P. 5521-5524.

32. Salwa Khan/ Hereditary thrombophilia// Thrombosis Journal. -2006. - vol. 4. - Issue 5. - P. 1186-2001.

33. Kurihara M., Watanabe K., Inoue S., Wada Y., Ono M., Wakiyama M., Kinoshita S., Hamasaki M./ Characterization of two novel mutations of antithrombin gene observed in Japanese thrombophilic patients// Thrombosis Research. - 2005. - vol. 115. - Issue 5. - P. 351-358.

34. F. Fourrier/ Meningococcemia and purpura fulminance in adults: acute deficiencies of proteins C and S and early treatment with antithrombin III concentrates// Intensive Care Medicine. - 1990. -vol. 16.-P. 121-124.

35. Tomohiro Sokomoto/ Affect of Activated Protein C on Plasma Plasminogen Activator InhibitorActivity in Patient with Acute Miocardial Infarction Treated with Alteplase// Journal of American Colledge of Cardiology. - 2003. - vol. 42, № 8. - P 1289-1394.

36. Jung H., Tae G., Kim Y./ Change of viscoelastic property and morphology of fibrin affected by antithrombin III and heparin: QCM-Z and AFM study// Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. -2009.-vol. 68.-Issue l.-P. 111-119.

37. Giancarlo Liumbruno, Francesco Bennardello, Angela Lattanzio, Pierluigi Piccoli, Gina Rossetti/ Recommendations for the use antithrombin concentrates and prothrombin complex concentrates// Blood Transfusion. - 2009. - vol. 7. - Issue 4. - P. 325-334.

38. Fu, Yi-Ping; Jin, Li-De; Shiu, Shu-Jing; Li, Dung-Ming/ Method for the recovery of fibrinogen, protrombin complex, albumin and antithrombin III from frozen plasma// TW 226333. - 2005.

39. Zhao R./ A novel matrix for high performance affinity chromatography and its application in the purification of AT III// the Joyrnal of Chromatography B-analitical technologies in the Biomedical and Life Sciences. - 2005. - vol. 816. - Issue 1-2. - p. 175-181.

40. A. L. Dawidowl, T. Rauckyte, J. Rogalski/ The Preparation of Sorbents for the Analysis of Human Antithrombin III by Means of High Performance Affinity Chromatography// Chromatographia. -1993.-vol. 37.-№3/4.-p. 168-172.

41. Tomono Sukekazu [et al.]/ Purification of antithrombin III by deactivated thrombin gel// JP58010522(A). - 1983 - 01 - 21.

42. Uemura Y., [et al.]/ Antithrombin preparation and process for the production thereof// US Patent 4.340.589. - 1982. - 07. - 20.

43. Marc Cohen, MD, FACC, Kenneth W. Mahaffey, MD, FACC, Karen Pieper, MS,Charles V. Pollack, JR, MD, Elliott M. Antman, MD, FACC, James Hoekstra, MD, Shaun G. Goodman, MD, FACC, Anatoly Langer, MD, FACC, Jacques J. Col, MD, Harvey D. White, MD, Robert M. Califf, MD, FACC, James J. Ferguson, MD, FACC/ A Subgroup Analysis of the Impact of Prerandomization Antithrombin Therapy on Outcomes in the SYNERGY Trial// Journal of the American College of Cardiology. - 2006. - vol. 48. - № 7. - P. 1346-1354.

44. Brian L.Warren/ High-Dose Antuthrombin III in Severe Sepsis// American Medical Association. - 2001. - vol. 286. - № 15. - p. 1869-1878.

45. Eibl S. [et al.]/ Method of producing an antithrombin III-heparin concentrate or a antithrombin III-heparinoid concentrate// US Patent 4.510.084. - 1985. - 04. - 09.

46. Mitra G [et al.]/ Covalently bound heparin-antithrombin III complex// US Patent 4.689.323. - 1987. - 08. - 25.

47. Linnau Y. [et al.]/ Method for purification of antithrombin III using an anion exchanger// US Patent 6.395.880. - 2002. - 05. - 28.

48. Berry L. [et al.]/ Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates// US Patent 6.562.781. - 2003. - 05. - 13.

49. Patel S., Berry L.R., Chan A.K.C./ Covalent antithrombin-heparin complexes// Thrombosis Research. - 2007. - vol. 120. - Issue 2. -P. 151-160.

50. Doenges R., Romisch J., Stauss H., Brazel D./ Separation of antithrombin III variants by micellar electrokinetic chromatography// Journal of Chromatography A. - 2001. - vol. 924.-Issue 1-2.-P. 307-313.

51. Assay of human antithrombin III./ European Pharmacopoeia 6.3.// 2006.-p. 234.

52. Esmon P. [et al.]/ Method of detecting proteolytically modified antithrombin// US Patent 5.248.596. - 1993. - 09. - 28.

53. P. M. Mannucci, C. Boyer, M. Wolf, . A. Tripodi, M. J. Larrieu/ Treatment of congenital antithrombin III deficiency with concentrates// British Journal of Haemotology. - 1982. - vol. 50. -P. 531-535.

54. Tim Edmunds, Scott M. Van Patten, Julie Pollock, Eric Hanson, Richard Bernasconi, Elizabeth Higgins, Partha Manavalan, Carol Ziomek, Harry Meade, John M. McPherson, Edward S. Cole/ Trangenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin// Blood. - 1998.-vol. 91. -№ 12.-P. 4561-4571.

55. Ideno S. [et al.]/ Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it// US Patent 5/989/593. -1999.- 11.-23.

56. Karlsson G./ Pasteurization of antithrombin III without generation of the prelatent form of antithrombin// Protein expression and purification. -2004. - vol. 35. - Issue 2. -P. 381-386.

57. Morrica A., Nardini C., Falbo A., Bailey AC., Bucci E./ Manufacturing process of anti-thrombin III concentrate: viral safety validation studies and effect of column re-use on viral clearance// Biologicals. - 2003. - vol. 31.- Issue 3. - P. 165-173.

58. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products / WHO Technical Report. - 2004. - № 924. - Annex 4. - 75 c.

59. F. Highsmith, H. Xue, X. Chen, L. Benade, J. Owens, E. Shanbrom, W. Drohan/ Iodine-Mediated Inactivation of Lipid- and Nonlipid-Enveloped Viruses in Human Antithrombin III Concentrate// Blood. - 1995. - vol. 86. - № 2. - P. 791-796.

60. Kessler CM, Tang Z, Jacobs HM, Szymanski LM/ The suprapharmacologic dosing of antithrombin concentrate for Staphylococcus aureus-induced disseminated intravascular coagulation in guinea pigs: substantial reduction in mortality and morbidity// Blood. - 1997. - vol. 89. - № 12. - P. 4393-4401.

61. Rachel Davis-Jackson, Hernan Correa, Ronald Horswell, Halina Sadowska-Krowicka, Kathleen McDonough, Chittaranjan Debata, Renee' Gardner, Duna Penn/ Antithrombin III (AT) and recombinant tissue plasminogen activator (R-TPA) used singly and in combination versus supportive care for treatment of endotoxin-induced disseminated intravascular coagulation (DIC) in the neonatal pig// Thrombosis Journal. - 2006. — P. 4-7.

62. Zhang Yanjie, Pan Jingye, Wang Mingsham/ Dual effects of antithrombin III on inflammatory factor and blood coagulatory factor in rats with hemorrhagic shock// Pharmacology. - 2006. -vol. 22.-№6.-P. 1152-1154.

63. Choi Goda, Hofstra H. Jorrit-Jan, Roelofs J.T.H. Joris, Rijneveld W. Anita, Bresser Paul, Jaring S. van der Zee, Sandrine Florquin, Tom van der Poll, Marcel Levi, Marcus J. Schultz/ Antithrombin inhibits bronchoalveolar activation of coagulation and limits lung injury during Streptococcus pneumoniae pneumonia in rats// Critical Care Medicine. - 2008. - vol. 36. - № 1. - P. 204-210.

64. SUN Hui-ming, HONG Ling-zhi, SHEN Xiao-kun, LIN Xin-qing, SONG Yong, SHI Yi/ Antithrombin-III without concomitant heparin improves endotoxin-induced acute lung injury rats by inhibiting the activation of mitogen-activated protein kinase// Chinese Medical Journal. - 2009. - vol. 122. - № 20. - P. 24662471.

65. Junji Yamashita, Kenji Nakajima, Yoichi Ohno, Yoshiaki Kaneshiro, Takato Matsuo, Kenji Kaneko/ Effects of antithrombin III (KENKETU NONTHRON) on puromycin aminonucleoside nephrosis in rats// Japanese Pharmacology & Therapeutics. - 2007. -vol. 35. -№2.-P. 169-177.

66. Nakamura K., Yoneda M., Ito Т., Takamoto S., Nakade Y., Okamoto S., Okada M., Yokohama S., Aso K., Makino I./ Antithrombin III prevents concavalin A-induced liver injury through inhibition of macrophage inflammatory protein-2 release and production of prostacyclin in mice// Journal of Hepatology. -2002. - vol. 36. - Issue 6. - P. 766-773.

67. Дрозд H.H., Макаров B.A., Мифтахова H.T., Ажигирова М.А./ Антитромботическая активность отечественного препарата AT III на модели индуцированного венозного тромбоза// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. -№ 7 - с. 75-77.

68. Busch С, Owen WG/ Identification In Vitro of an Endothelial Cell Surface Cofactor for Antithrombin III// Journal of Clinical Investigation. - 1982. - vol. 69. - P. 726-729.

69. Hockin MF, Jones КС, Everse SJ, Mann KG/ A model for the stoichiometric regulation of blood coagulation// Journal of Biological Chemistry - vol. 277. - P. 18322-18333.

70. Шибеко A.M./ Моделирование формирования фибринового сгустка и исследование влияния потока крови на этот процесс// Дисс. - 2009.

71. Citak A, Emre S, Sairin A, et al./ Hemostatic problems and thromboembolic complications in nephrotic children.// Pediatr Nephrol. 2000;14:138-42.

72. Vinazzer H./ Therapeutic use of antithrombin III in shock and disseminated intravascular coagulation.// Sem Thromb Hemost. 1989;15:347-52.

73. Beinart G, Damon L./ Thrombosis associated with Lasparaginase therapy and low fibrinogen levels in adult acute lymphoblastic leukemia// Am J Hematol. 2004;77:331-5.

74. Langley PG, Keays R, Hughes RD, et al./ Antithrombin III supplementation reduces heparin requirement and platelet loss during hemodialysis of patients with fulminant hepatic failure// Hepatology. 1991;14:251-6.

75. Дереза Т.JI./ Концентрат фактора IX системы свертывания крови и метод его получения.// RU2163140. - 2001. - 02. - 20.

76. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation/ U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration// 2001.

77. Туркова Я./ Аффинная хроматография.// Из-во «Мир», М. -1980.-с. 267-272.

78. Т. Burnouf, М. Radosevich/ Reducing the risk of infection from plasma products: specific preventative strategies.// Blood Reviews. -2000. Vol. 14. P. 94-110.

79. Uriyu K., Ohmizu A., Fukuyama H., Takechi K., Yokoyama К./ Liquid preparation of antithrombin III and stabilizing method therefor.// US Patent 5589516. - 1996. - 12.-31.

80. T. Burnouf/ Safety aspects in the manufacturing of plasma-derived coagulation factor concentrates.// Biologicals. - 1992. - Vol. 20. - P. 91-100.

81. Foster P.R., Welch A.G., McLean C., et al./ Studies on the removal of abnormal prion protein by processes esed in the manufacture of human plasma proteins.// Vox Sang. - 2000. - Vol. 78. - P. 86-95.

82. Goran Karlsson, Stefan Winge/ Separation of latent, prelatent and native forms of human antithrombin by heparin affinity high performance liquid chromatography// Protein Expression and Purification. - 2004. - vol. 33. - Issue 2. - P. 339-345.

83. Andrea Heger, Tom Grunert, Petra Schulz, Djuro Josic, Andrea Buchacher/ Separation of active and inactive forms of human antithrombin by heparin affinity chromatography// Thrombosis Research. - 2002. - vol. 106. - Issue 2. - P. 157-164.

84. Демченко А.П./ Люминисценция и динамика структуры белков.// Из-во "Наукова думка", Киев. - 1988. —280 с.

85. Liu W., Langer R., Klibanov A./ Biotech.Bioeng. - 1991. -vol. 37. -P. 177-184.

86. Hugh W. Hoogendoorn, et al/ Method for measureing antithrombin activity// US Patent 6423658. - 2002. - 08. - 13.

87. Costantino H., Shieh L., Klibanov A., Langer R./J. Control. Release. - 1997. - vol. 44. - P. 255-261.

88. Crotts G., Park T./ Stability and release of bovine serum albumin encapsulated with poly(D,L-lactice-co-glycolide) microparticles// J. Control. Release. - 1997. - vol. 44. - P. 123-134.

89. Sola-Penna M., Meyer-Fernandes J./ Stabilization against thermal inactivation promoted by sugars on enzyme structure and function: why is trehalose more effective than jther sugars./ Arch. Biochem. Biophys. - 1998.-vol. 360-№1. - P. 10-14.

90. Brande J., Landkjager L./ Chemical stability of insulin. 3. Influence of excipients, formulation, and pH// Acta Pharm. Nord. - 1992. -vol. 4-№3,-P. 149-158.

91. Chan A.K.C., Berry L.R., Paredes N., Parmar N./ Isoform composition of antithrombin in a covalent antithrombin-heparin complex// Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2003. - vol. 309. - Issue 4. - P. 986-991.

92. McCoy A.J., Pei X.Y., Skinner R., Abrahams J., Carrell R.W./ Structure of (3-antithrombin and the effect of glycosylation on antithrombin's heparin affinity and activity// Journal of Molecular Biology. - 2003. - vol. 326. - Issue 23. - P. 823-833.