Разработка метода культивирования патогенных микобактерий на перевиваемой культуре клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Алексеев, Александр Юрьевич

• Алексеев, Александр Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алексеев, Александр Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОЁЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Туберкулез

1.1.1. Туберкулез в сельском хозяйстве

1.1.2. Исторические аспекты

1.1.3. Таксономия микобактерий туберкулезного комплекса

1.1.4. Туберкулез лабораторных животных

1.2. Методы культивирования микобактерий туберкулезного комплекса

1.2.1. Исторические аспекты

1.2.2*. Морфологические, тинкториальные и культуральные 27 характеристики микобактерий туберкулезного комплекса

1.2.3. Ультраструктурная организация микобактерий 32 туберкулезного комплекса

1.2.4. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на 33 твердых питательных средах

1.2.5. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на 42 жидких питательных средах

1.2.6. Проблемы сохранения свойств музейных и коллекционных 45 штаммов микобактерий туберкулезного комплекса неизмененными при длительном культивировании

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода культивирования патогенных микобактерий на перевиваемой культуре клеток»

Актуальность.

Туберкулез представляет одну из первостепенных проблем здравоохранения, а также приводит к большим потерям среди поголовья сельскохозяйственных животных [Донченко А.С., 1998]. В связи с широким распространением туберкулеза во всем мире ВОЗ считает совершенствование диагностических средств и способов его лечения приоритетной проблемой [Global tuberculosis control // World Health Organization report, 2003].

Традиционные методы культивирования микобактерий туберкулеза все меньше удовлетворяют нуждам клиники, так как информативность микробиологических исследований явно недостаточна. Применяемые методы малоэффективны и не позволяют составить представление об истинном состоянии микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного [Головлев E.JI., 1998-6; Дорожкова И.Р., 1996].

При переходе во внешнюю среду из организма человека или животного или при резком изменении условий существования в этой среде патогенные бактерии с помощью различных сенсорных и регуляторных механизмов перестраивают работу своего генетического аппарата, что позволяет им сохранять жизнеспособность. [Roszak et. al., 1984; Гинцбург A.JI., и др., 1997; Young D.B., 2002]. Еще в 1953 г. Heinmets F. с соавторами [Heinmets F. et al., 1953] предположил, что в условиях стресса, особенно при голодании, аспорогенные бактерии существенно изменяют свою морфологию (клетки "мельчают"), темпы деления и метаболизм. Позже это было подтверждено исследованиями Е.Л. Головлева, Ю.М. Романовой и др. [Головлев Е.Л., 1998-в; Романова Ю.М. и др., 1998],. В связи с тем, что интенсивная химиотерапия повреждает различные метаболические системы микробной клетки, часть микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Жизнеспособность микобактерий снижается, что может проявляться потерей его способности к росту на общепринятых питательных средах, а также возникновением потребности в осмотически сбалансированных питательных средах [Дорожкова И.Р., 1996].

• Микробные системы обычно входят в более«сложные экологические системы, включающие как микро-, так и макроорганизмы, и члены микробной популяции часто функционируют именно в связи с процессами, идущими в макроорганизмах. Культивируя микроорганизм на искусственной среде, мы тем самым вынимаем его из процесса взаимоотношений с макроорганизмом и запускаем процесс изменения стабильности генотипа. Важно отметить, что современные методы долгого поддержания коллекционных штаммов в живом, биологически неизмененном культивируемом состоянии неэффективны, так как накоплено достаточно данных об изменениях свойств штаммов в процессе г длительного культивирования на общепринятых питательных средах. Свойства многих бактериальных патогенов изменяются уже через 2-3 пассажа при культивировании на традиционных средах [Caldwell D.E. et al., 1997; Ramirez E., Villaverde A., 1997; Олескин A.B. и др., 2000; Головлев Е.Л., 2001].

Общепризнанно, что длительное культивирование патогенных микобактерий на стандартных питательных средах приводит к изменению вирулентности (снижению) [Кузяев В.А 1972; Благодарный Я.А., Блехман

И.М.-, 1976; Голышевская В.И., 1995; Пушкарева- В.И., Боев Б.В., 1997;

Романенко В.Ф. и др., 2002; Вишневский Б.И. и др., 2002]. Несмотря на то, что для длительного культивирования рекомендовано большое количество питательных сред и способов культивирования, ни один из них не позволяет сохранять биологические свойства Mycobacterium tuberculosis complex неизменными [Донченко А.С., Донченко В.Н., 1994; Романенко

В.Ф.'и др., 2002; Вишневский Б.И. и др., 2002].

В связи с вышеизложенным, разработка метода, позволяющего сохранять биологические свойства Mycobacterium tuberculosis complex неизмененными в процессе длительного культивирования, является актуальной проблемой биологической науки.

Целью настоящей работы является разработка метода длительного культивирования патогенных микобактерий на основе перевиваемой культуры клеток и изучение сохранения биологических свойств микобактерий при его применении.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Изучение возможности использования метода культивирования на основе перевиваемой культуры клеток для длительного культивирования Mycobacterium tuberculosis.

2. Изучение морфологических и культуральных характеристик Mycobacterium tuberculosis complex при замене ростовых сред и линий перевиваемых культур клеток.

3. Изучение сохранения вирулентных свойств и лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis при длительном культивировании на перевиваемой культуре клеток.

4. Изучение чувствительности метода культивирования на культуре клеток к внесенной дозе инфицирующего агента — микобактерии туберкулеза.

5. Определение локализации Mycobacterium tuberculosis во время роста на перевиваемой культуре клеток.

Научная новизна работы.

Впервые для приближения условий культивирования Mycobacterium tuberculosis complex к естественным условиям в качестве компонента в среде использована перевиваемая культура клеток. *

Впервые достигнуто сохранение биологических свойств (морфологических, культуральных, вирулентных) Mycobacterium tuberculosis complex в процессе длительного культивирования при совместном культивировании микобактерий и перевиваемых культур клеток.

Впервые показано, что микобактерии туберкулеза не проникают в клетку во время роста на перевиваемой культуре клеток Vero.

- Теоретическая и практическая значимостб работы. г

Результаты проведенных исследований являются экспериментально-теоретической базой для решения проблемы сохранения биологических свойств выделяемых и хранящихся штаммов патогенных микобактерий в изменяющихся условиях существования.

Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулеза на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять биологические свойства микобактерий неизмененными в процессе культивирования. На метод культивирования получен патент РФ "Метод культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis" № 2209829, f от 10.08.2003г.

• Проведенные исследования позволяют использовать разработанный метод для сохранения биологических свойств патогенных микобактерий разных видов (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium) неизмененными в процессе длительного культивирования.

Разработаны методические рекомендации "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября 2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 г.). Апробация работы.

В процессе работы полученные результаты были представлены в виде стендовых сообщений на:

- Congress of ЕССО XIX (European Culture Collections' Organization), The Biological Ressource Centers and Genetics, May 11-12, 2000;

- 5-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии "Биотехнология -2001", Россия, Пущино, 25-27 сентября, 2001 г.;

- Всероссийской научной конференции "Клинические перспективы в икфектологии", посвященной 125-летию со дня рождения профессора Н.К. Розенберга и 105-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии, Россия, Санкт-Петербург, 17-18 октября, 2001 г.;

- International Conference "Molecular Mechanisms of Genetical Processes and Biotechnology", Russia-Byelorussia, Moscow-Minsk, 18-24 november, 2001;

- Второй научной конференции с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, .дальнего Востока и

Крайнего Севера", Новосибирск, Россия, 29-31 мая 2002 г.;

- International Symposium "Integrative medicine" in International Congress "Progressive Scientific Technologies for Human Health", Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), june 8-19, 2003;

- II Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики *как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья животных", Россия, Ставрополь, 2224 октября, 2003 г.;

В процессе работы полученные результаты были доложены на:

- IX International Conference "New Information Technology in Medicine and Ecology", Ukraine, Gursuf (Crimea), june 1-10, 2001;

- Конференции молодых ученых CO РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины, Россия, Новосибирск, 14-15 июня, 2001 г.; • '

- VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и'паразитологов, Москва, 26-28 марта 2002 г.;

- Satellite Symposium "New Technologies in Medicine and Biology of the 3rd Millennium" in I International Symposium "Stress and Extreme Conditions", Ukraine, Kara-Dag, Feodosia (Crimea), june 5-14,2002;

- Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова, Томск, Россия, 7-10 октября 2003 г. ,*

Разработан метод культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis, и получен патент РФ №2209829, БИ 22, 10.08.2003

Разработаны методические рекомендации "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября .2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 iv). !

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан новый метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную устойчивость микобактерий неизмененными в процессе длительного культивирования.

2. Метод культивирования на перевиваемой культуре клеток чувствительнее культивирования на жидких питательных средах в 10-100 раз.

Публикация результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов,, выводов, практических предложений, списка используемой литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 31 рисунком. Список* используемой литературы включает 173 источника, в том числе 61 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Алексеев, Александр Юрьевич

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан уникальный метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток, позволяющий сохранять их морфологические, культуральные, вирулентные характеристики и лекарственную г устойчивость неизмененными в процессе длительного культивирования. 2. Установлено, что при использовании предлагаемого метода культивирования наблюдается четыре фазы в процессе роста туберкулезных микобактерий (М tuberculosis штамм В-891, М. tuberculosis штамм В-892, М bovis штамм В-909, М avium штамм В-910), которые являются общими, и не зависят от используемой ростовой среды (BSK-II или Игла МЕМ-МД) и перевиваемой культуры клеток (Vero или ПК-91).

3. Выявлено, что патологическая картина и бактериальная обсемененность внутренних органов у животных, зараженных г микобактериями, культивируемыми на перевиваемой культуре клеток и к* микобактериями, выросшими на стандартной среде Левенштейна-Йенсена существенно отличается.

4. Разработанный метод культивирования на перевиваемой культуре клеток чувствительнее к внесенной дозе инфицирующего агента -микобактерии туберкулеза, чем метод культивирования на жидких питательных средах (Сотона, Школьниковой, Игла МЕМ-МД, Игла МЕМ-МД с лизатом Vero) в 10-100 раз. 5. Показано, что Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 при г культивировании разработанным методом не проникает в клетки перевиваемой культуры (Vero), а прикрепляется к их поверхности.

- 5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. ^ t

Разработан метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток. Материалы диссертации использованы при разработке методических рекомендаций "Метод длительного культивирования микобактерий туберкулезного комплекса на перевиваемой культуре клеток". Рекомендации утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №7 от 30 сентября 2003 г.), и подсекцией "Инфекционная патологии животных в регионе Сибири и

Дальнего Востока" ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 19 от 30 сентября 2003 г.).

1.3. Заключение

По словам профессора Дрожковой И.Р. [1996]: "В настоящее время традиционные методы выделения микобактерий туберкулеза все меньше удовлетворяют нуждам клиники, так как информативность микробиологических исследований явно недостаточна. Применяемые методы малоэффективны и не позволяют составить представление об истинном состоянии микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного". Для выделения, выращивания и определения лекарственной устойчивости микобактерий используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полу'синтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза [Головлев Е.Л., 1998-6; Дорожкова И.Р., 1996].

Жидкие среды, несмотря на их относительно простой состав, высокую чувствительность при культивировании микобактерий туберкулеза и довольно короткие сроки появления роста, имеют ряд существенных недостатков. Они легче подвергаются загрязнению, t применение их затрудняет количественную оценку роста, на них трудно получить первую генерацию микобактерий.

Более высокие показатели выделения микобактерий туберкулеза дают плотные, яичные питательные среды. При росте на них возможно получение чистой культуры, однако оптимальный рост возбудителя составляет достаточно длительный срок (8-12 недель).

Считается, что единственным достоверным методом диагностики туберкулеза в настоящее время является обнаружение микобактерий туберкулеза [Арсенин С.Л. и др., 1999]. Однако, несмотря на большое количество исследований в этой области, не существует простого, достоверного и быстрого бактериологического теста для диагностики активного туберкулеза. К сожалению, стандартные общепринятые методы бактериологического исследования при туберкулезе громоздки и часто неэффективны. Кроме того, наиболее широко применяемые методы требуют длительного времени и недостаточно чувствительны даже при мультибациллярном легочном туберкулезе, а при олигобациллярных формах процесса трудности его выявления возрастают во много раз.

Важно отметить, что указанные методы дают возможность получить информацию только о зрелой классической бактериальной (бациллярной) форме возбудителя, тогда как более ранние стадии его развития остаются вне поля зрения исследователя. Поэтому неадекватные культуральные методы могут быть причиной неудач в обнаружении ранних фаз заболевания или реактивации процесса. Кроме вышесказанного, большинство исследователей забывает, что микробные системы обычно входят в более сложные экологические системы, включающие как микро-, так и макроорганизмы, и члены микробной популяции часто функционируют именно в связи с процессами, идущими в макроорганизмах. Культивируя микроорганизм на искусственной среде, мы тем самым вынимаем его из процесса взаимоотношений с макроорганизмом и запускаем процесс изменения стабильности генотипа. Современные данные «говорят об изменении 9 свойств многих бактериальных патогенов через 2-3 пассажа при культивировании на традиционных средах[СаМ\уе11 D.E. et al., 1997; Ramirez Е., Villaverde А., 1997; Олескин А.В. и др., 2000; Головлев Е.Л., 2001].

Все это указывает на необходимость создания более совершенных способов культивирования возбудителя туберкулеза, позволяющих выделять, классифицировать, сохранять и поддерживать биологические свойства в течение нескольких пассажей для их изучения. Таким образом, разработка нового метода культивирования, 9 способного сохранять биологические свойства микобактерий туберкулеза неизменными при длительном культивировании, несомненно является актуальной целью работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ,'2.1. Материалы и методы *

2.1.1. Бактериальные штаммы.

Возбудители туберкулеза человеческого типа - Mycobacterium tuberculosis штамм В-891, Mycobacterium tuberculosis штамм В-892; возбудитель туберкулеза бычьего типа Mycobacterium bovis штамм В-909; возбудитель туберкулеза птичьего типа Mycobacterium avium штамм В-910 были выделены автором из биоматериала и задепонированы в коллекции микобактерий Института коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор".

При депонировании штаммов Mycobacterium tuberculosis В-891, *

Mycobacterium tuberculosis В-892 была отмечена их устойчивость к рифампицину 50 мг/мл и стрептомицину 50 мг/мл. Штаммы были заложены в коллекцию на 2 пассаже после выделения из биоматериала на среде Финн-2.

2.1.2. Перевиваемые культуры клеток.

Перевиваемая линия культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) была получена из Института клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор".

Перевиваемая линия культуры клеток ПК-91 (почка кошки) [патент РФ №2121501 от 19.12.94] была любезно предоставлена научным сотрудником Лаборатории изучения и мониторинга зоонозных инфекций Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" Дурымановым А.Г.

2.13. Питательные среды.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза -среда Левенштейна-Иенсена (Тюменское государственное предприятие по производству бактерийных препаратов) содержит следующие компоненты в 1 литре:

- калий фосфорнокислый однозамещенный 1,54 г.

- магний сернокислый 0,15 г.

- натрий лимоннокислый 0,38 г. аспарагин 2,31 г. ,

- глицерин 7,70 г. г малахитовый зеленый 0,26 г.

- яйцо куриное в виде яичной массы 600 мл

- дистиллированная вода до 1 литра.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза -среда Финн-2 (Тюменское государственное предприятие по производству бактерийных препаратов) содержит следующие компоненты в 1 литре: т калий фосфорнокислый однозамещенный 0,0 г. г

- магний сернокислый 0,15 г. г натрий лимоннокислый трехзамещенный 0,3 г.

- железоаммонийные квасцы 0,015 г.

- аммоний лимоннокислый однозамещенный 1,5 г.

- натрий глютаминовокислый, кислый 3,0 г.

- глицерин 6,0 г.

- малахитовый зеленый 0,2 г.

- яйцо куриное в виде яичной массы 600 мл т дистиллиррванная вода до 1 литра. , г

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза -среда Сотона содержит следующие компоненты в 1 литре:

- аспарагин 4 г.

- глицерин 60 мл

- К-ацетил-О-глюкозамин 0,4 г;

- бикарбонат Na 2,2 г; т L-глютамина 0,1 г; «

I ,*

- сыворотка бычья (или кроличья) фетальная 0,08 л. г рифампицин 0,051 г (при необходимости добавления).

- налидиксовая кислота 0,1 г.

Питательная среда для культур клеток — среда Игла MEM в модификации Дульбеко (Каталог фирмы ISN, biochemicals and reagents catalog, 2002-2003 гг, с. 791, №1033220) с 0,2% BSA (V фракция) и 15тМ Hepes содержит следующие компоненты в 1 литре:

7 питательная среда DMEM (ISN, 2002-2003,,№1033220) - навеска на

9 ,'

1 литр г BSA V фракция (ISN, 2002-2003, №194772) - 2 г

- Hepes 1 М (ISN, 2002-2003, №1688449) - 15 мл

- рифампицин 0,051 г (при необходимости добавления).

2.1.4. Лекарственные препараты.

Для определения резистентности Mycobacterium tuberculosis штамм В-891 были выбраны наиболее распространенные противотуберкулезные препараты: рифампицин, канамицин, стрептомицин, изониазид, 9 пиразинамид, этамбутол. Концентрации препарата были взяты в соответствии с инструкцией [Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, 2003]:

- Рифампицин - 50 мкг/мл (ЗАО "Брынцалов А", Москва, Россия);

- Канамицина сульфат - 50 мкг/мл (ОАО "Биохимик", Саранск, Россия);

- Стрептомицина сульфат - 50 мкг/мл (ЗАО "Брынцалов А", Москва,

Россия);

- Изониазид - 5 мкг/мл (Объединение "Мосхимфармпрепараты", Москва, Россия);

- Пиразинамид - 200 мкг/мл (Новарис Энтерпрайсиз Лтд., Ворли, Мумбай, Индия);

- Этамбутол - 10 мкг/мл (ЗАО "Макиз-Фарма", Москва, Россия). в ,*

2.1.5. Животные.

В работе использовали беспородных морских свинок весом 250300 г. Все животные были получены из питомника лабораторных животных Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН. Животные в питомнике содержались с соблюдением правил и норм кормления, содержания и гуманного обращения.

Для экспериментов использовали только здоровых животных, не контаминированных микобактериями туберкулезного комплекса. Перед заражением, случайно выбранным морским свинкам ставили реакцию

Манту по общепринятой методике [Дорожкова И.Р., 1996], вводя 0,02 мл «

ППД-туберкулина внутрикожно в наружную поверхность бедра. При отрицательной реакции через 48 часов свинок данной группы брали в опыт.

2.1.6. Культивирование микобактерий туберкулезного комплекса на плотных и жидких питательных средах.

Посевы, пассирование, наблюдения и оценка роста микобактерий туберкулезного комплекса на плотных яичных питательных средах о »

Левенштейна-Иенсена и Финн-2, а также на жидких питательных средах

Сотона и Школьниковой проводились по общепринятой методике t

Тогунова А.И., 1964; Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, 2003].

Оценка роста проводилась визуально, а также при увеличении • ^

5 X Г2,5; 10 X 12,5; 20 X 12,5 на инвертированном микроскопе. I

2.1.7. Подготовка линий перевиваемых культур клеток к совместному культивированию.

Перевиваемую линию культуры клеток Vero (почка зеленой мартышки) культивировали в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:3-1:5. Частота пересевов: по мере' образования плотного монослоя, как правило, один раз в 4-5 суток.

Перевиваемую линию культуры клеток ПК-91 (почка кошки) в лаборатории ведут в монослое, на роллерной установке в стеклянных флаконах на ростовой среде Игла MEM с добавлением 5 процентов сыворотки крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем, и 1 процента сыворотки плодов коровы. Кратность рассева: 1:4-1:7. Частота пересевов: по мере образования плотного монослоя, как правило, один раз в 5-6 суток. ^

В пластиковые флаконы с площадью поверхности 25 см 2 засевают по 1х106 (0,04x106 кл/см2) клеток на указанной ростовой среде в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37+0,5 °С. Через двое суток, при плотности монослоя клеток 10 кл/см , ростовую среду сливают и заливают среду BSK-II в объеме 10 мл или среду Игла МЕМ-МД в объеме 10 мл. Флаконы помещают в термостат при 37+0,5 °С. Визуальный осмотр культуры клеток проводят ежедневно с использованием инвертируемого микроскопа. Плотный монослой клеток при использовании среды BSK-II сохраняется до 21 суток. Плотный монослой клеток при использовании • • • среды Игла МЕМ-МД сохраняется до 14-18 суток.'

2.1.8. Техника заражения лабораторных животных.

Заражение морских свинок проводилось по общепринятой методике {Тогунова А.И., 1964] подкожно с правой стороны живота в дозе 1 мл бактериальной взвеси 5 ЕД бак. стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича). Доза для заражения была выбрана экспериментальным путем, как доза, позволяющая зараженным морским свинкам не погибать во время проведения эксперимента и наиболее точно проводить оценку внутриорганизменного распространения микобактерий.

2.1.9. Техника приготовления и окраски мазков.

Приготовленные по общепринятой методике [Биргер М.О., 1973] мазки из жидких культур, культур на плотных средах фиксировали в 95% этиловом спирте в течении 20 минут. Фиксированный мазок окрашивали по методу Циля-Нильсена [Биргер М.О., 1973}. При просмотре под микроскопом кислото- и спиртоустойчивые микобактерии красного цвета, все остальные микроорганизмы - синего.

2.1.10. Методика оценки патологических изменений внутренних органов морских свинок.

Для оценки распространения и характера туберкулезного поражения у морских свинок была использована модифицированная схема Ю.К. Вейсфейлера [1975]. По этой схеме специфические изменения в органах и лимфатических узлах оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые затем переводятся в цифровые показатели. Оценивалась степень пораженности легких, печени, селезенки, паховых лимфатических узлов определением количества и величиной измененных участков органа по схеме, согласно которой максимальное поражение составляет -н-н-, в цифровом выражении 4.Таким образом, максимальный индекс степени пораженности внутренних органов животного составляет 16 (100%). Далее общие индексы пораженности в цифровом или процентном виде вычислялись для общей группы животных в эксперименте. *

2.1.11. Методика определения КОЕ (колония образующих единиц).

В процессе культивирования микобактерий туберкулеза на жидких средах проводилось определение КОЕ, путем высева 35 мкл или 100 мкл суспендированной жидкой среды с микобактериями на плотную питательную среду Левенштейна-Иенсена, и подсчетом через 2 и 4 недели количества визуально видимых характерных колоний.

2.1.12. Методика определения высеваёмости микобактерий туберкулеза из внутренних органов морских свинок. »

Образцы для посева (10 мг.) отбирались из внутренних органов (паховый лимфатический узел, легкие, печень, селезенка) эвтаназированных морских свинок. Образцы обрабатывались по Аликаевой [ГОСТ 26072-89, СТ СЭВ 3457-81; Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, 2003]. Далее их высевали о на плотную питательную среду Левенштейна-Иенсена. На 30 сутки культивирования подсчитывались визуально видимые характерные колонии микобактерий туберкулеза, t

Полученные экспериментальные данные обрабатывались с применением математической статистики [Усович А.Т., Лебедев П.Т. 1970].

2.1.13. Электронная микроскопия образцов микобактерий.

Образцы для электронной микроскопии были залиты фиксатором (10% формалин) и переданы заведующему лабораторией патофизиологии и микроскопии Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор"

Рябчиковой Е.И.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алексеев, Александр Юрьевич, 2004 год

1. Аликаева А.П. Упрощенный метод типирования туберкулезных культур / А.П. Аликаева, Т.П. Жерносек. // Ветеринария. -1950. № 4. - С. 56.

2. Биргер М.О. Приготовление препаратов для микроскопии // В:

3. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (ред. Биргер М.О.). М., Медицина, 1973. - С. 21-33.

4. Благодарный Я. А. Природноочаговые антропозоонозы / Я.А. Благодарный, И.М. Блехман. Омск, 1976. — 235 с.

5. Борисов В.А. Экологические аспекты концепции ликвидации туберкулеза / В.А. Борисов. // Материалы Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (16-17 мая 2001 г.); Сб. науч. тр. / РАСХН СО, ВНИИБТЖ. Омск, 2001. - С. 155-157.

6. Варенко Ю.С. Модификация метода Калфина для выращиваниямикобактерий / Ю.С. Варенко, П.С. Бескровный, О.А. Ластков. // Проблемы туберкулеза. 1978. - № 3. - С. 74-76.

7. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии / Ю.К. Вейсфейлер. Будапешт, АН Венгрии, 1975. - 336 с.

8. Вишневский Б.И. Вирулентность микобактерий туберкулеза / Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская, С.Н. Васильева и др. // Проблемы туберкулеза.-2002.-№10.-С. 33-36.

9. Вуль С.М. Высеваемость микобактерий туберкулеза из различного патологического материала / С.М. Вуль, Е.М. Морейн, Г.В. Турбинер и др. // Проблемы туберкулеза. 1967. - № 5. - С. 78-82.

10. Гинцбург A.JI. Некультивируемые формы патогенных бактерий /

11. A.JT.," Гинцбург, Ю.М. Романова, Е.И. Емельяненко и др. // В: Эпидемические аспекты экологии бактерий (ред. Прозоровский С.В.). — М., Фармарус-принт, 1997.-С. 197-220.

12. Головлев E.JI. Метастабильность фенотипа у бактерий / ЕЛ. Головлев // Микробиология. 1998-а. - Т. 67 (2). - С. 149-155.

13. Головлев E.JT. О старых проблемах новой систематики бактерий// Микробиология. 1998-6. Т. 67 (2), с. 281-286.

14. Головлев E.JT. Другое состояние неспорулирующих бактерий / ЕЛ. Головлев // Микробиология. 1998-в. - Т. 67 (6). - С. 725-735.

15. Головлев E.JI. Экологическая стратегия* бактерий: специфика проблемы / E.JI. Головлев // Микробиология. 2001. - Т. 70 (4). - С. 437443.'

16. Голышевская В.И. Возбудитель туберкулеза: биохимические особенности и трудности микробиологической диагностики /

17. B.И. Голышевская // Вестник РАМН. 1995. - №7. - С. 13-15.

18. Голышевская В.И. Микробиологическая диагностика туберкулеза / В.И. Голышевская, А.А. Корнеев, JI.H. Черноусова и др. // Вестник РАМН. 1995. - №7. - С. 16-18.

19. Голышевская В.И. Совершенствование микробиологической диагностики туберкулеза / В.И. Голышевская, Т.Т. Попеску. // Проблемы туберкулеза. 1989. - № 10. - С. 38-40.

20. Донченко А.С. Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей / А.С. Донченко, В.Н. Донченко. -Новосибирск, 1994. 354 с.

21. Донченко А.С. Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов,яков, овец и пантовых оленей / А.С. Донченко, В.Н. Донченко. // РАСХН.

22. Сиб. отд ние. -Новосибирск, 1994. - 354 с. « в

23. Донченко В.Н. Выделение микобактерий из тканей животных /

24. B.Н. Донченко, А.С. Донченко, Н.И. Воробьева. // Профилактика и оздоровление животных от туберкулеза и бруцеллеза: Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд ние. ИЭВС и ДВ. - Новосибирск, 1988. - С. 28-31.

25. Донченко В.Н. Скорость и интенсивность роста Mycobacteriumbovis (штамм 8, ВИЭВ) на различных питательных*средах / В.Н. Донченко, в

26. C.В. Ионина. // Материалы Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций. Сб. науч. тр. / РАСХН СО, ВНИИБТЖ, Омск, 2001.-С. 159-161.

27. Дорожкова И.Р. L-трансформация микобактерий в свете современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в мире / И.Р. Дорожкова, З.С. Земскова, В.Н. Круду // Вестник РАМН. 1995. - №7. - С. 30-33.

28. Дурыманов А.Г. Метод культивирования микроорганизмов Mycobacterium tuberculosis / А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, А.Ю. Алексеев и др // Патент РФ №2209829, БИ 22, 10.08.2003.

29. Инструкция по диагностике туберкулеза у сельскохозяйственных животных. М., 2002. - 14 с.

30. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза // В:

31. Приказ Минздрава РФ от 21 марта 2003 года №109 "О совершенствованиипротивотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"http://edu.park.ru/public/default.asp?no=4079360) t

32. Ионина С.В. Повышение диагностической эффективности питательных сред для культивирования микобактерий туберкулеза: Автореф. дис. . канд. биологич. наук / С.В. Ионина. Новосибирск, 2001. - 18 с.

33. Кассич Ю.Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич, А.Т. Борзяк, А.Ф. Кочмарский.- Киев, Урожай, 1990. 304 с.

34. Кассич Ю.Я. Совершенствование и сравнительное изучениеметодов обработки материала из объектов • внешней Среды длхкультуральной диагностики туберкулеза / Ю.Я. Кассич, П.М. Тихонов. // t

35. Ветеринария. Киев. - 1984, Вып. 54. - С. 16-18.

36. Кассич Ю.Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич. Киев, Урожай, 1990. - 128 с.• t

37. Кисленко В.Н. Экологическая валентность Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium и ее эпизоотологическая роль: Автореф. дис. . докт. ветеринар, наук / В.Н. Кисленко. Новосибирск, 1998. - 34 с.

38. Колычев Н.М. Зоопатогенные бактерии и меры борьбы с ними / Н.М. Колычев, В.Г. Ощепков. Омск, ОмГАУ, 2001. - 632 с.

39. Корнеев А. А. К вопросу об определении лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза на плотных и жидких питательных средах / А.А. Корнеев, В.А. Пузаноов, Т.Д. Гришина // Вестник РАМН. 1995. - №7. - С. 28-29.

40. I Коронелли Т.В. Культивирование микббактерий и условно-патогенных микобактерий на среде с н-алканами / Т.В. Коронелли, Н.И. Фадеева. // Проблемы туберкулеза. 1986. -№ 9. - С. 44-47.

41. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология ивирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. Санкт-Петербург,

42. Специальная литература, 1998. 290 с. ,0

43. Косенко В.Е. Влияние обработки патологического материала (химическими веществами) на высеваемость микобактерий туберкулеза / В.Е. Косенко, A.M. Кадочкин, Н.М. Тажгалиев. // Ветеринария. 1984. -№ 5.-С.67-68.

44. Кузяев В.А. Сравнительное изучение патогенности туберкулезных и атипичных микобактерий при пассажах на телятах: Автореф. дис. . канд. ветеринар, наук / В.А. Кузяев. Ленинград, 1972. - 16 с.

45. Кульговеня П.С. Сравнительная оценка питательных сред Гельберга и Левенштейна-Иенсена для выделения микобактерий изгбактериологически отрицательного патологического материала / П.С. Кульговеня. // Здравоохранение Белоруссии. 1970. -№ 2. - С. 60-61.

46. Левина К.А. Опыт практического применения трех питательных сред для культивирования микобактерий туберкулеза / К.А. Левина // Проблемы туберкулеза. 1988. - № 6. - С. 66-67.

47. Литвин В.Ю. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде / В.Ю. Литвин, В.И. Пушкарева. // ЖМЭИ. 1994. -Приложение 1.-С. 83-87.68. . Маянский А.Н. Микобактерии: туберкулез ц микобактериозы. / А.Н.9

48. Меньшиков Д.Д. Ультраструктура микобактерий туберкулеза, L-форм микобактерий и ихреверантов: Автореф. дис. . канд. биология, наук / Д.Д. Меньшиков. М., 1971. - 19 с.

49. Микобактерии // В: Определитель бактерий Берджи Том 2 (ред. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж., Уилльямс С.), - М., Мир, 1997. -С. 606-612.72. ' Модель JI.M. Биология и биохимия туберкулезных микобактерий /

50. Л.М. Модель. М., АМН СССР, 1952. - 248 с. t

51. Овдиенко Н.П. Выделение микобактерий и чувствительность крупного рогатого скота к туберкулину / Н.П. Овдиенко. // Ветеринария. -1989.-№8.-С. 26-28.

52. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов / А.В. Олескин, И.В. Ботвинко, Е.А. Цавкелова. // Микробиология. — 2000. -Т. 69 (3).-С. 309-327.

53. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии (ред. Воробьев А.А. и Кривошеин Ю.С.). М., Мастерство, 2001. - 224 с.

54. Перельман М.Н. Туберкулез / М.Н. Перельман, В.А. Корякин, Н.М. Протопопова. -М., Медицина, 1990. 304 с.

55. Прозоров А. А. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики / А.А. Прозоров. // Микробиология. 1999. - Т. 68. - №5. С. 632-646.

56. Рыскина Т.Е. О микробиологической диагностике туберкулеза / Т.Е. Рыскина. // Проблемы туберкулеза. 1965. -№ 12. - С. 66-67.

57. Сафин М.А. Современные методы диагностики и меры борьбы с туберкулезом животных / М.А. Сафин, Г.З. Идрисов. Казань, Таткнигоиздат, 1992. - 168 с.

58. Смолянинов Ю.И. Экономические потери от туберкулеза животных / Ю.И. Смолянинов, В.Г. Ощепков. // Большой Целевой Журнал о туберкулезе. 2000. - № 10. - С. 38-39.

59. Сомов Г.П. О миксотрофии патогенных бактерий / Г.П. Сомов, JI.C. Бузолева, С.А. Черкасова и др. // ЖМЭИ. 1994. - № 5. - С. 3-6.

60. Таллер Л.А. Совершенствование лабораторных методов выделения и идентификации микобактерий туберкулеза у крупно рогатого скота: Автореф. дис. канд. ветеринар, наук / Л.А. Талле^р. Омск, 1995. - 19 с.

61. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред / М.И. Тарков. — Кишинев, Штиинца, 1972. — 166 с.

62. Телишевская Л.Я. Контроль и стандартизация компонентов и питательных сред бактериальных культур / Л.Я. Телишевская, А.П. Простяков, С.И. Цыганкова и др. // Бюл. ВИЭВ. 1983. - Вып. 49. -С. 83-90.•

63. Терских В.И. Сапронозы (о болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания) / В.И. Терских // ЖМЭИ.- 1958.-№8.-С. 118-122.

64. Тогунова А.И. Туберкулез / А.И. Тогу нова // В: Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней (ред. Матвеев

65. Финкель Е.А. Сухие питательные среды для диагностики туберкулеза / Е.А. Финкель, Ю.Б. Погребинская. Фрунзе, Кыргызстан, 1977.- 130 с.

66. Финн Э.Р. Пути повышения высеваемости и ускорения роста микобактерий туберкулеза / Э.Р. Финн // Проблемы туберкулеза. -1974. № 12.-С. 72-75.

67. Финн Э.Р. Пути повышения высеваемости и ускорения роста микобактерий туберкулеза в современных условиях их изменчивости:I

68. Автореф. дис. . канд. ветеринар, наук / Э.Р. Финн. — Кишинев, 1973. -20 с.

69. Хазипов Н.З. Туберкулез крупного рогатого скота / Н.З. Хазипов, М.А. Сафин, Г.З. Идрисов. М., Агропромиздат, 1985. - 127 с.

70. Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека / Б.Л. Черкасский. М., Медицинская газета, 1994. - 617 с.

71. Черкес Ф.К. Руководство к практическим занятиям по микробиологическим исследованиям / Ф.К. Черкес. М., Медицина, 1980.-307 с. «

72. Шайхаев Г.О. Туберкулез проблема не только социальная / Г.О. Шайхаев // Природа. - 1999. - №10. - С. 8-12.

73. Шаров А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение ее эффективности: Автореф. дис. .«докт. ветеринар, наук / А.Н. Шаров. М., 1989. - 31 с.

74. Шлегель Г.Г. История микробиологии (пер. с нем. Мирчик Т.Г.) / Г.Г. Шлегель М., Едиториал УРСС, 2002. - 304 с.г

75. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных (ред. Конопаткин А.А.). М., Колос, 1984, 537 с.

76. Юсковец М.К. Туберкулез домашних животных и методы борьбы с ним / М.К. Юсковец М., Сельхозгиз, 1948. - 240 с.

77. Ященко Т.Н. Лабораторная диагностика туберкулеза / Т.Н. Ященко. М., Медицина, 1969. - 24 с.

78. Aranaz A. Restriction fragment length polymorphism and spacer oligonucleotide typing: a comparative analysis of fingerprinting strategies for

79. Mycobacterium bovis / A. Aranaz, E. Liebana, A. Mateos et al. // Veterinarymicrobiology. 1998. - V. 61. - P. 311 -324.

80. Bermudez L.E. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells / L.E. Bermudez, J. Goodman // Infection and Immunity. 1996. - V. 64(4). - P. 1400-1406.

81. Bloom B.R. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer / B.R. Bloom, C.J.L. Murray// Science. 1992. - V. 257. - P. 1055-1064.

82. Journal of clinical microbiology. 1999. - V. 37(6). - P. 2013-2015.

83. Dietrich G. Isplation of RNA from mycobacteria grown under in vitro and in vivo conditions / G. Dietrich, U.E. Schaible, K.D. Diehl et al. // FEMS Microbiology Letters. 2000. - V. 186(2). - P. 177-180.

84. Dubo, S.R. Media for tubercle bacill / S.R. Dubo, G. Middlebrook // American review of tuberculosis. 1947. - V. 56, № - P. 334-335.

85. Falcone V. Growth of recombinant Mycobacterium tuberculosis H37Rain mouse macrophages / V. Falcone, F. Collins // Clinical and experimentalimmunology. 1997. - V. 109( 1). - P. 80-83. в

86. Gallagher J. A selective olei acid albumin agar medium for the cultivation of M. bovis / J. Gallagher, D.M. Horwill // The Journal of hygiene. -1974. V. 79, № 7. - P. 155-158.

87. Global tuberculosis control surveillance, planning, financing// WHO report. - Geneva, 2003. - 229 p.www.who.int/gtb/publications/globrep/pdf/tbreprintfinal.pdf).

88. Heifets L. New agar medium for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide / L. Heifets, T. Sanchez // Journal of clinical microbiology. 200.0. - V. 38(4). - P. 1498-1501.r

89. Heinments F. The use of metabolites in the restoration of the viability of heat and chemically inactivated Escherichia coli / F. Heinments, W.W. Taylor, J.J. Lehman // Journal Bacteriology. 1953. - №67. - P. 5-14.

90. Hussong D. Viable Legionella Pneumophila not detectable by culture on agar medium / D. Hussong, R.R. Colwell, M. O'Brien // Bio/Technologv. -1987.-V. 5.-P. 947-950.

91. Kuang T. The study on the simplified agar media for mycobacteria / T. Kuang, P. Song, L. Wang et al. // Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta microbiologica Sinica. 1995. - V.35(4). - P. 298-302.r

92. McDonough K.A. Pathogenesis of tuberculosis: interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages / K.A. McDonough, Y. Kress,

93. B.R. Bloom // Infection and Immunity. 1993. - V. 61(7). - P. 2763-2773.

94. Mehta P.K. Comparison of in vitro models for the study of Mycobacterium tuberculosis invasion and intracellular replication / P.K. Mehta,

95. C.H. King, E.H. White et al. // Infection and Immunity. 1996. - V. 64(7). - P. 2673-2679.

96. Middlebrook G. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods / G. Middlebrook, M.L. Cohn // American Journal of Public Health. 1958. - V. 48. - P. 844-853.

97. Petrini B. Drug-resistant and multidrug-resistant tubercle bacilli / B. Petrini, S. HofFner// International Journal of Antimicrobial Agents. 1999. - V. 13.-P. 93-97.

98. Piddington D.L. Growth of Mycobacterium tuberculosis in a defined medium is very restricted by acid pH and Mg (2+) levels / D.L. Piddington A. Kashkouli, N.A. Buchmeier // Infection and Immunity 2000. - V. 68 (8). - P. 4518-4522.

99. Ramirez E. Viral spread within ageing bacterial populations / E. Ramirez, A. Villaverde // Gene. 1997. - №202. - P. 147-149.

100. Roszak D.B. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems / D.B. Roszak, D.J. Grimes, R.R. Colwell // Canadian Journal of Microbiology. 1984. - V. 30. - P. 33-338.

101. Sarma L.V. Rapid cultivation of Mycobacterium tuberculosis in liquid medium / L.V. Sarma // Indian journal of medical sciences. 1998 - V. 52(8). -P. 352-256.

102. Sechi L.A. Different strategies for molecular differentiation of Mycobacterium bovis strains isolated in Sardinia, Italy / L.A. Sechi, G. Leori, S.A. Lollai et al. // Applied and environmental microbiology. 1999. - V. 65(4). -P. 1781-1785.

103. Sun Z. Spent culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis H37Ra improves viability of aged cultures of this strain and allows small inocula to initiate growth / Z. Sun, Y. Zhang // Journal of bacteriology. 1999. - V. 181(24).-P. 7626-7628.

104. Weerman G.M. Use of a modified JH11 -agar to increase growth rate of M. bovis from bovine tissus / G.M. Weerman, J.C. Pike, J.I. Fox // Australian Veterinary Journal. 1986. - V. 63, № 10. - P. 348-349.

105. Microbiology. 2002. - №148. - P. 2915-2917.171.' Young D.B. Approaches to combat tuberculosis / D.B. Young, B.D. Robertson // Current opinion in biotechnology. 1998. - V. 9. - P. 650-652.

106. Zhang M. Growth of virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis strains in human macrophages / M. Zhang, J. Gong, Y: Lin et al. // Infection andr1.munity. 1998. - V. 66(2). - P. 794-799.