Разработка метода иммобилизации белков в микрочипах для иммуноферментного анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Авсеенко, Наталья Викторовна

• Авсеенко, Наталья Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Авсеенко, Наталья Викторовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Методы изготовления микрочипов.

1. Синтез вещества на микроматрице.

2. Методы нанесения вещества на микрочипы.

2.1. Последовательные методы:.

2.2. Параллельные методы.

II. Электронапыление. Различные применения и подробное описание метода.

1. Применение электронапыления для изготовления тонких источников радиоактивности.

2. Применение электрораспыления в масс-спектрометрии.

2.1. Явление электрораспыления. Теория метода.

3. Сохраняют ли молекулы нативное состояние при электрораспылении?

4. Применение электрораспыления для изучения третичной структуры белковых ионов в газовой фазе.

5. Применение электронапыления в изготовлении образцов для туннельной микроскопии.

6. Другие известные применения явления электрораспыления.

7. Применение электронапыления для изготовления микрочипов.

III. Методы иммобилизации белков на микрочипах.

1. Адсорбция.

2. Химическое привязывание.

2.1. Пришивание глутаровым альдегидом.

2.2. Ковалентная пришивка через производные силана.

2.3. Пришивка белков к поверхности золота через тиоловые группы.

2.4. Декстрановые спейсоры для пришивки белков и способы их активации.

2.5. Пришивка белков через Ж^-концевые гистидины (Н1з

§) к никилированному стеклу.

3. Иммобилизация в пористых средах.

3.1. Иммобилизация белков на фильтрах.

3.2. Иммобилизация белков в ПААГ.

IV. Анализ методов регистрации в иммунохимическом гетерогенном анализе.

1. РИА.

2. ФИА.

3. ИФА.

V. Конкретные примеры изготовления и применения белковых микрочипов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода иммобилизации белков в микрочипах для иммуноферментного анализа»

Общая тенденция в современных биологических исследованиях -накопление все большего объема информации и оперирование с большими объемами данных. От исследования отдельных генов биологи перешли к исследованию целых геномов. Многие современные генетические, фармацевтические и клинические анализы, анализы загрязнений среды и пищевых продуктов требуют параллельного проведения сотен и даже тысяч однотипных тестов.

На смену рутинным аналитическим методам приходят микрочипы (микроматрицы) - аналитические устройства, позволяющие производить параллельный, одновременный анализ многих взаимодействий биологических молекул с использованием минимальных количеств анализируемого материала. В простейшем случае - это решетка из точек (пятен) биологических молекул, упорядоченно расположенных на поверхности подходящего субстрата. Миниатюризация и объединение аналогичных тестовых систем на одном носителе не только позволяет значительно уменьшить затраты времени и реактивов, но и дает возможность одновременного проведения множества тестов, повышает достоверность их сравнительного анализа.

Огромный вклад в развитие микрочипов внес профессор Р. Экинс из Лондонского университета, еще в середине 80-х годов обративший внимание научной общественности на то, что размеры аналитической системы в иммунологии могут быть существенно уменьшены без потери чувствительности. Он показал теоретически, а затем и на опытных образцах, что уменьшение размеров аналитического пятна экономически выгодно, позволяет сократить время и дает возможность создания мультикомпонентных аналитических систем [25,29,28,26,27].

Работа над самым глобальным биологическим проектом последнего десятилетия - «Геномом человека» стимулировала развитие высокопроизводительных методов анализа и в первую очередь -олигонуклеотидных микроматриц. Такие микрочипы в настоящее время включают до 400 тысяч различных нуклеотидов на микроматрице размером с почтовую марку.

Завершение геномного проекта ставит следующую грандиозную задачу в биологических исследованиях - понимание функции открытых генов. Один из популярных подходов, названный «Протеомикой» по аналогии с «Геномикой», состоит в использовании комбинации двумерного электрофореза в полиакриламидном геле с последующим масс-спектрометрическим анализом первичной структуры разделенных денатурированных белков. Протеомные исследования такого рода могут установить гены, продуктом которых являются белки, наличие посттрансляционных модификаций и предполагаемую функцию белка. Необходимым условием является гомологичность первичной структуры исследуемого белка структуре другого белка с известной функцией, либо принадлежность гена исследуемого белка к известному оперону. Однако примерно 40-50% генов неизвестных белков не удовлетворяет этим условиям [12,130]. Белковые микрочипы могут стать мощным средством для определения функциональных свойств таких белков-«сирот» при проведении массового тестирования каталитических свойств белков, определения их способности взаимодействовать с другими компонентами живой клетки.

Белковые микрочипы могут оказаться также чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфическихаллергенов. Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы) позволили бы анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции. Таким образом, разработка белковых микрочипов является очень актуальной и перспективной задачей.

ДНК-микрочипы уже производятся промышленно и успешно применяются в науке и медицине [108]. Технология изготовления белковых микрочипов значительно отстает в своем развитии от ДНК-микрочипов. Причин этому несколько: во-первых, ДНК-микрочипы были востребованы проектом «Геном человека»; во-вторых, белки являются молекулами более разнообразными в химическом и физическом плане; в третьих, молекулы ДНК более стабильны и менее подвержены повреждениям. В настоящее время многие лаборатории мира работают над разработкой технологии изготовления белковых микроматриц, применяя различные технологии нанесения и иммобилизации белков.

Метод электронапыления, разработанный В. Н. Морозовым [86,85] является очень перспективным способом нанесения микроточек белка на матрицу, так как позволяет одновременно изготавливать тысячи микрочипов, характеризуется малым расходом белков и небольшими затратами времени (примерно 1 мкл белкового раствора электронапыляется на 100000 точки за 30 секунд [2]). Биологическая активность электронапыленных веществ отлично сохраняется приираспылении в сухом режиме, когда капли белкового раствора распыляемого при низкой влажности высыхают в полете за милисекунды. Однако на пути применения технологии электрораспыления для изготовления белковых микрочипов былосерьезное препятствие, связанное с трудностью иммобилизации белков из сухого состояния.

Цель данной работы состояла в разработке технологии иммобилизации белка на поверхности носителя, создании прототипов многокомпонентных микроматриц для иммунохимического анализа и проверке их работоспособности в модельной системе.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Авсеенко, Наталья Викторовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Технология изготовления белковых микрочипов методом электронапыления, разработанная в данной работе, может найти множество полезных применений в медицине, в прикладных и фундаментальных исследованиях. Наиболее очевидным применением разработанных микроматриц могла бы быть проверка крови на присутствие антител разных классов к целому ряду инфекционных агентов, аллергенов. В отличие от существующих в клинической лаборатории методов, такое определение сразу включало бы в себя проверку на сотни, а может быть, тысячи потенциальных антигенов или аллергенов. Микроматрицы составленные из таких элементов как ДНК, белки, характерные для аутоиммунизации организма, можно было бы использовать в диагностике аутоиммунных заболеваний, которые трудно диагностируются в клинике.

Еще одним направлением исследования могли бы быть микрочипы на белки-маркеры определенных заболеваний. В отличие от антигенных и аллергенных микрочипов, такие микроматрицы состояли бы из антител специфичных к белкам маркерам. Связывание белков-маркеров из плазмы можно было бы регистрировать такими физическими методами как плазмонный резонанс и сканирующая силовая микроскопия.

Разработанная здесь технология может быть полезна в протеомных исследованиях для выявления функциональных свойств многочисленных белков человека и животных и растений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Авсеенко, Наталья Викторовна, 2002 год

1. Arenkov, P., Kukhtin, A., Gemmel, A., Voloshuk, S., Chupeeva, V., Mirzabekov, А. (2000) Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reaction. Anal Biochem., 278, 123-131.

2. Avseenko, N.V., Morozova T.Ya. Ataullakhanov F.I., Morozov V.N. (2001) Immobilization of proteins in immunochemical microarrays fabricated by electrospray deposition. Anal. Chem. 73, 6047-6052.

3. Back, J.F., Oakenfull, D., Smith, M.B. (1979) Increased stability of proteins in the presence of sugars. Biochemistry, 18, 5191-5196.

4. Balcells, M., Klee, D., Fabry, M. and Hocker H.(1999) Quantitative assessment of protein adsorption by combination of ELISA with radioisotope-based studies. J. Colloid and Interface Sci. 220, 198-204.

5. Bashir, R., Gomez, R, Sarikaya, A., Ladisch, M.R., Sturgis, J. and Robinson J.P. (2001) Adsorption of avidin on microfabricated surfaces for protein biochip applications. Biotechnol. Bioeng., 73, 324-328.

6. Beier, M. and Hoheisel, J.D. (1999). Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips. NAR, 27, 19701977.

7. Berger, C.E.H., Beumer, T.A.M., Kooyman, R.P.H., Greve, J. (1998) Surface plasmon resonance multisensing. Anal. Chem., 70, 703-706.

8. Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, В., Bosshard, H.R., Biebuyck, H. P. (1998) Printing patterns of proteins. Langmuir, 14, 2225-2229.

9. Bernard, A., Michel B. and Delamarche, E. (2001) Micromosaic immunoassays, Anal. Chem., 73, 8-12.

10. Bernard, A., Renault, J.P., Michel, B., Bosshard, H.R.and Delamarche, E, (2000) Microcontact printing of proteins. Adv. Mater. 12/14,10671070.

11. Bertolini, G., De Pasquali G. and Fantechi R., (1965) Improvements of electrospraying technique. Nuclear Instruments and Methods, 32, 355.

12. Blackstock, W.P., Weir, M.P. (1999) Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. TIBTECH, 17, 121-127.

13. Blades, A.T., Ikonomou, M.G. and Kebarle, P. (1991) Anal. Chem., 63, 2109.

14. Blanchard, A.P., Kaiser, R.J., Hood, L.E. (1996) High-density oligonucleotide arrays. Biosensors & Bio electronics, 11, 687-690.

15. Brockman, A.H., Orlando, R. (1996) New immobilization chemistry for probe affinity mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 10, 1688-1692.

16. Bruninx, E. and Rudstam, G. (1961) Electo-spraying: a method of making samples for P counting allowing accurate corrections for self-scattering and self-absorption. Nuclear Instruments and Methods, 13,131.

17. Buchko, C.J., Kozloff, K.M., Sioshansi, A., O'Shea, K.S. and Martin, D.C. (1996) Electric field mediated deposition of bioactive polypeptides on neural prosthetic devices. Mat. Res. Soc. Symp. Proc., 414, 23-28.

18. Carpenter, P.L. Immunology and Serology. W.B. Saunders Co.: Philadelphia, 1975.

19. Chapman, R.G., Ostuni, E., Takayama, Sh., Holmlin, R.E., Yan, L. and Whitesides, G.M. (2000) Surveying for surfaces that resist the adsorption of proteins. J. Am. Chem. Soc., 122, 8303-8304.

20. Dill, K., Montgomery, D.D., Wang, W., Tsai, J.C. (2001) Antigen detection using microelectrode array microchips. Anal Chim. Acta 444, 69-78.

21. Dole, M., Mack, L.L., Hines, R.L., Mobley, R.C., Ferguson, L.D. and Alice, M.B. (1968) Molecular beams of microions. J. Chem. Phys49, 2240-2249.

22. Dole, M., Mack, L.L., Hines, R.L., Mobley, R.C., Ferguson, L.D.and Alice, M.B. (1968) Molecular beams of microions. J. Chem. Phys., 49, 2240-2249.

23. Ekins, R.P. (1987) An overview of present and future ultrasensitive non-isotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.

24. Ekins, R.P. (1998) Ligand assay: from electrophoresis to miniaturized microarrays. Clin. Chem. 44, 2015-2030.

25. Ekins, R.P. (1999) Microarrays: their origins and applications. TIBTECH, 17,217-218.

26. Ekins, R.P., Berger, H, Chu, F.W, Finckh, P., Krause, F. (1998) Miniaturized immunoarrays: ultrasensitive multianalyte immunoassays on a chip. Nanobilogy, 4,197-220.

27. Ekins, R.P., Chu, F.W. (1991) Multianalyte microspot immunoassay -microanalytical "Compact Disk" of the future. Clin. Chem. 37, 19551967.

28. Ewalt, K. L„ Haigis, R.W., Rooney, R. Ackley, D., Krihak, M. (2001) Detection of biological toxins on an active electronic microchip. Anal. Biochem. 289, 162-172.

29. Fodor, S.P., Read, J.L., Pirrung, M.C., Stryer, L., Lu, A.T., Solas, D. (1991) Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 251, 767-773.

30. Ge, H. (2000) UPA, a universal protein array system for quantitative detection of protein-protein, protein-DNA, protein-RNA and protein-ligand interactions. Nucl. Acids Res. 28, n. 2, e3, i-vii.

31. Gibson, T.D. and Woodward, J.R. In: Biosensors and Chemical Sensors, ACS Symposium series, 487; Edelman, P.G., Wang, J., American Chemical Society; Washington, DC, 1992; pp 40-55.

32. Gomez, A. and Tang, K. (1994). Charge and fission of droplets in electrostatic sprays. Phys. Fluids, 6, 404-413.

33. Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmel, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P., Mirzabekov, A. (1997) Manual manufacturing of oligonucleotides, DNA, and protein microchips. Anal Biochem., 250, 203-211.

34. Haab, B.B., Dunham, M.J. and Brown, P.O. (2001) Protein microarreys for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genom Biology, 2(2), research 0004.10004.13

35. Habeeb, A.F.E.A. and Hiramoto R. (1968) Reaction of proteins with glutaraldehyde. Archives of Biochem. And Biophys., 126, 16-26.

36. Hall, D.R., Jacobsen, M.P., Winzor, D. J. (1995) Stabilizing effect of sucrose against irreversible denaturation of rabbit muscle lactate dehydrogenase. Biophys. Chem., 57,47-54.

37. Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

38. Hayes, M.A., Poison, N.A., Phayre, A.N., Garcia, A.A. (2001) Flow-based microimmunassay. Anal. Chem. (in press).

39. Hengsakul, M., Cass, A.E.G. (1996) Protein patterning with a photoactivatable derivative of biotin. Bioconjugate Chem., 7, 249-254.

40. Hermanson,G.T. Bioconjugate Techniques. Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

41. Hovis, J.S.and Boxer, S.G. (2000) Langmuir, 16, 894.

42. Howell, E.E., Nasser, J. and Schray, K.J. (1981) Coated tube enzyme immunoassay: Factors affecting sensitivity and effects of reversible protein binding to polystyrene. J. Immunoassay, 2, 205-225.

43. Huang, R.P. (2001) Detection of multiple proteins in an antibody -based protein microarray system J. Immunol. Meth. 255, 1-3.

44. Huang, W., Wang, J., Bhattacharyya, D., Bachas, L. (1997) Improving the activity of immobilized subtilisin by site-specific attachment to surfaces. Anal. Chem., 69, 4601-4607.

45. Hudis, M.(1973) Techniques and application of plasma chemistry. Edited by Hollahan, J.R. and Bell, A., JOHN WILEY & SONS, chap. 3, 113147.

46. Ikonomou, M.G., Blades, A.T. and Kebarle, P. (1991j Electrospary-ion spray: a comparison of mechanisms and performance. J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 2, 497.

47. Immobilization of Enzymes and Cells. Ed. by G.F. Brickerstaff. (1997) Humana Press, Totoma, New Jersey.

48. Iribarne, J.V., Thomson, B.A.(1976) On evaporation of small ions from charged droplets. J. Chem. Phys., 64, 2287.

49. James, C.D., Davis, R.C., Craighhead, H.G., Isaacson, M., Turner, J.N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. (1998) Langmuir, 14, 741-744.

50. Jonson, U., Malvquist (1992) Real time biospecific interaction analysis. In: Advances in Biosensors, Ed. A.P.F. Turner, Vol. 2, pages 291-336, JAI Press Ltd, London.

51. Joos, T. O., Schrenk, M., Hopfl, P., Kroger, K., Chowdhury, U., Stoll, D. Schorner, D., Durr, M., Herick, K., Rupp, S., Sohn, K. and Hammerle, H. (2000) A microarray ELISA for autoimmune diagnostics. Electrophoresis, 21, 2641-2650.

52. Karyakin, A.A., Presnova, G.V., Rubtsova, M.Y., Egorov, A.M. (2000) Oriented immobilization of antibodies onto the gold surfaces via their native thiol groups. Anal. Chem., 72, 3805-3811.

53. Kawahara, J., Ohmori, T., Ohkubo, T., Hattori, S. and Kawamura, M. (1992) The structure of glutaraldehyde in aqueous solution determined by ultraviolet absorption and light scattering. Anal. Biochem., 201, 94-98.

54. Kebarle, P. and Ho, Y. in RB.Cole (ed.), Electrospray Ionization Mass Spectrometry, Wiley, New York, 1997, chapt. 1.

55. Kebarle, P. and Tang, L. (1993) From ions in solution to ions in the gas phase. Anal. Chem., 65, 973-986.

56. Konermann, L., Collings, B.A. and Douglas, D. J. (1997) Cytochrome c folding kinetics studied by time-resolved ESI-MS. Biochemistry, 36, 5554-5559.

57. Konermann, L., Rosell, F.L., Mauk A.G. and Douglas, D. J. (1997) Acid-induced denaturation of myoglobin studied by time-resolved ESI-MS. Anal. Chem., 36, 6448-6454.

58. Korzec,D., Rapp,J., Theirich,D. and Engmann, J. Cleaning of metal parts in oxygen radio frequency plasma: process study. J. Vac. Sci. Technol., 12 (2), 369-371.

59. Kuby, J, Cameron, J., Todd, C., Mitchell, J. Immunology, 4th edn. W.H. Freeman and Company, New York, 2001.

60. Kumar, A. and Whitesides,G.M. (1993) Appl. Phis. Lett. 63,2002.

61. Kuznetsova,A. and Yates, J.T. (2001) Making a superior oxide corrosion passivation layer on aluminum using ozone. Langmuir, 17, 2146-2152.

62. Lahiri, J., Ostuni, E., Whitesides, G.M. (1999) Patterning ligands on reactive SAMs by microcontact printing. Langmuir, 15, 2055-2060.

63. Lauer, K.F. and Verdingh,V. (1964) Preparation by electro-spraying of thin uranium, plutonium and boron samples for neutron cross section measurements in 4n geometry. Nuclear Instruments and Methods, 31, 355.

64. Lee, S.H. and Ruckenstein, E. (1988) Adsorption of proteins onto polymeric surfaces of different hydrophylicities - a case study with BSA. J. Colloid and Interface Sci. 125, 365-379.

65. Lemmo, A.V., Fisher, J.T. Geysen, H.M., Rose, D.J. (1997) Characterization of an inkjet chemical microdispenser for combinatorial library synthesis. Anal. Chem. 69, 543-551.

66. Lesley, S.A. (2001) High-throughput proteomics: protein expression and purification in postgenomic world. Protein Expression and Purification, 22,159-164.

67. Lin, J.-N., Herron, J., Andrade J. D. and Brizgys, M. (1988) Characterization of immobilized antibodies on silica surfaces. IEEE Trans. Biomed. Eng., 35, 466-471.

68. Loo, J.A. (1997) Studying non-covalent complexes by ESI-MS. Mass Spectrometry Reviews, 16, 1-23.

69. Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Biissow, K., Lehrach, H., Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Anal. Biochem. 270, 103-111

70. Lui, W.R., Langer, R. and Klibanov, A.M.(1991) Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state. Biotechnol. and Bioengineer., 37, 177-184.

71. Lyaschenko, K. P., Singh, M., Colangeli, R, Gennaro, M.L. (2000) A multi-antigen print immunoassay for the development of serological diagnosis of infectious deseases. J. Immunol. Meth. 242, 91-100.

72. Lyashchenko, K.P., Singh, M., Colangeli, R., Gennaro, M.L. (2000) A multi-antigen print immunoassay for the development of serological diagnosis of infectious diseases. J. Immunol. Meth. 242, 91-100.

73. Macbeth, G., Schreiber, S.L. (2000) Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science, 289, 1760-1763.

74. Martin, B., Gaber, B. P., Patterson, C.H., Turner, D.C. (1998) Direct protein microarray fabrication using a hydrogel "stamper". Langmuir, 21, 3971-3975.

75. Mc Gall, G.H., Barone, A.D., Diggelmann, M., Fodor, S.P.A., Gentalen, E., Ngo, N. (1997) The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrate. J. Am. Chem. Soc. 119, 5081-5090

76. Michelson, D. Electrostatic Atomization, Adam Higer, Bristol & New York, 1990.

77. Moerman, R., Frank, J., Marijnissen, J. C., M. van Dedem, G. W. K., (1999) Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying. Journal of Aerosol Science, 30, 1 Sept, 551-552.

78. Moerman, R., Frank, J., Marijnissen, J. C.M., Schalkhammer, T., van Dedem, G.W.K. (2001) Miniaturized electrospraying as a technique for the production of microarrays of reproducible micrometer-sized protein spots. Anal Chem. 73,2183-2189.

79. Moody, M.D.,Van Arsdell, S.V., Murphy, K.P., Orencole, S.F. and Burns, C. (2001) Array-based ELISAs for high-throughput analysis of cytokines. BioTechniques 31, 186-194.

80. Mooney, J.F., Mcintosh, J.R., Liberko, C.A., Walba, D.M., Rogers, C.T. (1996) Patterning of functional antibodies and other proteins by photolithography of silane monolayers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12287-12291.

81. Morozov V.N., Morozova T.Ya. (1999) Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active substances. Anal. Chem., 71, 31103117.

82. Morozov V.N., Morozova T.Ya. (1999) Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films. Anal. Chem., 71, 1415-1420

83. Morozov, N.V. and Morozova, T. Ya. (1992) Mechanical detection of interaction of small specific ligands with proteins and DNA in cross-linked samples. Anal. Biochem., 201, 68-79.

84. Morozov, V.N., Morozova, T. Ya., Hiort, D.C. and Schwartz, D.C. (1996) New polyacrylamide gel-based methods of sample preparation for optical microscopy: immobilization of DNA molecules for optical mapping. J. Microsc., 183(3),205-214.

85. Morozov, V.N., Seeman, N.C. and Kallenbach, N. R. (1993) New methods for imaging molecules in scanning tunneling microscopy. Scanning Microscopy, 7, 757-779.

86. Morozov,V.N., Morozova, T.Ya., Kallenbach, N. R. (1998) Atomic force microscopy of structures produced by electrospraying polimer solutions. Int. J. Mass. Spectrom. Ion Processes, 178, 143-159

87. Miihlard, A., Ajtai, K. and Fabian, F. (1970) Reaction of myosin with salicylaldehyde. Biochim. Biophys. Acta, 205, 342-354.

88. Naviroj, S., Culler, S.R., Koenig, J.L. and Ishida, H (1984) Structure and adsorption characteristics of silane coupling agents on silica and e-glass fiber: dependence on pH. J. Colloid Interface Sci., 97, 308-317.

89. Nelson, B.P., Grimsrud, T.E., Liles, M.R., Goodman, R.M., Corn, R.M. (2001) Surface plasmon resonance imaging measurements of DNA and

90. RNA hybridization adsorption onto DNA microarrays. Anal. Chem., 73, 1-7.

91. Newman, J.D., Turner, A.P.F. (1992) Ink-jet printing for the fabrication of amperometric glucose biosensors. Anal. Chim. Acta, 262, 13-17.

92. Norde, W. and Zoungana, T. (1998) Surface-induced changes in the structure and activity of enzymes physically immobilized at solid /liquid interfaces. Biotechnol. Appl. Biochem., 28, 133-143.

93. Nuzzo, R.G., Allura, D.L. (1983) Adsorptionof Afunctional organic disulfides on gold surfacee. J. Amer. Chem. Soc. 105, 4481-4483.

94. Nuzzo, R.G., Zegarski, B.R., Dubois, L.H. (1987) Fundamental studies of the chemisorption of organosulfur coumpounds on Au. Implication for molecular self-assembling on gold surfaces. J. Amer. Chem. Soc. 109, 773-740.

95. O'Brien, M.A.(1948) The control of humidity by saturated salt solution. J. Sci. Instrum. 25, 73-76.

96. Pease, A. N., Solas, D., Sullivan, E.J., Cronin, M.T., Holmes, C.P., Fodor, P. A. (1994) Ligh-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022-5026.

97. Penzol, G., Armisen, P., Fernandez-Lafuente, R., Rodes, L. And Guisan, J. M. (1998) Use of dextrans as long and hydrophilic spacer arms to improve the performance of immobilized proteins acting on macromolecules. Biotechnol. and Bioeng., 60, 518-523.

98. Pirrung, M.C., Huang, C.Y. (1996) A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. Bioconjugate Chem., 7, 317-321.

99. Pramanik,B.N., Bartner,P.L, Mirza, U. A., Liu Yan-Hui and Ganguly A.K.(1998) ESI-MS for the study of non-covalent complexes: an emerging technology. J. Mass Spectrom., 33, 911-920.

100. Pritchard, D.J., Morgan, H., Cooper, J.M. (1995) Patterning and regeneration of surfaces with antibodies. Anal. Chem., 67, 3605-3607.

101. Proudnikov, D., Timofeev, E., Mirzabekov, A. (1998) Immobilization of DNA in Polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips. Anal Biochem., 259, 34-41.

102. Robinson, C.V. and Raford, S.E. (1995) Weighing the evidence for structure: electrosparay ionization mass spectrometry of proteins. Structure, 3, 861.

103. Robinson, P.S. (1966). The production of radioactive sources by the electrospraying method. Nuclear Instruments and Methods, 40, 136.

104. Sauerbrey, G.Z. (1959) Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung Dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschr. fur Phys., 155, 206222.

105. Schena, M. Heller, R.A., Theriault, T.P., Konrad, K., Lachenmeier, E., Davis, R.W. (1998) Microarrays: biotechnology's discovery platform for functional genomics. TIBTECH, 16, 301- 306.

106. Schuck, P. (1997) Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules. Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 541-566

107. Shalon, D., Smith, S.J. Brown, P.O. (1996) A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Research, 6, 639-645

108. Smith, D.P.H. (1986)IEEE Trans. Ind. Appl., IA-22, 527.

109. Smith, L.D. and Zhang, Z. (1994) Probing non-covalent structural features of proteins by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 13,441-429.

110. Souheng,Wu (1982) Polymerlinterface and Adhesion. Marcel Decker, Inc. NY-Basel, pp 406-433.

111. Standefer, J.C.; Saunders, G.C. Enzyme immunoassay for gentamycin. Clin. Chem. 1978, 24, 1903-1907.

112. Van der Eijk, W., Oldenhof, W. and Zehner. W. (1973) Preparation of thin sources, a review. Nuclear instruments and Methods, 112, 343-351.

113. Vandenberg, E. T., Bertilsson, L., Leeidberg, B., Uvdal, K., Erlandsson, R., Elwing, H. and Lundstorm, I. (1990) Structure of 3-aminopropil triethhoxy silane on silicon oxide. J. Colloid Interface Sei., 147,103-118.

114. Walsh, M.K., Wang, X. and Weimer B.C. (2001) Optimizing the immobilization of single-stranded DNA onto the glass beads. J. Biochem. Biophys. Methods, 47, 221-231.

115. Wampler, F.W., Blades, A.T. and Kebarle, P. (1993; J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 63,1989.

116. Whitelegge, J.P., Gundersen, C.B. and Faull, K.F. (1998) ESI-MS of intact intrinsic membrane proteins. Protein Science, 7, 1423-1430.

117. Wiltshire, S., O'Malley, S., Lambert J., Kukanskis, K., Edgar, D., Kingsmore, S.F. and Schweitzer, B (2000) Clin. Chem. 46, 1990-1993

118. Winkimair, M., Schuetz, J.A., Weller, M.J.and Niessner, R. (1999) Immunochemical array for the identification of cross-reacting analytes. J. Anal Chem., 363, 731-737.

119. Winkimair, M., Schuetz, A.J., Weller, M.G. and Niessner, R. (1999) Immunochemical array for the identification of cross-reacting analytes. Fresenius J. Anal. Chem. 363,731-737.

120. Winston, R.L. and Fitzgerald M.C.(1997) MS as a readout of protein structure and function. Mass Spectrometry Reviews, 16, 165-179.

121. Yamashita, M. and Fenn, J.B. (1984) J. Phys. Chem., 88, 4451;4671.

122. Александров, M.JI., Галл, Л.Н., Краснов, B.H., Николаев, В.И., Павленко, В.А. и Шкуров, В.А. (1984) ДАН СССР, 277, 379.

123. Василисков, В.А., Тимофеев, Э.Н., Суржиков, С.А., Дробышев, А.Л., Шик, В.В., Мирзабеков, А.Д. (1998) Метод получения микрочипов с помощью сополимеризации с акриамидом. Мол. Биол. 32, 923-925.

124. Гайер, Г.(1974) Электронная гистохимия. П\ред. Бухвалова, И.Б. «Мир» Москва, стр. 10-14.

125. Журавлева, Г.А., Миронова, Л.Н., Инге-Вечтомов, С.Г. (2000) Геном дрожжей и первые шаги в постгеномную эру. Мол. Биология, 34, 560-571.

126. Иммуно-ферментный Анализ. Ред. Нго, Т.Т., Ленхофф, Г. и Егоров, А.М. Изд-во «Мир», Москва, 1988.

127. Кляшицкий Б.А., Межова, И.В., Швец, В.Щ1986) Методы химической активации полисахаридных носителей для синтеза афинных адсорбентов. Yen. Биол. Химии, т. 27, 187-220. г

128. Лопатин, Б.А. Кондуктометрия. Новосибирск. Сиб. Отд. АН СССР, 1967.

129. Петров, A.A., Бальян, Х.В.,Трощенко, А.Т. Органическая Химия. Изд-во Высшая школа, Москва, 1969.

130. Пичугин A.B., Персональное сообщение1. БЛАГОДАРНОСТИ.

131. Благодарю моего мужа за любовь, терпение и помощь в компьютерной обработке результатов и верстке диссертационной работы. Благодарю моего сына за терпение и поддержку.

132. Благодарю моих родителей Морозова В. Н. и Морозову Т.Я. за неоценимый опыт, активную помощь в работе и обсуждении результатов и вообще за все.

133. Благодарю Атаулаханова Ф. И. мудрое руководство, помощь, доброту и чуткость.

134. Благодарю Пичугина А. В. за помощь в освоении метода ИФА и активное участие в обсужднии результатов.

135. Благодарю моих рецензентов Бутылина А. А. и Сударикова А. Б. за внимательное прочтение диссертации и ценные замечания и советы. Благодарю Реука В. Д. за ценные советы и помощь в подготовке диссертационной работы к защите.

136. Благодарю всех сотрудников лаборатории физической биохимии системы крови и всего Гематологического научного центра за помощь и участие. Мне было очень приятно работать в месте с ними.