Разработка метода экспресс-диагностики перинатальных инфекций на основе количественной оценки содержания ДНК бактерий, колонизирующих организм плода и новорожденного тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат медицинских наук Дегтярева, Лидия Андреевна

• Дегтярева, Лидия Андреевна
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Дегтярева, Лидия Андреевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Роль инфекционной патологии в неонатальной практике

1.2 Этиология неонатальных инфекций

1.3 Характеристика некоторых патогенов

1.4 Диагностика неонатальных инфекций

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Культивирование штаммов бактерий

2.2 Микробиологические методы, использованные для выделения бактерий из клинического материала

2.3 Выделение геномной ДНК из штаммов бактерий

2.4 Выделение геномной ДНК из бактериальных культур и клинических образов

2.5 Дизайн и синтез олигонуклеотидных праймеров и зондов Taqman

2.6 Мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени

2.7 Молекулярное клонирование

2.8 Изучение специфичности разработанной тест-системы

2.9 Статистическая обработка полученных результатов

Глава 3. Собственные результаты

3.1 Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов Тацтап

3.2 Оценка специфичности, аналитической чувствительности тест-системы, а также достоверности количественной детекции ДНК

3.3 Получение рекомбинантных плазмидных ДНК для использования в качестве калибраторов и внутреннего контроля ПЦР

3.4 Сравнение различных методов выделения бактериальной геномной ДНК

3.5 Оценка диагностической чувствительности и специфичности разработанной тест системы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода экспресс-диагностики перинатальных инфекций на основе количественной оценки содержания ДНК бактерий, колонизирующих организм плода и новорожденного»

Актуальность.

Одной из наиболее актуальных и сложных проблем современной перинатологии являются инфекционные заболевания [7, 26, 33]. Ключевыми бактериальными патогенами, вызывающими неонатальные инфекции, являются Escherichia coli, Klebsiella spp., Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Lysteria monocytogenes [1,38].

Успешное разрешение проблемы перинатальных инфекций, как в их предупреждении, так и в патогенетически оправданном и своевременном лечении, зависит от использования эффективных диагностических и лечебных технологий. В связи с чрезвычайно высокой скоростью развития инфекционного процесса у новорожденного ребенка, особую значимость в неонатальной клинике приобретают методы микробиологической экспресс-диагностики. В настоящее время спектр диагностических возможностей для выявления перинатальных инфекций значительно расширился. В частности, в существующих программах по раннему выявлению инфекций у новорожденных, большое значение придается серологической диагностике, прежде всего для выявления вирусных инфекций [10].

В то же время, существующие методы не всегда оказываются достаточно чувствительными для выявления патогенных микроорганизмов. В большей степени это относится к бактериальным патогенам, для обнаружения которых в основном используются традиционные микробиологические методы, характеризующиеся длительным временем получения результата, высокой трудоемкостью и высокой зависимостью интерпретации результатов от квалификации лабораторного персонала [2].

В связи с этим в последние годы отдается предпочтение методам, основанным на эффектах ДНК-гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Прежде всего, речь идет о методах, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы отличаются высокой з чувствительностью и специфичностью, позволяют обнаруживать присутствие микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала за короткое время [3, 4, 8, 83]. В качестве объекта исследования может быть использован любой биологический материал. Современные модификации этого метода, в первую очередь мультипраймерная ПНР в режиме реального времени, позволяют проводить не только одновременное качественное определение присутствия нескольких патогенных микроорганизмов в исследуемом материале, но и устанавливать их количественное содержание [61].

В настоящее время в России не представлено ни одной тест-системы для одновременного определения методом мультипраймерной ПЦР в режиме реального времени бактерий S. agalactiae, Е. coli, Klebsiella spp., являющихся основными патогенами в неонатологической практике. Разработка и внедрение в практику подобной тест-системы позволит существенно сократить время постановки диагноза и назначения этиотропной антибактериальной терапии новорожденным в отделениях интенсивной терапии и реанимации.

Цель исследования:

Разработать диагностическую тест-систему, обеспечивающую одновременную экспресс-диагностику инфекционных заболеваний, вызванных Streptococcus agalactiae, Escherichia coli и Klebsiella spp., у плодов и новорожденных детей путем количественной детекции геномной ДНК указанных возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Задачи исследования:

1. Подобрать нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов для детекции S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp. 4

2. Сравнить эффективность различных методов выделения ДНК из бактериальных культур S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp. Выбрать наиболее адекватный метод, пригодный для выделения ДНК из различных видов клинического материала.

3. Создать систему калибровочных образцов ДНК и ДНК внутреннего контроля для использования в создаваемой мультипраймерной тест-системе.

4. Оптимизировать условия протекания ПЦР-РВ для детекции S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp, включая подбор оптимальной концентрации компонентов реакции и температурных режимов ее проведения.

5. Оценить чувствительность, специфичность и достоверность качественной и количественной детекции ДНК S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp. с использованием полученной мультипраймерной тест-системы.

Научная новизна исследования.

В ходе исследования была создана мультипраймерная тест-система, позволяющая проводить одновременную детекцию методом ПЦР-РВ трех основных возбудителей неонатальных инфекций. Был произведен дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов комплементарных фрагментам генов uid А Е. coli, cfb S. agalactiae, консервативному участку 16S рибосомальной РНК Klebsiella spp., а также проверена специфичность и чувствительность этих праймеров на коллекции лабораторных штаммов и клинических образцах. Кроме того, была предложена модификация метода выделения геномной ДНК улучшающая выход геномной ДНК, выделяемой из бактерий рода Streptococcus.

Практическая значимость работы.

Применение разработанной тест-системы должно обеспечить раннее, в том числе доклиническое, выявление наиболее значимых перинатальных инфекций; широкий спектр дифференциально-диагностических возможностей при сходстве клинической картины заболевания у новорожденных; количественную оценку бактериальной обсемененности исследуемого материала, а также высокую чувствительность и специфичность.

Внедрение результатов работы в практику.

В настоящее время полученная тест-система используется в научно-исследовательской работе кафедр микробиологии и вирусологии, клинической лабораторной диагностики, а также кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Результаты исследования включены в материалы лекционного курса для студентов, врачей интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1) В ходе исследования была разработана мультипраймерная тест-система для выявления ДНК Е. coli, S. agalactiae, Klebsiella spp. в образцах клинического материала методом ПЦР-РВ.

2) Протокол выделения бактериальной ДНК из клинического материала, разработанный в ходе настоящего исследования, существенно повышает эффективность экстракции ДНК из бактерий рода Streptococcus.

3) Полученная диагностическая тест система характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью детекции ДНК трех основных возбудителей неонатальных инфекций в различных видах клинического материала.

Апробация работы.

Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, протокол №1 от 25 февраля 2010 года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых ВАК научных журналах.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на русском языке, на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 180 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 9 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Клиническая лабораторная диагностика», Дегтярева, Лидия Андреевна

Выводы

1. В ходе проведенного исследования были разработаны высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды комплементарные фрагментам генов cfb S. agalactiae, uidA Е. coli и консервативному участку 16S-pPHK Klebsiella spp., позволяющие осуществлять детекцию ДНК указанных бактерий методом ПНР в режиме реального времени.

2. Разработанный в ходе исследования протокол экстракции геномной ДНК обеспечивает адекватное выделение ДНК из бактерий S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp.

3. Созданный лабораторный образец диагностической тест системы позволяет в короткие сроки (не более 3 часов) проводить количественную детекцию бактериальных патогенов S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp. методом ПЦР-РВ в различных видах клинического материала.

4. Полученная мультипраймерная тест-система характеризуется высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, а также достоверностью качественной и количественной детекции ДНК S. agalactiae, Е. coli и Klebsiella spp.

Практические рекомендации

Диагностическая мультипраймерная тест-система предназначена для экспресс-диагностики перинатальных инфекций, вызванных S. agalactiae, Е. coli, Klebsiella spp может быть использована в работе диагностических лабораторий родильных домов, неонатальных центров, отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных, отделений выхаживания недоношенных при лечении и диагностике инфекционных заболеваний у новорожденных детей.

Всем новорожденным с типичными проявлениями внутриутробной инфекции, а также детям из группы высокого риска по развитию перинатальных инфекций, в случае ухудшения их состояния в раннем неонатальном периоде, должно проводиться целенаправленное лабораторное обследование с целью установления или объективного подтверждения этиологии заболевания.

По способности выявления возбудителя инфекции данная диагностическая система позволяет непосредственно выявлять в биологических жидкостях или тканях ребенка (плода) микроорганизмы.

При использовании данного метода исследований следует помнить, что обследование должно быть, проведено до начала использования в лечении ребенка антибактериальных препаратов.

Диагностическая тест система предназначена для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК S. agalactiae, Е. coli, Klebsiella spp. в клиническом материале (кровь, плазма крови, соскоб эпителиальных клеток, слюна, моча, трахеальные и гастральные аспираты) методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Диагностическая система может быть использована в клинической диагностике носительства S. agalactiae, Е. coli, Klebsiella spp., а также для оценки эффективности терапии.

Время проведения анализа после приготовления реактивов составляет не более 2,5 ч.

Набор рассчитан на проведение анализа 50 неизвестных образцов, включая положительные и отрицательные контрольные образцы (всего 100 определений).

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Дегтярева, Лидия Андреевна, 2010 год

1. Антонов А.Г., Байбарина E.H., Соколовская Ю.В. и др. Объективные диагностический критерии сепсиса у новорожденных. //Вопр. гинекологии, акушерства и перинатологии. 2005; 4 (4-5): 113-115.

2. Барашнев Ю.И. Перинатальная неврология. М.: Триада-Х, 2001. - 640 с.

3. Ведяков A.M., Долгих М.С. Детекция ДНК ' цитомегаловируса в различном биологическом материале у больных с аллотрансплантатами органов методом полимеразной цепной реакции. //Клиническая лабораторная диагностика.-1998.-11.- С. 19-25.

4. Виноградская Г.Р., Горышин И.Ю., Новикова Л.И., Плуталов О.В., Башмакова М.А., Берлин Ю.А., Цинзерлинг В.А., Шварц E.H., Ланцов

5. B.А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека. //Биополимеры и клетка.- 1991.1. C. 35-48.

6. Володин H.H., Дегтярева М.М., Дегтярев Д.Н. и др. Особенности иммунологической адаптации у новорожденных детей в норме, при респираторном дистресс-синдроме и при пневмонии бактериальной этиологии //Int. J. Immunorehabil. — 1999. — N 11. — P. 82—89.

7. Володин H.H., Коршунов B.M., Гладько H.A., Кафарская Л.И., Сидоров

8. A.A., Ахметова Л.М. Влияние микрофлоры родовых путей беременных на течение периода новорожденности недоношенных детей. //Вопросы охраны материнства и детства. 1986. - 31. 3. - С. 53-56.

9. Гельфанд Б.Р., Руднов В.А., Проценко Д.Н. и др. Сепсис: определение, диагностическая концепция, патогенез и интенсивная терапия. Сепсис в начале XXI века. //Клинические рекомендации РАСХИ. /Под ред.

10. B.C. Савельева и Б.Р. Гельфанда. М: Литтера, 2006: 16-20.

11. Гланц С. Медико-биологическая статистика /Пер. с англ. под ред. Н.Е. Бузикашвили и Д.В. Самойлова. -М.: Практика, 1999. -460 с.

12. Гомелла Т.Л. Каннингам М.Д. Инфекционные болезни. //Неонатология. М.: Медицина, 1998: 369-407.

13. Ю.Гриноу А., Осборн Д., Сазерленд Ш. // Врожденные, перинатальные и неонатальные инфекции. М.: Медицина, 2000,- 288 с.

14. Диагностика цитомегаловирусной инфекции у беременных./Н.А. Фарбер, В.Н. Мартынова, H.A. Малышев и др. //Акуш. и гинек. 1990.-№7.-С. 73-75.

15. Дмитриев А., Кантикова М., Микула И. и др. Факторы и генетика патогенности стрептококков группы В. //Микробиол. 2000. 5:92 97.

16. Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Тогузов Р.Т. //Разработка и применение ПЦР-технологий для генодиагностики вирусных инфекций //Клин. лаб. диагностика.- М.: Медицина, 2007.-№ 9.-С. 38-43.

17. Иванов Д.О. Клинико-лабораторные варианты течения сепсиса новорожденных: Автореф.дис. . докт. мед. наук. СПб, 2002.

18. Использование цепной реакции полимеризации для выявления вируса цитомегалии в тканях человека /Г.Р. Виноградская, И.Ю. Горышин, О.В. Плутарский и др. //VII Всесоюз. симпоз.: Молекуляр. механизмы генет. процессов. М., 1990. - С. 2037.

19. Каржас Н.В. Лабораторная диагностика ЦМВ у ВИЧ-инфицированных пациентов. //Рос. Мед. Вести. 1997. - Т. 2. №2. - С. 34-38.

20. Каржас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция современная диагностика. //Клин, лабор. диагн.-1998.-№ 6.-С. 16-17.

21. Леган М.В., Чернявский A.M., Мироненко С.П. и др. Исследование герпесвирусов в крови больных с сердечнососудистой патологией. //Клиническая лабораторная диагностика.-2003.- № 4.- С. 48-49.

22. Медицинская микробиология: учебник /под ред. В.И. Покровского.-М.: ГЭОТАР-Медиа. 2006.- 765 с.90

23. Меджидова М.Г., Адуева С.М., Федорова Н.Е. и др. Выявление маркеров вирусов простого герпеса и цитомегалии у новорожденных и детей раннего возраста. //Микробиол. Эпидемиол. и иммунобиол. 2005. 5:74-81.

24. Неонатология: Национальное руководство /под. ред. Н.Н. Володина.-М.: ГЭОТАР-Медиа. 2007 848 с.

25. Неонатология: учебное пособие: / Н.П. Шабалов.- Т.Н. — М.: МЕДпресс-информ, 2006.- 656 с.

26. Никонов А.П., Асцатурова О.Р. Цитомегаловирусная инфекция и беременность. Consilium medicum/гинекология/патология беременности. Т. 09.N 1. 2007.

27. Рахманова А.Г., Кирпичникова Г.И., Неверов В.А., Ремезов А.П. Этиопатогенез, лабораторная диагностика и терапия герпесвирусных инфекций.-СПб, 2003.- 47 с.

28. Самсыгина Г.А. Гнойно-воспалительные заболевания новорожденных (этиология, факторы риска, клинико-иммунологические критерии диагноза и тактика лечения): Автореф.дис. докт. мед. наук. М., 1985.

29. Самсыгина Г.А., Яцык Г.В., Сепсис новорожденных. //Руководство по педиатрии. Неонатология. М.: Династия, 1999- С. 337-352.

30. Самсыгина Г.А., Герасимова Н.В., .Першина Г.Д, Материалы VII национального конгресса: Человек и лекарство. // Международный журнал медицинской практики, 2000, № 4.- 65с.

31. Самсыгина Г.А. Сепсис и септический шок. //Педиатрия 2009, Т. 87, №1:121-127.

32. Сидорова И.С., Алешкин В. А., Афанасьев С. С.,Матвиенко Н.А.Состояние иммунной системы у беременных и новорожденных группы высокого риска по внутриутробному инфицированию.// Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1999, №6.-С. 10-16

33. Суворов А.Н., Дмитриев А.В., Тотолян А.А. Изучение генетических основ патогенности стрептококков групп А и В. //Мед. акад. журн. 2001, 1 (3): 12-22.

34. Туки Пат А., Пекхем Катрин С. Цитомегаловирус. //Врожденные, перинатальные и неонатальные инфекции: Пер. с англ. /Под ред. А. Гриноу, Дж. Осборна, Ш. Сазерленд.- М.: Медицина, 2000.- С. 59-73.

35. Флеминг П., Спидел Б., Марлоу Н., Дан П.М. Перинатальные инфекции. Краткое руководство по неонатологии. Представительство «Вое ohmtda», 1993: 273-289.

36. Яцык Г.В., Бомбардирова Е.П. Сепсис новорожденных. Современные проблемы диагностики и лечения. //Практика педиатра, февраль 2009, С. 6-9.

37. Abraham Е., Matthay M.A., Dinarello С.A. et al. Consensus conference definitions for sepsis, septic shock, acute lung ihjury, and acute respiratory distress syndrome: Time for a réévaluation. //Crit. Care Med. 2000: 28: 232235.

38. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F, Britt W.J. 1990. Congenital and perinatal cytomegalovirus infections. //Reviews of Infectious Diseases 12 (suppl. 7): P. 745-753.

39. Angert E.R., Clements D., Pace N.R. The largest bacterium. //Nature 1993. 362: 239.

40. Angus D.C., Linde-Zwirble W.T., Lidicker J. et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analyses of incidence, outcome, and associated cost of care. //Crit. Care Med. 2001; 29 (7): 1303-1310.

41. Archimbaud C., Chambon M., Bailly J.L. Impact of rapid enterovirus molecular diagnosis on the management of infants, children, and adults with aseptic meningitis. //J. Med. Virol. 2009. 81(l):42-8.

42. Adriaanse A.H., Lagendijk I., Muytjens H.L., Nijhuis J.G., Kollee L.A. Neonatal early onset group B streptococcal infection: a nine-year retrospective study in a tertiary care hospital. //J. Perinat. Med. 1996. 24:531-538.

43. Arlet, G., Sanson-Le Pors M.J., Rouveau M., Fournier G., Marie O., Schlemmer B. and Philippon A. 1990. Outbreak of nosocomial infection due to Klebsiella pneumoniae producing SHV-4-lactamase. //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 9:797-803.

44. Ashshi A.M., Klapper P.E. and Cooper R.J. 2003. Detection of human cytomegalovirus, human herpes virus type 6 and human herpes virus type 7 in urine specimens by multiple PCR. //J.Infect. 47:59-64.

45. Baltimore R.S., Huie S.M., Meek J.I., Schuchat A, O'Brien K.L. Early-Onset Neonatal Sepsis in the Era of Group B Streptococcal Prevention. // Pediatrics. 2001.108:1094-198.

46. Barenfanger J., Drake C., Leon N., Mueller T., Troutt T. Clinical and financial benefits of rapid detection of respiratory viruses: an outcomes study. //J. Clin. Microbiol. 2000. (38):2824-28.

47. Bej A.K., Di Cesare J.L., Haff L., Atlas R.M. Detection of Escherichia coli and Shigella spp. in water by using the polymerase chain reaction and gene probes foruid. //Appl. Environ. Microbiol. 1991. 57(4): 1013-7.

48. Bellid L.L., Ohning B.L. Neonatal sepsis. //Medicine. Neonatology. Com. Inc, 2007:351-369.

49. Bellin T., Pulz M., Matussek A., Hempen H.G. and Gunzer F. Rapid detection of enterohemorrhagic Escherichia coli by real-time PCR with fluorescent hybridization probes. //J. Clin. Microbiol. 2001. 39:370-374.

50. Bergeron M.G., Ke D., Menard C., Picard F.J., Gagnon M., Bernier M., Ouellette M., Roy P.H., Marcoux S., Fraser W.D. Rapid detection of group B streptococci in pregnant women at delivery. N Engl //J. Med. 2000.-343: 175-179.

51. Bergseng H., Bevanger L., Rygg M. Real-time PCR targeting the sip gene for detection of group B streptococcus colonization in pregnant women at delivery. //J. of Med. Microbiol. 2007. 56:223-28.

52. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry.-1999. № 273.- P. 221-228.

53. Birnboim H.C., Doly J., A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. //Nucleic Acids Res. 1979. Nov 24.7(6): 151323.

54. Blanco C., Ritzenthaler, Mata-Gilsinger M. Cloning and Endonuclease Restriction Analysis of uidA and uidR Genes in Escherichia coli K-12: Determination of Transcription Direction for the uidA Gene. //J. of bacteriology. 1982. 2:587-594.

55. Boyer K.M., Gadzala C.A., Kelly P.D.; Gotoff S.P. Selective intrapartum chemoprophylaxis of neonatal group B streptococcal early-onset disease. III. Interruption of mother-to-infant transmission. //J. Infect. Dis. 1983. 148:810-816.

56. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M., Jansen C.L., Wertheim-van, Dillen P.M., van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. //J. Clin. Microbiol. 1990. Mar. 28(3):495-503.94

57. Brocklehurst P. Green Top guideline: prevention of early onset neonatal group B streptococcal disease. Available at: www.rcog.org.uk/resources/Publik/pdf/GuoupB strep no 36/pdf. Accessed 2003. Sept. 13. 2005.

58. Bullock J., Robertson A., Bodenbender J., Kontras S., Miller C. Inflammatory responses in the neonate reexamined. //Pediatrics. 1969. 44: 58-61.

59. Calderaro A., Piccolo G., Gorrini C. Comparison between two Real-time PCR assays and a nested-PCR for the detection of Toxoplasma gondii. //Acta Biomed. 2006. 77: 75-80.

60. De Champs C., Sirot D., Chanal C., Poupart M.C., Dumas M.P. and Sirot J. 1991. Concomitant dissemination of three extended-spectrum lactamases among different Enterobacteriaceae isolated in a French hospital. //J. Antimicrob. Chemother. 27:441-457.

61. Carson W., Caliguri M. Natural killer cell subsets and development. //Methods. 1996. 9: 327^3.

62. Chandler S.H., McDougall J.K. Comparison of restriction site polymorphisms among clinical isolates and laboratory strains of human cytomegalovirus. //J. Gen. Virol. 1986. 67: 2179-2192.

63. Chee M.S., Bankier A.T., Beck S. et al. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. //Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. 154: 125-170.

64. Chiesa C., Pellegrini G., Panero A., Osborn J.F., Signore F., Assumma M.,

65. Pacifico L. C-reactive protein, interleukin-6, and procalcitonin in the95immediate postnatal period: influence of illness severity, risk status, antenatal and perinatal complications, and infection. //Clin. Chem. 2003. 49:60-8.

66. Chin K.C., Fitzhardinge P.M. Sequelae of early-onset group B hemolytic streptococcal neonatal meningitis. //J. Pediatr. 1985. 106:819-822.

67. Chmouryguina I.I., Suvorov A.N., Ferrieri P. et al. Conservation of C5a peptidase genes in group A and B streptococci. //Infect. Immun. 1996. 64: 2387 2390.

68. Crackn Mc G.H. Jr., Sarf L.D. Endotoxin in cerebrospinal fluid: detection in neonates with bacterial meningitis. //JAMA. 1976. 235:617-620.

69. Cunney R.J., McNamara E B., Alansari N., Loo B. and Smyth E.G. The impact of blood culture reporting and clinical liaison on the empiric treatment of bacteraemia. //J. Clin. Pathol. 1997. 50:1010-1012.

70. Davis C.A., Vollata E.H., Forristal J. Serum complement levels in infancy: age related changes.//Pediatr. Res. 1979. 13: 1043-6.

71. Dierkes C., Ehrenstein B., Siebig S. et al. Clinical impact of a commercially available multiplex PCR system for rapid detection of pathogens in patients with presumed sepsis. //BMC Infect. Diseases. 2009. 9(126): 1-7.

72. Dmitriev A., Totolian A., Tkacikova L. et al. Features of the genome structure of group B streptococci of bovine origin. //Folia Veterinaria. 2001. 45:57-63.

73. Eden P.A., Schmidt T.M., Blakemore R.P., Pace N.R. Phylogenetic analysis of Aquaspirillum rnagnetotacticum using polymerase chain reaction-amplified 16s rRNA-specific DNA. //Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. 41: 324.

74. Edwards M.S., Kasper D.L. and Baker C .J. Rapid diagnosis of type III group B streptococcal meningitis by latex particle agglutination. //J. Pediatr. 1979. 95:202-205.

75. Embury S.H., Scharf S.J., Saiki R.K., et al. Rapid prenatal diagnosis of sickle cell anemia by a new method of DNA analysis. //N. Engl. J. Med. 1987. (316):656.

76. Ferrieri P., Cho D.S., Livdahl C. et al. DNA restriction profiles ofnontypable group B streptococcal clinical isolates. //Adv. Exp. Med. Biol. 1997. 418: 343-346.

77. SO.Franken C., Haase G., Brandt C. Horizontal gene transfer and host specificity of betahaemolytic streptococci: the role of a putative composite transposon containing scpB and Imb. //Mol. Microbiol. 2001. 41: 925 935.

78. FredricksD.,andD.Relman. 1998 .ImprovedamplificationofmicrobialDNAfro mbloodculturesbyremovalofthePCRinhibitorsodiumpolyanetholesulfonate.J. Clin.Microbiol.36:2810-2816.

79. Friedman G., Silva E. Vincent J.L. Has the mortality of septic shock changed with time? Crit. //Care Med. 1998. 26 (12): 2078-2086.

80. Fowlie P.W., Schmidt B. Diagnostic tests for bacterial infection from birth to 90 days a systematic review. //Arch Dis Child Fetal NeonatalEd 1998. 78:92-98.

81. Garner J.S., Jarvis W.R., Emori T.G., Horau T.C., Hughes J.M. CDC definitions for nosocomial infections. //Am J. Infect. Control. 1988. 16:12840.

82. Gase K., Ferretti J.J., Primeaux C. et al. Identification, cloning, and expression of the CAMP factor gene (cfa) of group A streptococci. //Infect. Immun. 1999. 67: 4725 4731.

83. Gerdes J.S., Polin R.A. Sepsis screen in neonates: evaluation of plasma fibronectin. //Pediatr. Infect. Dis. 1987. 6: 443.

84. Gordillo M.E., Singh K.V., Baker C.J. et al. Typing of group В streptococci: comparison of pulsedfield gel electrophoresis and conventional electrophoresis. //J. Clin. Microbiol. 1993. 31: 1430 1434.

85. Granlund M., Oberg L., Sellin M. et al. Identification of a novel insertion element, IS 1548, in group В streptococci, predominantly in strains causing endocarditis. //J. Infect. Dis. 1998. 177: 967 976.

86. Graves L.V., Swaminathan В., Persing et. al., eds. Diagnostic Molecular Microbiology. //ASM. 1993.-P. 617-621.

87. Goldmann D.A. The bacterial flora of neonates in intensive care monitoring and manipulation. //J. of Hospital Infect. 11 (suppl. A): 1988 340-351.

88. Guerina N.G. Bacterial and fungal infections. In: Cloherty JP, Stark AR, editors. Manual of neonatal care. 3rd ed. Little, Brown and Co. 1991: 146.

89. Gunson R.N., Maclean A.R., Shepherd S.J., Carman W.F. Simultaneous Detection and Quantitation of Cytomegalovirus, Epstein-BarrVirus, and Adenovirus by Use of Real-Time PCR and Pooled Standards. //J.C.M.-2009.-№3.-P. 765-770.

90. Harris K.A., Hartley J.C. Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service. //J. of Medic. Microbiol. 2003. 52: 685-91.

91. Hassan A.A., Abdulmawjood A., Yildirim A.O., Fink K., Lammler C., Schlenstedt R. Identification of streptococci isolated from various sources by determination of cfb gene and other CAMP-factor genes. //Can. J. Microbiol. 2000. Oct; 46(10):946-51.

92. Hervas J.A., Alomar A., Salva F. Neonatal sepsis and meningitis in Mallorca, Spain, 1977-1991. //Clin. Infect. Dis. 1993. 16: 719

93. Hiramamatsu K., Hanaki H., Ino T. et al. //J. Antimicrob. Chemother. 1997. 40: 135-6.

94. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-P. 986994.

95. Jackson J.B., Kwolc S.Y., Sninsky J.J. Human immunodeficiency virus type 1 detected in all seropositive symptomatic and asymptomatic individuals. //J. Clin. Microbiol. 1990. (28): 16-9.

96. Jacoby, G.A. Antimicrobial-resistant pathogens in the 1990 s. //Annu. Rev. Med. 1996. 47:169-179.

97. Jamulitrat S., Meknavin U. and Thongpiyapoon S. Factors affecting mortality outcome and risk of developing nosocomial bloodstream infection. Infect. //Control. Hosp. Epidemiol. 1994. 15:163-170.

98. Jahnke S., Bartiromo G., Maisels M.J. The peripheral white blood cell count in the diagnosis of neonatal infection. //J. Perinatol.1985. 5: 50.

99. Jemima S.A., Verghese S. Multiplex PCR for blaCTX-M blaSHV in the extended spectrum betalactamase (ESBL) producing Gram-negative isolates. //Indian. J. Med. Res. Sept. 2008. 128:313-317.

100. Jeffeiy H.E., Lahra M.M. The Impact of Infection During Pregnancy on the Mother and Baby. //Fetal and Neonatal Pathology Keeling J.W., Khong T.Y. (Eds.). 2007. 4th ed., P. 379-423.

101. Jochimsen B., Nygaard P. and Vestergaard T. Location on the chromosome of Escherichia coli of genes governing purine metabolism. //Mol. Gen. Genet. 1975. 143:85-91.

102. Johnston R.B.Jr. Function and cell biology of neutrophils and mononuclear cells in the newborn infant. //Vaccine 1998. 14.15. 1363-8.

103. Jordan J.A., Durso M.B. Comparison of 16sRNA gene PCR and BACTEC 9240 for detection of neonatal bacteriemia. //J. Clin. Microbiol. 2000. 38(7):2574-2578.

104. Jordan J.A., Durso M.B. Real-Time Polymerase Chain Reaction for Detecting Bacterial DNA Directly from Blood of Neonates Being Evaluated for Sepsis. //J. of Molecular Diagnostics. 2005. 7(5): 575-81.

105. Jordan J.A., Durso M.B. Butchko A.R. Evaluating the Near-Term Infant for Early Onset Sepsis Progress and Challenges to Consider with 16S rDNA Polymerase Chain Reaction Testing. //J. of Molecular Diagnostics 2006. 8(3):357-63.

106. Justin M.C. et al. Development and Evaluation of a Real-Time PCR Assay for Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Gene. //J. of clinical microbial. Feb.2009 P. 322-326.

107. Jurgens D., Sterzik B.3 Fehrenbach F.J. Unspecific binding of group B streptococcal cocytolysin (CAMP factor) to immunoglobulins and its possible role in pathogenicity. //J. Exp. Med. 1987. 165:720-32. Pub. Med. 354658.

108. Kary Mullis. The Polymerase Chain Reaction. Nobel Lecture. Dec. 8. 1993. LEX PRIX NOBEL. The Nobel Prizes. Almqvist and Wiksell Int., Stockholm, Sweden.

109. Kayser F.H., Bergerbachi B., Beck W.D. //J. Hosp. Infect. 1986. 7 (suppl. A): 19-27.

110. Kaufman D., Fairchild K.D. Clinical Microbiology of Bacterial and Fungal Sepsis in Very-Low-Birth-Weight Infants. //Clinical Microbiology Reviews 2004. 17(3): 638-80.

111. Ke D., Menard C., Picard F.J., Boissinot M., Ouellette M., Roy P.H., Bergeron M.G. Development of conventional and real-time PCR assays for the rapid detection of group B streptococci. //Clin Chem. 2000. 46. 324-331.

112. Kellogg J.A., Manzella J.P., Bankert D.A.: Frequency of low-level bacteriemia in children from birth to fifteen years of age. //J. Clin. Microbiol. 2000. 38(6):2181-2185.

113. Kenneth C. Iregbul, Olufumilayo Y. Elegba2, Iretiola B. Babaniyi. Bacteriological profile of neonatal septicaemia in a tertiary hospital in Nigeria. //African Health Sciences. 2006. Sept. 6(3): 150-154.

114. Kimberlin D. Herpes simplex virus, meningitis and encephalitis in neonates. //Herpes. 2004; 11 (suppl 2): 65A-76A.

115. Kurlat I., Stoll B.J., Mc Gowan J.E.J. Time to positivity for detection of bacteremia in neonates. //J. Clin. Microbiol. 1989. 27:1068-71.

116. Kurupati P., Chow C., Kumarasinghe G., Poh C.L. Rapid Detection of Klebsiella pneumoniae from Blood Culture Bottles by Real-Time PCR. //J. Clin. Microbiol. 2004. March. 42(3): 1337-1340.

117. Laforgia N., Coppola B., Carbone R., et al. Rapid detection of neonatal sepsis using polymerase chain reaction. //Acta Pediatr. 1997. 86:1097-9.

118. Lebovici L.S., Shraga I., Drucker M., Konigsberger H., Samra Z. and Pitlik S.D. 1998. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. //J. Intern. Med. 244:379-386.

119. Logan J.M.J., Edwards K.J., Saunders N.A. and Stanley J. Rapid identification of Campylobacter spp. by melting peak analysis of biprobes in real-time PCR. //J. Clin. Microbiol. 2001. 39:2227-2232.

120. Luck S., Torny M., d'Agapeyeff K. et al. Estimated early-onset group B streptococcal neonatal disease. //Lancet. 2003; 361: 1953-1954

121. Lupo M., Halpern Y.S. Gene controlling L-glutamic acid decarboxylase synthesis in Escherichia coli K-12. //J. Bacteriol. 1970. Aug. 103(2):382-6.

122. Maniatis T. Molecular cloning: A lab. Manual New York: Cold Spring Harbor lab. - 1986. - 545 c

123. Mendez J.C., Espy M.J., Smith T.F., Wilson J.A., Paya C.V. Evaluation of PCR Primers for Early Diagnosis of Cytomegalovirus Infection following Liver Transplantation. //J. Clin. Microbiol. 1998. Febr. 36(2): 526-530.

124. McCabe K.M., Khan G., Zhang Y.H., Mason E.O., McCabe ERB. Amplification of bacterial DNA using highly conserved sequences: automated analysis and potential for molecular triage of sepsis. //Pediatrics 1995. 95: 165.

125. Mercer B., Gaucher C., Feugeas 0., Mazurier C. Direct PCR from whole blood without DNA extraction. //Nucl Acid Res. 1990. 18: 5908.

126. Miller M., Bovey S., Patio K. et al. Application of PCR to multiple specimen types for diagnosis of cytomegalovirus infection: Comparison with cell culture and shell vial assay. //J. Clin. Microbiol. 1994. 32:5-10.

127. Mocarski E.S., Courcelle C.T. Cytomegalovirus and their replication. In D. Knipe, P. Howley (Eds.), Fields Virology Philadelphia: Lippincott, Williams and Wilkins. 2001. P. 2629- 2673.

128. Moore M.R., Schrag S.J., Schuchat A. Effects of intrapartum antimicrobial prophylaxis for prevention of group-B-streptococcal disease on the incidence and ecology of early-onset neonatal sepsis. //Lancet Infect. Dis. 2003:201-213.

129. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. //Methods Enzymol. 1987. (155):335.

130. Mullis K.B., Faloona F.A., Scharf S.J., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. //Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986. (51):263.

131. Natarajan G., Johnson Y. R., Zhang F., Chen K. M., M. J. WorshamReal-Time Polymerase Chain Reaction for the Rapid Detection of Group B Streptococcal Colonization in Neonates. //Pediatrics. 2006. 118(1)14-22.

132. Nelson C.T., Demmicr G. Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant. //Clin. Perinatol. 1997. 24:151-160.

133. Niwa T., Kawamura Y., Katagiri Y., et al. Lytic enzyme, labiase for a broad range of Gram-positive bacteria and its application to analyze functional DNA/RNA. //J. Microbiol. Methods. 2005. 61(2):251-60.

134. Nolte F.S., Caliendo A.M. Molecular detection and identification of microorganisms. //Murray P.R. (eds) Manual of Clinical Microbiology, 8thedn., American Society for Microbiology, Washington DC. 2003. P. 236243.

135. Norman M.E., Gall E.P., Taylor A., Laster L. Nilsson U.R. Serum complement profiles in infants and children. //J. Pediatr. 1975. 87 912-6.

136. Nozawa N., Koyano S., Yamamoto Y. et al. Real-Time PCR Assay Using Specimens on Filter Disks as a Template for Detection of Cytomegalovirus in Urine. //J. of Clinic. Microbiol. 2007. 45(4): 1305-7.

137. Noraz N., Lathey J.L. et al. // Blood. 1997. 89: 2443-2452.

138. Novel M. and Novel G. Regulation of, B-glucuronidase synthesis in Escherichia coli K-12: constitutive mutants specially derepressed for uidA expression.//J. Bacteriol. 1976. 127:406-417.

139. Numazaki K. Human cytomegalovirus infection of breastmilk. //FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. 18:91-98.

140. Oana K., Kawakami Y., Hayashi T. et al. Simple broad-spectrum protocol using labiase for bacterial cell lysis to prepare genomic DNA for pulsed-field gel electrophoresis analysis. //Microbiol. Immunol. 2009. 53(l):45-8.

141. Ohlin A., Backman A., Bjorkqvist M. et al. Real-time PCR of the 16S-rRNA gene in the diagnosis of neonatal bacteraemia. //Acta Pediatrica. < 2008. 97:1376-80.

142. Osrin D., Vergnano S., Costello A. Serious bacterial infections in newborn infants in developing countries. //Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. Jun. 17(3):217-24.

143. Pawlotsky J.M. Virologic techniques for the diagnosis and monitoring of hepatitis B. //Gastroenterol. Clin .Biol. 2008. 32:56-63.

144. Paule S.M., Pasquariello A.C., Hacek D.M. Direct Detection of Staphylococcus aureus from Adult and Neonate Nasal Swab Specimens Using Real-Time Polymerase Chain Reaction. //J. of Molecular Diagnostics 2004. 6(3): 191-6.

145. Placzek M.M., Whitelaw A. Early and late septicemia. //Arch. Dis. Child. 1983. 58: 728.

146. Pedersen G., Schonheyder H.C. and Sorensen H.T. Antibiotic therapy and outcome of monomicrobial gram-negative bacteremia: a 3-year population-based study. //Scand. J. Infect. Dis. 1997. 29:601-606.

147. Pena C., Pujol M., Ardanuy C. et al. Epidemiology and successful control of a large outbreak due to Klebsiella pneumoniae producing extended spectrum (3 lactamases. //Antimicrob Agents Chemother. 1998; 42:53-8.

148. Petty R.E., Hunt D.W.C. Neonatal dendritic cells. //Vaccine. 1998. 16: 1378-82.

149. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. //Nucleic. Acids. Res". 2001. 29. E45.

150. Reier-Nilsen T., Farstad T., Nakstad B., Lauvrak V., Steinbakk M: Comparison of broad range 16S rDNA PCR and conventional blood culture for diagnosis of sepsis in the newborn: a case control study. //BMC Pediatrics. 2009. 9(5): 1471-2431.

151. Roberton N.R.C. Textbook of neonatology. 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1992.

152. Ruimy R., Dos-Santos M., Raskine L., Bert F. et al. Accuracy and Potential Usefulness of Triplex Real-Time PCR for Improving Antibiotic Treatment of Patients with Blood Cultures Showing Clustered Gram

153. Positive Cocci on Direct Smears. //J. of Clinic. Microbiol. 2008. 46(6): 2045-51.

154. Sarff L.D., McCracken G.H., Schiffer M.S. et al. Epidemiology of Escherichia coli Kl in healthy and diseased newborns. //Lancet. 1975. 10991104.

155. Siegel J., McCracken J.D, Jr G.H. Sepsis neonatorum. //New England J. of Med. 1981. 304: 642-647.

156. Skalka B., Smola J. Lethal effect of CAMP-factor and UBERIS-factor~a new finding about diffusible exosubstances of Streptococcus agalactiae an d Streptococcus uberis. //Zentralbl. Bakteriol. 1981. 249:1904.

157. Skeidsvoll, J. and Ueland P.M. Analysis of double-stranded DNA by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection using the monomeric dye SYBR Green I. //Anal. Biochem. 1995. 231:359-365.

158. Sison A.V., Campos J.M. Laboratory Methods for Early Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 in Newborns and Infants. //Clinic. Microbiol. Reviews. 1992. 5(3): 238-47.

159. Stoker NG. The polymerase chain reaction and infectious diseases: hopes and realities. //Trans Roy Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. 84: 755.

160. Stoll B.J., Gordon T., Korones S.B. //Late-onset sepsis in very low birth weight neonates: a report from the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network. //J. Pediatr. 1996; 129 :63-71.

161. Spelling R.S., Newton E., Gibbs R.S. Intramniotic infection in low birthweight infants. //J. of Infect. Dis. 1988. 157: 113-117.

162. Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E. et al. Congenital cytomegalovirus infection; the relative importance of primary and recurrent maternal infection. //New England J. of Med. 1982. 306: 945-949.

163. Tapsall J.W., Phillips E.A. Presumptive identification of group B streptococci by rapid detection of CAMP factor and pigment production. //Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1987. 7:225-8.

164. Tullus K., Berglund B., Fryklund B., Kuhn I., Burman L.G. Epidemiology of faecal strains of the family Enterobacteriaceae in 22 neonatal wards and influence of antibiotic policy. //J. of Clinic. Microbiol. 1988. 26: 1166-1170.

165. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. //Nat. Biotechnol.-1996.-№ 14.- P. 303-308.

166. Tichopad A., Bar T., Pecen L., Kitchen R.R., Kubista M., Pfaffl M.W. Quality control for quantitative PCR based on amplification compatibility test. //Methods, April. 2010. P. 308-312.

167. Washington J. A., Ilstrup D.M. Blood cultures: issues and controversies. //Rev. Infect. Dis. 1986. 8: 792.

168. Weile J., Knabbe C. Current applications and future trends of molecular diagnostics in clinical bacteriology. //Anal Bioanal Chem. 2009; 394:731-42.

169. Weisman L.E., Stoll B.J., Cruess D.F., et al. Early-onset group B streptococcal sepsis: a current assessment. //J Pediatr. 1992. 121:428-433.

170. Wilkins E.G., Roberts C. Screening for enteropathogenis Escherichia coli.//J. of Hospital Infection. 1988. 12. 177-182.

171. Wilson C., Lewis, D. Penix, L. The physiologic immunodeficiency of immaturity. //E. R. Stiehm (ed.), Immunologic Disorders in Infants and Children, 4th edn. Philadelphia, PA: W. B. Saunders. 1996. P. 253-95.

172. Zaidi A.K., Thaver D., Ali S.A., Khan T.A. Pathogens associated with sepsis in newborns and young infants in developing countries. //Pediatr. Infect. Dis. J. 2009. Jan. 28(1 suppl):S10-8.