Разработка метода биотестирования безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Клабукова, Дарья Леонидовна

• Клабукова, Дарья Леонидовна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Клабукова, Дарья Леонидовна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Способы биотестирования пищевых продуктов, ингредиентов и кормов

1.2 Микрофлора мясных продуктов и способы ее изучения

1.2.1 Бактериальные стартовые культуры в мясной промышленности

1.2.2 Применение молекулярно-генетических методов для оценки микробной безопасности мясных продуктов

1.2.3 Применение T-RFLP-анализа для изучения микрофлоры пищевых продуктов

1.3 Применение микроорганизма Lactobacillus plantarum для профилактики и лечения заболеваний ЖКТ сельскохозяйственных животных и птицы

1.3.1 Использование Lactobacillus plantarum в рационе сельскохозяйственных птиц

1.3.2 Использование Lactobacillus plantarum в свиноводстве

Заключение по обзору литературы

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Схема проведения исследований

2.2 Объекты исследований

2.3 Методы исследований

2.3.1 Методы культивирования и исследования клеток животных и человека

2.3.2 Микробиологические методы

2.3.3 Молекулярно-генетические методы

2.3.4 Методы оценки безопасности микроорганизмов на мышах

2.3.5 Исследования образцов мясных продуктов

2.3.6 Исследования на бройлерах

2.3.7 Статистическая обработка экспериментальных данных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

3 Разработка способа биотестирования на клеточных тест-системах

3.1 Выбор клеточных тест-систем

3.2 Анализ ростовой кинетики клеточных тест-систем

3.3 Метод определения безопасности пищевых ингредиентов

3.4 Метод определения безопасности пробиотических микроорганизмов

Заключение к главе 3

4 Выделение и комплексные исследования стартовых культур - новых пищевых ингредиентов микробного происхождения

4.1 Анализ микрофлоры ферментированного мясного продукта

4.1.1 Определение общего количества микроорганизмов и лактобактерий методом ПЦР-РВ

4.1.2 Исследование микрофлоры продукта методом T-RFLP

4.2 Выделение, идентификация и комплексное исследование новых штаммов микроорганизмов

4.2.1 Идентификация выделенных микроорганизмов

4.2.2 Морфологические и культуральные свойства

4.2.3 Физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов

4.2.4 Технологические свойства выделенных микроорганизмов

4.2.5 Пробиотические свойства выделенных микроорганизмов

4.3 Биотестирование молочнокислых микроорганизмов на клеточных тест-системах

4.4 Исследование безопасности молочнокислого микроорганизма Staphylococcus carnosus на мышах

Заключение к главе 4

5 Получение нового пробиотического штамма для животноводства на основе молочнокислого микроорганизма Lactobacillus plantarum L-211

5.1 Исследование комплекса характеристик штамма L. plantarum L-211

5.1.1 Идентификация штамма по биохимическому профилю

5.1.2 Морфологические и культуральные свойства

5.1.3 Физиолого-биохимические свойства штамма

5.1.4 Технологические свойства молочнокислого микроорганизма

5.1.5 Пробиотические свойства штамма

5.1.6 Молекулярно-генетическая идентификация штамма

5.2 Биотестирование L. plantarum L-211 на клеточных тест-системах

5.3 Оценка безопасности Lactobacillus plantarum L-211 на мышах

Заключение к главе 5

6 Комплексная оценка технологических и потребительских характеристик ферментированного мясного продукта с бактериальной композицией стартовых культур

6.1 Выбор заквасочных микроорганизмов для ферментированного мясного продукта

6.2 Выработка сырокопченой колбасы со стартовыми культурами

6.3 Исследование характеристик конечного мясного продукта

Заключение к главе 6

7 Оценка пробиотической активности штамма Lactobacillus plantarum L-211 и влияние на микрофлору цыплят-бройлеров

7.1 Результаты T-RFLP-анализа микрофлоры слепых отростков бройлеров

7.2 Влияние L. plantarum на нормофлору кишечников бройлеров

7.3 Влияние Lactobacillus plantarum на «нежелательную» микрофлору

7.4 Влияние L. plantarum на количество патогенных микроорганизмов

7.5 Влияние L. plantarum на количество некультивируемых бактерий

7.6 Влияние Lactobacillus plantarum L-211 на транзитную микрофлору

Заключение к главе 7

ВЫВОДЫ

СОКРАЩЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода биотестирования безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Биотехнология является одним из важнейших и перспективных направлений развития технологий в Российской Федерации. На 2013-2020 годы принята государственная программа «Развитие науки и технологий», в которой определены приоритетные направления развития сферы исследований и разработок в тематической области «Биотехнологии».

Актуальными направлениями клеточной биотехнологии являются разработка методов и способов культивирования клеток человека, животных и растений, изучение их культурально-морфологических свойств и ультраструктуры, разработка способов идентификации и оценки эффективности ингибиторов онкологических и инфекционных заболеваний.

Биотехнологические подходы играют все большую роль в пищевой промышленности при разработке и производстве продуктов функциональной направленности, в том числе с применением пробиотических микроорганизмов, заквасочных и стартовых культур.

Фундаментальные исследования в данной области направлены на поиск и скрининг новых промышленно-ценных штаммов, пробиотиков и синбиотиков, изучение их свойств, метаболических путей, физиологических функций и продуцируемых биологически активных соединений. Современным подходом является изучение генома молочнокислых бактерий, разработка методов молекулярной идентификации и таксономии, благодаря чему появляется возможность применять выявленные и изученные микроорганизмы в производстве новых видов продуктов питания и продовольственного сырья, функциональных пищевых продуктов, диетических (лечебных и профилактических) продуктов (Ганина В.И., Громовых Т.И., Костенко Ю.Г., Семенихина В.Ф., Хорольский В.В., Bover-Cid S., DeVuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Madsen S.M., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.).

Прикладные аспекты состоят в разработке технологий получения и характеристике функциональных свойств продуктов, имеющих в своем составе биологически активные соединения и биокомпозиции, а также в проектировании и оптимизации технологических процессов для получения продуктов с высокой добавленной стоимостью. На основе новых штаммов осуществляется создание высокоактивных молочнокислых и других технологических микроорганизмов, высококонцентрированных заквасок и стартовых культур с заданными биологическими характеристиками и оптимизированными технологическими свойствами для промышленной биотехнологии.

Важным является мониторинг качества и безопасности пищи и ингредиентов, поэтому ведутся разработки методов тестирования функциональных свойств пищевых продуктов и ингредиентов, включающие выявление новых тест-объектов, проведение работ по оценке индикаторной значимости организмов, их адаптационной способности к действующим факторам в различных условиях, создание лабораторных моделей и модельных систем. Результаты направлены на создание и внедрение эффективных биотест-систем, в том числе экспрессных, на основе биологического материала и живых организмов, разработку биосенсоров, создание методов и критериев оценки состояния биоиндикаторов по их физиологическому состоянию и морфологическим изменениям в ходе онтогенеза (Гроздов А.О., Децина А.Н., Елисеева Л.Г., Еремец В.И., Зуев Е.Т., Рогов И.А., Скрябин К.Г., Черемных Е.Г., Bhunia A.K., Deshpande S.S., Jay J.M., Rasooly R., Wiseman A., Yamashoji S. и др.).

Пробиотические микроорганизмы обладают огромным метаболическим потенциалом и осуществляют множество биохимических процессов, предотвращают колонизацию желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, участвуют в формирования местного и системного иммунитета. На сегодняшний день пробиотики широко используются как в пищевой промышленности (Ганина В.И., Королева Н.С., Семенихина В.Ф., Fuller R., Gibson G., Klaenhammer T.D. и др.), так и в сельском хозяйстве (Артемьева О.А., Егоров И.А., Зиновьева Н.А., Иванова А.Б., Малик Н.И., Лаптев

Г.Ю., Неминущая Л.А., Ноздрин Г.А., Панин А.Н., Самуйленко А.Я., Субботин В.В., Эрнст Л.К., Фисинин В.И., Oggioni M.R., Ouwehand A.C. и др.).

Изучение роли пищевых биологически активных веществ и их влияния на рост и развитие клеток откроет возможности для разработки и использования функциональных пищевых продуктов в целях оптимизации питания, профилактики и минимизации риска заболеваний.

Степень разработанности темы

Согласно Доктрине продовольственной безопасности РФ от 30 января 2010 г решение ключевых задач в сфере обеспечения продовольственной безопасности предполагает развитие фундаментальных и прикладных научных исследований по медико-биологической оценке безопасности новых и традиционных источников пищи и ингредиентов, внедрение инновационных биотехнологий, эффективную переработку пищевого сырья, развитие производства пищевых продуктов, в том числе обогащенных незаменимыми эссенциальными нутриентами, функциональных пищевых продуктов, продуктов детского питания, диетических, лечебных, профилактических, а также биологически активных добавок к пище.

Молекулярно-генетические и метаболические факторы определяют нормальное протекание метаболизма в клетках, их дифференциацию, деление и апоптоз, осуществление физиологических функций тканей и органов и, в конечном счете, здоровье организма. Множество эпидемиологических и доклинических исследований свидетельствует, что между данными детерминантами и конкретными пищевыми субстанциями существует множество разнообразных взаимоотношений. Выяснение этих взаимосвязей, в том числе на клеточном уровне, способно обеспечить научную базу для наиболее обоснованных рекомендаций использования соответствующих нутриентов с целью сохранения и укрепления физического и психического здоровья и снижения риска возникновения заболеваний (Тутельян В.И., Шендеров Б.А., Milner J.A., Shils M.E.).

Поскольку клетки позвоночных in vitro реагируют на воздействие химических и биологических факторов адекватно исходному организму, предлагается использовать метод биотестирования на клеточных культурах различных типов тканей человека и животных. Данный подход позволит определить морфофизиологические и хемотаксические изменения тест-систем, сигнализирующие о положительном либо неблагоприятном эффекте, и провести оценку безопасности потенциальных пищевых ингредиентов, в том числе функциональных, включая пробиотические микроорганизмы.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлась разработка метода биотестирования безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем.

Исходя из цели исследований, были сформулированы следующие задачи:

- разработка метода биологической оценки безопасности пищевых ингредиентов и пробиотических микроорганизмов с использованием культур клеток животных и человека; выбор клеточных тест-систем и оценка их характеристик в культуре in vitro, включая показатели ростовой кинетики;

- получение новых пищевых ингредиентов микробного происхождения -скрининг молочнокислых микроорганизмов из микробных сообществ мясных продуктов естественной ферментации, изучение их физиолого-биохимических, молекулярно-генетических, пробиотических и технологических свойств; оценка безопасности вновь выделенных микроорганизмов и уже используемых в промышленности стартовых культур в опытах на культурах клеток in vitro и подтверждение in vivo на мышах;

- получение нового пробиотического штамма для животноводства -изучение его физиолого-биохимических, молекулярно-генетических и пробиотических свойств; оценка безопасности пробиотического микроорганизма на культурах клеток in vitro и подтверждение in vivo на мышах;

- технологическая характеристика микробных пищевых ингредиентов, изучение их влияния на комплекс потребительских и технологических свойств

пищевых продуктов; изучение влияния пробиотического штамма на микрофлору сельскохозяйственных животных на примере цыплят-бройлеров.

Научная новизна работы

Предложен метод оценки безопасности пищевых ингредиентов и пробиотических микроорганизмов с помощью тест-систем на основе клеток человека и животных in vitro, патенты № 2604802 РФ «Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем» и № 2604804 РФ «Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем».

При исследовании профиля микробного сообщества мясного продукта естественной ферментации методом T-RFLP установлено, что большая часть микрофлоры колбасы (около 80%) представлена безопасными (64,8%), некультивируемыми (14,8%) и условно-патогенными (19,7%) микроорганизмами; 0,7% приходилось на патогенные бактерии Campylobacter lari. Из мясного продукта естественной ферментации выделены и идентифицированы молочнокислые микроорганизмы Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus sakei KD-2 и Enterococcus faecalis KD-3.

С помощью метода биотестирования определено влияние на клеточные тест-системы штаммов Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus sakei KD-2 и Enterococcus faecalis KD-3, выделенных из ферментированного мясного продукта и стартовых культур Lactobacillus curvatus 111-1, Lactobacillus sakei 306-1, Lactobacillus casei 10, Lactobacillus plantarum 19, Pediococcus acidilactici 3, Pediococcus acidilactici 38, Pediococcus pentosaceus 39, Pediococcus pentosaceus 55, Staphylococcus carnosus S-1, Staphylococcus xylosus Р-1 из коллекции ФГБОУ ВО МГУПП. Все штаммы являются безопасными. Наибольшее воздействие в отношении опухолевых клеток при дозозависимом ингибировании жизнеспособности проявили штаммы Lactobacillus curvatus 111-1, Lactobacillus plantarum 19 и Pediococcus acidilactici 3. Результаты, полученные на клеточных тест-системах, подтверждены исследованиями на мышах.

Проведена идентификация, изучены физиолого-биохимические, пробиотические и молекулярно-генетические свойства молочнокислого микроорганизма Lactobacillus plantarum L-211, рекомендуемого в качестве пробиотика для животноводства. С помощью метода биотестирования на клеточных тест-системах установлено, что штамм является не токсичным и не токсигенным, что подтверждено в исследованиях на мышах.

Практическая значимость работы

Разработан метод биотестирования объектов пищевого назначения на клеточных тест-системах.

Предложен молекулярно-генетический метод T-RFLP-анализа для исследования профиля микробного сообщества ферментированных пищевых продуктов и поиска новых технологических штаммов микроорганизмов.

Выделенные из мясного продукта естественной ферментации и идентифицированные молочнокислые микроорганизмы Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus sakei KD-2 и Enterococcus faecalis KD-3 депонированы во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номерами B-12732, B-12733 и B-12734 соответственно.

Разработана бактериальная композиция на основе стартовых культур Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus plantarum 19 и Staphylococcus carnosus S-1, которая рекомендуется к использованию в рецептуре сырокопченых колбас для повышения санитарно-гигиенического состояния и осуществления контролируемой ферментации мясного сырья.

Проведена комплексная оценка технологических и потребительских характеристик ферментированного мясного продукта с бактериальной композицией стартовых культур, которая позволила получить продукт с высокими характеристиками.

Проведена оценка пробиотической активности штамма Lactobacillus plantarum L-211 и его влияния на микрофлору пищеварительного тракта цыплят-бройлеров. Установлено, что при добавлении штамма в рацион цыплят-бройлеров

возросла доля представителей нормофлоры: целлюлозолитических бактерий, лактобактерий, селеномонад и некультивируемых бактерий. При этом снизилось количество нежелательных актиномицетов и энтеробактерий, патогенных стафилококков, пептококков, фузобактерий и представителей транзитной микрофлоры - псевдомонад.

Основные положения, выносимые на защиту

Метод биотестирования безопасности пищевых ингредиентов с использованием клеточных тест-систем in vitro.

Молекулярно-генетический способ T-RFLP для исследования профиля микробного сообщества ферментированных мясных продуктов.

Новые штаммы микроорганизмов Lactobacillus sakei KD-1 (B-12732), Lactobacillus sakei KD-2 (B-12733) и Enterococcus faecalis KD-3 (B-12734).

Бактериальная композиция на основе стартовых культур Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus plantarum 19 и Staphylococcus carnosus S-1 для мясной промышленности.

Пробиотический штамм для животноводства Lactobacillus plantarum L-211.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конкурсах и конференциях: Международной конференции молодых ученых «Проблемы пищевой безопасности» (Москва, 2013); V Международной научно-технической конференции «Безопасность и качество продуктов питания. Наука и образование» (Москва, 2014); Общеуниверситетских научных конференциях молодых ученых и специалистов «День науки МГУПП» (Москва, 2014, 2015, 2016); XIII научно-практической конференции с международным участием «Живые системы» (Москва, 2015); Международном научном форуме молодых ученых «Наука будущего - наука молодых» (Севастополь, 2015); 8-м Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические

процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2016); VI Международной научно-практической конференции «Современные достижения биотехнологии. Новации пищевой и перерабатывающей промышленности» (Ставрополь, 2016); 62-м Международном Конгрессе по вопросам науки и технологии мясной промышленности (Бангкок, Тайланд, 2016).

Работа «Биотестирование пробиотиков на клеточных тест-системах in vitro для разработки бактериальной композиции и создания кисломолочного продукта» отмечена дипломом на конкурсе молодых ученых 8-го Международного научно-практического симпозиума «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» 26-27 апреля 2016 г, Москва.

Автором получен сертификат за участие в составе программного комитета секции «Агро-, био- и продовольственные технологии» Международного научного форума молодых ученых «Наука будущего - наука молодых», 29 сентября - 2 октября 2015, Севастополь.

Публикации

По материалам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 19 печатных работ, в том числе статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ - 4, в других изданиях - 14, 2 патента, одно учебное пособие для студентов группы направлений подготовки 19.00.00 уровней бакалавриата и магистратуры.

Благодарност и

Автор выражает благодарность директору Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» ГНЦ РФ, д.б.н., профессору Синеокому С.П., главному специалисту ООО «Биотроф» Никонову И.Н.

Часть работ была выполнена за счет гранта Российского научного фонда «Изучение механизмов биосинтеза и деградации специфических биологически

активных белков и пептидов под действием ферментативного и неферментативного протеолиза тканей Sus scofa и Bos taurus и разработка на их основе специализированных пищевых продуктов» (проект № 16-16-10073) и при поддержке субсидии Минобрнауки РФ «Создание полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ и технологии его производства» (шифр заявки «2014-14-579-0001-023»).

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Способы биотестирования пищевых продуктов, ингредиентов и кормов

Контроль качества и безопасности пищевых продуктов направлен на разработку биотехнологических подходов к медико-биологической оценке новых и нетрадиционных источников пищи, пищевых добавок и ингредиентов. Обеспечение безопасности пищевых ингредиентов является важной частью санитарно-эпидемиологического благополучия населения, поскольку некачественные компоненты и продукты питания могут приводить к заболеваниям различной этиологии. В животноводстве обеспечение надлежащего качества кормов и добавок необходимо для реализации генетического потенциала, роста, развития и продуктивности животных, во избежание ухудшения санитарного состояния и последующих экономических потерь. Для предотвращения этого необходимо тщательно проводить испытания токсичности объектов пищевого и сельскохозяйственного назначения, в том числе пробиотических микроорганизмов.

Для оценки существующих способов биотестирования объектов пищевого и кормового назначения был проведен анализ литературных и патентных источников. Предметом которого являлись разработки и исследования в РФ и мире в области определения безопасности, в том числе оценки токсичности и токсигенности объектов пищевого и кормового назначения, в том числе функциональных пищевых ингредиентов, БАВ, продуктов микробного синтеза и пробиотических микроорганизмов с использованием живых тест-объектов.

Известен способ определения безопасности растительных масел с помощью Tetrahymena pyriformis (Пат. РФ № 2415417), который позволяет повысить точность и достоверность результатов определения безопасности растительного масла. Способ включает подготовку исследуемого и контрольного (нерафинированное масло) образцов масла; приготовление питательной среды, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт, морскую соль, масляный раствор

витамина Е концентрацией 30% и дистиллированную воду; внесение в количестве по 5 мл 30 мл исследуемого и контрольного образца масла в питательную среду; перемешивание; стерилизацию при температуре 80 °С и охлаждение полученной смеси; внесение в нее тест-организма Tetrahymena pyriformis в количестве 0,2 мл; термостатирование для размножения микроорганизмов в течение 3 суток при температуре 25 °С; встряхивание среды пробы для аэрации 3 раза в сутки через равные промежутки времени; фиксацию микроорганизмов раствором Люголя; подсчет в камере Горяева и оценку безопасности (Б) в процентах.

В патенте РФ № 2512751 рассмотрен способ оценки биологической ценности молочных продуктов, который осуществляют с использованием в качестве тестирующего объекта имаго комнатной мухи (Musca domestica) (Пат. РФ № 2512751). Биологическая ценность продукта определяется путем сравнения продолжительности жизни имаго, в рацион которых включен исследуемый молочный продукт, и имаго, в рационе которых исключены молочные продукты.

Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов позволяет сократить время проведения биоанализа, получить сведения о наличии токсинов. Он заключается в использовании инфузорий Paramecium caudatum, культивируемых на зернах длиннозерного риса (Пат. РФ № 2266015). Оценку токсичности проводят по проценту выживших инфузорий в водном растворе ацетонового экстракта исследуемого продукта.

Другое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при выявлении токсигенных кишечных палочек (Пат. РФ № 2262529). Способ предусматривает проведение испытания по выживаемости инфузорий вида стилонихии путем смешивания среды инфузорий вида стилонихии с кишечной палочкой, выращенной на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1-3 суток в соотношении 3:1 и определение степени токсичности исследуемого объекта, оцениваемой по степени выживания инфузорий. Изобретение позволяет обнаружить патогенные штаммы кишечной палочки, осуществлять эпидемиологический надзор за ее присутствием и распространением,

оптимизировать сроки культивирования при производстве вакцинных препаратов против эшерихиоза молодняка животных.

Патент РФ № 2377561 описывает способ биотестирования активности препарата, полученного из дождевых червей, с помощью олигохет (Пат. РФ № 2377561). Способ включает смешивание препарата с водой, помещение олигохет в полученный раствор, выдерживание в течение 30 мин с последующим определением активности препарата по поведенческой реакции олигохет, причем об активности препарата судят по отсутствию сползания олигохет в клубок в присутствии активного препарата.

Известен способ определения биологической активности вещества, заключающийся в том, что выделяют клетки из биологических тканей человека или животных, проводят мечение с использованием флюоресцентного красителя, ко-культивируют с пораженными заболеванием клетками, к ко-культуре добавляют исследуемое вещество, определяют биологическую активность исследуемого вещества, анализируя жизнеспособность определенной клеточной популяции в ко-культуре здоровых и пораженных заболеванием клеток по увеличению или снижению процента мертвых клеток (Пат. РФ № 2492472).

Для автоматизированного биотестирования разработан приборно-вычислительный комплекс БиоЛаТ-3.2 с системой визуализации и программным обеспечением для математической обработки данных. Предназначен для биологической оценки действия кормовых и пищевых продуктов и добавок, с/х сырья растительного и животного происхождения, а также фармацевтических препаратов и БАД. Биологическая оценка осуществляется с помощью регистрации тест-реакций инфузорий Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus и Tetrahymena pyriformis на пробы исследуемых объектов (утв. РАСХН и ГНУВНИИВСГЭ, 2009 г).

В 1997 г был разработан экспресс-метод токсико-биологической оценки мяса, мясных продуктов и молока с использованием инфузорий тетрахимена пириформис (МУК по токсико-биологической оценке мяса, мясных продуктов и молока с использованием инфузорий тетрахимена пириформис, 1997).

Биологическую ценность мяса, мясопродуктов и молока определяют по числу инфузорий, размножившихся на испытуемых пробах с определенным количеством азота за 4-ро суток культивирования. Полученные данные сравнивают с числом инфузорий на контроле, а результат выражают в процентах. Количество простейших подсчитывают под малым увеличением микроскопа в камере Фукс-Розенталя или Горяева. Безвредность продуктов определяют по характеру движения инфузорий, наличию измененных форм и мертвых клеток в культуре.

В ГОСТ 31674-2012 описаны несколько методов определения общей токсичности кормов, комбикормов и сырья. Метод биотестирования кормов на стилонихиях (Stylonychia туЫ1ш) основан на извлечении из исследуемых кормов различных фракций токсических веществ параллельно ацетоном и водой с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий. Оценку результату биотеста дают по реакции гибели инфузорий. Безопасным в этом случае следует считать корм, определенный как нетоксичный при одновременном параллельном исследовании как ацетонового, так и водного экстракта. С учетом времени подготовки пробы корма к биотесту определение общей токсичности одной пробы занимает от 3,5 до 4,0 ч; десяти проб - от 4,5 до 5,0 ч.

Метод биотестирования кормов на колподах (Colpoda steinii) основан на извлечении из испытуемых кормов фракций токсичных веществ параллельно ацетоном и водой с последующим воздействием этих веществ на колподы. Время полного анализа одной пробы - от 3,5 до 4 ч, десяти проб - от 4,5 до 5 ч.

Основные методы определения общей токсичности кормов биотестированием на кроликах и мышах основаны на испытании кормов растительного и животного происхождения, а также комбикормов для продуктивных и непродуктивных животных и кормовых добавок методом биотестирования параллельно на кроликах (кожная проба) и на мышах (острый опыт), что дает возможность учесть как дермонекротическое действие токсинов, так и их воздействие на пищеварительную систему теплокровных животных. Результат определяют по совокупности реакций в обоих методах: корм

нетоксичный (нетоксичен в обоих тестах), корм токсичный (токсичен хотя бы в одном тесте).

При этом готовят и вводят мышам либо ацетоновый экстракт (если по результатам экспресс-биотеста токсичен был ацетоновый экстракт корма), либо водный экстракт (если по результатам экспресс-биотеста токсичен был водный экстракт). Такой анализ дает возможность учесть действие водорастворимых и растворимых в ацетоне токсинов (ГОСТ 31674-2012).

Согласно МУ 2.3.2.2789-10 изучение штаммов пробиотических микроорганизмов по показателям, характеризующим их безопасность, проводится путем тестирования in vitro и в экспериментах in vivo (на моделях конвенциональных линейных лабораторных животных обоего пола, обычно применяемых в нутрициологии - мышах, крысах, морских свинках, кроликах, с пероральным введением стандартных и аггравированных доз (до 1011 КОЕ и более в 1 г инокулята, но не менее 109 КОЕ на животное) (МУ 2.3.2.2789-10).

Согласно МУК 4.2.2602-10 для токсикологических исследований используют здоровых животных, полученных из сертифицированных питомников. Вирулентность, токсигенность, токсичность (общую, «острую» и «хроническую»), безвредность, дермонекротические и другие свойства определяют не менее чем на двух видах (нелинейных или линейных) или двух линиях одного вида животных в зависимости от изучаемого штамма. Исследования проводят на животных обоего пола (МУК 4.2.2602-10).

Таким образом, биологическую оценку безопасности пищевых продуктов, ингредиентов и пробиотиков проводят с использованием одноклеточных протистов, насекомых, мелких ракообразных, водорослей и семян высших растений. Недостатком данных методов является то, что тест-организмы имеют значительно более простую клеточную организацию, чем высшие позвоночные, организмы которых состоят различных типов тканей и клеток.

В качестве модельной системы организма человека обычно используются высшие животные (молодые особи крыс, мышей, кроликов, кошек и др.), в том числе сельскохозяйственные (например, цыплята). Недостатками методов с

использованием высших млекопитающих являются высокая стоимость, громоздкость, длительность анализа и этические проблемы. Поэтому необходим простой, доступный и достоверный метод оценки воздействия различных пищевых ингредиентов на живой организм и его системы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Клабукова, Дарья Леонидовна, 2017 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Автоматизированный метод оценки токсичности продовольственного сырья и кормов на инфузориях Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis; утв. РАСХН 2009 г и ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

2. Асонов Н.Р. Микробиология. - М.: Колос, Колос-Пресс. - 2002. - 352 с.

3. Банникова Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. - М.: Пищевая промышленность. - 1975. - 257 с.

4. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2003. - № 3. - С. 109-113.

5. Блинкова Л.П. Биотехнологические условия синтеза бактериоцинов / Блинкова Л.П. [и др.] // Микробиология. - 2006. - № 2. - С. 83-89.

6. Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования. - М.: Генетика. - 2006. - Т. 42, № 12. - С. 1621-1635.

7. Брюханов А.Л., Рыбак К.В., Нетрусов А.И. Молекулярная биология / А.Л. Брюханов, К.В. Рыбак, А.И. Нетрусов. - М.: изд-во МГУ. - 2012. - 474 с.

8. Градова Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Градова Н.Б. и др. - М.: ДеЛи принт. - 2001. - 131 с.

9. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - М.: Стандартинформ. - 2013. - 33 с.

10. ГОСТ 10444.12-2013. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов (с Поправкой). - М.: Стандартинформ. - 2014. - 10 с.

11. ГОСТ 32031-2012. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes. - М.: Стандартинформ. - 2014. - 26 с.

12. ГОСТ 25011-81. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка (с Изменением N 1). - М.: Стандартинформ. - 2010. - 8 с.

13. ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91). Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб. - М.: Стандартинформ. - 2010. - 10 с.

14. ГОСТ Р 51478-99 (ИСО 2917-74). Мясо и мясные продукты. Контрольный метод определения концентрации водородных ионов (pH). - М.: Стандартинформ. - 2010. - 6 с.

15. ГОСТ Р 51479-99 (ИСО 1442-97). Мясо и мясные продукты. Метод определения массовой доли влаги. - М.: Стандартинформ. - 2010. - 6 с.

16. ГОСТ 23042-86. Мясо и мясные продукты. Методы определения жира. -М.: Стандартинформ. - 2010. - 6 с.

17. ГОСТ 8558.1-78. Продукты мясные. Методы определения нитрита (с Изменениями N 1, 2). - М.: Стандартинформ. - 2010. - 14 с.

18. ГОСТ Р 55480-2013. Мясо и мясные продукты. Метод определения кислотного числа. - М.: Стандартинформ, 2014. - 8 с.

19. ГОСТ Р 54346-2011. Мясо и мясные продукты. Метод определения перекисного числа. - М.: Стандартинформ. - 2012. - 12 с.

20. ГОСТ Р 55810-2013. Мясо и мясные продукты. Метод определения тиобарбитурового числа. - М.: Стандартинформ. - 2014. - 8 с.

21. ГОСТ 9959-91. Продукты мясные. Общие условия проведения органолептической оценки. - М.: Стандартинформ. - 2010. - 10 с.

22. ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus. - М.: Стандартинформ. - 2013. - 28 с.

23. ГОСТ 29185-91. Продукты пищевые. Методы выявления и определенияя количества сульфитредуцирующих клостридий. - М.: Стандартинформ. - 2010. -6 с.

24. Дмитриева В.С., Семенов С.М. Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов. - Практическое руководство. - М.: Медицина, 1965. - 365 с.

25. Желдакова Р.А. Выделение и идентификация микроорганизмов. Учебно-методическое пособие. - Минск: БГУ. - 2003. - 23 с.

26. Ильина Л.А. Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода Т-Я^ЪР с целью разработки способов ее оптимизации : диссертация ... кандидата биол. наук : 03.01.06 / Ильина Л.А. -Санкт-Петербург, 2012. - 197 с.

27. Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Филиппова В.А., Никонов И.Н., Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Фисинин В.И., Чеботарев И.И., Машенцева Н.Г., Клабукова Д.Л. Определение пробиотической активности штамма Ьас1вЪасШ18 р1а~Магпт Ь-211 методом Т-Я^ЪР // Биофармацевтический журнал. - 2015. - В. 7, № 6. - С. 1115.

28. Кабисов Р., Цугкиев Б., Хозиев А. Использование штаммов лактобактерий при выращивании бройлеров // Птицеводство. - 2010. - 5: С. 4041.

29. Колотвина С.В., Машенцева Н.Г., Титов Е.И., Митасева Л.Ф. Молекулярно-генетические и физико-химические методы для характеристики санитарно-гигиенического состояния ферментированных мясных продуктов. - М.: Биотехнология. - 2011. - № 4. - С. 88-94.

30. Колотвина С.В. Адаптация и оптимизация метода ПЦР в реальном времени для микробиологического анализа мясных продуктов. - М.: Биотехнология. - 2012. - № 3. - С. 85-91.

31. Корочкин Р.Б. Культивирование вирусов в культурах клеток : учеб.-метод. пособие / Р.Б. Корочкин, А.А. Вербицкий, В.Н. Алешкевич, А.В. Сандул. -Витебск: ВГАВМ, 2010. - 43 с.

32. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина. - 2004. - 576 с.

33. Лаптев И.А. Разработка бактериального препарата на основе штамма-продуцента нитритредуктазы для снижения остаточного нитрита натрия в мясных продуктах. Автореферат.. .к.т.н. / И.А. Лаптев // М.: МГУПБ, 2008. - 24 с.

34. Лысак В.В. Микробиология. - Минск: БГУ, 2008. - 427 с.

35. Лысак В.В. Микробиология. Практикум : пособие / В. В. Лысак, Р. А. Желдакова, О. В. Фомина. - Минск: БГУ. - 2015. - 115 с.

36. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Перевод с англ. языка под редакцией А.А. Баева и К.Г. Скрябина. - М.: Мир. - 1984. - 479 с.

37. Машенцева Н.Г., Хорольский В.В. Функциональные стартовые культуры в мясной промышленности. - М.: ДеЛи принт. - 2008. - 336 с.

38. Методические указания по токсико-биологической оценке мяса, мясных продуктов и молока с использованием инфузорий тетрахимена пириформис (экспресс-метод): утв. ГУВ Минсельхозпрода РБ 20.10.1997. - Витебск. - 1997. -13 с.

39. МУ 2.3.2.2789-10. Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов: Методические указания. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. - 2010. - 93 с.

40. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - 2004. - 91 с.

41. МУК 4.2.2.2602-10 Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков: Методические указания. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. - 2010. -60 с.

42. Навашин С.М., Фомина И.П. Справочник по антибиотикам. - М.: Медицина. - 1974. - 416 с.

43. Нефедова Н.В., Серегин И.Г. Биологические методы снижения бактериальной контаминации фарша для колбасных изделий // М.: Мясная индустрия, 2003. - № 10. - С.48-51.

44. Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. - М.: Агропромиздат. - 1990. - 223 с.

45. Пат. № 2501861 РФ, МПК G01N33/53, С^1/02, C12N1/20. Способ определения адгезивных свойств бактерий рода ЕМвгососсш с помощью клеточной линии СаСо-2 / Нгуен Т.М.К. (КЦ), Машенцева Н.Г. (КЦ). - заявл. 12.05.12.; опубл. 20.12.13.

46. Пат. РФ № 2415417, МПК G01N33/03. Способ определения безопасности растительных масел / Францева Т.П. (КЦ), Прудникова Т.Н. (КЦ), Широкорядова О.В. (КЦ). - приор. 03.08.2009; опубл. 27.03.2011.

47. Пат. РФ № 2512751, МПК 00Ш33/04. Способ оценки биологической ценности молочных продуктов / Сороколетов О.Н. (КЦ), Бгатов А.В. (КЦ), Кунц Е.В. (КЦ). - приор. 24.12.2012; опубл. 10.04.2014.

48. Пат. РФ № 2266015, МПК А23К, 00Ш33/02. Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов / Гроздов А.О. (КЦ). -приор. 16.08.2001; опубл. 20.12.2005.

49. Пат. РФ № 2262529, МПК С12Ш/10, С1201/10. Способ биотестирования токсигенности кишечной палочки / Терехов В.И. (КЦ), Шпонько Ю.Б. (КЦ), Боровой В.Н. (КЦ), Тельнов С.Н. (ВД). - приор. 23.12.2003; опубл. 20.10.2005.

50. Пат. РФ № 2377561, МПК 00Ш33/18, А01К67/033. Способ биотестирования активности препаратов, полученных из дождевых червей / Стом Д.И. (ВД), Балаян А.Э. (RЦ), Полехина С.В. (ВД), Быбин В.А. (RЦ). -приор. 11.02.2008; опубл. 27.12.2009.

51. Пат. РФ № 2492472, МПК 00Ш33/15. Способ определения биологической активности вещества / Ризванов А.А. (КЦ), Блатт Н.Л. (КЦ), Салафутдинов И.И. (RЦ), Шафигуллина А.К. (RЦ), Шахин Ф. (ТК), Ялвач М.Э. (ТК), Андраш П. (НЦ), Киясов А.П. (ВД). - приор. 11.09.2009; опубл. 10.09.2013.

52. Розанов Н.И. Справочник по микробиологической технике. - М.: СельхозГИЗ. - 1957. - 320 с.

53. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - Изд. 2-е, перераб и доп. - М.: Колос. - 1979. - 216 с.

54. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных / М.А.Тимошко. - Кишинев: Штиинца, 1990. -189 с.

55. Титов Е.И. Стартовые культуры, снижающие содержание холестерина, в мясных продуктах / Е.И. Титов, C.B. Колотвина, Н.Г. Машенцева, А.И. Семенышева, Т.М.К. Нгуен // Мясная индустрия. - 2012. - № 2. - С. 22-25.

56. ТР ТС 021/2011. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции». Решение Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 г N 880 // СПС «КонсультантПлюс».

57. ТР ТС 033/2013. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции». Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 09.10.2013 N 67 // СПС «КонсультантПлюс».

58. ТР ТС 034/2013. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции». Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 9 октября 2013 г N 68 // СПС «КонсультантПлюс».

59. Фисинин В.И. Методика проведения научных и производственных исследований по кормлению сельскохозяйственной птицы. Молекулярно-генетические методы определения микрофлоры кишечника / Под ред. В.И. Фисинина. - Сергиев Посад. - 2013.

60. Фисинин В.И., Егоров И.А., Ленкова Т.Н., Околелова Т.М. Руководство по оптимизации рецептов комбикормов для сельскохозяйственной птицы // Сергиев Посад. - 2014. - 155 с.

61. Фисинин В.И. Подходы к созданию пробиотических биопрепаратов на основе лизинпродуцирующих бактерий / Фисинин В.И. [и др.] // Биофармацевтический журнал. - 2014. - В. 6, № 6. - P. 60-64.

62. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток : практическое руководство / Р.Я. Фрешни; пер.5-го англ. изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. - 2010. - 691 с.

63. Хорольский В.В. Выделение и идентификация бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов для использования в производстве ферментированных мясных продуктов: лабораторный практикум / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, А.И. Семенышева - М.: МГУПБ, 2008. - 79 с.

64. Цыренов В.Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений: Учебно-методическое пособие. - Улан-Удэ: ВСГТУ. - 2003. - 58 с.

65. Barrow P.A. Brooker B.E., Fuller R., Newport M.J. The attachment of bacteria to the gastric epithelium of the pig and its importance in the microecology of the intestine // J.ppl.Bacteriol. - 1980. - № 49. - P. 147-154.

66. Bover-Cid S., Holzapfel W.H. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria // Int. J. Food Microbiol. - 1999. - V. 53. - № 1. - Р. 33-41.

67. Casquete R. Impact of pre-selected autochthonous starter cultures on the flavor quality of Iberian dry-fermented «salcM^n» sausage with different ripening processes / Casquete R. [et al.] // J. Food Sci. - 2011. - V. 76, № 9. - P. 535-544.

68. Chernukha I., Minaev M., Korsakov K., Bataveva D. Detection and identification of S. carnosus in starter cultures using Real Time PCR and subsequent HRM analysis on amplification products // Procedia Food Sci. - 2015. - V. 5. - P. 3841.

69. Chon H., Choi B., Jeong G., Mo I. Evaluation system for an experimental study of low-pathogenic avian influenza virus (H9N2) infection in specific pathogen free chickens using lactic acid bacteria, Lactobacillusplantarum KFCC11389P // Avian Pathol. - 2008 - V. 37, № 6. - P. 593-597.

70. Citar M. Human intestinal mucosa-associated Lactobacillus and Bifidobacterium strains with probiotic properties modulate IL-10, IL-6 and IL-12 gene expression in THP-1 cells / Citar M. [et al.] // Benef Microbes. - 2015. - V.6, № 3. - P. 325-336.

71. Cusick S.M., O'Sullivan D.J. Use of a single, triplicate arbitrary primed-PCR procedure for molecular fingerprinting of lactic acid bacteria // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - V. 66, № 5. - P. 2227-2231.

72. Danilovic B. The characterisation of lactic acid bacteria during the fermentation of an artisan Serbian sausage (Petrovska Klobasa) / Danilovic B. [et al.] // Meat Sci. - 2011. - V. 88, № 4. - P. 668-674.

73. Delia E., Tafaj M., Mannerin K. Efficiency of Probiotics in Farm Animals // In Probiotic in Animals, ed. E. Rigobelo. InTech. - 2012. - V. 2. - P. 247-272.

74. De Vuyst L., Vandamme E.J. Nisin, a lantibiotic produced by Lactococcus lactis subsp. lactis: properties, biosynthesis, fermentation and applications. In: De Vuyst L, Vandamme EJ (eds) Bacteriocins of lactic acid bacteria // Blackie, London. - 1994. -P. 151-221.

75. Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K., Ishizaki A. Class Ila bacteriocins: biosynthesis, structure and activity // FEMS Microbiol. Rev. - 2000. - V. 24. - P. 85106.

76. Erkkila S. Bioprotective and probiotic meat starter cultures for the fermentation of dry sausages // Academic dissertation, Helsinki. - 2001. - 64 p.

77. FEMS Microbiology Letters. - 2000. - V. 187. - P. 167-173.

78. Fernandez MF., Boris S., Barbes C. Probiotic properties of human lactobacilli strains to be used in the gastrointestinal tract // J Appl Microbiol. - 2003. - V. 94, № 3. - p. 449-455.

79. Fonseca S., Ivette Ouoba L.I., Franco I., Carballo J. Use of molecular methods to characterize the bacterial community and to monitor different native starter cultures throughout the ripening of Galician chorizo // Food Microbiol. - 2013. - V. 34, № 1. - P. 215-226.

80. Fontana C., Gazzola S., Cocconcelli P.S., Vignolo G. Population structure and safety aspects of Enterococcus strains isolated from artisanal dry fermented sausages produced in Argentina // Lett. Appl. Microbiol. - 2009. - V. 49, № 3. - P. 411-414.

81. Freshney R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications // John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA, 6th edition. - 2010.

- 796 p.

82. Jack W.R., Tagg J.R., Ray B. Bacteriocins of Grampositive bacteria // Microbiol. Rev. - 1995. - V. 59. - P. 171-200.

83. Hammes W.P. Bacterial starter cultures in food production // Food Biotechnol. - 1990. - V. 4. - P. 383-397.

84. Heres L. Fermented liquid feed reduces susceptibility of broilers for Salmonella enteritidis / Heres L. [et al.] // Poult Sci. - 2003. - V. 82, № 4. - P. 603611.

85. Guo X. Development of a real-time PCR method for Firmicutes and Bacteroidetes in faeces and its application to quantify intestinal population of obese and lean pigs / Guo X. [et al.] // Letters in Applied Microbiology. - 2008. - V.47. - P.367-373.

86. Hashimoto S. Beta-hydroxyisovalerylshikonin is a novel and potent inhibitor of protein tyrosine kinases / Hashimoto S. [et al.] // Jpn. J. Cancer Res. - 2002. - V. 93, № 8. - P. 944-951.

87. Honda G. Isolation of deoxyshikonin, an antidermatophytic principle from Lithospermum erythrorhizon cell cultures / Honda G. [et al.] // J. Nat. Prod. - 1988. -Vol. 51, № 1. - P. 152-154.

88. Hulst M. Oral administration of Lactobacillus plantarum 299v modulates gene expression in the ileum of pigs: prediction of crosstalk between intestinal immune cells and sub-mucosal adipocytes / Hulst M. [et al.] // Genes Nutr. - 2015. - V. 10, № 3.

- P. 461.

89. IARC Monographs evaluate consumption of red meat and processed meat [Электронный ресурс] : Press release N°240, 26 October 2015. - Электрон. дан. -2015. - Режим доступа: http://www.iarc.fr/en/media-centre/pr/2015/pdfs/pr240_E.pdf

- Загл. с экрана.

90. Jahan M., Krause D.O., Holley R.A. Antimicrobial resistance of Enterococcus species from meat and fermented meat products isolated by a PCR-based rapid screening method // Int. J. Food Microbiol. - 2013. - V. 163, № 2-3. - P. 89-95.

91. Kesmen Z. Combination of culture-dependent and culture-independent molecular methods for the determination of lactic microbiota in sucuk / Kesmen Z. [et al.] // Int. J. Food Microbiol. - 2012. - V. 153, № 3. - P. 428-435.

92. Kitts C.L. Terminal restriction fragment patterns: a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics // Current Issues in Intestinal Microbiology. - 2001. - № 2. - P. 17-25.

93. Kucan M. Testing the adhesion and colonization ability of Lactobacillus plantarum strain S1 to the mice intestinal epithelium / Kucan M. [et al.] // International Journal of sanitary Engeneering research. - 2012. - V. 6, № 1. - P. 25-30.

94. Lahtinen SJ. Degradation of 16S rRNA and attributes of viability of viable but nonculturable probiotic bacteria // Lett Appl Microbiol. - 2008. - V. 46, № 6. - P. 693-698.

95. Leroy F., Verluyten J., De Vuyst L. Functional meat starter cultures for improved sausage fermentation // Int. J. Food Microbiol. - 2006. - V. 106. - № 3. - P. 270-285.

96. Lin M.Y., Yen C.L. Antioxidative ability of lactic acid bacteria // J. Agric. Food. Chem. - 1999. - V. 47. - № 4. - P. 1460-1466.

97. McCartney A.L. Application of molecular biological methods for studying probiotics and the gut flora // Br. J. Nutr. - 2002. - № 88. - P. 29-37.

98. Miller P., Liu X., McMullen L.M. Microbiota of regular sodium and sodium-reduced ready-to-eat meat products obtained from the retail market // Can. J. Microbiol. - 2015. - V. 61, № 2. - P. 150-154.

99. Mizumachi K. Effect of fermented liquid diet prepared with Lactobacillus plantarum LQ80 on the immune response in weaning pigs / Mizumachi K. [et al.] // Animal. - 2009. - V. 3, № 5. - P. 670-676.

100. Nieminen TT. Characterization of psychrotrophic bacterial communities in modified atmosphere-packed meat with terminal restriction fragment length

polymorphism / Nieminen TT. [et al.] // Int J Food Microbiol. - 2011. - V. 144, № 3. -P. 360-366.

101. Ouwehand A.C., Salminen S., Isolaury E. Probiotics: an overview of beneficial effects // Antonie Leewenhoek. - 2002. - № 82. - P. 279-289.

102. Pat. US5753467 A, CA2125141A1, DE69225333D1, DE69225333T2, EP0620862A1, EP0620862B1, W01993011264A1. Method for the identification of microorganisms by the utilization of directed and arbitrary DNA amplification / Jensen M.A., Straus N.A. - № US 08/701,290; filed 22.08.1996; priority 19.05.1998. [Электронный ресурс]. - Электрон. дан. - Режим доступа: https://www.google.kz/patents/US5753467. - Загл. с экрана.

103. Peng Q. Effects of dietary Lactobacillus plantarum B1 on growth performance, intestinal microbiota, and short chain fatty acid profiles in broiler chickens / Peng Q. [et al.] // Poult Sci. - 2016. - V. 95, № 4. - P. 893-900.

104. Polka J. Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by high-throughput sequencing of 16S rRNA amplicons / Polka J. [et al.] // Food Microbiol. - 2015. - V. 46. - P. 342-356.

105. Price K.L., Totty H.R., Lee H.B., Utt M.D., Fitzner G.E., Yoon I., Ponder M.A., Escobar J. Use of Saccharomyces cerevisiae fermentation product on growth performance and microbiota of weaned pigs during Salmonella infection // J. Anim. Sci. - 2010. - V. 88, № 12. - P. 3896-3908.

106. Q&A on the carcinogenicity of the consumption of red meat and processed meat [Электронный ресурс]. - Электрон. дан. - 2015. - Режим доступа: http://www.iarc.fr/en/media-centre/iarcnews/pdf/Monographs-Q&A_Vol 114.pdf -Загл. с экрана.

107. Rahkila R. Characterization and evaluation of the spoilage potential of Lactococcus piscium isolates from modified atmosphere packaged meat / Rahkila R. [et al.] // Int J Food Microbiol. - 2012. - V. 156, № 1. - P. 50-59.

108. Reynisson E. Bacterial composition and succession during storage of North-Atlantic cod (Gadus morhua) at superchilled temperatures / Reynisson E. [et al.] // BMC Microbiol. - 2009. - V. 9. - P. 250.

109. Rijnen L., Bonneau S., Yvon M. Genetic characterization of the major lactococcal aromatic aminotransferase and its involvement in conversion of amino acids to aroma compounds // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. - № 11. - P. 48734880.

110. Rungrassamee W. Development of bacteria identification array to detect lactobacilli in Thai fermented sausage / Rungrassamee W. [et al.] // J. Microbiol Methods. - 2012. - V. 91, № 3. - P.341-353.

111. Sun Y., Liu Y. Investigating of yeast species in wine fermentation using terminal restriction fragment length polymorphism method // Food Microbiol. - 2014. -V. 38. - P. 201-207.

112. Suo C. Effects of Lactobacillus plantarum ZJ316 on pig growth and pork quality / Suo C. [et al.] // BMC Vet Res. - 2012. - № 8. - P. 89.

113. Tanaka Y. Rapid estimation of microbial populations in fish samples by using terminal restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rDNA / Tanaka Y. [et al.] // J Food Prot. - 2010. - V. 73, № 1. - P. 104-113.

114. Wanangkarn A. Lactic acid bacterial population dynamics during fermentation and storage of Thai fermented sausage according to restriction fragment length polymorphism analysis / Wanangkarn A. [et al.] // Int. J. Food Microbiol. - 2014. - V. 186. - P. 61-67.

115. Yang KM. Effect of Lactobacillus plantarum on diarrhea and intestinal barrier function of young piglets challenged with enterotoxigenic Escherichia coli K88 / Yang KM. [et al.] // J Anim Sci. - 2014. - V. 92, № 4. - P. 1496-1450.