«Разработка лиофилизированного препарата на основе рекомбинантных вирусных векторов для профилактики лихорадки Эбола и исследование его иммуногенных и протективных свойств» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Должикова Инна Вадимовна

• Должикова Инна Вадимовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Должикова Инна Вадимовна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Болезнь, вызванная вирусом Эбола

1.2. Структура вируса Эбола

1.3. Жизненный цикл вируса Эбола

1.4. Функции белков вируса Эбола и механизмы ухода от иммунного ответа хозяина

1.4.1. Нуклеопротеин (№)

1.4.2. УР35

1.4.3. УР40

1.4.4. Белки GP

1.4.5. УР30

1.4.6. УР24

1.4.7. Белок L

1.5. Разработка вакцин против БВВЭ

1.5.1. История разработки вакцин против БВВЭ

1.5.2. Векторные вакцины против БВВЭ, вышедшие в клинические исследования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. МАТЕРИАЛЫ, использованные в диссертационной работе

2.1.1. Оборудование

2.1.2. Микроорганизмы и рекомбинантные вирусные векторы

2.1.3. Линии клеток млекопитающих

2.1.4. Животные

2.1.5. Плазмидные векторы

2

2.1.6. Антитела

2.1.7. Рекомбинантные белки

2.1.8. Различные реактивы для молекулярно-биологических процедур

2.1.9. Среды для культивирования бактерий

2.1.10. Среды для культивирования эукариотических клеток и реактивы для трансфекции

2.1.11. Наборы

2.1.12. Синтез нуклеотидных последовательностей, секвенирование

2.1.13. Реактивы, используемые в иммунобиологических методах

2.1.14. Реактивы и наборы, используемые при исследовании иммуногенности

2.2. МЕТОДЫ

2.2.1. Получение и анализ рекомбинантных вирусных векторов

2.2.2. Получение лиофилизированных препаратов рекомбинантных вирусных векторов

2.2.3. Исследования иммуногенности

2.2.4. Исследования протективной активности

2.2.5. Статистические и биоинформатические методы

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выбор антигена и вектора для доставки антигена

3.2. Оптимизация нуклеотидной последовательности для экспрессии полноразмерного гликопротеина GP вируса Эбола

3.3. Получение рекомбинантных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа и вируса везикулярного стоматита, несущих антиген GP вируса Эбола

3.4. Получение лиофильно-высушенных rVSV-GP и rAd5-GP

3.5. Исследование экспрессии гена гликопротеина вируса Эбола в составе полученных рекомбинантных вирусов rAd5-GP и rVSV-GP

3.5.1. Исследование экспрессии гена гликопротеина в составе полученных рекомбинантных вирусов rAd5-GP и rVSV-GP методом иммуноблотинга

3.5.2. Исследование экспрессии гена гликопротеина в составе полученных рекомбинантных вирусов rAd5-GP и гУБУ-ОР методом иммуноцитохимии

3.6. Исследование иммуногенности гУБУ-ОР и rAd5-GP у грызунов и приматов

3.6.1. Исследование напряженности гуморального иммунного ответа

3.6.1.1. Исследование напряженности гуморального иммунного ответа у мышей при иммунизации гУБУ-ОР и rAd5-GP

3.6.1.2. Исследование напряженности гуморального иммунного ответа у макак резус при иммунизации гУБУ-ОР и rAd5-GP

3.6.2. Исследование напряженности клеточного иммунного ответа

3.6.2.1. Исследование напряженности клеточного иммунного ответа у мышей при иммунизации гУБУ-ОР и rAd5-GP

3.6.2.2. Исследование напряженности клеточного иммунного ответа у макак резус при иммунизации гУБУ-ОР и rAd5-GP

3.7. Исследование протективности гУБУ-ОР и rAd5-GP у приматов

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

Д-пептид - пептид, образующийся при протеолизе pre-sGP

БВВЭ - болезнь, вызванная вирусом Эбола

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВАК - высшая аттестационная комиссия

ВНА - вирус-нейтрализующие антитела

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ВПЧ - вирусоподобные частицы

вч, в.ч. - вирусная частица

ДДС - додецилсульфат

ДИ - доверительный интервал

ДК - дендритная клетка

дцРНК - двуцепочечная РНК

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН-у - интерферон гамма

ЛД50 - полулетальная доза, средняя доза вещества, вызывающая гибель половины

членов испытуемой группы

МкАт - моноклональные антитела

МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови

мРНК - матричная РНК

н.о. - нуклеотидное основание

оцРНК - одноцепочечная РНК

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

РНП-комплекс - рибонуклеопротеиновый комплекс

УФ - ультрафиолет

ФГА - фитогемагглютинин

ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат ФНО - фактор некроза опухоли

A549 - культура эпителиальных клеток аденокарциномы человека

Ad3, ChAd3 - аденовирус шимпанзе 3 серотипа

Ad26 - аденовирус человека 26 серотипа

BDBV - вирус Эбола вида Бундибугио

CatB, CatL - катепсин B, катепсин L

CD - кластер дифференцировки

CD209/DC-SIGN - внутриклеточная адгезионная молекула 3-захватывающего неинтегрина

CLEC4M/DC-SIGNR - член семейства лектиновых доменов C-типа EBOV - вирус Эбола

ELISPOT - метод иммуноферментных пятен

GMK-AH-1 (Д) - культура клеток эпителия почки зеленой мартышки GP - гликопротеин вируса Эбола

НЕК-293 - культура клеток эмбриональной почки человека

IFN-Y - интерферон гамма

IRF3 - регуляторный фактор интерферона

L - каталитическая субъединица вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы

LiVP-T7pol - штамм осповакцины, несущие ген Т7 полимеразы

MHC - главный комплекс гистосовместимости

MVA - модифицированный вирус осповакцины Анкара

NCP1 - транспортер холестерина Нимана-Пика

NHP - нечеловекоподобные приматы

NP - нуклеопротеин

PCT - Договор о патентной кооперации (The Patent Cooperation Treaty) PKR - РНК-зависимая протеинкиназа

pre-GP - предшественник структурного трансмембранного гликопротеина вируса Эбола

pre-sGP - предшественник растворимого гликопротеина вируса Эбола

6

pre-ssGP - предшественник малого растворимого гликопротеина вируса Эбола rAd5 - рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа rAd5-EGFP - рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа, несущий ген зеленого флюоресцентного белка

rAd5-GP - рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа, несущий ген гликопротеина вируса Эбола вида Заир RESTV - вирус Эбола вида Рестон

RIG-1 - рецептор группы RIG-I-подобных рецепторов, кодируется геном RIG-1 -retinoic acid-inducible gene

rVSV - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита

rVSV-GP - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, несущий ген гликопротеина вируса Эбола вида Заир и псевдотипированный гликопротеином вируса Эбола вида Заир

sGP - растворимый секретируемый гликопротеин вируса Эбола

shed GP - «сброшенный» гликопротеин вируса Эбола

ssGP - малый растворимый секретируемый гликопротеин вируса Эбола

STAT - сигнальный белок и активатор транскрипции

SUDV - вирус Эбола вида Судан

TACE (ADAM17) - ФНОальфа-конвертирующий фермент TAE - трис-ацетатный буфер

TAFV - вирус Эбола вида Тай Форест (вирус тайских лесов) TIM-1 - домен иммуноглобулина Т-клеток и домен 1 муцина TMB - тетраметилбензидин

Vero E6 и Vero(B) - культуры клеток почки африканской зеленой мартышки

VP24 - минорный белок матрикса

VP30 - минорный нуклеопротеин

VP35 - белок нуклеокапсида

VP40 - матричный белок

WHO - World Health Organization - Всемирная организация здравоохранения ZEBOV - вирус Эбола вида Заир

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Разработка лиофилизированного препарата на основе рекомбинантных вирусных векторов для профилактики лихорадки Эбола и исследование его иммуногенных и протективных свойств»»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы и степень ее разработанности. Болезнь, вызванная вирусом Эбола (БВВЭ) — одно из самых опасных вирусных заболеваний, поражающих человека и приматов. Болезнь характеризуется тяжелым течением, общей интоксикацией и высоким уровнем летальности, достигающим в ряде случаев 90% (в среднем 50%) [Geisbert, 2015]. Первая вспышка БВВЭ была зафиксирована в 1976 году в Ямбуку (Демократическая Республика Конго, в то время - северная часть Заира) и в Нзаре (Судан). В том же году был впервые выделен возбудитель БВВЭ - вирус Эбола (Ebolavirus) - от больного, который проживал в долине реки Эбола. С момента выделения патогена и до настоящего времени было зарегистрировано более 20 вспышек БВВЭ, самая крупная из которых в 2014-2016 годах переросла в эпидемию и унесла жизни более 11000 человек [WHO. Ebola situation report-21 October 2015; Жданов и соавт., 2015].

Наиболее эффективным и экономичным способом защиты от эпидемий является вакцинопрофилактика, однако к началу последней вспышки БВВЭ, переросшей в эпидемию, в мире не было ни разрешенных к применению вакцин, ни других эффективных профилактических средств.

БВВЭ является серьезной угрозой для глобальной безопасности. Начиная с 1976 года, когда вирус Эбола был впервые обнаружен, все зарегистрированные вспышки в основном ограничивались сельской местностью в Восточной и Центральной Африке. Но в 2014 году вспышка, которая началась в трех странах Западной Африки, изменила ситуацию. Впервые вирус выявляли в городских центрах Центральной Африки и за пределами Африки - на территории Европы и Северной Америки.

В связи с высоким уровнем смертности во время последней эпидемии БВВЭ и распространением вируса за пределы Африки, в начале августа 2014 года был созван Комитет ВОЗ, который пришел к выводу, что начавшаяся вспышка БВВЭ

представляет собой чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения, имеющую международное значение, что значительно ускорило разработку профилактических и терапевтических средств против БВВЭ.

Первые вакцины против БВВЭ были созданы в 1980 году и в их основе лежал инактивированный нагреванием или формалином вирус Эбола. Эти вакцины показали хорошие результаты протективности на модели морских свинок, однако в исследованиях на приматах было показано, что вакцины не обладают 100% уровнем защиты животных от летальной инфекции, вызванной вирусом Эбола [Lupton et а1., 1980; Geisbert е1 а1., 2002].

Наибольшим протективным потенциалом среди всех антигенов вируса Эбола обладает поверхностный гликопротеин GP, необходимый для интернализации вируса. Согласно литературным данным, антитела против рецептор-связывающего домена GP способны ограничивать проникновение вируса Эбола в клетку, что, в конечном счете, ограничивает его размножение. Во многих исследованиях было показано, что использование гликопротеина вируса Эбола в составе разрабатываемых вакцин позволяет защитить животных от летальной инфекции, вызванной этим вирусом. В связи с этим, гликопротеин вируса Эбола является перспективным компонентом для использования в составе вакцины [ОЫшат, 2016].

Следующее поколение вакцин против БВВЭ было основано на использовании подходов генетической иммунизации, когда доставка целевых антигенов осуществляется с помощью генетических конструкций (плазмидных ДНК) непосредственно в клетки организма, где и происходит синтез антигенов. Синтез антигенов патогена в самих клетках организма позволяет имитировать инфекционный процесс, что в результате приводит к формированию как гуморального, так и клеточного иммунного ответ. Однако использование плазмидных ДНК в качестве системы доставки целевых антигенов в клетки в случае БВВЭ является нецелесообразным, поскольку для индукции протективного иммунного ответа требуется многократная иммунизация, что в

случае разворачивающейся эпидемии нежелательно [МаГт et а1., 2006;

9

Должикова и соавт, 2017]. Последнее поколение вакцин против БВВЭ также основано на использовании подходов генетической иммунизации, но для доставки целевых антигенов в клетки организма используются рекомбинантные вирусные векторы [Ohimain, 2016]. Такие векторы способны трансдуцировать различные типы клеток, способны активировать врожденный иммунный ответ, более полно, в отличие от векторов на основе плазмидных ДНК, имитируют инфекционный процесс в организме, зачастую не требуют использования адъювантов, позволяют индуцировать мощный иммунный ответ (как гуморальный, так и клеточный) и не требуют многократных иммунизаций [Gabitzsch et.al., 2009; Choi, Chang, 2013; Ura et.al., 2014; Lauer et.al., 2017; Vermillion, Klein, 2018]. Данные свойства делают рекомбинантные вирусные векторы перспективной платформой для создания вакцин против БВВЭ. Наиболее изученными рекомбинантными вирусными векторами являются векторы на основе аденовируса человека пятого серотипа. Помимо этого в последнее время широкое распространение получили рекомбинантные векторы на основе вируса везикулярного стоматита и вируса осповакцины [Ohimain, 2016; Должикова и соавт., 2017].

В настоящее время большое количество вакцин против БВВЭ находятся на

разных стадиях доклинических и клинических исследований. Восемь вакцинных

препаратов показали высокую иммуногенность в клинических исследованиях

[Ohimain, 2016]. Основной проблемой при разработке вакцин является

длительность протективного поствакцинального иммунитета. Данную проблему

можно решить при использовании подхода гетерологичной двукратной

вакцинации [Moorthy et al., 2014]. В исследовании Стенли и соавторов было

показано, что гомологичная двукратная вакцинация вектором на основе Ad3

(Ad3+Ad3) обеспечивала защиту 100% животных от летальной инфекции,

вызванной вирусом Эбола, через 5 недель после вакцинации. Протективная

эффективность такой вакцинации снижалась до 33% при заражении животных

вирусом Эбола через 8 месяцев после иммунизации. В то же время при

использовании гетерологичного режима вакцинации (Ad3 + MVA) протективность

10

через 8 месяцев после иммунизации составила 100% [Stanley et al., 2014; Должикова и соавт., 2017]

Опыт разработки профилактических препаратов против лихорадки Эбола, исследования иммунных реакций у приматов после иммунизации, которые коррелировали с защитой от летальной инфекции, вызванной вирусом Эбола [Sullivan et al., 2011], а также иммунологические исследования у людей в фазе реконвалесценции после БВВЭ во время последней эпидемии [Dahlke, Lunemann, 2016] позволяют сформулировать несколько ключевых условий для создания эффективной вакцины против лихорадки Эбола: во-первых, для формирования полноценного клеточного и гуморального иммунитета вакцина должна быть основана на рекомбинантных вирусных векторах, во-вторых, для формирования длительного протективного иммунитета вакцина должна быть гетерологичной, в-третьих, производство вакцины должно быть безопасным (невозможно или трудно выполнимо создание инактивированной или аттенуированной вакцины).

Цель исследования. Разработка лиофилизированного препарата на основе рекомбинантных вирусных векторов для профилактики лихорадки Эбола и исследование его иммуногенных и протективных свойств.

Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1. Получение рекомбинантных вирусных векторов, несущих ген гликопротеина GP вируса Эбола вида Заир, на основе аденовируса человека 5 серотипа (rAd5-GP) и вируса везикулярного стоматита (rVSV-GP). Анализ экспрессии гена гликопротеина в клетках, трансдуцированных rVSV-GP и rAd5-GP.

2. Разработка композиций для получения лиофильно высушенных компонентов препарата: rVSV-GP и rAd5-GP.

3. Исследование иммуногенности лиофилизированного препарата рекомбинантных вирусных векторов на основе rAd5 и rVSV, несущих ген гликопротеина GP вируса Эбола.

4. Исследование протективности лиофилизированного препарата рекомбинантных вирусных векторов на основе rAd5 и rVSV, несущих ген гликопротеина GP вируса Эбола.

Научная новизна. 1) Создан новый лиофилизированный вакцинный препарат на основе рекомбинантных вирусных векторов rVSV и rAd5, несущих антиген GP вируса Эбола, для индукции специфического иммунитета против вируса Эбола. Данный препарат хранится при температуре +4оС, что облегчает его хранение и транспортировку, особенно в случаях использования в эндемичных районах.

2) Показано, что иммунизация мышей и макак резус рекомбинантным вирусным вектором, несущим гликопротеин вируса Эбола вида Заир, приводит к формированию перекрестного гуморального иммунитета к гликопротеинам вирусов Эбола видов Судан и Бундибугио. В исследовании клеточного звена иммунитета у иммунизированных мышей также было показано наличие перекресного иммунного ответа (CD4+ и CD8+ клеток) к гликопротеину вируса Эбола вида Судан.

3) При исследовании гуморального иммунного ответа, сформированного вакцинацией рекомбинантными вирусными векторами на основе rAd5-GP, rVSV-GP или их комбинациями, показано, что наиболее выраженный иммунный ответ развивается у мышей и макак резус при гетерологичной двукратной вакцинации, когда последовательно вводятся сначала rVSV-GP, а затем rAd5-GP.

4) Показано, что наличие предсуществующего иммунного ответа к аденовирусному вектору не влияет на иммуногенность лиофилизированного препарата на основе rVSV-GP и rAd5-GP при введении по схеме гетерологичной двукратной вакцинации, где последовательно вводятся сначала компонент rVSV-GP, а затем компонент rAd5-GP.

5) Показано, что гетерологичная двукратная вакцинация (rVSV-GP + rAd5-GP) приводит к формированию напряженного протективного иммунитета у приматов, который обеспечивает защиту 100% животных от летальной инфекции, вызванной вирусом Эбола.

Новизна исследований подтверждена Патентами РФ на изобретение RU

2578159 от 20.03.2016 г. (удостоен диплома «Лучшее изобретение года»), RU

2578160 от 20.03.2016 г. (удостоен диплома «Лучшее изобретение года»), Яи 2644202 от 08.02.2018 г. и Патентом Африканской организации интеллектуальной собственности №18489 от 04.12.2018 г.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенных исследований получены рекомбинантные векторные конструкции, на основе которых разработана кандидатная лиофилизированная комбинированная векторная вакцина против БВВЭ, которая обеспечивает защиту 100% животных от летальной инфекции, вызванной вирусом Эбола. По результатам проведенных доклинических исследований собран пакет документов, что позволило получить разрешение на проведение клинический исследований. В настоящее время завершены клинические исследования разработанного вакцинного препарата.

Разработаны композиции буферов, позволяющие получать лиофилизированные препараты рекомбинантных вирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа и вируса везикулярного стоматита без падения их активности.

Результаты работы защищены тремя Патентами РФ и одним патентом Африканской организации интеллектуальной собственности:

1. Патент РФ RU 2578159 С1 на изобретение «ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА» (Заявка: 2015104928/10. Дата подачи заявки: 13.02.2015). Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Лысенко А.А., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Джаруллаева А.Ш., Артемичева Н.М., Бурмистрова Д.А., Тухватулин А.И., Пантюхов В.Б., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Опубликовано: 20.03.2016 Бюл. № 8, с. 1-31.

2. Патент РФ RU 2578160 С1 на изобретение «ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА (ВАРИАНТЫ)» (Заявка: 2015111368/10. Дата подачи заявки: 31.03.2015). Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Джаруллаева А.Ш., Артемичева Н.М., Тухватулин А.И., Пантюхов В.Б., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Опубликовано: 20.03.2016 Бюл. № 8, с. 1-43.

3. Патент РФ RU 2644202 C2 на изобретение «ОДНОДОМЕННЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКУ GP ВИРУСА ЭБОЛА ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ЛИХОРАДКИ ЭБОЛА» (Заявка: 2015152866. Дата подачи заявки: 09.12.2015). Щебляков Д.В., Егорова Д.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Белый Ю.Ф., Зубкова О.В., Фаворская И.А., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Тухватулин А.И., Сыромятникова С.И., Пантюхов В.Б., Шатохина И.В., Воронина О.Л., Борисевич С.Б., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Опубликовано: 08.02.2018 Бюл. № 4, с. 1-2.

4. Патент Африканской организации интеллектуальной собственности (OAPI, Organisation Africaine de la Propriété Intellectuelle) №18489 на изобретение «Immunobiological agent and utilization method thereof for inducing specific immunity against Ebola virus (variants)» (Заявка: 1201700364. Дата подачи заявки: 18.02.2016). Logunov D.J., Shmarov M.M., Tutykhina I.L., Zubkova O.V., Scheblyakov D.V., Scherbinin D.N., Dolzhikova I.V., Dzharullaeva A.S., Artemicheva N.M., Tukhvatulin A.I., Pantjukhov V.B., Syromyatnikova S.I., Shatokhina I.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L., Borisevich S.V. Опубликовано: 04.12.2018. Патент действует в каждом из семнадцати (17) государств-членов Организации: Бенин, Буркина-Фасо, Камерун, Центральноафриканская Республика, Коморские Острова, Конго, Кот-д'Ивуар, Габон, Гвинея, Гвинея-Бисау, Экваториальная Гвинея, Мали, Мавритания, Нигер, Сенегал, Чад, Того.

Поданы две заявки на зарубежные патенты по международной процедуре

РСТ:

1. РС№Ш016/000065 «ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА». Международная публикация WO 2016/130047 от 18.08.2016г. Дата приоритета: 13.02.2015. Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Лысенко А.А., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Джаруллаева А.Ш., Артемичева Н.М., Бурмистрова Д.А., Тухватулин А.И., Пантюхов В.Б., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л.

2. РСТ/Ш2016/000086 «ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА (ВАРИАНТЫ)». Международная публикация WO 2016/159823 от 06.10.2016г. Дата приоритета: 31.03.2015. Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Джаруллаева А.Ш., Артемичева Н.М., Тухватулин А.И., Пантюхов В.Б., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л.

Внедрение полученных результатов в практику. Выполненная работа представляет собой законченное научное исследование, имеющее выраженную прикладную направленность. По результатам исследования был разработан лиофилизированный препарат для профилактики болезни, вызванной вирусом Эбола. Дальнейшие проведенные доклинические исследования препарата позволили получить разрешение на проведение клинических исследований. В настоящее время завершены клинические исследования разработанной вакцины [c1inica1-tria1s.ru/info_tria1/412496.htm1, c1inica1trials.gov/ct2/show/NCT03333538], по результатам которых будет подготовлен и подан пакет документов для получения разрешения на регистрацию вакцины для медицинского применения.

В рамках диссертационной работы были разработаны композиции буферов,

позволяющие получать лиофилизированные препараты рекомбинантных

15

вирусных векторов на основе вируса везикулярного стоматита и аденовируса человека 5 серотипа. Данные композиции в настоящее время используются в условиях производственной площадки филиала «Медгамал» ФГБУ «НИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России для изготовления лиофилизированных форм лекарственных препаратов на основе рекомбинантных вирусных векторов.

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования послужили современные подходы, теоретические и экспериментальные наработки к разработке вакцин на основе рекомбинантных вирусных векторов. В работе использованы актуальные молекулярно-биологические, иммунологические, цитологические, биохимические, вирусологичесие, биоинформатические методы, а также методы прикладной статистики и методы работы с животными.

Достоверность результатов. Достоверность результатов исследования подтверждается достаточным количеством наблюдений, современными методами исследования, которые соответствуют поставленным в работе цели и задачам. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам. Проверка статистических гипотез осуществлялась при допустимом в медико-биологических исследованиях 5%-ом уровне значимости (0,05).

Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации, обоснованы и подтверждены фактическим материалом.

Указанное выше позволяет считать полученные результаты достоверными, сделанные выводы обоснованными и вытекающими из результатов проведенных исследований.

Положения, выносимые на защиту:

• При исследовании гуморального иммунного ответа, сформированного вакцинацией лиофилизированными рекомбинантными вирусными векторами на основе rAd5-GP, rVSV-GP или их комбинациями (однократная иммунизация, двукратная гомо- и гетерологическая иммунизация), показано, что наиболее

выраженный иммунный ответ развивается у мышей и у макак резус при последовательном введении rVSV-GP и rAd5-GP.

• Наличие предсуществующего иммунного ответа к аденовирусному вектору не оказывает достоверного влияния на иммуногенность лиофилизированного препарата на основе rVSV-GP и rAd5-GP при введении их по схеме гетерологичной двукратной вакцинации, где последовательно вводятся сначала rVSV-GP, а затем rAd5-GP.

• Иммунизация лиофилизированным препаратом (rVSV-GP + rAd5-GP) приводит к формированию напряженного протективного иммунитета у приматов, который обеспечивает защиту 100% животных от летальной инфекции, вызванной вирусом Эбола.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на совещании исполкома ВОЗ (Женева, 2016), III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания" (Сочи, 2016), совместной научной конференции отделов медицинской микробиологии, иммунологии, эпидемиологии, генетики и молекулярной биологии бактерий, бактериальных инфекций ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России 21 июня 2017 г., симпозиуме «China-Russia Symposium on AIDS, TB and Influenza» (Пекин, 2018)

Апробация диссертации состоялась «01» марта 2018 г. на научной конференции отделов Иммунологии, Интерферонов, Генетики и молекулярной биологии бактерий, Медицинской микробиологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Протокол № 2 от 01.03.2018).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.09 -Клиническая иммунология, аллергология.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы, 3 из которых - в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации основных научных результатов

диссертации. Имеется 3 патента РФ на изобретение № 2578159, № 2578160, № 2644202, а также 1 патент Африканской организации интеллектуальной собственности на изобретение № 18489. Опубликованы 2 зарубежные заявки на патенты по международной процедуре PCT № РСТ/КШ016/000065 и № PCT/RU2016/000086.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы и список используемой литературы (139 источника, в том числе 19 отечественных и 120 зарубежных). Работа содержит 13 таблиц и 33 рисунка.

Личный вклад автора. Автор непосредственно получил рекомбинантные

вирусные конструкции на основе аденовируса человека 5 серотипа rAd5-GP и

вируса везикулярного стоматита rVSV-GP, разработал композиции буферов,

позволяющие получить лиофилизированные препараты рекомбинантных

вирусных векторов rVSV-GP и rAd5-GP, изучил экспрессию гена GP в составе

полученных рекомбинантных вирусных векторов методами иммуноблотинга и

иммуноцитохимии, исследовал напряженность гуморального и клеточного

иммунного ответа к антигену GP мышей и макак резус, иммунизированных

полученными лиофилизированными рекомбинантными вирусными векторами,

подобрал оптимальную схему иммунизации для индукции протективного

иммунного ответа, проанализировал и обобщил полученные результаты.

Получение и очистка рекомбинантных вирусов на основе вируса везикулярного

стоматита были выполнены под руководством к.б.н. Зубковой О.В. (лаб.

иммунобиотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России).

Очистка рекомбинантных вирусов на основе аденовируса человека 5 серотипа

была выполнена совместно с к.б.н. Костарным А.В. (лаб. иммунобиотехнологии

ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России) и к.б.н. Семихиным А.С.

(Филиал «Медгамал» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России).

Получение лиофилизатов рекомбинантных вирусных векторов rVSV-GP и rAd5-

18

ОР было выполнено совместно с к.б.н. Семихиным А.С. (Филиал «Медгамал» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России). Исследование протективной активности препаратов гУБУ-ОР и гАё5-ОР были выполнены совместно с ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Болезнь, вызванная вирусом Эбола

Болезнь, вызыванная вирусом Эбола (БВВЭ) — одно из самых опасных вирусных заболеваний, поражающих человека, человекообразных приматов, низших приматов и других животных. Болезнь характеризуется тяжелым течением, развитием общей интоксикации и высоким уровнем летальности, достигающим 90% [Sanchez et. al., 2006; Taylor et. al., 2010; Geisbert et. al., 2015]. Возбудителем данного заболевания является вирус рода Эбола (Ebolaviruses), который относится к семейству Филовирусов (Filoviridae) [Beer et.al., 1999]. Общими чертами всех вирусов семейства Filoviridae (отряд Mononegavirales) является характерная филаментоподобная форма вирусных частиц, а также структура генома, представленная одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью [Brahat et.al., 2012]. Выделяют три рода филовирусов: Ebolavirus, Marburgvirus и Cuevavirus. Из них выраженной патогенностью для человека обладают вирусы родов: Ebolavirus и Marburgvirus, при этом наиболее патогенным является вирус Эбола (Ebolavirus, EBOV). В настоящее время известно 6 видов вируса Эбола: Bundibugyo ebolavirus (BDBV), Zaire ebolavirus (ZEBOV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus (SUDV), Tai Forest ebolavirus (TAFV), Bombali ebolavirus (BOMV), из которых наиболее патогенными для человека являются ZEBOV, SUDV и BDBV [Hartman et. al., 2010; Kuhn et. al., 2010; Киселев и соавт., 2015; Должикова и соавт., 2017; Goldstein et. al., 2018]. Классификация рода Ebolavirus, принятая в настоящее время, представлена на рисунке 1.

Первичными хозяевами вируса Эбола предположительно являются летучие мыши. Заражение людей зачастую происходит при контакте с органами, кровью, выделениями или иными жидкими отделимыми организма инфицированных животных [El Sayed et.al., 2016]. Распространение вируса происходит от человека

20

человеку через поврежденные кожные покровы и слизистую оболочку при контакте с кровью и другими жидкостями организма инфицированных людей, а также при контакте с поверхностями и материалами, загрязненными вирусом [Bausch et.al., 2007; Flemming, 2011; Camacho et.al., 2014; Нечаев и соавт., 2015].

Впервые БВВЭ была выявлена в 1976 году в Ямбуку (Демократическая Республика Конго, в то время - северная часть Заира) и в Нзаре (Судан). В том же году был впервые выделен возбудитель БВВЭ - вирус Эбола (Ebolavirus) - от больного, который проживал вблизи реки Эбола [Bull. of WHO, 1978a; Bull. of WHO, 1978b].

Отряд Mononegavirales

Семейство Filoviridae Род Ebolavirus

Вид Tai Forest ebolavirus

Вирус: вирус тайских лесов (TAFV) Вид Reston ebolavirus

Вирус: вирус Рестон (RESTV) Вид Sudan ebolavirus

Вирус: вирус Судан (SUDV) Вид Zaire ebolavirus

Вирус: вирус Эбола (ZEBOV) Вид Bundibugyo ebolavirus

Вирус: вирус Бундибугио (BDBV) Вид Bombali ebolavirus

Вирус: вирус Бомбали (BOMV)

Рисунок 1. Классификация вирусов рода Ebolavirus. Жирным отмечен вирус, вызвавший эпидемию БВВЭ в странах Западной Африки в 2014-2016 г.

Ранние симптомы БВВЭ неспецифичны, включат в себя жар, озноб, недомогание и миалгию. Далее развиваются симптомы, сигнализирующие о вовлечении различных систем организма: ЖКТ (анорексия, тошнота, рвота, боль в животе, диарея), дыхательной (боль в груди, одышка, кашель, выделения из носа) и сердечно-сосудистой (постуральная гипотензия, отечность) систем [Е1 Sayed et.al., 2016; МоЬи1а е!а1., 2018]. В течение последней стадии заболевания происходит повышение проницаемости сосудов, массивное поражение тканей, нарушение системы свертывания крови и кровоизлияния. Геморрагические

проявления включают в себя точечные кровоизлияния, экхимозы и кровотечения слизистых [El Sayed et.al., 2016]. В дальнейшем развивается полиорганная недостаточность и шок, которые являются преимущественными причинами смерти. Инкубационный период составляет от 2 до 21 дня, однако смерть обычно наступает в течение 4-10 дней с момента заражения. Высокая вирулентность EBOV связана со способностью вируса блокировать иммунный ответ хозяина, вызывая иммунопаралич [Ohimain, 2016; Rivera, Messaoudi, 2016].

С момента выделения патогена и до настоящего времени было зарегистрировано более 20 вспышек БВВЭ, самая крупная из которых в 2014-2016 годах переросла в эпидемию и унесла жизни более одиннадцати тысяч человек [WHO, 2015. Ebola Situation Report-21] (рис. 2). К моменту начала последней эпидемии в мире не было зарегистрировано ни профилактических, ни терапевтических средств против БВВЭ [Попова и соавт., 2015].

Рисунок 2. Количество случаев заражения/смерти во время вспышек БВВЭ, вызванных вирусом ZEBOV, с 1976 г. по 2017 год.

1.2. Структура вируса Эбола

Вирионы вируса Эбола имеют сложное строение и состоят из оболочки, нуклеокапсида, полимеразного комплекса и матрикса [Bharat et.al., 2012]. Вирионы вируса Эбола имеют нитевидную форму, что и явилось причиной для выделения в семейство Filoviridae. Вирионы имеют диаметр 80 нм, длину от 600 нм до 20000 нм и могут быть представлены различными формами (рис. 3): они могут быть свернуты в виде цифры 6, кольцеобразно и U-образно и изгибаться [Ellis et. al., 1978; Ascenzi et. al., 2008]. Вся поверхность вириона покрыта отдельно стоящими пепломерами, состоящими из гликопротеина, заякоренного в оболочку вириона; нуклеокапсид имеет спиральную симметрию (рис. 4) [Gutsche et.al., 2015; Beniac, Booth, 2017].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Должикова Инна Вадимовна, 2019 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Всемирная Организация Здравоохранения. URL: http://www.who.int/medicines/emp_ebola_q_as/en/ (дата обращения: 11.01.2018).

2. Всемирная Организация Здравоохранения. Вакцины против БВВЭ. http://www.who. int/medicines/ebola-treatment/emp_ebola_vaccmes/en/ (дата обращения: 26.03.2018).

3. Всемирная Организация Здравоохранения. Болезнь, вызванная вирусом Эбола. Информационный бюллетень - Май 2017 г. URL: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs103/ru/ (дата обращения: 26.02.2018)

4. Международная база Клинических исследований ClinicalTrials.gov URL: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03333538 (дата обращения: 18.02.2018).

5. База Клинисеских исследований в Российской Федерации Clinical-Trials.ru URL: http://clinical-trials.ru/info_trial/412496.html (дата обращения: 18.02.2018).

6. ExPASy SIB Bioinformatics Resource Portal: ViralZone. URL: http://viralzone.expasy.org/207?outline=all_by_species/ (дата обращения: 11.01.2018).

7. Visual Science. URL: http://visual-science.com/projects/ebola/poster/ (дата обращения: 11.01.2018).

8. WHO Ebola vaccine TPP. URL: www.who.int/immunization/research/target-product-

profile/WHO_Ebola_vaccine_TPP_version_final.pdf (дата обращения: 26.03.2018)

9. Патент РФ RU 2578159 C1, 2016, ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА. Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Лысенко А.А., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Джаруллаева А.Ш., Артемичева Н.М.,

120

Бурмистрова Д.А., Тухватулин А.И., Пантюхов В.Б., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Опубликовано: 20.03.2016 Бюл. № 8, с. 1-31.

10. Патент РФ RU 2578160 С1, 2016, ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА (ВАРИАНТЫ). Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Зубкова О.В., Щебляков Д.В., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Джаруллаева А.Ш., Артемичева Н.М., Тухватулин А.И., Пантюхов В.Б., Сыромятникова С.И., Шатохина И.В., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Опубликовано: 20.03.2016 Бюл. № 8, с. 1-43.

11. Патент РФ RU 2644202 С2, 2018, ОДНОДОМЕННЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКУ GP ВИРУСА ЭБОЛА ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ЛИХОРАДКИ ЭБОЛА. Щебляков Д.В., Егорова Д.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Белый Ю.Ф., Зубкова О.В., Фаворская И.А., Щербинин Д.Н., Должикова И.В., Тухватулин А.И., Сыромятникова С.И., Пантюхов В.Б., Шатохина И.В., Воронина О.Л., Борисевич С.Б., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Опубликовано: 08.02.2018 Бюл. № 4, с. 1-2.

12. Порядок и методы контроля иммунобиологической безопасности вакцин. Общие методические принципы / РД 42-28-10-90. - Утв. и ввелен в действие Минздравом СССР 12.03.90 г.

13. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова. -М.: Гриф и К, 2012. - 944 с

14. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева, -М.: «Медицина», 2005 - 832 с.

15. Должикова И.В., Токарская Е.А., Джаруллаева А.Ш., Тухватулин А.И., Щебляков Д.В., Воронина О.Л., Сыромятникова С.И., Борисевич С.В., Пантюхов В.Б., Бабира В.Ф., Колобухина Л.В., Народицкий Б.С., Логунов Д.Ю.,

Гинцбург А.Л. Векторные вакцины против болезни, вызванной вирусом Эбола. // Acta Naturae. 2017. том 9, № 3 (34), с. 4-12

16. Жданов К.В., Захаренко С.М., Коваленко А.Н., Семенов А.В., Фисун А.Я. Геморрагическая лихорадка Эбола: диагностика, этиотропная и патогенетическая терапия, профилактика // Клиническая медицина. 2015. №9. С.5-11

17. Киселев О.И., Васин А.В., Шевырева М.П. Геморрагическая лихорадка Эбола: свойства возбудителя и разработка вакцин и химиопрепаратов // Молекулярная биология.—2015.—Т. 49, № 4.— С.541-554.

18. Лукина Р.Н. Реакция нейтрализации. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней // Под ред. П.Ф.Здродовского и М.И.Соколова - М. 1965. - С. 146-157.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Издательство: "Мир" - М. 1984.

20. Нечаев В.В., Жданов К.В., Гришанова Г.И. Характеристика эпидемии, вызванной вирусом Эбола, в Западной Африке. // Журнал инфектологии. 2015. Вып. 2. С. 21-30.

21. Петри Авива, Сабин Кэролайн. Наглядная медицинская статистика. Учебное пособие. // ГЭОТАР-Медиа, 2015.

22. Попова А.Ю., Сафронов В.А., Boiro M.Y., Куклев Е.В. и др. Эпидемиологические особенности болезни, вызваной вирусом Эбола, в странах Западной Африки в 2013-2015 гг. // Проблемы особо опасных инфекций. 2015. Вып. 3. С. 42-48.

23. Сизикова Т.Е., Лебедев В.Н., Пантюхов В.Б., Борисевич С.В. Молекулярные механизмы проникновения вируса Эбола в пермиссивные клетки. // Проблемы особо опасных инфекций. 2015 Вып. 3. С. 89-93.

24. Телесманич Н.Р., Микашинович З.И., Ломаковский Н.С., Лосева Т.Д., Чайка С.О. Биохимия вируса Эбола и молекулярные аспекты биологической защиты // Журнал фундаментальной медицины и биологии. 2015. №3. С.28-34

25. Унгуряну Т.Н., Гржибовский А. М. Краткие рекомендации по описанию, статистическому анализу и представлению данных в научных публикациях // Экология человека. 2011. №5. С. 55-60.

26. Ebola haemorrhagic fever in Zaire, 1976. Report of an International Commission. // Bull. of WHO. - 1978a. - Vol. 56, N 2. - P.271-293.

27. Ebola haemorrhagic fever in Sudan, 1976. Report of an International Commission // Bull. of WHO. - 1978b. - Vol. 56, N 2. - P. 247-270

28. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. The Ebola Epidemic in West Africa: Proc. Workshop. Washington, DC: Nat. Acad. Press, 2016. 2016:56-58

29. World Health Organization. 2015. Ebola Situation Report-21. URL: http://apps.who.int/ebola/current-situation/ebola-situation-report-21-october-2015

30. Adu-Gyamfi E, Soni SP, Xue Y, Digman MA, Gratton E, Stahelin RV. The Ebola Virus Matrix Protein Penetrates into the Plasma Membrane: A KEY STEP IN VIRAL PROTEIN 40 (VP40) OLIGOMERIZATION AND VIRAL EGRESS. // The Journal of Biological Chemistry. 2013. V. 288(8). P. 5779-5789.

31. Agnandji ST, Huttner A, Zinser ME, Njuguna P, Dahlke C, Fernandes JF, Yerly S, Dayer JA, Kraehling V, Kasonta R, et al. Phase 1 Trials of rVSV Ebola Vaccine in Africa and Europe - Preliminary Report. // The New England journal of medicine 2015; PMID: 25830326; http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1502924

32. Altenburg AF, Kreijtz JH, de Vries RD, Song F, Fux R, Rimmelzwaan GF, Sutter G, Volz A. Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) as Production Platform for Vaccines against Influenza and Other Viral Respiratory Diseases. // Viruses. 2014. V. 6(7). P. 2735-2761.

33. Ascenzi P, Bocedi A, Heptonstall J, Capobianchi MR, Di Caro A, Mastrangelo E, Bolognesi M, Ippolito G. Ebolavirus and Marburgvirus: insight the Filoviridae family. // Mol Aspects Med. 2008. V. 29(3). P. 151-185.

34. Audet J, Kobinger GP. Immune evasion in ebolavirus infections. // Viral Immunol. 2015. V. 28(1). P. 10-18.

35. Banadyga L, Hoenen T, Ambroggio X, Dunham E, Groseth A, Ebihara H. Ebola virus VP24 interacts with NP to facilitate nucleocapsid assembly and genome packaging. // Scientific Reports. 2017 V. 7(1). №7698. P. 1-14.

36. Bausch DG, Towner JS, Dowell SF, Kaducu F, Lukwiya M, Sanchez A, Nichol ST, Ksiazek TG, Rollin PE. Assessment of the risk of Ebola virus transmission from bodily fluids and fomites. // J Infect Dis. 2007. V. 196 (2). P. 142-147.

37. Beer B, Kurth R, Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. // Naturwissenschaften. 1999. V. 86(1). P. 8-17.

38. Beniac DR, Booth TF. Structure of the Ebola virus glycoprotein spike within the virion envelope at 11 Ä resolution. // Sci Rep. 2017. V. 7. №46374.

39. Bharat TA, Noda T, Riches JD, Kraehling V, Kolesnikova L, Becker S, Kawaoka Y, Briggs JA. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. V. 109(11). P. 4275-4280.

40. Biedenkopf N, Schlereth J, Grünweller A, Becker S, Hartmann RK. RNA Binding of Ebola Virus VP30 Is Essential for Activating Viral Transcription. // J Virol. 2016. V. 90(16). P. 7481-7496.

41. Bharat TA, Noda T, Riches JD, Kraehling V, Kolesnikova L, Becker S, Kawaoka Y, Briggs JA. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. // Proc Natl Acad Sci USA. 2012. V. 109(11). P. 4275-4280.

42. Brown KS, Safronetz D, Marzi A, Ebihara H, Feldmann H. Vesicular stomatitis virus-based vaccine protects hamsters against lethal challenge with Andes virus. // J Virol. 2011. V. 85(23). P. 12781-12791.

43. Camacho A, Kucharski AJ, Funk S, Breman J, Piot P, Edmunds WJ. Potential for large outbreaks of Ebola virus disease. // Epidemics. 2014. V. 9. P. 70-78.

44. Choi Y, Chang J. Viral vectors for vaccine applications. // Clinical and Experimental Vaccine Research. 2013. V. 2(2). P. 97-105.

45. Clarke DK, Hendry RM, Singh V, Rose JK, Seligman SJ, Klug B, Kochhar

S, Mac LM, Carbery B, Chen RT; Brighton Collaboration Viral Vector Vaccines Safety

124

Working Group. Live Virus Vaccines Based on a Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Backbone: Standardized Template with Key Considerations for a Risk/Benefit Assessment. // Vaccine. 2016. V. 34(51). P. 6597-6609.

46. Collar A.L., Clarke E.C., Anaya E., Merrill D., Yarborough S., Anthony S.M., Kuhn J.H., Merle C., Theisen M., Bradfute S.B. Comparison of N- and O-linked glycosylation patterns of ebolavirus glycoproteins. // Virology. 2017. V. 502. P. 39-47.

47. Cook JD, Lee JE. The Secret Life of Viral Entry Glycoproteins: Moonlighting in Immune Evasion. // PLoS Pathog V. 9(5): e1003258.

48. Dahlke C, Lunemann S, Kasonta R, Kreuels B, Schmiedel S, Ly ML, Fehling SK, Strecker T, Becker S, Altfeld M, Sow A, Lohse AW, Munoz-Fontela C, Addo MM. Comprehensive characterization of cellular immune responses following Ebola virus infection. // J Infect Dis. 2017. V. 215(2). P. 287-292.

49. De La Vega M-A, Wong G, Kobinger GP, Qiu X. The Multiple Roles of sGP in Ebola Pathogenesis. // Viral Immunology. 2015. V. 28(1). P. 3-9.

50. De Santis O, Audran R, Pothin E, Warpelin-Decrausaz L, Vallotton L, Wuerzner G, Cochet C, Estoppey D, Steiner-Monard V, Lonchampt S, et al. Safety and immunogenicity of a chimpanzee adenovirus-vectored Ebola vaccine in healthy adults: a randomised, double-blind, placebo-controlled, dose-finding, phase 1/2a study. // The Lancet Infectious diseases. 2016. V. 16. P. 311-320.

51. Dolnik O., Volchkova V., Garten W., Carbonnelle C., Becker S., Kahnt J., Ströher U., Klenk H. D., Volchkov V. Ectodomain shedding of the glycoprotein GP of Ebola virus. // EMBO J. 2004. V. 23(10). P. 2175-2184.

52. Dolzhikova IV, Zubkova OV, Tukhvatulin AI, Dzharullaeva AS,

Tukhvatulina NM, Shcheblyakov DV, Shmarov MM, Tokarskaya EA, Simakova YV,

Egorova DA, Scherbinin DN, Tutykhina IL, Lysenko AA, Kostarnoy AV, Gancheva

PG, Ozharovskaya TA, Belugin BV, Kolobukhina LV, Pantyukhov VB,

Syromyatnikova SI, Shatokhina IV, Sizikova TV, Rumyantseva IG, Andrus AF,

Boyarskaya NV, Voytyuk AN, Babira VF, Volchikhina SV, Kutaev DA, Bel'skih AN,

Zhdanov KV, Zakharenko SM, Borisevich SV, Logunov DY, Naroditsky BS, Gintsburg

AL. Safety and immunogenicity of GamEvac-Combi, a heterologous VSV- and Ad5-

125

vectored Ebola vaccine: An open phase I/II trial in healthy adults in Russia. // Hum Vaccin Immunother. 2017. V. 13(3). P. 613-620.

53. Dowling W, Thompson E, Badger C, Mellquist JL, Garrison AR, Smith JM, Paragas J, Hogan RJ, Schmaljohn C. Influences of glycosylation on antigenicity, immunogenicity, and protective efficacy of ebola virus GP DNA vaccines. // J Virol. 2007. V. 81(4). P. 1821-1837.

54. El Sayed SM, Abdelrahman AA, Ozbak HA, Hemeg HA, Kheyami AM, Rezk N, El-Ghoul MB, Nabo MM, Fathy YM. Updates in diagnosis and management of Ebola hemorrhagic fever. // J Res Med Sci. 2016. V. 21. P. 84.

55. Ellis, E. T. Bowen, D. I. Simpson, S. Stamford, Ebola virus: a comparison, at ultrastructural level, of the behaviour of the Sudan and Zaire strains in monkeys. // Br J Exp Pathol. 1978. V. 59(6). P. 584-593.

56. Ersching J, Hernandez MI, Cezarotto FS, Ferreira JD, Martins AB, Switzer WM, Xiang Z, Ertl HC, Zanetti CR, Pinto AR. Neutralizing antibodies to human and simian adenoviruses in humans and New-World monkeys. // Virology. 2010. V. 407(1). P. 1-6.

57. Ewer K, Rampling T, Venkatraman N, Bowyer G, Wright D, Lambe T, Imoukhuede EB, Payne R, Fehling SK, Strecker T, et al. A Monovalent Chimpanzee Adenovirus Ebola Vaccine Boosted with MVA. // The New England journal of medicine. 2016. V. 374. P. 1635-1546.

58. Feng Z, Cerveny M, Yan Z, He B. The VP35 Protein of Ebola Virus Inhibits the Antiviral Effect Mediated by Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase PKR. // Journal of Virology. 2007. V. 81(1). P. 182-192.

59. Flemming A. Achilles heel of Ebola viral entry. // Nat Rev Drug Discov. 2011. V. 10(10). P. 731.

60. Gabitzsch ES, Xu Y, Yoshida LH, Balint J, Amalfitano A, Jones FR. Novel Adenovirus type 5 vaccine platform induces cellular immunity against HIV-1 Gag, Pol, Nef despite the presence of Ad5 immunity. // Vaccine. 2009. V. 27(46). P. 6394-6398.

61. Geisbert T.W. Marburg and Ebola Hemorrhagic Fever (Filoviruses). In: Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. Eighth Edition. / Philadelphia: Elsevier. 2015. P. 1995-1999

62. Geisbert TW, Pushko P, Anderson K, Smith J, Davis KJ, Jahrling PB. Evaluation in nonhuman primates of vaccines against Ebola virus. // Emerging infectious diseases. 2002. V. 8. P. 503-507.

63. Goldstein T, Anthony SJ, Gbakima A, Bird BH, Bangura J, Tremeau-Bravard A, Belaganahalli MN, Wells HL, Dhanota JK, Liang E, Grodus M, Jangra RK, DeJesus VA, Lasso G, Smith BR, Jambai A, Kamara BO, Kamara S, Bangura W, Monagin C, Shapira S, Johnson CK, Saylors K, Rubin EM, Chandran K, Lipkin WI, Mazet JAK. The discovery of Bombali virus adds further support for bats as hosts of ebolaviruses. // Nat Microbiol. 2018. V. (10). P. 1084-1089.

64. Gutsche I, Desfosses A, Effantin G, Ling WL, Haupt M, Ruigrok RW, Sachse C, Schoehn G. Structural virology. Near-atomic cryo-EM structure of the helical measles virus nucleocapsid. // Science. 2015. V. 348(6235). P. 704-707.

65. Hartman AL, Towner JS, Nichol ST. Ebola and marburg hemorrhagic fever. // Clin Lab Med. 2010. V. 30(1). P. 161-177.

66. Henao-Restrepo AM, Longini IM, Egger M, Dean NE, Edmunds WJ, Camacho A, Carroll MW, Doumbia M, Draguez B, Duraffour S, Enwere G, Grais R, Gunther S, Hossmann S, Konde MK, Kone S, Kuisma E, Levine MM, Mandal S, Norheim G, Riveros X, Soumah A, Trelle S, Vicari AS, Watson CH, Keita S, Kieny MP, R0ttingen JA. Efficacy and effectiveness of an rVSV-vectored vaccine expressing Ebola surface glycoprotein: interim results from the Guinea ring vaccination cluster-randomised trial. // Lancet. 2015. V. 386(9996). P. 857-866.

67. Henao-Restrepo AM, Camacho A, Longini IM, Watson CH, Edmunds WJ,

Egger M, Carroll MW, Dean NE, Diatta I, Doumbia M, Draguez B, Duraffour S,

Enwere G, Grais R, Gunther S, Gsell PS, Hossmann S, Watle SV, Konde MK, Keita S,

Kone S, Kuisma E, Levine MM, Mandal S, Mauget T, Norheim G, Riveros X, Soumah

A, Trelle S, Vicari AS, R0ttingen JA, Kieny MP. Efficacy and effectiveness of an rVSV-

vectored vaccine in preventing Ebola virus disease: final results from the Guinea ring

127

vaccination, open-label, cluster-randomised trial (Ebola Qa Suffit!). // Lancet. 2017. V. 389(10068). P. 505-518

68. Humphreys IR, Sebastian S. Novel viral vectors in infectious diseases. // Immunology. 2018. V. 153(1). P. 1-9.

69. Huttner A, Dayer JA, Yerly S, Combescure C, Auderset F, Desmeules J, Eickmann M, Finckh A, Goncalves AR, Hooper JW, et al. The effect of dose on the safety and immunogenicity of the VSV Ebola candidate vaccine: a randomised doubleblind, placebo-controlled phase 1/2 trial. // The Lancet Infectious diseases. 2015. V. 15. P. 1156-1166.

70. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. // Gene. 1990. V. 96(1). P. 23-28.

71. Ito H., Watanabe S., Takada A., Kawaoka Y. Ebola Virus Glycoprotein: Proteolytic Processing, Acylation, Cell Tropism, and Detection of Neutralizing Antibodies. // J Virol. 2001. V. 75(3). P. 1576-1580.

72. Iwasa A, Shimojima M, Kawaoka Y. sGP Serves as a Structural Protein in Ebola Virus Infection. // The Journal of Infectious Diseases. 2011. V. 204 (Suppl 3). P. S897-S903.

73. Johnson KA, Taghon GJF, Scott JL, Stahelin RV. The Ebola Virus matrix protein, VP40, requires phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) for extensive oligomerization at the plasma membrane and viral egress. // Scientific Reports. 2016. V. 6. № 19125.

74. Kibuuka H, Berkowitz NM, Millard M, Enama ME, Tindikahwa A, Sekiziyivu AB, Costner P, Sitar S, Glover D, Hu Z, et al. Safety and immunogenicity of Ebola virus and Marburg virus glycoprotein DNA vaccines assessed separately and concomitantly in healthy Ugandan adults: a phase 1b, randomised, double-blind, placebo-controlled clinical trial. // Lancet. 2015. V. 385. P. 1545-1554.

75. Kirchdoerfer RN, Abelson DM, Li S, Wood MR, Saphire EO. Assembly of the Ebola virus nucleoprotein from a chaperoned VP35 complex. // Cell reports. 2015. V 12(1). P. 140-149.

76. Kirchdoerfer RN, Moyer CL, Abelson DM, Saphire EO. The Ebola Virus VP30-NP Interaction Is a Regulator of Viral RNA Synthesis. // PLoS Pathog. V. 12(10). e1005937.

77. Kondratowicz A.S., Lennemann N.J., Sinn P.L., T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zair Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. // Proc Natl Acad Sci USA. 2011. V. 108(20). P. 8426-8431.

78. Kuhn J.H. Proposal for a revised taxonomy of the family Filoviridae: Classification, names of taxa and viruses, and virus abbreviations / J.H. Kuhn, S. Becker, H. Ebihara et al. / Archives of Virology. 2010. Vol. 155, N 12. P. 2083-2103.

79. Kuzmina NA, Younan P, Gilchuk P, Santos RI, Flyak AI, Ilinykh PA, Huang K, Lubaki NM, Ramanathan P, Crowe JE Jr, Bukreyev A. Antibody-Dependent Enhancement of Ebola Virus Infection by Human Antibodies Isolated from Survivors. // Cell Rep. 2018. V. 24(7). P. 1802-1815.

80. Lauer KB, Borrow R, Blanchard TJ. Multivalent and Multipathogen Viral Vector Vaccines. // Papasian CJ, ed. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 2017. V. 24(1). P. e00298-16.

81. Ledgerwood JE, Costner P, Desai N, Holman L, Enama ME, Yamshchikov G, Mulangu S, Hu Z, Andrews CA, Sheets RA, et al. A replication defective recombinant Ad5 vaccine expressing Ebola virus GP is safe and immunogenic in healthy adults. // Vaccine. 2010. V. 29. P. 304-313.

82. Ledgerwood JE, DeZure AD, Stanley DA, Novik L, Enama ME, Berkowitz NM, Hu Z, Joshi G, Ploquin A, Sitar S, et al. Chimpanzee Adenovirus Vector Ebola Vaccine. // N Engl J Med. 2017. V. 376. P. 928-938.

83. Lee CS, Bishop ES, Zhang R, et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. // Genes & diseases. 2017. V. 4(2). P. 43-63.

84. Lee JE, Saphire EO. Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry. // Future virology. 2009. V. 4(6). P. 621-635.

85. Li W, Ye L, Carrion R Jr, Mohan GS, Nunneley J, Staples H, Ticer A,

Patterson JL, Compans RW, Yang C. Characterization of Immune Responses Induced

129

by Ebola Virus Glycoprotein (GP) and Truncated GP Isoform DNA Vaccines and Protection Against Lethal Ebola Virus Challenge in Mice. // The Journal of Infectious Diseases. 2015. V. 212(Suppl 2). P. S398-S403.

86. Li JX, Hou LH, Meng FY, Wu SP, Hu YM, Liang Q, Chu K, Zhang Z, Xu JJ, Tang R, Wang WJ, Liu P, Hu JL, Luo L, Jiang R, Zhu FC, Chen W. Immunity duration of a recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine and a homologous prime-boost immunisation in healthy adults in China: final report of a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. // Lancet Glob Health. 2017. V. 5(3). P. e324-e334.

87. Lupton HW, Lambert RD, Bumgardner DL, Moe JB, Eddy GA. Inactivated vaccine for Ebola virus efficacious in guinea pig model. // Lancet. 1980. V. 2. P. 12941295.

88. Lyles D. S., Rupprecht C. E. Rhabdoviridae. / In Fields Virology, 5th edn. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins. - 2007. - P. 1363-1408

89. Madara JJ, Han Z, Ruthel G, Freedman BD, Harty RN. The multifunctional Ebola virus VP40 matrix protein is a promising therapeutic target. // Future virology. 2015. V. 10(5). P. 537-546.

90. Martin J., Sullivan N., Enama M., Gordon L., Roederer M., Koup R. et al. A DNA vaccine for Ebola virus is safe and immunogenic in a phase I clinical trial. // Clin. Vaccine Immunol. 2006. V. 13(11). P. 1267-1277.

91. Martinez MJ, Volchkova VA, Raoul H, Alazard-Dany N, Reynard O, Volchkov VE. Role of VP30 phosphorylation in the Ebola virus replication cycle. // J Infect Dis. 2011. V. 204 (Suppl 3). P. S934-S940.

92. Marzi A, Engelmann F, Feldmann F, Haberthur K, Shupert WL, Brining D, Scott DP, Geisbert TW, Kawaoka Y, Katze MG, Feldmann H, Messaoudi I. Antibodies are necessary for rVSV/ZEBOV-GP-mediated protection against lethal Ebola virus challenge in nonhuman primates. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. V. 110. P. 1893-1898.

93. Marzi A, Feldmann F, Geisbert TW, Feldmann H, Safronetz D. Vesicular stomatitis virus-based vaccines against Lassa and Ebola viruses. // Emerg Infect Dis. 2015. V. 21. P. 305-307.

94. Milligan ID, Gibani MM, Sewell R, Clutterbuck EA, Campbell D, Plested E, Nuthall E, Voysey M, Silva-Reyes L, McElrath MJ, et al. Safety and Immunogenicity of Novel Adenovirus Type 26- and Modified Vaccinia Ankara-Vectored Ebola Vaccines: A Randomized Clinical Trial. // Jama. 2016. V. 315. P. 16101623.

95. Mobula LM, Nathalie MacDermott, Clive Hoggart, Brantly K, Plyler L, Brown J, Kauffeldt B, Eisenhut D, Cooper LA, Fankhauser J. Clinical Manifestations and Modes of Death among Patients with Ebola Virus Disease, Monrovia, Liberia, 2014. // Am J Trop Med Hyg. 2018. V. 98(4). P. 1186-1193.

96. Moorthy V, Fast P, Greenwood B. Heterologous Prime-Boost immunisation in Ebola vaccine development, testing and licensure. Report of a WHO Consultation held on 21 November 2014, Geneva, Switzerland

97. Mühlberger, E., M. Weik, V. E. Volchkov, H. D. Klenk, and S. Becker. Comparison of the transcription and replication strategies of Marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. // J. Virol. 1999. V. 73. P. 2333-2342.

98. Mühlberger E. Filovirus replication and transcription. // Future Virol. 2007. V. 2(2). P. 205-215.

99. Noda T, Kolesnikova L, Becker S, Kawaoka Y. The Importance of the NP: VP35 Ratio in Ebola Virus Nucleocapsid Formation. // The Journal of Infectious Diseases. 2011. V. 204 (Suppl 3). P. S878-S883.

100. Ohimain EI. Recent advances in the development of vaccines for Ebola virus disease. // Virus Res. 2016. V. 211. P. 174-185.

101. Rampling T, Ewer K, Bowyer G, Wright D, Imoukhuede EB, Payne R, Hartnell F, Gibani M, Bliss C, Minhinnick A, et al. A Monovalent Chimpanzee Adenovirus Ebola Vaccine - Preliminary Report. // The New England journal of medicine. 2015.

102. Regnery RL, Johnson KM, Kiley MP. Virion nucleic acid of Ebola virus. // J Virol. 1980. V. 36(2). P. 465-469.

103. Regules JA, Beigel JH, Paolino KM, Voell J, Castellano AR, Muñoz P,

Moon JE, Ruck RC, Bennett JW, Twomey PS, Gutiérrez RL, Remich SA, Hack HR,

131

Wisniewski ML, Josleyn MD, Kwilas SA, Van Deusen N, Mbaya OT, Zhou Y, Stanley DA, Bliss RL, Cebrik D, Smith KS, Shi M, Ledgerwood JE, Graham BS, Sullivan NJ, Jagodzinski LL, Peel SA, Alimonti JB, Hooper JW, Silvera PM, Martin BK, Monath TP, Ramsey WJ, Link CJ, Lane HC, Michael NL, Davey RT Jr, Thomas SJ; rVSVAG-ZEBOV-GP Study Group. A Recombinant Vesicular Stomatitis Virus Ebola Vaccine -Preliminary Report. // N Engl J Med. 2015. и обновленная работа этих авторов: A Recombinant Vesicular Stomatitis Virus Ebola Vaccine. // N Engl J Med. 2017. V. 376. P. 330-341.

104. Reynard O, Borowiak M, Volchkova VA, Delpeut S, Mateo M, Volchkov VE. Ebolavirus Glycoprotein GP Masks both Its Own Epitopes and the Presence of Cellular Surface Proteins. // Journal of Virology. 2009. V. 83(18). P. 9596-9601.

105. Rocha CD, Caetano BC, Machado AV, Bruna-Romero O. Recombinant viruses as tools to induce protective cellular immunity against infectious diseases. // Int Microbiol. 2004. V. 7(2). P. 83-94.

106. Ross PJ, Parks RJ. Construction and characterization of adenovirus vectors. // Cold Spring Harb Protoc. 2009. Протокол №5011.

107. Safronetz D, Hegde NR, Ebihara H, Denton M, Kobinger GP, St Jeor S, Feldmann H, Johnson DC. Adenovirus vectors expressing hantavirus proteins protect hamsters against lethal challenge with andes virus. // J Virol. 2009. V. 83(14). P. 72857295.

108. Sanchez A, Kiley MP, Holloway BP, Auperin DD. Sequence analysis of the Ebola virus genome: organization, genetic elements, and comparison with the genome of Marburg virus. // Virus Res. 1993. V. 29(3). P. 215-240.

109. Sanchez A, Yang ZY, Xu L, Nabel GJ, Crews T, Peters CJ. Biochemical Analysis of the Secreted and Virion Glycoproteins of Ebola Virus. // J Virol. 1998. V. 72(8). P. 6442-6447.

110. Sanchez A. et. al. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. // Fields virology. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins - 2006. - P. 1409-1448

111. Sarwar UN, Costner P, Enama ME, Berkowitz N, Hu Z, Hendel CS, Sitar

S, Plummer S, Mulangu S, Bailer RT, et al. Safety and immunogenicity of DNA

132

vaccines encoding Ebolavirus and Marburgvirus wild-type glycoproteins in a phase I clinical trial. // The Journal of infectious diseases. 2015. V. 211. P. 549-557.

112. Schlereth J, Grünweller A, Biedenkopf N, Becker S, Hartmann RK. RNA binding specificity of Ebola virus transcription factor VP30. // RNA Biol. 2016. V. 13(9). P. 783-798.

113. Schmidt ML, Hoenen T. Characterization of the catalytic center of the Ebola virus L polymerase. // PLoS Negl Trop Dis. 2017. V. 11(10). e0005996.

114. Sridhar S. Clinical development of Ebola vaccines. // Ther Adv Vaccines. 2015. V. 3(5-6). P. 125-138.

115. Stanley DA, Honko AN, Asiedu C, Trefry JC, Lau-Kilby AW, Johnson JC, Hensley L, Ammendola V, Abbate A, Grazioli F et al. Chimpanzee adenovirus vaccine generates acute and durable protective immunity against ebolavirus challenge. // Nat Med. 2014. V. 20(10). P. 1126-1129.

116. Sullivan NJ, Hensley L, Asiedu C, Geisbert TW, Stanley D, Johnson J, Honko A, Olinger G, Bailey M, Geisbert JB, Reimann KA, Bao S, Rao S, Roederer M, Jahrling PB, Koup RA, Nabel GJ. CD8+ cellular immunity mediates rAd5 vaccine protection against Ebola virus infection of nonhuman primates. // Nat Med. 2011. V. 17(9). P.1128-1131.

117. Takamatsu Y., Kolesnikova L., Becker S. Ebola virus proteins NP, VP35, and VP24 are essential and sufficient to mediate nucleocapsid transport. // Proc Natl Acad Sci USA. 2018. V. 115(5). P. 1075-1080.

118. Takada A, Watanabe S, Okazaki K, Kida H, Kawaoka Y. Infectivity-enhancing antibodies to Ebola virus glycoprotein. // J. Virol. 2001. V. 75. P. 2324-2330.

119. Takada A, Ebihara H, Feldmann H, Geisbert TW, Kawaoka Y. Epitopes required for antibody-dependent enhancement of Ebola virus infection. // J Infect Dis. 2007. V. 196(Suppl 2). P. S347-56.

120. Tapia MD, Sow SO, Lyke KE, Haidara FC, Diallo F, Doumbia M, Traore

A, Coulibaly F, Kodio M, Onwuchekwa U, et al. Use of ChAd3-EBO-Z Ebola virus

vaccine in Malian and US adults, and boosting of Malian adults with MVA-BN-Filo: a

phase 1, single-blind, randomised trial, a phase 1b, open-label and double-blind, dose-

133

escalation trial, and a nested, randomised, double-blind, placebo-controlled trial. // The Lancet Infectious diseases. 2016. V. 16. P. 31-42.

121. Taylor DJ, Leach RW, Bruenn J. Filoviruses are ancient and integrated into mammalian genomes. // BMC Evol Biol. 2010. V. 10:193

122. Ura T, Okuda K, Shimada M. Developments in Viral Vector-Based Vaccines. // Vaccines. 2014. V. 2(3). P. 624-641.

123. Vanderzanden L, Bray M, Fuller D, Roberts T, Custer D, Spik K, Jahrling P, Huggins J, Schmaljohn A, Schmaljohn C. DNA vaccines expressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethal challenge. // Virology. 1998. V. 246. P.134-144.

124. Verheust C, Goossens M, Pauwels K, Breyer D. Biosafety aspects of modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vectors used for gene therapy or vaccination. // Vaccine. 2012. V. 30(16). P. 2623-2632.

125. Vermillion MS, Klein SL. Pregnancy and infection: using disease pathogenesis to inform vaccine strategy. // NPJ Vaccines. 2018. V. 3:6.

126. Volchkov VE, Becker S, Volchkova VA, Ternovoj VA, Kotov AN, Netesov SV, Klenk HD. GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases. // Virology. 1995. V. 214(2). P. 421-430.

127. Volchkov VE, Volchkova VA, Chepurnov AA, Blinov VM, Dolnik O, Netesov SV, Feldmann H. Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus. // J Gen Virol. 1999. V. 80 ( Pt 2). V. 355-362.

128. Volchkov VE, Volchkova VA, Mühlberger E, et al. Recovery of infectious Ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity. // Science. 2001. V. 291. P. 1965-1969.

129. Wang B., Wang Y., Frabutt D.A., Zhang X., Yao X., Hu D., Zhang Z., Liu C., Zheng S., Xiang S.H., Zheng Y.H. Mechanistic understanding of N-glycosylation in Ebola virus glycoprotein maturation and function. // J Biol Chem. 2017. V. 292(14). P. 5860-5870.

130. Wang H, Shi Y, Song J, Qi J, Lu G, Yan J, Gao GF. Ebola Viral Glycoprotein Bound to Its Endosomal Receptor Niemann-Pick C1. // Cell. 2016. V. 164(1-2). P. 258-268.

131. Watanabe S, Noda T, Kawaoka Y. Functional Mapping of the Nucleoprotein of Ebola Virus. // Journal of Virology. 2006. V. 80(8). P. 3743-3751.

132. Watanabe S, Noda T, Halfmann P, Jasenosky L, Kawaoka Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. // J Infect Dis. 2007. V. 196 Suppl 2. P. S284-S290.

133. White JM, Schornberg KL. A new player in the puzzle of filovirus entry. // Nat Rev Microbiol. 2012. V. 10(5). P. 317-322.

134. Wold WSM, Toth K. Adenovirus Vectors for Gene Therapy, Vaccination and Cancer Gene Therapy. // Current gene therapy. 2013. V. 13(6). P. 421-433.

135. Yu DS, Weng TH, Wu XX, Wang FXC, Lu XY, Wu HB, Wu NP, Li LJ, Yao HP. The lifecycle of the Ebola virus in host cells. // Oncotarget. 2017. V. 8(33). P. 55750-55759.

136. Zhang AP, Bornholdt ZA, Liu T, Abelson DM, Lee DE, Li S, Woods VL Jr, Saphire EO. The ebola virus interferon antagonist VP24 directly binds STAT1 and has a novel, pyramidal fold. // PLoS Pathog. 2012. V. 8(2). e1002550.

137. Zhang C, Zhou D. Adenoviral vector-based strategies against infectious disease and cancer. // Human Vaccines & Immunotherapeutics. 2016. V. 12(8). P. 20642074.

138. Zhang WW, Li L, Li D, Liu J, Li X, Li W, Xu X, Zhang MJ, Chandler LA, Lin H, Hu A, Xu W, Lam DM. The First Approved Gene Therapy Product for Cancer Ad-p53 (Gendicine): 12 Years in the Clinic. // Hum Gene Ther. 2018. V. 29(2). P. 160179.

139. Zhu FC, Hou LH, Li JX, Wu SP, Liu P, Zhang GR, Hu YM, Meng FY, Xu JJ, Tang R, et al. Safety and immunogenicity of a novel recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine in healthy adults in China: preliminary report of a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. // Lancet. 2015. V. 385. P. 2272-2279

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, доктору биологических наук, член-корреспонденту РАН, заместителю директора ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России Логунову Денису Юрьевичу за предоставление возможности выполнения данной диссертационной работы, всестороннюю помощь и внимание. Искренне благодарю доктора биологических наук Народицкого Бориса Савельевича, доктора биологических наук Шмарова Максима Михайловича, кандидата биологических наук Тухватулина Амира Ильдаровича, Джаруллаеву Алину Шахмировну, кандидата биологических наук Щеблякова Дмитрия Викторовича, кандидата биологических наук Зубкову Ольгу Вадимовну, кандидата биологических наук Тутыхину Ирину Леонидовну, кандидата биологических наук Костарного Алексея Викторовича, кандидата биологических наук Семихина Александра Сергеевича, кандидата биологических наук Воронину Ольгу Львовну, кандидата биологических наук Щербинина Дмитрия Николаевича за помощь и ценные советы в работе. Выражаю искреннюю благодарность доктору биологических наук, кандидату медицинских наук, член-корреспонденту РАН, начальнику «48 ЦНИИ» Министерства обороны России Борисевичу Сергею Владимировичу и сотрудникам «48 ЦНИИ» Министерства обороны России за помощь в выполнении отдельных этапов работы. Также выражаю благодарность всем сотрудникам лабораторий клеточной микробиологии, иммунобиотехнологии и молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России за помощь и поддержку на всех этапах работы.

Свою признательность выражаю ученому секретарю диссертационного совета доктору медицинских наук, профессору Русаковой Екатерине Владимировне, кандидату медицинских наук Алимбаровой Людмиле Михайловне, рецензенту кандидату медицинских наук Зубашеву Игорю

Константиновичу и рецензенту кандидату биологических наук Коноплевой Марии Вениаминовне за помощь в подготовке материала диссертации к защите.